Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

estrogeenin (E2) ja progesteroni (P4) ovat keskeisiä toimijoita kypsymistä ihmisen kohdun limakalvon. Vastaava steroidi hormoni modulaattorit, tamoksifeenin (TAM) ja mifepristonin (RU486) käytetään laajalti rintasyövän hoidossa ja ehkäisyyn varten, vastaavasti.

Menetelmät /tärkeimmät havainnot

geeniekspressioprofilointi n ihmisen kohdun limakalvon Ishikawa syöpäsolulinjan käsitelty E2 ja P4 3 h ja 12 h, ja TAM ja RU486 12 tuntia, suoritettiin käyttäen RNA-sekvensointia. Korkea mRNA havaittiin geenejä, kuten

PSAP ATP5G2, ATP5H

, ja

GNB2L1

seuraavat E2 tai P4 hoitoon. Kaikkiaan 82 biomarkkereita kohdun limakalvon biologian joukosta tunnistettiin E2 aiheuttama geenien ja 93 joukossa P4 reagoiva geenejä. Tunnistetut biomarkkerit sisältyvät:

EZH2, MDK, MUC1, SLIT2,

ja

IL6ST

, jotka ovat geenejä aikaisemmin liittyy kohdun limakalvon vastaanottavaisuuden. Lisäksi 98,8% ja 98,6% E2 ja P4 reagoiva geenien Ishikawa soluissa, vastaavasti, havaittiin myös kahdessa ihmisen puolivälissä sekretorisen kohdun limakalvon biopsianäytteissä. TAM hoito näytteillä sekä antagonistisia ja agonistivaikutukset E2, ja myös säädellään osajoukko geenien itsenäisesti. Solusyklin säädin sykliini D1 (

CCND1

) osoitti merkittävää ylössäätöä hoidon jälkeen TAM. RU486 ei näytä toimivan puhdas antagonisti P4 ja toiminnallinen analyysi RU486 vasteen tunnistaa geenejä, jotka liittyvät tarttumista ja apoptoosin, mukaan lukien alas geenien liittyvät solu-solu kontakteja ja tarttuvuus kuin

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

ja

COL2A1.

Johtopäätökset

Merkittävät muutokset geenien ilmentyminen, jonka Ishikawa solulinjan havaittiin jälkeen hoitojen kanssa E2, P4, TAM, ja RU486 . Nämä transcriptome data tuottaa arvokasta tietoa mahdollisia biomarkkerit liittyvät endometriumin vastaanottavaisuutta, ja myös helpompi ymmärtää molekyyli muutokset tapahtuvat endometriumin alkuvaiheessa rintasyövän hoitoon ja ehkäisyä käyttö.

Citation: Tamm -Rosenstein K, Simm J, Suhorutshenko M, Salumets A, Metsis M (2013) muutokset transcriptome Human kohdun limakalvon Ishikawa Cancer Cell Line indusoima estrogeenin, progesteronin, tamoksifeenin, ja Mifepristone (RU486) havaittuna RNA-sekvensointi. PLoS ONE 8 (7): e68907. doi: 10,1371 /journal.pone.0068907

Editor: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 toukokuu 2013; Hyväksytty: 7. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 16 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Tamm-Rosenstein et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut Tallinnan teknillisen yliopiston (Kohdennettu hanke ei. B611), viro opetus- ja Science (Kohdennettu hanke ei. SF0180044s09) ja Enterprise Estonia (Grant no. EU30020).

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasteroidin hormonit, estrogeeni (E2) ja progesteroni (P4), keskeisessä asemassa ovat säännellä normaaliin toimintaan ihmisen kohdun limakalvon. Esimerkiksi normaalin kuukautiskierron aikana, proliferaatiota, erilaistumista, ja rappeutumista kohdun limakalvon esiintyy vastauksena vaihtelevissa E2 ja P4 tasolla. Vuonna proliferatiivinen vaiheessa E2 stimuloi epiteelisolujen ja peruskudoskomponentit kohdun limakalvon. Vuonna eritysvaiheessa, P4 moduloi glandulaarinen erilaistumista ja inhibition estrogeeni-välitteisen proliferaation [1]. On aikana puolivälissä eritysvaiheessa että kohdun limakalvo saavutetaan fenotyypin yhteensopiva onnistunut alkion istutuksen.

parempi ymmärtäminen biologian ja toimintaa ihmisen kohdun limakalvon on tärkeää lisätä tietämystä naisten hedelmättömyys, ja suunnittelu hoitoja näitä ehtoja. Vastaavasti etsiä merkkiaineiden kohdun limakalvon vastaanottavaisuuden ja uusia lähestymistapoja parantaa istutusta hinnat aikana hedelmöityshoitoja ei ole tehty. Viime vuosina useat tutkimukset, joissa microarray ilmaisun analyysi ovat tunnistaneet monenlaisia ​​geenien ylä- tai alassäädetty ihmisen kohdun limakalvon aikana alkion istutusta [2] – [10]. Jokainen tunnistettiin tutkimuksessa useita kandidaattigeenit uskotaan olevan kriittinen alkion implantaatioprosessiin. Kuitenkin vain harvat geenejä johdonmukaisesti raportoitu.

genomista toimintaa E2 ja P4 ovat pääasiassa välittävät tumareseptoreihin. Kun E2 tai P4 ovat sitoutuneet niiden reseptoreihin, ne voivat sitoa vaste-elementit DNA suurella affiniteetilla ja säätelevät kohdegeenien transkription. Ihmisillä on kaksi tyyppiä estrogeenireseptoreihin ERa ja ER, ja nämä koodaavat erilliset geenit [11], [12]. ERa ja ER ilmentyvät kaikissa endometriumin solutyypeissä koko kuukautiskierron ajan, ja tehdään muutoksia ilmaisun ja toimintaa. Esimerkiksi ERa ja ER ilmentyvät korkeammilla tasoilla aikana proliferatiivinen vaiheessa, mutta aktiivisuus on heikompi aikana eritysvaiheessa kun ne sovelletaan tukahduttava vaikutus P4. On jälkeen proliferatiivinen vaihe, joka P4 välittää E2-pohjainen esikäsittely kohdun limakalvon kohti valtiota vastaanottavaisuuden.

Toisin ERa ja ER, progesteroni reseptorit (PRS), PRA ja PRB, koodataan sama geeni (

PGR

), mutta transkriboidaan eri promoottoreita. Tämän seurauksena, PRB sisältää lisäksi 164 aminohappoa N-päässään [13], [14]. Molemmat isoformit ekspressoituvat strooman ja epiteelin kohdun limakalvon aikana proliferatiivisen vaiheessa. Ilmaisulla molempien reseptorien pienenee jyrkästi epiteelin aikana alussa tai puolivälissä eritysvaiheessa [15]. Kohdun limakalvon reseptiivisyys näyttää tiiviisti liittyy alas-säätely epiteelin PRS, kun strooman säilytetään ainoastaan ​​ilmaus PRA aikana eritysvaiheessa [16]. Expression of PR geenien kohdun limakalvon rauhasepiteeliin ohjataan E2 ja P4, E2 asiakkuutta PR synteesiä ja P4 alaspäin säätäminen ilmentymä omaa reseptorin [1].

valikoiva ER modulaattorit (SERM) on kyky vuorovaikutuksessa Keskeisten agonisteina tai antagonisteina riippuen kohdekudokseen ja moduloimaan signaalitransduktioreaktioteiden E2-reagoivien geenien [17]. Esimerkiksi tamoksifeeni (TAM) sitoutuu suurella affiniteetilla ERS estäen siten toimia natiivin E2. Koska sen antagonistista aktiivisuutta E2, TAM on laajalti käytetty rintasyövän hoidossa. Kuitenkin yksi hankalia haittavaikutuksia rintasyövän hoitoja TAM näyttää olevan sen proliferatiivinen vaikutus kohdun limakalvoon [18], [19]. Esimerkiksi kohdun liittyviä patologioita TAM hoidot ovat liikakasvu, polyypit, karsinoomat, ja sarkoomat [20]. Samanlaisia ​​SERM, selektiivisiä progesteroni reseptorin modulaattorit (SPRMs) on kehitetty antagonisoida prosesseja aktivoituu P4. Mifepristonia (RU486) on P4 antagonisti, joka kilpailee endogeenisen P4 reseptorin sitoutumiselle [21] ja sitä käytetään lopettaa raskauden alkuvaiheessa. RU486 myös osoittaa 2-to-10-kertaa suurempi affiniteetti PRS verrattuna P4 [22].

Tarkka perustana ero kudosspesifisiä signalointi E2 ja P4 ei ole vielä täysin ymmärretty, ja ymmärtämään paremmin E2 ja P4 toimia tarvitaan arvioida niiden roolit säätelyssä endometriumin geenin ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa ihmisen kohdun johdettu epiteelin syövän solulinja, Ishikawa, on käytetty. Se on yksi hyvin tunnettu ihmisen kohdun limakalvon solulinjoja tällä hetkellä saatavilla. Ishikawa-soluja, jotka ovat peräisin hyvin erilaistunut adenokarsinooma ihmisen kohdun limakalvon epiteelin, että funktionaalista steroidireseptorit E2 ja P4 [23] – [25]. Tämän seurauksena tämä solulinjoja edustaa Ideaalimallin tutkitaan vastetta kohdun limakalvon epiteelin E2 ja P4. Tässä tutkimuksessa, suuren suoritustehon RNA-sekvensoinnilla (RNA-sekvenssi) on sovellettu tutkimuksia E2- ja P4-riippuvainen transcriptomes käytettäessä kohdun limakalvon yhteydessä. Steroidihormonireseptori modulaattorit, TAM ja RU486, käytettiin myös tutkimaan reseptoriin riippuvan signaalitransduktion, ja arvioida agonistinen tai antagonistinen aktiivisuus Ishikawa solulinjassa. Lopuksi merkittävät E2- ja P4-riippuvaisten geenien tunnistettu Ishikawa solulinjassa tutkittiin endometriumin biopsianäytteissä kerätään vastaanottavainen puolivälissä eritysvaiheessa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ishikawa solulinja saatiin professori Anneli Stavreus-Evers (Uppsalan yliopisto, Ruotsi). -Soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (PAA, Pasching, Itävalta), joka oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS, PAA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (PAA), 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Hormonaalisten hoitoja, E2 (β-estradioli) tai P4 (4-pregnen-3,20-dioni) lisättiin viljelyalustaan ​​loppupitoisuuteen 10

-8 M. steroidi hormoni modulaattorit, tamoksifeeni (TAM , 4-hydroksitamoksifeeni) ja mifepristonin (RU486), lisättiin viljelyalustaan ​​lopulliseen konsentraatioon 1 uM. Kaikki hormonit ja modulaattorit tilattiin Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Saksa), jossa E2 ja P4 liuotetaan dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja TAM ja RU486 etanoliin (EtOH). Ohjaus näytteitä käsiteltiin ajoneuvon vain. Kulttuurien hormoni lisäravinteet, dekstraanipäällysteisellä, puuhiilikäsitelty FBS ja median ilman fenolipunaista käytettiin 48 tuntia ennen kokeiden välttämiseksi hormonin kaltainen aktiivisuus fenolipunaista.

RNA

Kokonais-RNA uutettiin käsittelemättömien solujen ja soluissa, sen jälkeen 3 h ja 12 h hormonihoidon käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, USA). Biopsiat kerättiin kahdelta potilaalta (ikä, 34 ja 38 vuotta) selittämätön lapsettomuus hoidettiin Nova Vita Clinic. Koepaloja kerättiin päivinä LH + 7 LH + 9 mukainen virtsan ovulaatiotestit. Kudosnäytteet homogenisoitiin kudos lyzer (Qiagen), ja kokonais-RNA uutettiin aiemmin formaliinikiinnitetyt (3,7%), kohdun limakalvon biopsiat käyttämällä RNeasy FFPE (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tutkimus suoritettiin noudattaen paikallisten eettisten normien ja hyväksyi eettinen Review komitean Human Research yliopiston Tarton, jossa kirjallinen suostumus on saatu molempien TET.

RNA Library Valmistelu

RNA kirjastot solulinjan ja kohdun limakalvon näytteet valmistettiin käyttäen Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit (FC-122-1001, Illumina, San Diego, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solujen näytteitä, mRNA puhdistettiin käyttäen polyA valinta, ja sittemmin hajanaista kemiallisesti. Sillä kudosnäytteitä, kokonais-RNA kerättiin ilman polyA valintaa ja pirstoutumista askel lyhennettiin perustuu edellisen formaliinikäsittely näytteitä. Kaikissa näytteissä, RNA: t muunnettiin yksijuosteiseksi cDNA käyttämällä satunnaisia ​​hexamer esikäsittely. Multiplexing eri adapteri indeksit tehtiin ja laadun tuloksena kirjaston tarkistettiin käyttäen Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Saksa).

RNA-Seq ja data-analyysin

Single-end (SE ) sekvensointi 75 bp suoritettiin käyttäen Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, USA). Bowtie ohjelmointi käytettiin tehdä alustava sekvenssien ihmisen genomin 19 (Hg19), oletusasetuksilla käytetään löytää vain täydellinen otteluissa. Sekvensoitu fragmentit tasataan

H. Sapiens

viite genomi (Hg19) tarjoamat Kalifornian yliopisto, Santa Cruz (UCSC) Genome selainta käyttäen Tophat v1.2.0 algoritmia oletusasetuksilla [26]. Kohdistettu lukee myöhemmin jalostetaan selostukset käyttäen Cufflinks v1.1.0 [27], jossa runsaus arvioidaan ja analysoidaan tutkia ero ekspressiokuvioiden välillä solun näytteitä. Kalvosinnapit rakennettu vähimmäismäärä selostukset parhaiten kuvaavat lukee aineisto. The Benjamin-Hochberg korjauksen useita testejä käytettiin P merkitsevistä geenejä väärä löytö määrä (FDR) arvo 0,05. Normalized RNA-Seq fragmentti laskee osoittaa suhteellinen runsaus selostukset käytettiin. Runsautta ilmoitettiin yksikköinä FPKM (esim Fragments Per kiloemästä transkriptilaji miljoonasosaa fragmenttien kartoitettu). Tulostiedostot kalvosinnappeja analysoitiin Cuffcompare mukana oleva viittaus UCSC Taulukko Browser (Homo sapiens GRCh37 /Hg19) [28]. Cuffcompare luokittelee kukin transkriptin tunnettuja tai uusia. Cuffdiff uudelleen arvioita runsaudesta transkriptien lueteltu Cuffcompare ja testit ero ilmentymisen välillä valitun kokeita. Jos yksi kokeissa (joko ohjaus- tai hoito) oli 0 FPKM, logaritmista muutosta tuli ääretön. Ekspressoimme log muutos näissä tapauksissa +14 jopa sääntelyn ja -14 varten alassäätöä.

Functional Analysis

toiminnallinen luokitus geenien näytteillä merkittävä ero ilmaisun profiileja vastauksena eri steroidi hormoni ja niiden analogiset hoitoja, kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) 9.0 ohjelmisto (Ingenuity Systems) käytettiin. IPA transkriptiotekijä moduulia käytettiin ennustamaan geenien ilmentymisen muutoksia todettujen mahdollisten siteet ERS ja PRS. Lisäksi IPA biomarkkereiden analyysisuodattimien havainnut mahdollisia biomarkkereita valituissa kudoksissa.

Data Visualization

R tilastojen (versio 2.14.0) (https://www.R-project.org/) käytettiin käsitellä ja visualisoida tulokset Cufflinks analyysit. Laskenta tilastot, mukaan lukien yhteinen ja ainutlaatuinen laskee merkittävästi vaikuttaa geenien, suoritettiin R käyttäen skripti. Sillä heatmap visualisointeja, R paketti gplots (versio 2.10.1) (https://CRAN.R-project.org/package=gplots) käytettiin. Lisäksi erot FPKM arvoja käsiteltyjen näytteiden verrattuna ei-käsiteltyjen näytteiden laskettiin, että lämpökarttoja. Suurin absoluuttinen FPKM ero kunkin geenin tunnistettu, ja sitä käytettiin normalisoimaan FPKM tietoja kunkin geenin. Siten tuloksena arvot ovat välillä -1 ja 1, ja arvo 0 vastaa muutoksen puuttuminen verrattuna ei-käsitellyssä näytteessä. Näiden pohjalta normalisoitujen ilmaisun arvot, geenit sijoitetaan heatmap hierarkkinen klusterointi.

Tulokset

Euroopan transcriptome on Ishikawa Cell Line ennen ja jälkeen hoidon kanssa E2, P4, ja Vastaavat modulaattorit

PolyA-valittu RNA ihmisen kohdun limakalvon solulinjaa, Ishikawa, alistettiin SE-sekvensointi 75 emäsparin pitkä lukee. Viite mittaukset kunkin näytteen jälkeen valmistettiin perustuu 8-11 × 10

6 lukee että saatiin. Tavoitteena Tämän sekvensoinnin vaivaa oli saada kokonaiskuva geeniekspressioprofiili on Ishikawa solulinjan jotta voidaan tunnistaa muutoksia geenien ilmentyminen, jotka tapahtuvat aikana varhaisen reagoinnin tämän solulinjan steroidihormonien ja niiden modulaattorit. Kaiken kaikkiaan seitsemän näytteet analysoitiin, ja nämä sisältyvät ei-käsitellyissä soluissa, käsitellyissä soluissa E2 tai P4 3 ja 12 tuntia, ja solut, joita käsiteltiin TAM tai RU486 modulaattorit 12 tuntia. Suurin osa lukee kustakin näytteestä (esim 70%) onnistuneesti kohdistettu ihmisen perimän versio 19 (Hg19). Tilastollisia arvoja näiden linjaukset ja määrä identifioitujen geenien, mukaan lukien sekä tunnettuja ja tuntemattomia geenejä, on lueteltu taulukossa 1. suhteellinen runsaus fragmenttien laskettiin Cufflinks, ja ne ilmoitettiin yksikköinä FPKMs kuvaamiseksi ilmentyvien geenien (esim fragmentit) havaita RNA-Seq kokeita. Taulukossa 1, geenien lukumäärän eri FPKM runsaus, sekä määrä geenejä, jotka osoittivat merkittäviä muutoksia ilmaisun jälkeen, hormoni /modulaattori hoitoon, verrattiin ei-käsiteltyjen solujen. Lisäksi herkin geenit tunnistettiin päässä Ishikawa solulinjasta verrattiin ihmisen kohdun limakalvon koepalojen (n = 2) kerätään aikana alkion istutusta. Täydellinen luettelo ilmentyvien geenien tunnistaminen ja FPKM arvot ovat saatavilla taulukossa S1.

Yksi eduista on RNA-sekvenssi-analyysi on kyky havaita suhteellisen korkea ekspressiotasot geenejä. Osajoukko geenien Ishikawa solulinja oli FPKM-arvot, jotka olivat suurempia kuin 1000 sen jälkeen, kun hormoni /modulaattorin hoidot (taulukko 2). Näihin sisältyvät geenit koodaavat prosaposin (

PSAP

), ATP disyntaasit,

ATP5G2

ja

ATP5H

, ja guaniininukleotidiä sitova proteiini (

GNB2L1

). Nämä geenit olivat hyvin voimakkaasti ilmaistu vastauksena E2 tai P4 hoitoon. Ilmaukset

ATP5G2

,

ATP5H

ja

GNB2L1

ei ole osoitettu liittyvän kohdun limakalvoon ennen. Vaihtoehtoisesti geenit, jotka koodaavat S100 kalsiumia sitovia proteiineja A2 (

S100A2

) ja A6 (

S100A6

), lämpösokkiproteiini 90 kDa alfa (

HSP90AA1

), ja HSPA8, sekä pyruvaattikinaasia lihasten (

PKM2

), osoitti korkeita ilmentymisen 12 tunnin kuluttua hoidon TAM. Näistä geeneistä ainoastaan ​​ilmaus

S100A2

on liittynyt TAM hoitoa rintasyöpäkudosnäytteessä muttei endometrium [29]. Lisäksi geeni ferritiini valon polypeptidin (

FTL

), ei myöskään havaittu kohdun limakalvon entisen tutkimuksissa havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​12 tunnin hoidon jälkeen E2, P4, ja TAM (taulukko 2).

Merkittävät Gene Expression muutokset Ishikawa Cell Line jälkeen E2 ja P4 Hoidot

Suhteellinen mRNA ekspressiotasot (yksikköinä FPKM) varten E2- ja P4-käsitellyt solut verrattiin käsittelemättömien solujen avulla Cuffdiff ohjelmistoa (versio 1.1.0) ja 5% FDR. Useita geenejä, jotka osoittivat merkittäviä muutoksia ilmaisun jälkeen kunkin hoitoja on lueteltu taulukossa 1. Lisäksi, vain tunnettuja geenejä olivat mukana seuraavissa analyyseissä geenin ilmentymisen tietoja.

yhteensä 1691 tunnettuja geenejä (taulukko S2 ) havaittiin merkittävästi vaikuttaa Ishikawa soluissa hoitoja E2 3 h (n = 1084) ja 12 h (n = 1121) verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin. Näistä geeneistä, 614 olivat merkittävästi säädelty, ja 470 oli merkittävästi alassäädetty kuluttua 3 h E2 hoitoa. Kun hoito E2 jatkettiin 12 h, induktio 715 geenien, ja tukahduttaminen 406 geenien havaittiin.

Suurin osa geeneistä 12 h TAM hoito osoittivat antagonistista aktiivisuutta E2. Kaksitoista tuntia hoidon TAM johti alhainen tai havaitsemattomia tasoja mRNA: 654 (91,5%) geenien 715 geenien oli korkeampi mRNA-tasot hoidon jälkeen E2: ssa 12 h. Ylimääräinen 406 geenejä havaittiin alassäädetty hoidon jälkeen E2 12 tuntia, ja 75,1% (n = 305) näistä geeneistä esillä ainoastaan ​​vähäisiä muutoksia geenien aktiivisuutta, tai niihin liittyi puuttuminen sääntelyn, 12 h kuluttua hoidon TAM.

perusteella saadut tiedot, TAM ei toiminut puhdas antagonisti E2 Ishikawa solulinjassa. Esimerkiksi on 715 geenien säädelty hoidon jälkeen E2 12 tuntia, 61 (8,5%) olivat myös merkitsevästi sääteli hoidon jälkeen TAM. Lisäksi joukossa 406 geenejä, todettiin alassäädetty hoidon jälkeen E2 12 tuntia, 101 (24,9%) olivat yhtä alassäädetty hoidon jälkeen TAM. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että TAM on sekä antagonistinen ja agonistinen varten E2 Ishikawa solulinjassa (kuva S1).

hoidon jälkeen P4, yhteensä 1692 tunnettuja geenejä esillä merkittäviä eroja ilmaisun (taulukko S3 ). Näistä geeneistä, 1082 esillä muutokset 3 h jälkeen hoidon, ja 1097 havaittiin seuraavat 12 h hoito, sekä verrattuna ei-käsitellyn Ishikawa-soluja. Näistä geeneistä, 592 (54,7%) oli merkitsevästi säädelty, ja 490 (45,3%) oli alassäädetty 3 h hoidon jälkeen P4, kun taas 631 (57,5%) oli säädelty ja 466 (42,5%) laski -regulated 12 h käsittelyn jälkeen P4.

Kun Ishikawa-soluja käsiteltiin RU486: ssa 12 h, matala tai ei-havait- tavissa mRNA havaittiin 84,0% (n = 530), ja geenit, jotka olivat merkittävästi sääteli hoidon jälkeen P4 12 h (n = 631). Toinen 466 geenejä havaittiin alassäädetty hoidon jälkeen P4 12 tuntia, ja näistä 88,2% (n = 411) oli vähäinen alassäätöä tai osoittanut mitään asetusta, hoidon jälkeen RU486 12 tuntia.

Niistä 631 geenit, jotka olivat säädellään ylöspäin vasteena 12 h P4 hoitoa, 101 (16,0%) näiden geenien myös merkittävästi säädelty hoidon jälkeen RU486. Vaihtoehtoisesti on 466 geenien säädellä vähentävästi hoitovastetta P4 12 tuntia, 55 (11,8%) oli samanlainen alassäätöä hoidon jälkeen RU486. Lisäksi samanlainen TAM, RU486 näytteillä sekä agonistinen ja antagonistinen aktiivisuus P4 Ishikawa soluissa (kuvio S2).

Niistä 1691 geenien merkittävästi reagoi E2, ja 1692-geenien merkittävästi reagoivien P4, 1051 olivat yleisiä molemmille ryhmille, mikä viittaa siihen, että ne säätelevät sekä hormonit. Suhteellinen enemmistö geenien tunnistettu merkittäviä muutoksia sen jälkeen, kun E2 ja P4 hoitoa, ei ole mainittu endometriumin yhteydessä ennen.

Mahdolliset ER ja PR tavoitteet Niistä E2 ja P4 Merkittäviä tunnistettujen geenien

IPA-analyysi geenien havaittiin olevan herkkä E2 paljasti 20 mahdollista kohdegeenien E2-reseptorin, ERa (

ESR1

), joka perustuu tietokantaan kokeellisesti havaittu reseptorin vuorovaikutuksia. Esimerkiksi

ABCA3, CELSR2, CYP1A1, DDX17, EFEMP1, ENO1, FOSL2, GREB1, KCNK6, MAPK12, MYC, PDCD4, PGR, SHANK3, TGFa,

ja

TPM1

kasvoi merkittävästi -regulated hoidon jälkeen E2: ssa 12 h. Kääntäen,

CCNG2, KCTD6, LDLR,

ja

PRLR

olivat alassäädetty. Näistä geenituotteiden, PGR ja MAPK12 osallistua glukokortikoidireseptorin signalointi, kun taas MYC ja CYP1A1 osallistuvat aryylihiilivetyreseptori (AHR) signalointia (kuva S3).

12 tunnin kuluttua hoidon P4, ilmaus

CDKN1C, F3, FKBP5, Gas6, IL1R1, NQO2, PFKP, TSC22D3

ja

PGR

havaittiin olevan säädelty, kun taas

EZR

,

ACSL1, AKAP13, CCNB2, GLUL, MYCN, PPIF,

ja

SNTB2

todettiin alassäädetty. Näistä CDKN1C, FKBP5 ja PGR edistää glukokortikoidireseptoriin signalointi, kun taas ACSL1 ja PFKP ovat rooleja glukoneogeneesia (kuva S4).

biomarkkereiden Analyysi E2 ja P4 Merkittävät Geenit päässä Ishikawa Cell Line

Seuraavaksi mahdollisia biomarkkereita joukossa E2 (n = 1691) ja P4 (n = 1692), joka reagoi geenejä tutkittiin. Vain molekyylit aiemmin havaittu ihmisen kohdun limakalvon varten harkittiin IPA biomarkkereiden analyysin, ja molekyylit olivat edelleen suodatetaan kuuluvat ne liittyvät sukuelimiin sairauksia tai hormonitoimintaa häiriöt.

IPA biomarkkereiden analyysiin tunnistettu 82 mahdollisia biomarkkereita keskuudessa E2 merkittäviä geenejä ja 93 mahdollisia biomarkkereita joukossa P4 merkittäviä geenejä. Oli 62 potentiaali biomarkkereiden molekyylejä yhteinen molemmille ryhmille. Täydellinen luettelo biomarkkereiden ilmaistuna nisäkkään kohdussa verrataan biomarkkereita yksilöityjen Ishikawa soluissa 3 tunnin ja 12 tunnin kuluttua E2, P4, ja vastaavaan modulaattoriin hoitoja (taulukko S4). Valikoima ainutlaatuisia E2 ja P4 riippuvainen biomarkkerit, jotka ovat liittyneet endometriumin vastaanottavaisuutta ja alkion implantaatio on lueteltu taulukossa 3. Ensiksi mainitun osalta nämä sisältyvät seuraavat geenit liittyvät kohdun limakalvoa ja alkion implantaatio:

MUC1, EZH2, HMGCR, MDK, PRDM2, PXN,

ja

SLIT2

(taulukko 3). Geenejä yhteinen sekä E2 ja P4 reagoiva geenit, potentiaali biomarkkerit tunnistettiin, jotka liittyvät kohdun vastaanottavaisuutta tai endometrioosi, ja nämä olivat:

ARG2, ANXA1, AR, BMPR2, CDKN1C, CXCL16, EGFR, FGFR1, HMGA1, IGFR2 , IL1R1, JAG1, anna-7, MCAM, NCOA3, Notch1, PDCD4, PGR, RACGAP1, TMSB10,

ja

TNC

(taulukko S4).

Samalla tavoin, keskuudessa P4 reagoiva geenien mahdolliset biomarkkerit tunnistettiin, jotka liittyvät kohdun limakalvon kehittyminen tai aikaisin raskauden:

CTNNA1, ErbB3, FGFR2, IGFBP5, IKBKB, IL6ST, KCNMA1, NOTCH3, S100A4, STAT3, TCF7L2, TGFB1,

ja

TGFBR3

(taulukko 3).

vertailun merkittävät E2 ja P4 Responsive Geenit Yksilöitiin Ishikawa Cell Line Human kohdun limakalvon transcriptome

ennustaa onko E2 ja P4 reagoiva tunnistettujen geenien Ishikawa soluja myös ilmaistu ihmisen kohdun limakalvon ja /tai ovat rooleja implantaatioprosessiin alkioiden, näiden geenien ilmentymistä tutkittiin kahdessa ihmisen kohdun kudosnäytteitä kerätään puolivälistä sekretorisen kohdun limakalvoon. Mukaan RNA-Seq data, 1671 (98,8%) E2 reagoiva geenien ja 1668 (98,6%) ja P4 reagoiva geenien tunnistettu Ishikawa solulinjassa todettiin myös ilmaistava ihmisen kohdun limakalvon näytteestä saatujen kaksi potilasta, jotka tehtiin koepala. Nämä ihmisen endometriumin näytteitä käytettiin vain vertailun vuoksi. Taulukossa 1 ilmaisulliset runsaus (esim FPKMs) E2: n ja P4 biomarkkereita havaittu ihmisen kohdun limakalvon koepalojen verrataan ei-käsiteltyjen Ishikawa-soluja. Niistä IPA-tunnistettu E2 ja P4 biomarkkereita läsnä Ishikawa soluissa,

EZH2, MDK, MUC1, SLIT2,

ja

IL6ST

todettiin myös olevan läsnä ihmisen kohdun limakalvon transcriptomes (kuvio 1) .

Red geenejä säädellään ylöspäin E2 ja P4 käsitellään Ishikawa soluja verrattuna ei-käsitellyistä soluista; green geenit alassäädetty. Geenit sijaitsee vasemmalla puolella poikkiviiva osoittavat korkeampi suhteellinen runsaus (FPKM) ihmisen koepala näyte verrattuna ei-käsiteltyjen Ishikawa soluissa. Geenit sijaitsee oikealla puolella poikkiviiva heikompi suhteellinen runsaus (FPKM) ihmisen koepala näyte verrattuna ei-käsiteltyjen Ishikawa soluissa.

TAM Responsive geenien Ishikawa Cell Line, jotka liittyvät että Reproductive sairaudet

jälkeen hoidossa Ishikawa solujen TAM 12 tuntia, ilmaus 1013 geenien havaittiin merkittävästi muuttunut verrattuna ei-käsiteltyjen Ishikawa soluissa. Näistä geeneistä, 432 oli säädelty ja 581 olivat alassäädetty (taulukko S5). Nämä tulokset osoittavat, että TAM on sekä antagonistinen ja agonistinen aktiivisuus E2 Ishikawa soluissa. Lisäksi lisäksi vaikuttamaan E2 geenien, TAM merkittävästi muuttunut ilmentyminen 789 geenien riippumatta E2 (kuvio 2A).

Ainutlaatuinen ja yhteiset geenit kuluttua 12 h E2 ja TAM hoitoa. B Ainutlaatuinen ja yhteisiä geenejä kuluttua 12 h P4 ja RU486 hoitoa. Esitettyjen numeroiden kussakin ympyrät edustavat useita merkittävästi muuttunut geenien ainutlaatuinen hoitoa, ja nuolet osoittavat tavalla ne säänneltyjä (ylä- tai alassäätöä verrattuna ei-käsiteltyjen Ishikawa solut). Päällekkäisyyksiä osoittavat useita yleisesti muuttunut geenejä.

Käyttäen IPA ydin analyysin ennustettu toiminta TAM reagoivien geenien saatiin. Kaikkiaan 168 geenien havaittiin liittyvän eri sukuelimiin sairauksia, kuten kohdun, munasarjojen ja kohdunkaulan syöpiä, sekä sukupuolielinten kasvaimet, amenorrea, metrorragia, ja munasarjojen monirakkulatauti (taulukko 4).

Yksi tärkeimmistä signalointireittien tunnistaa TAM reagoiva geeneistä liittyi sääntelyä DNA-replikaation, rekombinaation, ja korjaus sekä solusyklin etenemistä ja solujen kokoonpano ja organisaatio. Lisäksi TAM reagoiva geenejä koodattu molekyylejä, jotka suoraan tai välillisesti, liittyivät solusyklin säädin, sykliini D1 (

CCND1

). Vastaavasti

CCND1

todettiin olevan merkittävästi säädelty 12 h käsittelyn jälkeen TAM (kuva 3).

Red molekyylit edustavat säädelty ja vihreä alas geenien joukossa TAM 12 h merkittäviä geenejä Ishikawa soluissa. Verkot luotiin käyttämällä IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

RU486 Merkittävät geenien Ishikawa Cell Line liittyvät Reproductive sairaudet

hoito Ishikawa solujen kanssa P4 antagonisti, RU486, 12 tuntia aiheutti merkittäviä muutoksia ilmaisua 546 geenien verrattuna käsittelemättömiin soluihin, joissa 255 geenejä säädellään ylöspäin ja 291 geenien alassäädetty (taulukko S6). Samanlaisia ​​TAM, RU486 näyttelyitä sekä agonistin antagonistivaikutuksia P4 Ishikawa soluissa. Esimerkiksi, 377-geenien reagoivat RU486 12 h kuluttua ei havaittu merkittäviä muutoksia ilmentymisessä hoidon jälkeen P4: ssa 12 h. Näin ollen, nämä geenit säädellään itsenäisesti RU486 ja ilman P4 Ishikawa-soluja (kuvio 2B).

546 geenien havaittiin olevan herkkä hoidon RU486, 86 koodattu molekyylit liittyvät sairaudet sukuelimiin. Esimerkiksi molekyylit, jotka liittyvät adenomyoosin, sukurauhaskasvaimien, metrorrhagia, ja kohdun leiomyooma tunnistettiin (taulukko 4). Joka perustuu geenien, jotka olivat reagoi hoitoon RU486, signalointireitin liittyvän geenin ilmentymistä, solu-solu-signaloinnin ja vuorovaikutukset, ja kudosten kehitystä havaittiin. Keskeinen molekyylit tähän verkkoon, mukaan lukien kadheriinin 2 (CDH2) ja monimutkainen välillä AR ja NFKB, välittävät suoraa ja epäsuoraa vuorovaikutusta RU486 reagoiva geenien (kuvio 4). Esimerkiksi transkription yhteistyössä repressorigeenistä,

NCOR2

, oli säädelty kuin oli androgeenireseptorin (

AR

) geeni. Kuitenkin transkriptiotekijä, FOXA1 oli alassäädetty. Geenit, jotka liittyvät solusta soluun kontakti ja adheesio olivat myös alassäädetty, ja mukana:

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

ja

COL2A1.

Vaihtoehtoisesti

PDK1

ja

ADAM15

oli säädelty, ja ovat rooleja induktioon kudosvauriot. Suurin osa molekyyleistä johti verkoston liittyy myös solukuolemaan ja apoptoosiin.

Keskeinen molekyylien verkko olivat kadheriinin 2 (CDH2), AR ja NFKB monimutkainen. Verkot luotiin käyttämällä IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määritellä transkription vastetta endometriumin malli hoitoon E2, P4, TAM, ja RU486. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti soveltamisen RNA-Seq tutkimuksen varhaisen genominlaajuisten vaikutuksia ihmisen kohdun limakalvon solulinjassa. Lisäksi suurin geenien havaittiin olevan merkittävästi reagoi E2 ja P4 on Ishikawa solulinjassa havaittiin myös ihmisen biopsiat kerätään alkion istutusta.

Viime vuosikymmenen aikana, mikrosiruja on ollut eniten