Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kemoterapian aiheuttaman väheneminen kasvaimen kuormitus on funktio apoptoottisen solukuoleman, johtamasta solunsisäinen kaspaaseja. Kuitenkin tehokkuus näiden hoitojen on vaarassa vaikuttavia mutaatioita geeneistä, valvontaan ja /tai säätelemällä apoptoottisia signalointi. Siksi on toivottavaa tunnistaa uusia polkuja solukuoleman, joka voisi toimia yhdessä tai ilman tehokasta apoptoottisen koneiston. Tässä suhteessa, viimeaikaiset todisteet tukevat olemassa uuden solukuolemareittiin kutsutaan autophagy, joka aktivoituu, kun kasvutekijä puutteen tai altistuminen genotoksisten yhdisteiden. Toiminnallinen merkitystä tämän reitin kannalta sen kyky toimia stressivastetta tai todella kuolema efektori mekanismi on vielä kyseessä; kuitenkin raporttien mukaan autophagy on erikoistunut muoto solukuoleman tietyissä olosuhteissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä raportoidaan samanaikaisesti induktion kaanoniin autophagy ja apoptoosin ihmisen syöpäsoluja altistettaessa pienimolekyylinen yhdiste, joka laukaisee solunsisäisten vetyperoksidia (H

2O

2) tuotantoa. Ottaa huomioon, hiljentämisen beclin1 ei inhiboi tunnusmerkkejä autophagy eikä solukuoleman induktioon, Atg 7 tai Ulk1 pudotus merkittävästi kumottu lääkkeen aiheuttama H

2O

2-välitteisen autophagy. Lisäksi tarjoamme todisteita siitä, että aktivoitu solunulkoinen säännelty kinaasin (ERK) ja c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) ovat alkupään efektoreita hallitsemaan sekä autophagy ja apoptoosin vastauksena suurentaa solunsisäisen H

2O

2. Mielenkiintoista on, että esto JNK toiminnan päinvastaiseksi kasvu Atg7 ilmentyminen tässä järjestelmässä, mikä osoittaa, että JNK voi säädellä autophagy aktivoimalla Atg7. Huomattavaa on, että pienmolekyyliyhdisteen laukeaa autophagy ja apoptoosin alkusolut potilaista peräisin lymfooma, mutta ei ei-transformoiduissa soluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Kun otetaan huomioon, että menetys tuumorisuppressorin beclin 1 liittyy neoplasia, kyky tämän pienmolekyyliyhdisteen harjoittaa sekä autophagic ja apoptoottisten koneiden kautta ROS tuotanto ja myöhemmän aktivoinnin ERK ja JNK voisi olla potentiaalia translaation vaikutuksia.

Citation: Wong CH, Iskandar KB, Yadav SK, Hirpara JL, Loh T, Pervaiz S (2010) samanaikainen induktio Non-Canonical Autophagy ja apoptoosi syöpäsoluissa ROS-Dependent ERK ja JNK aktivointi. PLoS ONE 5 (4): e9996. doi: 10,1371 /journal.pone.0009996

Editor: Gian Maria Fimia, INMI, Italia

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2009; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2010; Julkaistu: 02 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Wong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan apurahoja SP National Medical Research Council, Singapore, Biomedical Research Council, Singapore, opetusministeriö (MOE-Tier 2), Singapore, ja tutkimukseen varoja Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nyt on vakiintunut, että kemoterapian aiheuttaman väheneminen kasvaimen kuormitus on funktio apoptoottisen solukuoleman, johtamasta solunsisäinen kaspaasi proteaasien. Kuitenkin tehokkuus joidenkin näiden hoitojen tasoitettiin vaikuttavia mutaatioita erityisiä effektorit säätelevien geenien ja /tai säätelemällä apoptoottiset signalointi, kuten epigeneettiset vaiennettu kaspaasin 8, downregulation proapoptootti- proteiinien Bax ja Rahastolla-1, sekä voimistumista anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja IAP perheitä. Siksi on ollut työruuhka noin tunnistamisen uusia polkuja solukuoleman, jotka voivat toimia rinnakkain tai puuttuessa tehokkaan apoptoottisten koneita. Tässä suhteessa, viimeaikaiset todisteet on korostettu, että on olemassa uusi, kaspaasi-riippumaton reitti, jota kutsutaan autophagy, joka aktivoituu vasteena kasvutekijän puutteesta tai altistettaessa genotoksisten yhdisteiden [1]. Sekä katsoo, ei ole vielä päästy ulos toiminnallista merkitystä tämän reitin kannalta sen kyky toimia stressivastetta tai todella kuolema efektori mekanismi, viimeaikaiset todisteet näyttää tukevan että autophagy on erikoistunut muoto solukuoleman tietyissä olosuhteissa [ ,,,0],2], [3], [4].

joukossa useita efektorimekanismeja mukana ohjaamiseen ja säätämiseen solukuoleman polkuja, kuten apoptoosin ja autophagy, on solu redox tilan. Redox tila solun määritetään tasapaino määrien tuotannon ja jakautuminen reaktiivisia hapen ja /tai typen lajien (ROS, RNS) [5], kuten superoksidianionia (O

2

-) vetyperoksidia (H

2O

2), hydroksyyli radikaali (OH), typpioksidin (NO) ja hypokloorihapoke (HOCI) [6]. Olemme aiemmin osoittaneet, että kasvainsolun vaste kuoleman ärsykkeiden on funktio solun redox tilan, ja ärsykkeitä, erityisesti kuoleman aiheuttavia yhdisteitä, jotka indusoivat merkittävän solunsisäisen H

2O

2 helpottaa syöttämällä toteutus [7 ], [8], [9], [10] [11], [12], [13], [14], [15].

Mielenkiintoista, ROS on myös esitetty vahvoja signaaleja varten aktivointi mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasin (MAPK) perhe signalointi proteiineja, jotka käsittävät C-jun N-terminaalinen Kinase (JNK), p38 ja ERK [16]. MAPK perheenjäsenet aktivoidaan 3-tier kinaasikaskadin käsittää MAPK-kinaasin kinaasi (MAPKKK), MAPK-kinaasin (MAPKK) ja MAPK [17]. Jatkuva aktivaation JNK on suoraan sidoksissa kasvuun solunsisäisen ROS tuotanto [18], ja mahdollinen mekanismi voitaisiin toteuttaa inaktivaation MAPK fosfataaseja (MKP) [6]. Huomattavaa on, että kasvu solunsisäisen ROS sekä MAPK on osoitettu aikana autophagic suorituksen [19], [20].

Autophagy on hyvin tunnustettu jätehuolto solun, on pääasiassa mukana in takavarikoimista solukalvon ja pitkäikäinen soluelimiin osaksi autophagosomes, joka lopulta fuusioituvat lysosomeihin hajoamista ja ravinteiden kierrätys [21], [22]. Vielä tärkeämpää on, pysyviä autophagy vasteena solun jännitystiloja toimii voimakas syöttämällä signaali [23], [24], [25], kuten tapauksessa hoidon aiheuttama autophagy, erityisen ei-apoptoottisen kuoleman reaktiotien laukeaa, kun altistuminen kemoterapeuttiset yhdisteet [26]. Jälkimmäinen muodostaa perustan tunnistamiseksi tyypin II solukuoleman, tunnettu siitä, että liiallinen autophagosome muodostumisen [27], [28]. Paradoksaalisesti pohjapinta taso autophagy aiheuttamien rasituksia, kuten hypoksia ja kasvutekijä peruuttaminen vihjeitä solun kohtalon kohti selviytymistä [29], [30], [31].

aktivoituminen kanoninen autophagy polku on kriittisesti alla valvonnassa BH-3 vain Bcl-2 vuorovaikutuksessa proteiini, Beclin1 [32]. Erityisesti viimeaikaiset todisteet on unraveled uudenlainen autophagic solukuolemareittiin jossa Beclin1 on täysin tarpeeton. [33] Tämä voi olla ensiarvoisen tärkeää, kun suorituksen kaanoniin autophagy syöpäsoluissa varustetun Beclin1 Knockout fenotyyppi, voisivat edustaa uutta ja tehokas strategia aiheuttaa syöpää solukuoleman [34].

Kirjoittajat raportoivat mekanismin solukuoleman indusoidun ihmisen kasvainsoluissa on uusi pienmolekyyliyhdisteen, 1,3-dibutyyli-2-tio-oksolla,-imidatsolidiini-4,5-dioni (C1). Altistuminen ihmisen kolorektaalisyöpää ja monia muita kasvainten solulinjat C1 johti solukuoleman kanssa morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet vastaavat kaanoniin autophagy ja apoptoosin. Lisäksi korostamme uraauurtava osallistumista varhaisen ROS tuotanto ja ERK ja JNK aktivointi ylävirtaan autophagic ja apoptoottisten reittien. Tämä on uusi tase, jossa samanaikaisesti induktion Beclin1 riippumaton autophagy ja apoptoosin kasvainsoluissa pienimolekyylinen yhdiste, joka voi olla valtava kliinistä merkitystä, kun otetaan huomioon suhteellisen korkea esiintyvyys Beclin1 menetyksen ihmisen syövissä.

materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja kemikaalit

yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, ZVAD-Suomen markkaa, sekä kaspaasi 3 ja 9 estäjät (DEVD-fmk ja VEHD fmk) saatiin Alexis Biochemicals ( Lausen, Sveitsi). JNK-inhibiittori (SP600125), ERK-inhibiittoria (PD98059), naudan katalaasi, Earlen tasapainotettua suolaliuosta (EBSS) väliaineessa, rapamysiini, dietyyliditiokarbamaatti (DDC), E64D, pepstatiini-A, 3-metyyliadeniini, C2-Ceramide, N-asetyyli kysteiini, kristalliviolettia, ja MTT ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Superoksididismutaasi (SOD) hankittiin Calbichem (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa). Tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) saatiin Upstate (Millipore, MA).

tuumorisolulinioissa

HCT116 kolorektaalisyöpää solut jalomielinen lahjoitus tri Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) ja pidettiin McCoyn 5A (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia FBS), 1% L-glutamiinia ja 1% S-penisilliini (Hyclone, Thermo tieteelliset, Waltham, MA) 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2. HeLa kohdunkaulan karsinooma, A549 pienisoluinen keuhkosyöpä, M14 melanooma, SHEP1 ja SHSY5Y neuroblastooma solulinjat saatiin ATCC: stä ja ylläpidettiin DMEM: ssä (Hyclone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. MCF-7, T47D, ja MB-MDA231 rintasyövän solulinjat olivat ATCC: ltä ja viljeltiin RPMI (Hyclone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. HK-6, C666-1 nenänielun sinoomasolulinjoja, lahjakas Dr. Lo Kwok-wai (Kiinan University of Hong Kong) ja Dr. Hsieh Wen-poika (Johns Hopkins Singapore), pidettiin RPMI täydennetty 10% FBS .

transfektio pGFP-rLC3 ja siRNA

lyhytaikaista ekspressiota varten, solut transfektoitiin 8 ug pGFP-LC3 tai pCINeoEV tai pCIneo + Cat plasmidien Optimem1 ™ väliaineessa (Invitrogen Corporation, Carlsbad , CA) käyttämällä Superfect-transfektioreagenssia (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä pudotus geeniekspression, 50 nM siRNA (beclin- 1 siRNA, tai JNK1 /2 siRNA, tai ERK1 /2 siRNA, tai Atg7 siRNA, tai ULK-1 siRNA) transfektoitiin soluihin Optimem1 ™ väliaineessa käyttäen Dharmafect1 reagenssia ( Dharmacon) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Solujen elinkelpoisuus ja kasvaimen pesäkkeitä muodostavien määrityksissä

Solujen elinkelpoisuus seuraavat lääkealtistuksen määritettiin MTT-määrityksellä, kuten on kuvattu aiemmin (14). Sillä pesäkkeitä muodostavien määrityksiä, 10000 solua maljattiin petrimaljoille ja kasvatettiin 2 viikkoa. Sitten levyt värjättiin kristalliviolettiliuoksella (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ja pesäkettä manuaalisesti kuten aiemmin on kuvattu [35].

propidiumjodidivärjäys DNA pirstoutuminen

Solut käsiteltiin C1 varten ilmoitettuina ajankohtina, kuten on kuvattu kuviossa legendoja ennen propidiumjodidivärjäys DNA-sisällön analyysi, kuten on kuvattu aiemmin (14). Histogrammitietoja prosentuaalinen solujen subdiploidisista DNA on esitetty, ja ne ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä havaintoja.

virtaussytometrinen analyysi solunsisäisten ROS

Solut ladattiin 5 umol /l redox-herkkien väriaine 5- (ja-6) -chloromethyl-2-, 7-dichlorofluorescin diasetaatti (Molecular Probes, Invitrogen Corporation), kuten aiemmin on kuvattu (14), ja analysoitiin virtaussytometrialla (Coulter EPICS Elite ESP). Detection sisäisen mitokondrioiden O

2

– suoritettiin lataamalla solut MitoSox ™ RED MITOCHODNRIAL O

2

– INDICATOR (Molecular Probes, Invitrogen Corporation), kuten aikaisemmin on kuvattu ja analysoitiin virtaussytometrillä ( Coulter EPICS Elite ESP). Vähintään 10000 tapahtumien analysoitiin.

eristäminen mitokondrioiden

HCT116-solut käsiteltiin C1 6, 12 ja 24 tunnin alistettiin mitokondrioiden uutto kuten muualla on kuvattu (14). Mitokondrioiden pelletit hajotettiin standardin 1xRIPA lyysipuskuria ja supernatantit käytettiin solulimafraktiot.

Immunofluoresenssianalyysi on pGFP-rLC3 ja akridiinioranssi

analyysi LC3 suoritettiin käyttäen pGFP-rLC3 transfektoiduissa soluissa immunofluoresenssimikroskopialla. Transfektion jälkeen, jossa pGFP tyhjällä vektorilla tai pGFP-rLC3, soluja inkuboitiin C1 6-24 tuntia ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Eclipse TE2000-S, Nikon) käyttäen viritysaallonpituutta 488 nm ja emissio aallonpituudella 525 nm. Visualisointiin lysosomeihin, soluja käsiteltiin 6 tunnin ajan ja värjättiin sitten 2,5 ug /ml akridiinioranssia (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) ja 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja niistä analysoitiin sekä, vihreä ja punainen flurorescence, käyttäen fluoresenssimikroskopiaa kuten edellä on mainittu.

elektronimikroskopialla

Solut kiinnitettiin yön yli 2,5%: glutaraldelhyde 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,2), ennen kuin niitä kiinnitettiin jälkikäteen 1% OsO 4: ssa 1 tunti. Seuraavaksi solut dehydratoidaan etanolisarjassa ja upotettu Spurr n hartsia. Ultra ohuita leikkeitä värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja tarkkailtiin JEOL JEM-1230 transmissioelektronimikroskoopin.

Sytotoksisuusmääritvs primääri solujen lymfooma kudoksista

Ensisijainen kasvainkudoksen potilailta T tai B-solulymfooma saatiin suostuu potilaiden National University Hospital mukaisesti hyväksytyn IRB-protokollaa. Kudokset jauhettu ja kireät läpi MACS erotussuodattimeen (Miltenyi Biotec) saada yksisolususpensioi-. Lymfosyytit on saatu seuraavat Ficoll Hypaque-gradientin läpi sentrifugoimalla. Solujen elinkelpoisuus ensisijainen lymfooma /200 ul /kuoppa 96-kuoppalevyille määritettiin MTT-analyysi altistuksen jälkeen 25 ja 50 ug /ml C1 24 tuntia. MTT-määritys arvioitiin, kuten on kuvattu edellisessä osassa.

Western blot-analyysi

kokosoluproteiinikuviot uutteet eristettiin käyttäen 1X RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl: a , 0,25% deoksikolihappo, 1% NP-40, 1 mM EDTA: a ja proteaasi-inhibiittoreita (Calbiochem, San Diego, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia kokosoluliuotteista (30-120 ug /kaista) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti (10%, 12% tai 15%) polyakryyliamidigeelielektroforeesilla geelit (SDS-PAGE; BioRad Laboratories), siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad Laboratories) käyttäen märkä siirto (BioRad Laboratories), ja blotattiin primaarisilla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä Bax, p62, LC3 , Caspase 9, β-aktiini, GAPDH, ULK1 (Santa Cruz Biotechnology), Beclin1, ATG7, ATG12, ATG5, sytokromi C, JNK, p-JNK, c-Jun, pc-kesäkuu, Bid (Cell Signaling Technology), Kaspaasi 3 (Upstate, Millipore Corporation), kaspaasi 8, Smac, anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasin (BD Pharmingen) ja katalaasi (Calbiochem) ja tutkittiin vastaavan sekundaarisen isotyypin spesifiset vasta-aineet on merkitty piparjuuri-peroksidaasi (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Bound immuno-kompleksit tunnistettiin käyttämällä WEST PICO kemiluminesenssin alustan (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).

synteesi ja analyysi pienmolekyyliyhdisteen C1

pienmolekyyliyhdisteen 1,3- dibutyyli-2-tio-oksolla,-imidatsolidiini-4,5-dioni, jota tässä kutsutaan C1, syntetisoitiin seuraavasti: Oksalyylikloridia lisättiin 1,3-dibutyyli-2-tioureaa (10 mM) vedettömässä eetterissä pyöreäpohjaisessa pulloon sekoittaen. Reaktioseosta sekoitettiin 1-2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa ja sitten se kaadettiin kyllästettyyn NaHCO

3. Tuote uutettiin 3 kertaa etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattikerros pestiin sen jälkeen tislatulla vedellä ja sen jälkeen suolavedellä vettä. Sitten etyyliasetaatti kuivattiin vedettömällä Mg

2SO

4 ja poistettiin alennetussa paineessa. Puhdistus flash-kromatografoimalla (etyyliasetaatti: heksaani), jolloin saatiin keltainen öljy tuotetta. Öljymäinen tuote muuttui kiinteäksi jääkaapissa. Sen jälkeen yhdiste analysoitiin

1H-NMR,

13C-NMR ja MS ja tulokset esitetään seuraavasti:

Nimi: 1,3-dibutyyli-2-tio-oksolla,-imidatsolidiini-4,5-dioni; Väri: Oranssi; FT-IR (CH

2CI

2): 2875-2960 cm

– (Alifaattiset CH), 1770 (C = O), 1410 (C = S);

1H-NMR (CDCI

3): δ = 0,95 9 (t, J = 7,3 Hz, 6H, 4′-CH

3), 1,34 (sekstetti, J = 7,7 Hz, 4H, 3 ’ -CH

2), 1,67 (kvintetti, J = 7,2 Hz, 4H, 2-CH

2) 3,93 (t, J = 7,5 Hz, 4H, 1′-CH

2);

13C-NMR (CHCl

3): δ = 13,54 (C4 ’), 19,90 (C-3’), 29,72 (C-2 ’), 41,83 (C-1’), 155,35 (C- 4,5), 180,63 (C-2); Massa m /z (%): 242 (100) [M

+], 209 (26) [M + -HS], 187 (22); K C

11H

18N

2O

2S laskettu 242,34, Todettu 243,34.

Tuotto: 95%

Statistical analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään 3 kertaa, ellei toisin mainita. Kokeellinen erot testattiin tilastollista merkittävyyttä Studentin

t

-testi.

P

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

C1 indusoi solukuolemaa ja MOMP ihmisen kasvainsoluissa

Altistuminen syöpäsolujen ja kasvavia pitoisuuksia (25-200 ug /ml) C1 johti annoksesta riippuva väheneminen solujen elinkelpoisuuden 24 tuntia LD50 -100 ug /ml (kuvio 1 B). Lisäksi pesäkemuodostusta osoittivat merkittävää vähenemistä klonogeenisten kyky 25 ja 50 ug /ml, ja täydellinen lopettaminen pesäkkeiden muodostumisen 100 ug /ml (kuvio 1 C). Tulokset osoittivat myös, että inkubointi solujen C1 laukaisi mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP) osoituksena translokaatio sytokromi c: ja Smac, ja vastavuoroinen translokaation Bax ja Bid mitokondriot (kuvio 1 D). Lisäksi olemme saatu todisteita käsittelyn tehostamiseksi kaspaasien 3, 8 ja 9, ja lohkaisu kaspaasi 3 substraatin PARP kokosoluliuotteissa soluista seuraavista C1 hoidon, joka pelastettiin läsnä zVAD-fmk (kuvio 1E, F ). Analyysi solusyklin paljasti 20% soluista, joissa subdiploidisista DNA-pitoisuus (sub-G1 väestöstä) seuraavat 24 tuntia hoidon, joka kasvoi merkittävästi (52%) inkuboitaessa 48 tuntia ja estää läsnäollessa yleiseurooppalaisen kaspaasi estäjä (kuvio 1G). Kiehtovan, zVAD vain osittain säädetty suoja muoto C1-solukuolema (kuvio 1 H). Nämä tiedot osoittivat, että C1-solukuolema saattaa liittyä kaspaasi-riippumattomia reittejä. Tutkia, että ensin arvioidaan vaikutuksen kuolion estäjän, necrostatin, C1-solukuolema. Tulokset osoittivat, että vaikka necrostatin voitaisiin tehokkaasti kumota Tuumorinekroositekijä-α-solukuolema (Täydennyskuvio S1A), sillä ei ollut vaikutusta C1-solukuolema, mikä sulkee pois osallistumista kuolion tässä mallissa (kuvio 1 i).

(A) kemiallinen rakenne ja moolimassa yhdistettä C1. (B) Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla C1 (25 ug /ml 100 ug /ml) 18 tunnin ajan, ja solujen eloonjäämistä arvioitiin MTT-määrityksellä. (C) Kun altistuminen C1 kuin (B), 10000-solut ympättiin 100 mm: n petrimaljoille arvioimiseksi pesäkkeiden muodostumisen. (D) Soluja käsiteltiin C1 (100 ug /ml) ja 6, 12 ja 24 tuntia, ja solukomponenttien fraktioille tehtiin Western blot -analyysiä. (E) Lysaatit soluista, käsiteltiin C1 (100 ug /ml) seulottiin jalostukseen kaspaasien 3, 9 ja 8 (F, G, H) Soluja käsiteltiin C1 (100 ug /ml 18 h) läsnäolo tai puuttuminen zVAD-fmk (50 gM) ja 12 ja 24 tuntia ja (F) lysaatit koestettiin PARP lohkominen ja (G) solusyklin profiilit saatiin PI-värjäyksellä ja (H) eloonjäämistä arvioitiin MTT-määrityksellä . (I) Soluja esi-inkuboitiin Necrostatin-1 (50 uM 1 tunnin ajan) ennen altistusta C1 (100 ug /ml 18 h), ja eloonjääminen määritettiin MTT-määrityksellä.

induktio Beclin1 riippumaton autophagy C1

Seuraavaksi elektronimikroskoopilla analyysi solumorfologian suoritettiin altistuksen jälkeen C1. Kiinnostavaa, solujen altistaminen C1 (100 ug /ml 24 tuntia) johti muodostumista autophagosomes ja autophagic onteloita (kuvio 2A). Lisäksi lisääntyneen ekspression MAP1 LC3II (kutsutaan tässä LC3II) havaittiin aika-riippuvaisella tavalla (kuvio 2B). Erityisesti on huomattava, tunnistimme ensimmäistä kertaa LC3II rikastumista raskaan membraanifraktioiden seuraavat lääkehoidon (kuvio 2C). Tämä voi viitata läsnäolo mitokondrioiden hautautumisen jonka autophagic onteloita. Lisäksi solut transfektoitu LC3-GFP näy hajanainen kuvio, kun altistus C1 johti vihreä pistekeratopatiaa värjäys, joka osoittaa LC3II kertymistä sisällä autophagosomal kalvoja (kuvio 2D). Lisäksi merkittävä kasvu ilmentymisen Atg7 ja Atg5 yhdessä vastavuoroisesti väheneminen Atg12 ilmentyminen havaittiin, kun altistus (6-24 tuntia) solujen C1, mikä osoittaa Atg5-Atg12 konjugaatio (kuvio 2E).

(A) HCT116-soluja käsiteltiin C1 (100 ug /ml) 24 tunnin ajan, kiinteät ja tarkasteltiin elektronimikroskoopilla (suurennus x 40000). Nuolet osoittavat läsnäolo autophagosomes. (B) Lysaatit käsiteltyjen solujen C1 (100 ug /ml) seulottiin ja LC3II. (C) Western blotting-analyysi LC3II sisällä sytosolisia ja mitokondrioiden jakeet solujen altistumisen jälkeen C1. (D) Solut transfektoitiin ohimenevästi GFP-vektori tai LC3-GFP: ssa 48 tuntia, altistetaan C1 24 tunnin ajan ja analysoitiin sitten käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Nuolet osoittavat pistemäistä värjäytymistä osoittaa LC3 II yhdistäminen osaksi autophagosomes. (Mag: 40000 x). (E) jälkeen C1 altistuksen solulysaateista koetettiin varten Atg7, Atg5 ja Atg12.

Seuraavaksi tutkitaan, oliko riittävästi autophagic vuon altistuessaan C1. Autophagic flux on ratkaiseva määritettäessä, autophagic lastin ja kokoonpano lopulta saavuttaa lysosomeihin ja on sittemmin huonontunut. Yksi keino määrittää autophagic vuo on esikäsittelyä lysosomaalisissa estäjiä, E64D ja pepstatiini A ennen lisäämistä ärsyke. Lysosomaalinen estäjät lisäävät LC3 II muodostumista, osittain estämällä autophagosomal-lysosomaalisen fuusio. Siksi tutkimme vaikutus lysosomaalisen estoa C1-indusoidun LC3II muodostumista. Tuloksemme osoittivat, että inhibiittorit lisääntynyt LC3II liikevaihdon soluissa varhaisessa ajankohtina (6 tuntia), mutta ei ollut vielä lisääntyisi enää inkubaation (24 tuntia), jossa yhdisteen (Täydennyskuvio S1E). Sitten tarkastetaan, että ilmentymisen taso p62 /SQSTM1, merkkiaine autophagic flux [36]. Tasot p62 laski kun C1 hoito varhaisessa ajankohtina osoitus tehokkaan autophagy, mutta nousivat myöhemmin (12-24 tuntia; Täydennyskuvio S1F), mikä voi johtaa mahdollisuutta poikkeavien autophagic muutostilassa. Jälkimmäinen havainto päätelmää tukevat todisteet lysosomaalisen repeämä, analysoidaan akridiiniorans-, joka fluoresoi punaista happamassa osastoissa kuten lysosomeihin ja vihreä neutraalissa pH. Nostamalla vihreä flurorescence kanssa vastavuoroinen lasku punainen flurorescence havaittiin soluissa altistettaessa C1, joka osoittaa murtumisen lysosomeihin (Täydennyskuvio S1F).

Sen arvioimiseksi roolin Beclin1 C1 aiheuttaman autophagy, RNAi-välitteinen vaiennettu

Beclin1

suoritettiin. Knock alas

Beclin1

eivät estäneet LC3II kertymistä aiheuttama C1 eikä voisi pelastaa soluja kuolemasta liipaisu aktiivisuuden pienmolekyyliyhdisteen (kuvio 3A). Erityisesti

Beclin1

hiljentäminen voisi tehokkaasti kumota seerumistarvaatio aiheuttama LC3II muodostumista, mikä osoittaa klassisen roolia Beclin1 nälkään aiheuttama autophagy (Täydennyskuvio S1C). Toisin kuin

Beclin1

vaiennettu, si

Atg7

aiheutti huomattavan laskun LC3II kertymisen aiheuttama upon C1 valotuksen apoptoottista signaalia (PARP pilkkominen) määrä pysyi ennallaan (kuvio 3B). Yhdessä nämä tiedot osoittavat vahvaa todistetta sille, että altistuminen HCT116-solujen C1 laukaisee ei-kanoninen autophagy, mutta liittyy intermediacy ja ubikitiinipromoottori E1-muistuttavan entsyymin Atg7. Vahvistavia nämä havainnot saatujen tulosten geenin Knockdown n UNC-51 kaltainen kinaasi (ULK1; nisäkkään homologi hiiva Atg1), joka samalla esti LC3II muodostumista tässä mallissa (kuvio 3C). Lisäksi

a priori

solujen käsittely 3-MA (5 tai 10 mM) ei ollut juuri mitään vaikutusta LC3 II kertymistä indusoitiin C1 (kuvio 3D). Tärkeää on, esikäsittely HCT116-solujen ZVAD-fmk kaspaasi 3 estäjän tai kaspaasi 9 estäjä ei muuttanut kertymistä LC3II I aiheuttama C1, mikä osoittaa, että signaalit säätelevät apoptoosin eivät vaikuta autophagic signalointireitin (kuvio 3E). Vielä tärkeämpää on, hiljentämisen Atg7 merkittävästi suojattu HCT116-solut C1-indusoidun väheneminen solujen elinkyvyn, mikä osoittaa, että autophagic signaali voi olla tehokas solujen kuoleman liipaisin (kuvio 3F). Koska Beclin1 ei ollut mukana C1 aiheuttama autophagy, knockdovvn Beclin1 luonnollisesti ei muuttanut solukuolemaa vaste (kuvio 3F). Kuitenkin ULK hiljentäminen ei myöskään ollut merkittävää vaikutusta solukuolemaa (kuvio 3F), mikä puoltavana korvaavien vaikutusten kohdistaman muita näkyviä

Atg

geenejä.

(A), (B) ja (C) Soluja transfektoitiin siRNA: lla vastaan ​​Beclin1 tai ATG7 tai ULK1 48 tuntia, mitä seurasi altistus C1 (100 ug /ml) 24 tuntia. Kokosolulysaateille jälkeen koestettiin LC3II. (D) Soluja esi-inkuboidaan 3-MA (5 tai 10 mM) 1 tunti ennen altistusta 100 ug /ml C1 18 tuntia. Lysaatit Sitten immunologiseen blotattiin anti-LC3. (E) Soluja esikäsiteltiin ZVAD-fmk (50 gM), kaspaasi 3-estäjällä (50 uM) tai kaspaasi-9-inhibiittori (50 uM), ennen kuin lisättiin 100 ug /ml C1 18 tuntia. Lysaatit Sitten immunologiseen blotattiin anti-PARP ja anti-LC3 vasta-aine. (F) transfektoitiin siRNA vastaan ​​Beclin-1 tai Atg7 tai ULK1 ja altistetaan sitten 100 ug /ml C1 18 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-menetelmää kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

osoittaa, että autophagy lisäävä vaikutus tämän pienmolekyyliyhdisteen ei rajoitu kolorektaalikarsinoomasolulinjaa, LC3II muodostuminen oli arvioidaan 9 muissa ihmisen syövän solulinjat vaihtelevaa alkuperää. Todellakin, kasvu LC3II muodostuminen havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa, vaikkakin eri lääkeainepitoisuuksien (kuvio 4A). On huomattava, että samanlainen HCT116-soluissa, nämä solulinjat olivat myös herkkiä apoptoosin induktion C1 (tuloksia ei ole esitetty). Tutkimaan edelleen translationaalisen Näiden tietojen saatujen vakiintuneiden solulinjojen, me seuraavaksi vaikutus testattiin C1 ei-transformoiduissa soluissa (MCF-10A ja MRC riviä) sekä alkusolut saatiin potilailta, joilla lymfoomat. Toisin kuin syöpäsolut, ei-transformoidut solut eivät osoittaneet mitään merkkejä autophagy vastauksena C1 verrattuna HCT116-solut ja MDA-MB-231-soluja (kuvio 4B). Lisäksi edustava näyte potilaalta kliinisiä lymfooma selvästi herättänyt voimakasta LC3II muodostuminen vastauksena lääkeainealtistukseen (kuva 4B). Vielä tärkeämpää on, altistuminen primäärisiä soluja, jotka ovat peräisin lymfooma potilaiden (n = 12) osoitti annoksesta riippuvaa herkkyys C1, kun taas soluja ei-syöpä imusolmukkeet olivat suhteellisen tulenkestävää hoitoon (kuvio 4C). Nämä tiedot selvästi, että pienmolekyyliyhdisteen C1 laukeaa ja solukuolemaa erilaisissa syöpäsolun linjat ja primaarisissa soluissa, säästäen ei-transformoidut solut.

(A) primaariviljelmät lymfooma ja hyvänlaatuisia kudokset oli kasvatettu 6-kuoppalevyillä, ja altistetaan C1 25 ja 50 ug /ml 24 tunnin ajan, ja solujen eloonjäämistä arvioitiin MTT-määrityksellä. (B) Ensisijainen lymfooma-soluja, MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen, MCF10a nisäepiteelisoluissa, HCT116 ja peräsuolen solujen ja MRC-5 ihmisen keuhkon fibroblastit, joita hoidettiin C1 eri annoksilla 18 tuntia. Solulysaatit blir immunologiseen blotattiin anti-LC3 kanssa GAPDH kuin latauskontrollina. (C) kasvainsoluista eri suvusta käsiteltiin eri pitoisuuksilla C1 24 tuntia ja koko solulysaatit koestettiin LC3 II ja β-aktiini.

Solunsisäinen ROS ohjaa C1-indusoidun autophagy ja apoptoosin

Koska selvästi osoitettu kyky C1 samanaikaisesti aiheuttaa autophagy ja apoptoosin syöpäsoluissa, ryhdyimme selvittämään molekyylitason mekanismi (t) taustalla biologista aktiivisuutta. Ensin arvioidaan vaikutus solunsisäiseen ROS tuotantoon käytetään kahta erilaista fluoresoivaa antureista (MITOSOX ™ RED ja CM-DCHF-DA). Todellakin, altistuminen solujen C1 johti merkittävään kasvuun solunsisäisten ROS tuotanto mitattuna H

2O

2-sensitve koetin CM-DCHF-DA sekä lisäämistä sisäisen mitokondrioiden O

2

– tuotanto (kuvio 5A). Pre-inkubointi solujen ROS scavenger N-asetyylikysteiini (NAC; 200 uM) tai H

2O

2 scavenger, katalaasia (7000 yksikköä /ml), täysin tukossa kasvu CM-DCHF-DA fluoresenssi, mikä viittaa vahvasti siihen, että ROS lajista on H

2O

2 (kuvio 5B). Vahvistavia Näiden havaintojen yli-ilmentyminen ihmisen katalaasia havaittiin kumota C1-indusoidun ROS, arvioidaan CM-DCHF-DA värjäytymistä (kuvio 5A). Mielenkiintoista on, että katalaasi esi-inkubaatio sekä ohimenevä yliekspressio plasmidin, joka sisältää ihmisen katalaasia geenin inhiboi myös C1-indusoitua PARP pilkkominen, merkkiaine kaspaasi 3 aktivaation (kuvio 5B). Samanlainen estovaikutus katalaasin (eksogeeninen sekä yli-ilmentymisen) ja NAC havaittiin LC3II kertymistä aiheuttama C1 (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat voimakkaasti syytöstä solunsisäinen H

2O

2 ylävirran ärsyke, joka kontrolloi sekä autophagy ja apoptoosia tässä mallissa.

Kaikkiaan 1 x 10

6 solua inkuboitiin 100 ug /ml C1 3 tuntia ja (Ai) sisäistä mitokondrioiden O

2

– määritettiin käyttämällä fluoresoivaa väriainetta MitoSox ™ RED mitokondrioiden O

2

– Indicator ja solunsisäinen H

2O

2 havaittiin DCHF-DA kuormaus- ja analysoitiin virtaussytometrialla. (Ai) Soluja esi-inkuboitiin katalaasia (7000 yksikköä /ml) tai NAC (200 uM) 1 tunti ennen käsittelyä C1 (100 ug /ml 3 tunnin ajan) ja solunsisäinen H

2O

2 oli määritetään. (AII) Solut transfektoitiin ohimenevästi 8 ug pCINeoEV tai pCIneo + CAT: ssa 48 tuntia (Aiii) ja käsiteltiin C1 (100 ug /ml 3 tunnin ajan) ja solunsisäinen H

2O

2 määritettiin (AII ). Soluja esi-inkuboitiin katalaasia (7000 yksikköä /ml 1 tunnin ajan) tai transfektoitiin ohimenevästi pCINeoEV tai pCIneo + CAT ennen altistumista C1 (100 ug /ml 24 tunnin ajan), ja koko solulysaatit immunoblotattiin ja (B)