Krooninen sairaus

tiivistelmä

3-ulotteinen (3D) kulttuuri malleissa on mahdollista kuroa umpeen kuilu yksikerroksisen soluviljelmissä ja

in vivo

tutkimuksissa. Hyötyä syövän huumeiden löytö 3D-malleja, uusia tekniikoita tarvitaan, jotka mahdollistavat niiden käytön suuren suorituskyvyn (HT) seulonta myöntyväinen muodoissa. Olemme perustaneet miniatyrisoituja 3D viljelymenetelmiä riittävän vahva automatisoitu HT näyttöjä. Olemme hakeneet näitä menetelmiä arvioida herkkyys normaalin ja kasvaimia aiheuttavasta rintojen epiteelisolujen linjat vastaan ​​paneelin onkologialääkkeistä viljeltynä yksittäiskerroksina (2D) ja pallosia (3D). Olemme tunnistaneet kaksi luokkaa yhdisteitä, joilla on etuoikeutettu sytotoksisuus syöpäsoluja yli normaalien solujen viljelyn 3D-pallosia: mikrotubulia kohdistaminen aineita ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) estäjät. Edelleen paranna 3D-malli, superior eriyttäminen EC50 arvot proof-of-concept näytöt saatiin yhteistyössä viljelemällä rintasyövän solujen normaalin ihmisen fibroblastien ja endoteelisolujen. Lisäksi selektiivinen herkkyys syöpäsolujen kohti kemoterapia-havaittiin 3D yhdessä viljelemisen olosuhteissa, pikemminkin kuin 2D-kulttuuri yksisolukerroksissa, korostetaan 3D kulttuureissa. Lopuksi tutkimme oletetun mekanismeja, jotka ohjaavat eri teho näytetään EGFR: n estäjien. Yhteenvetona tutkimuksemme vahvistaa vankka 3D kulttuurin malleja ihmisen solujen HT arvioinnin kasvainsolun-selektiivisiä aineita. Tämä metodologia on odotettavissa antaa hyödyllinen väline tutkimuksen biologisten eroja 2D- ja 3D viljelyolosuhteet HT-muodossa, ja tärkeä perusta uusia syövän huumeiden löytö.

Citation: Howes AL, Richardson RD , Finlay D, Vuori K (2014) 3-ulotteinen kulttuuri Systems Anti-Cancer yhdiste profilointi ja korkean tehon seulomiseen Paljasta Kohonneita EGFR Inhibitor sytotoksisuus verrattuna yksikerrosviljelmän Systems. PLoS ONE 9 (9): e108283. doi: 10,1371 /journal.pone.0108283

Editor: Chryso Kanthou, Sheffieldin yliopisto, Iso-Britannia

vastaanotettu: 01 marraskuu 2013; Hyväksytty: 27 elokuu 2014; Julkaistu 23 syyskuuta 2014

Copyright: © 2014 Howes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Arra avustus (1 RC1 EB011780-01) ”High seulontaan ihmisen 3D pallosia epiteelin, endoteelin ja strooman solut” (Vuori, PI) alkaen HHS-National Institutes of Health-National Institute of Bioimaging ja biotekniikan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat huomata, että yksi tai useampi tekijöistä työskentelee tällä hetkellä kaupallinen yritys (Tanabe Research Laboratories). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

kehittäminen ja hyödyntäminen malli järjestelmien kerrata ihmisen kiinteiden kasvainten arkkitehtuurin ja biologian ovat välttämättömiä parempia ymmärtää patofysiologiassa kasvainsolujen, ja tukiin löytö uusien syöpähoitoihin. Tämän seurauksena on kehitetty vastaamaan mikroympäristössä kiinteitä kasvaimia. 3D sferoidiviljelmiä voi kerrata solu-vuorovaikutuksiin, solu-matriisi vuorovaikutus, ravinteiden ja hapen kaltevuudet, ja solu napaisuus joka puuttuu perinteisistä 2D yksikerrosviljelmässä [1], [2]. 3D viljelmät sisältävät myös heterogeeninen vyöhykkeitä lisääntyvien, lepotilassa, ja kuolevat solut, jotka niin ikään löydetty ihmisen kasvainkudoksessa ja näyttelytila ​​erilaiset herkkyydet anti-kasvaimen hoitojen [1], [3]. Siten 3D soluviljelymalleissa tuovat merkittävää lisäarvoa lääkekehityksen ja kehitysprosessi mahdollisena käytännön siltana perinteisten

in vitro

yksikerrosviljelmissä ja kallis

in vivo

eläinkokeissa [4], [ ,,,0],5], [6].

Nykyinen hoito useimmissa ihmisen syövissä sisältää kemoterapeuttisia aineita, jotka ovat myrkyllisiä vastaan ​​jakautuvia soluja, usein johtanut lukuisiin sivuvaikutuksia. Hyväksyminen molekulaarisesti kohdistettujen hoitojen, kuten proteiinikinaasi-inhibiittorit imatinibi gefitinibi, ja lapatinibi, ovat osoituksena lupauksen, että aineet, jotka on kohdistettu erityisesti syöpäsolujen sijaan kaikki jakautuvien solujen aiheuttaa vähemmän sivuvaikutuksia.

kun sytotoksisuus tutkimukset syöpäsoluja vastaan ​​suoritetaan solut tyypillisesti viljellään yhtenä kerroksena, jossa solu-solu kontakteja ja mikroympäristölle signaalit puuttuvat ja viljelyolosuhteet voivat siis oteta huomioon

in vivo

tilanteessa sytotoksisuus ja /tai lääkeresistenssin. Kiertämiseksi näitä teknisiä kysymyksiä, 3D-viljelmiä muotoutuvat ja analysoidaan monia mielenkiintoisia muotoja [7], [8], [9], ja co-viljelmiä todistaessa arvokkaana järjestelmät ennustamaan lääkevasteita

in vivo

useita eri sairauksia [10], [11], [12]. Tarjouskilpailupyyntö monimutkaisia ​​3D kulttuurin malleja nimenomaan rintasyövän [13] korostetaan, että työn Reid

et al.

Mitata transkription muutosten 3D monotypic kulttuureissa käyttäen suuri pitoisuus kuvantamisen [14], sekä Tutkimuksemme täällä jossa mitataan solujen elinkykyä in high-throughput (HT) myöntyväinen 3D yhteistyötä kulttuurien käyttökelpoisuuden osoittamiseksi 3D yhteistyön kulttuureissa tunnistamiseksi syöpälääkkeitä luotettavalla selektiivisyys kasvainsoluja yli normaalit solut.

Täällä ovat hyödyntäneet muokattu versio monisoluisten sferoidiviljelmiä ”roikkuu drop” tekniikalla [15] ja on optimoitu sen tiheäksi pyöreä-pohjalevyt, jotka on käsitelty hydrogeelien estää solujen kiinnittymistä, joka mahdollistaa muodostumista yksittäinen pallosia toistettavien koko useilla eri ihmisen solutyyppejä. Tarve HT-alistaa malleja syöpätutkimukseen on äskettäin arvioitu [16]. Viidestä näkyvin menetelmiä sellaisten tasaisesti kokoinen pallosia; eli kitosaani hydrogeeli co-kulttuuri, PDMS V-pohja mikrokuoppia, mikrofluidilaitteet, kaksikerroksinen embryonaalisia, ja usean hyvin roikkuvat pisara (tarkistetaan [3] ja [17]), päättelimme, että monen hyvin riippuva pisara malli on kaikkein HT-myöntyväinen johtuen kustannuksia, jotka täyttävät nesteannosteluliiketoiminnan vaatimukset, ja mikä vähemmän ristireaktiivisuutta annetut yhdisteet. Meidän tutkimuksissa me 3d kulttuureissa normaalien ja tuumorigeenisiä rintojen epiteelisolujen sopiva vankka solujen elinkelpoisuuden lukemia pääruutua ja toisen osuman vahvistusta. Pallojen havaittiin myös olla mahdollista perinteisen biokemiallisten ja solujen biologisten menetelmien (esim. Immunoblottaus ja immunovärjäystä), jolloin mekaaniset tutkimukset. Siten, käyttäen samaa kokeellista muotoa, voimme nyt verrata suoraan normaaleihin soluihin kasvainsolujen 3D kulttuuriin.

Tässä tutkimuksessa vertasimme herkkyys normaalin ja kasvaimen rintojen epiteelisolujen linjat 89 kliinisesti merkittäville yhdisteille National Cancer Instituten (NCI) Hyväksytty onkologian Drug Collection (ADC) [18]. Kuten odotettua, havaitsimme merkittävää sytotoksisuutta kohti sekä normaalin ja kasvaimen solulinjojen useita lääkkeitä, mutta myös tunnistettu mikrotubuluksiin kohdistus aineita ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) estäjät, kuten suurten yhdisteiden luokkia, jotka osoittivat etuoikeutettu sytotoksisuutta tuumorisoluja yli normaaleja soluja viljeltiin 3D. Olemme myös 3d yhteistyötä Ihmisen rintasyöpäsolujen epiteelisolujen strooman ja endoteelisolujen ja verrattiin niitä, 3D co-viljelmiä strooman ja endoteelisolujen. ADC kirjastoa seulottiin uudelleen käyttäen näitä co-kulttuureissa, tällä kertaa yli neljää ja tiiviimmän kestävyydestä määritystä. Tulokset näistä proof-of-concept näyttöjä osoitti, että 3D kulttuureissa ja yhteistyö kulttuurit voivat olla arvokkaita työkaluja tunnistaa kliinisesti käyttökelpoisia lääkkeitä, mukaan lukien molekyylirakennetta kohdistetut aineet ovat selektiivisiä kasvainsolujen yli normaaleja soluja, joilla on potentiaalia vähentää haitallisia puolelle -effects todettu usein sytostaattien.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet ja reagenssit

Hyväksytty onkologian Drug Collection (ADC) saatiin National Cancer Institute: n Developmental Therapeutics Program . Kokoelma sisältää 89 huumeet, kaikki yllä 10 mM 100% DMSO. Lisätietoja, katso: https://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/oncology_drugset_explanation.html [18]. Hoechst 33342 ostettiin Invitrogen (H3570), vinblastiini ja vinorelbiinin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ja lapatinibi, gefitinibi, dasatinibi ja Tyrphostin AG1478 LC Labs (Woburn, MA).

solut ja vasta-aineet

MCF-10A-solut, BT-474-soluja, ja ihmisen esinahan fibroblasteja (Hs.58) saatiin ATCC: ltä. MCF-10A-soluja viljeltiin 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 ug /ml hydrokortisonia, 5 ug /ml insuliinia, 5 ng /ml rhEGF, ja penisilliiniä, streptomysiiniä ja glutamiinia (PSG) täydentää. BT-474-soluja viljeltiin RPMI 10% FCS: ää ja ihmisen fibroblasteissa (HFS) viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FCS: ää ja PSG. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin Lonza (Walkersville, MD) ja viljeltiin Lonzan Endothelial Basal Cell Medium (EBM-2), johon on EGM-2 singlequots (CC-3124). CD31-vasta-ainetta (klooni JC70A) saatiin Dako North America, Inc. (Carpinteria, CA) (# M0823) ja käytettiin klo 1:50 laimennuksen, vimentiinin vasta-aine (V2122-11E) US Biological (1:200 laimennus ), The β-aktiini vasta-aineella (klooni AC-40) Sigmalta (1:5000 laimennus IB) ja HER2-vasta-aine (554299) BD Biosciences (1:1000 laimennus). Fosfo-HER2-vasta-ainetta (klooni 6B12) (1:100 laimennus IF, 1:1000 IB), fosfori-EGFR-vasta-aine (klooni D7A5) (1:100 laimennus IF, 1:1000 IB), ja koko EGFR vasta-aine (klooni C74B9) (1:1000 IB) olivat kaikki ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

Soluviljelyolosuhteiden 2D- tai 3D

MCF-10A, BT- 474, ihmisen fibroblasteja tai HUVEC ylläpidettiin yksikerrosviljelyissä mediassa kuvattu edellä. Tuottaa 3D miniatyyri kulttuureissa HTS, solut ympättiin solujen määrä havaittiin johdonmukaisesti yhdeksi tasaisesti pyöreä pallomainen. BT-474-solut ympättiin 3000 solua /kaivo (RPMI + 10% FBS + PSG medium) ja MCF-10A-solujen 1000 solua kuoppaa kohti (50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 ug /ml hydrokortisonia, 5 ng /ml insuliinia, 5 ng /ml rhEGF, PSG) 96-kuoppaisilla pyöreäpohjaisessa ultralow kiinnityslevyt (Corning # 7007). Yli neljäkymmentäkahdeksan tunnin aikana palloset itse koota siemennettyyn solut, yksi pallomainen (ja ~250 mikronia) per kuoppa. Sferoidit yli 200 mikronia, havaittiin olevan hypoksisia soluja sijaitsee sisätilojen sferoidi [käyttämällä detektioreagenssia hypoxyprobe, NPI Inc. (tietoja ei esitetty)]. Elinkelpoisuuden solujen säveltäminen pallojen tarkistettiin käyttäen ATP lukijalaitteen ja solujen havaittiin säilyttää kannattavuus vähintään viiden päivän kuluttua pinnoite ei tarvitse vaihtaa keskipitkällä tai lisätä lisiä. HTS kulttuureissa 2D, yleinen kudosviljelmässä kuorrutettu, tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille (Corning # 3595) käytettiin kasvaa soluja, samalla median ja saman solun pitoisuuksina kuin edellä mainittiin.

co-kulttuureissa 3D trypsinoituja solut laskettiin ja sekoitettiin keskenään kylvetään 96-kuoppaisiin pyöreäpohjaisessa ultralow kiinnityslevyt (Corning # 7007). Kuten legendoja, joko solujen kokonaismäärä pidettiin 3000 solua kuoppaa kohti, tai 3000 BT-474-solut ympättiin yhdessä 1500 HFS ja /tai HUVEC. Kuten me havaittu monotypic pallosia, co-viljelmät myös spontaanisti muodostunut yksi sferoidiviljelmiä kuoppaa kohti on 48-tunnin itämisaika. Analysoimalla ATP-tasot, yhdessä viljelemisen palloset olivat elinkelpoisia 5 päivää ilman keskipitkän muuttaminen tai täydentää. Kaikki yhteistyössä viljelmiä säilytetään 01:01:01 sekoitus RPMI: DMEM: EGM-2 täydellistä media. 2D co-viljelmiä maljattiin samassa suhteessa solujen saman sekoitettu väliaine, mutta tasapohjaisille 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Corning # 3595). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, 2D- tai 3D-soluja käytettiin -sytotoksisuusmäärityksiä seulonta tai immunovärjäytyminen, kuten on kuvattu myöhemmin Methods osissa.

Sytotoksisuusmääritvs

Solut maljattiin, kuten on kuvattu 2D tai 3D-kulttuuri, ja sitten käsiteltiin yhdisteillä on osoitettu pitoisuus 48 tuntia. Kvantifioimiseksi solujen ATP elävyyden, 50 ui CellTiter GLO-reagenssia (Promega) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä orbitaalisesti ravisteltiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa helpottaa hajoamista. Lisäksi sferoidit trituroitiin kuusi kertaa edistää täydellisen tuhoutumisen. No sisältö siirrettiin valkoisen pohja 96-kuoppalevylle ja luetaan Bio-Tek luminenssi -levylukijalla.

Immunofluoresenssianalyysi pallomaisten osien

Pallot vahvistettu 1 tunti sinkki formaliini , pestiin PBS: ssä, ja sitten jäädytettiin OCT (Takeda) varten kryostaatilla. Kymmenen mikronin leikkeitä kiinnitettiin objektilaseille ja värjättiin sopivan primaarisen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kolmen perusteellisen pesun 1X TBS + 0,2% Tween-20, levyt inkuboitiin anti-hiiri-Alexa 488 (Invitrogen) on 1:500 laimennus, anti-kani-Alexa 594 (Invitrogen) on 1:750 laimentaminen ja Hoechst 33342 on 1:10,000 laimennus 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Levyt pestiin ja asentaa Vectashield (Vector Laboratories).

Mikroskopia ja 3d

Brightfield tai loisteputki kuvia (10X) saatiin AI Observer Zeiss mikroskooppi Photometrics Coolsnap HQ

2camera. Konfokaaliset (BD CARVII) optisen leikkauksen suoritettiin z-sarjan jää 4 mikronia vaiheet, ja sen jälkeen niille 3D dekonvoluutiolla kautta Autoquant (Media Cybernetics) ohjelmistoja, ja visualisoida Metamorph 4D katsoja (MDS Analytical Tech).

Screening protokollat ​​

Hyväksytty syöpätautien Drug Collection saatu National Cancer Institute käytettiin näytöissä. Yhden keskitinpisteeseen pääruutua, BT-474-solut ympättiin 3000 solua /kaivo (RPMI + 10% FBS + PSG medium) ja MCF-10A solut 1000 solua kuoppaa kohti (50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 5 ng /ml insuliinia, 5 ng /ml rhEGF, PSG) 96-kuoppaisille Corning # 3595 (2D) tai Corning # 7007 (3D) levyjä. Laimennus levyt tehtiin laimentamalla yhdisteet 1:01 50% keski /50% DMSO: ta, jolloin saatiin lopullinen pitoisuus 5 uM per kuoppa. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia maljaamisen jälkeen soluja käsiteltiin kirjaston yhdisteitä. Seuraavat 48 tuntia yhdisteen inkuboinnin jälkeen solut lyysattiin 50 ui CellTiterGLO (Promega) reagenssi 15 minuutin orbital ravistamalla huoneenlämpötilassa. 75 ui liuosta siirrettiin Greiner Lumitrac levyt ja luetaan BioTek luminenssi -levylukijalla.

Yhdessä viljelemisen näytöt, sarjalaimennos seulontakokeista käytettiin. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 1500 HF + 1500 HUVEC solua kuoppaa kohti ihmisen fibroblastien ja ihmisen endoteelisolujen (HF + HE) co-viljelmät (EGM-2 täydelliseen alustaan), tai 750 HF + 750 HUVEC + 1500 BT-474 BT-474 + HF + HE co-viljelmät (in 01:01 RPMI + 10% FBS + PSG: EGM-2 täydelliseen alustaan). Solut ympätään Corning # 7007 pyöreäpohjaiseen, ultra-low kiinnityslevyt muodostivat yhden 3D sferoidin kuoppaa kohti, kun taas solut siemennettiin Corning # 3595 tasainen pohja, kudosviljelmän saaneista levyt kiinnitetään 2D yksikerroksisen. Seuraavat 48 tunnin inkuboinnin jotta pallomainen muodostumisen tai solun kiinnitys, soluja käsiteltiin käyttäen STAR nestekäsittelijää 1 ui yhdistettä. Tässä Hyväksytty onkologian Drug Collection käytettiin valmistettaessa master levyjen kautta laimentamalla DMSO käyttäen STAR nestekäsittelijää 10 mm, 1 mm, 100 uM, ja 10gM varastossa levyjen hoitoon solujen neljällä eri lopulliset pitoisuudet (100 uM, 10 uM, 1 uM ja 0,1 uM). Lapatinibia lisättiin kutakin laimennosta levy positiivisena kontrollina, jolloin saadaan lopullinen, ja pitoisuudet 10 uM, 1 uM, 0,1 uM ja 0,01 uM. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia myöhemmin 50 ui CellTiterGLO (Promega) reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan käyttämällä Multidrop Combi. Levyjä heiluteltiin 15 minuuttia edistää solujen hajoamista. Sferoidiviljelmiä hajoaminen edesauttoi sekoittamalla 100 ui äänenvoimakkuutta STAR nestekäsittelijää, ja sitten 75 ui siirrettiin Greiner Lumitrac 96-kuoppaiselle levylle luminesenssi käsittelyssä PE Kuvitella -levylukijalla. Sillä yksikerroksista levyt, 75 pl siirrettiin Greiner Lumitrac levyjen kuoppaa kohden, ja myös lukea PE Kuvitella.

Tulokset ja keskustelu

seulonta 3D kulttuurien paljastaa kasvainsolun selektiivisyys tiettyjen lääkeryhmien

sen määrittämiseksi, onko ihmisen soluja kasvatetaan 3D kulttuurin tarjotaan hyötyä yli 2D viljelmiä tunnistamiseksi kasvaimen vastaisen yhdisteet suurempi selektiivisyys kasvainsoluja kuin normaalit ihmisen solut, me optimoitu edellytykset kasvaa ja näytön rintaepiteelin solut kahdessa eri monen hyvin muodoissa. Muodostaa 3D-palloset, 96-U-pohjaisen ultra-low kiinnityslevyyn käytettiin. Tämä kannustaa soluja lisättiin kuhunkin kuoppaan aggregoitua yhteen ja muodostavat yhden pallomaista, koska he eivät voi tarttua hyvin pinnat (kuvio 1A). 2D-yksisolukerrokset kasvatettiin tyypillinen kudosviljelmässä-käsitelty, tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille (kuvio 1 B). Tärkeää on, että rintasyövän epiteelisolut (BT-474) ja ei-transformoitujen rintojen epiteelisolujen (MCF-10A) käsiteltiin ja asettaa samalla tavalla kaksi erilaista monen hyvin formaatteja, minimoi muista muuttujista, jotka voivat vaikuttaa lääkkeen tehoon. Solut maljattiin, käsiteltiin 48 tuntia myöhemmin lopullinen konsentraatio 5 uM yhdistettä (NCI: n Hyväksytty onkologian Drug Collection kirjasto), ja niistä määritettiin ATP-pitoisuus vielä 48 tuntia myöhemmin (kuvio 1C). 48 h ajankohtana seuraava pinnoitus valittiin perustuu tarvittava aika sferoideina muodostamiseksi ja saavuttaa toistettavissa tiiviyttä (perustuen sferoidiviljelmiä halkaisija) kussakin kuopassa. 48 tunnin kohdalla seuraava lääkehoitoa todettiin optimaalinen aika tarkkailla lääkkeen aiheuttamista solukuolemaa, kuten keskipitkän muutokset lisätä kustannuksella HT määrityksiä ja pidempään inkuboinnit johti käsittelemättömissä soluissa näytteille solukuoleman johtuu sammumiseen väliaineen ravinteita ja kertyminen jätteitä.

, yksi pallojakaantuminen kuoppaa kohti muodostettiin 96-pyöreäpohjaisessa ultra-low kiinnityslevyjä. Brightfield micrographs tyypillisistä BT-474 ja MCF-10A pallosia näkyvät 48 tunnin kuluttua pinnoitus,

baari,

200 mikronia. B, 2D yksikerrosviljelyissä asetettiin käyttäen samaa solujen määrä kuin pyöreäpohjaisessa levyille (3000 solua /kuoppa BT-474 tai 1000 solua /kuoppa MCF-10A) in tasainen pohja, kudosviljelmän päällystetty 96-kuoppalevyille . Fluoresenssi kuvia näytetään tyypillisiä BT-474 ja MCF-10A monolayers 48 tunnin kuluttua pinnoitus, värjättiin aktiini (punainen) ja DNA (sininen),

baari

, 200 mikronia. C, kaavamaisen näytön suunnittelu.

Ensimmäiset tulokset tästä proof-of-concept näytön analysoitiin vertaamalla yhdisteitä, jotka tuottivat positiivisen ”osuma” (määritellään vähentämällä ATP pitoisuus 50% tai enemmän kuin vehikkelillä käsiteltyihin soluihin) BT-474 kasvaimen solut verrattuna MCF-10A-soluja. Kuten olisi odotettavissa yhdisteille tunnettujen cytotoxicities, osumatarkkuus oli korkea sekä solulinjoissa, jossa 29% ja 25% yhdisteiden havaittiin olevan osumat BT-474 ja MCF-10A-soluissa, vastaavasti, 2D, 3D tai molempia viljelyolosuhteet. Vertaamalla yhdisteiden tunnistettu osuu kaksi erilaista solulinjaa ainakin yksi viljelyolosuhteissa oli muutamia yhdisteitä, jotka näyttivät olevan selektiivinen BT-474-solut yli MCF-10A-soluja (tietoja ei esitetty). Kuitenkin, kuten 3D-viljelyolosuhteet ennakoidaan paremmin vastaamaan kasvain arkkitehtuuri, keskityimme niitä yhdisteitä, jotka olivat osumia alla sekä 2D- että 3D-viljelyolosuhteet kasvainsoluissa, mutta vain 2D viljelyolosuhteissa normaaleissa soluissa, mikä viittaa etuoikeutettu vaikutuksia kasvainsoluihin 3D kulttuureissa. Nämä osumia mukana molecularly kohdennettuja yhdisteitä EGF-reseptoreita, kuten gefitinibi ja lapatinibi ja laajakirjoinen estäjä dasatinibia.

annosvastekokeissa suoritettiin tämän jälkeen tulosten varmistamiseksi ensisijaisen näytön ja tunnistaa EC50-arvot konsentraatio, jossa yhdiste vähentää solujen elinkelpoisuuden 50%, valitun yhdisteiden kunkin solutyypin viljeltiin 2D- ja 3D (taulukko 1, kuvio 2). MCF-10A-soluja, tulokset ensiölajittimen vahvistettiin varten lapatinibi, gefitinibi, ja dasatinibi (taulukko 1, kuvio 1A); alle 3D olosuhteissa, MCF-10A solut olivat kovin herkkä näiden yhdisteiden (EC50 5 uM). MCF-10A soluja kasvatettiin 2D yksittäiskerroksina puolestaan ​​osoittivat EC 50-arvojen alle 5 uM käsittelyn jälkeen lapatinibille tai dasatinibille. Kuten ensiölajittimen, BT-474-solut osoittivat, herkkyys (EC50 10 uM) molemmissa viljelyolosuhteissa näille yhdisteille (taulukko 1, kuvio 2A), ja siten selektiivisyys BT-474-solut yli MCF-10A-soluja havaittiin alle 3D viljelyolosuhteissa, jossa EC50-arvo lapatinib 1 uM BT-474 soluja ja 9,8 uM MCF-10A-solut (taulukko 1). Lasketut EC50-arvot gefitinibin ja Dasatinibin olivat hieman yli 5 uM (6-8 uM), joka voi johtua eri lähteestä käytettävien yhdisteiden uudistettuun annosvasteen analyysit verrattuna ensisijaisen näytön (NCI: n ADC kirjasto vs. LC Labs; NCI kirjasto muoto mahdollistaa yhdisteen käytön alustavaan seulontaan vain).

, konsentraatiovastekäyrät kertyi BT-474 tai MCF-10A soluissa asettaa ja käsiteltiin kolmesti lapatinibi gefitinibi tai dasatinibi kuvatulla materiaalit ja menetelmät, ja prosenttia elinkelpoisuus laskettiin luminesenssi lukemien edustaa ATP sisältöä ja normalisoidaan apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluissa. B, konsentraatiovastekäyrät kertyi BT-474 tai MCF-10A soluissa asettaa ja käsitelty kolmena kappaleena vinblastiiniin tai vinorelbiinin. Kaikki käyrät ovat edustavia tietoja ainakin kahdesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Microtubule kohdentamisaineita ”vinblastiini ja vinorelbiini oli myös saivat positiivisina” osumia ”meidän ensisijainen näyttö, mikä osoittaa lievää selektiivisyys BT-474-solut yli MCF-10A soluilla 3D viljelyolosuhteissa. Saadut tulokset vinblastiiniin ja vinorelbiinin ensisijaisessa näytössä ei helposti vahvistettu annos-vaste tutkimukset ovat kuitenkin (taulukko 1, kuvio 2B). Vaikka vinblastiini teki osoittamaan enemmän selektiivisyys BT-474-solut, varsinkin kun viljellään 3D kulttuureissa EC50-arvot havaitsimme olivat kaikki 5 uM (taulukko 1, kuvio 2B, vasen paneeli). Kun pitoisuus-vaste-kokeita, vinorelbiini oli todellakin osuman BT-474-soluissa, mutta ei MCF-10A-soluja viljeltiin 3D (taulukko 1, kuvio 2B, oikea paneeli). Kuitenkin alle 2D viljelyolosuhteissa, havaitsimme EC50-arvot alle 5 uM molemmissa solulinjoissa vaikka emme tunnistaa vinorelbiini kuin ”osuma” MCF-10A solujen ensisijainen näyttö. Selvittääkseen, poikkeavuuksia johtuu läpäiseväksi kysymyksistä, ovat myös vahvistaneet, että pienet fluoresoivan väriaineen molekyylit, ja samankokoisia monet lääkkeet, voi todellakin tunkeutua pallomainen ydin (tuloksia ei ole esitetty).

Yhdessä meidän tutkimukset osoittavat, että on mahdollista tunnistaa kasvaimeen selektiivisiä yhdisteitä soveltamalla strategiaa, joka hyödyntää tietoa sekä 2D- että 3D-sytotoksisuutta näyttöjä. Johtuen siitä, että proof-of-concept-tutkimus koskee kirjasto, joka koostuu tunnettujen bioaktiivisia yhdisteitä, havaitut erot herkkyys normaalin ja syövän epiteelisolujen ei välttämättä ole riittävän suuri varmistamaan ne olisivat käyttökelpoisia HTS ympäristössä. Puolueeton näyttö, jossa on suurempi pienimolekyylinen kirjasto todennäköisesti tuottavat erilaisia ​​ja mahdollisesti enemmän informatiivinen tuloksia. Myös ja osoituksena meidän seurantatutkimuksissa, perinteinen HTS jossa testataan yhdisteiden yhdellä pitoisuudella voidaan rasittaa vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia ja vaatii laajaa seurantaa testaus. Uusi paradigma, kvantitatiivinen HTS (qHTS), generoi konsentraatiovastekäyrät koeyhdisteiden yhdessä kokeessa ja todennäköisesti lievittää näitä kysymyksiä ja se voisi olla menetelmä valinta pikaseulontatesti uusien syöpälääkkeen yhdisteistä [19].

Co-kulttuuri malleja normaalien vs. syöpäsolujen näytteille erilaisia ​​lääkeherkkyyksiä 3D vs. 2D

Parantaakseen kun meidän seulontamenetelmiä, etsimme onko ihmisen syöpäsoluja viljeltiin 3D co -cultures tukevat solujen, kuten fibroblastien ja endoteelisolujen voisi osoittautua hyödylliseksi Tunnistus kohdennettua (ja yleensä vähemmän myrkyllisiä) yhdisteitä. Oletimme, että viljellään yhdessä kasvainsolujen fibroblastien ja endoteelisolujen voi vaikuttaa mikroympäristön 3D kulttuurin ja siten vaikuttaa lääkeaineen herkkyys. Kasvaimen mikroympäris-, mukaan lukien strooman tekijöistä, kuten fibroblastien ja endoteelisolujen, on tärkeä rooli tuumorin etenemisessä ja etäpesäkkeiden muodostumisen [20]. Normaalissa kudoksessa, epiteelisoluja erillään strooman vuorovaikutuksella tyvikalvon. Vuonna yhteistyössä kulttuureissa kuvattu, BT-474-solujen vuorovaikutuksessa suoraan fibroblastien ja endoteelisolujen, kuten voidaan havaita kehittyneen rintasyöpiä kuten invasiivisia duktaalikarsinooma [6], ja nämä kulttuuri järjestelmät voivat siis paremmin jäljitellä kasvain microenvironment kehittyneitä syöpiä . Monet tutkijat käyttävät laminiinin-rikas tyvikalvon uutettu Engelbreth-Holm-Swarm hiiren sarkooma (matrigeelin) edistää solujen kasvua 3D [3], [5] tai ksenograftimalleissa, mutta kustannuksella tämän reagenssin voisi olla kohtuuttomia HT-näytön ja saattavat häiritä tiettyjä määritystä readouts. Niinpä meidän malli, joka hyödyntää ihmisen fibroblastit ja endoteelisolujen kasvun tukemiseksi kasvaimen epiteelisolujen 3D kehitettiin kustannustehokas ja käytännöllinen vaihtoehto.

Hyödynsimme mallimme järjestelmä verrata co-viljelmiä sisältävä kasvain solut yhteistyöhön viljelmät puuttuu syöpäsoluja. BT-474-solulinja oli viljellään yhdessä 2D- tai 3D (kuvio 3A, ylhäällä vasemmalla ja oikealla, vastaavasti) normaalilla ihmisen fibroblasteja ja normaalin ihmisen endoteelisolujen (BT-474 + HF + HE). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että yhdessä viljelemisen aikana 3D, solutyypeissä toistuvasti itse koottavaksi rakenne, jossa BT-474 kasvainsolujen ympäröi ytimen fibroblastien ja endoteelisolujen. Nämä kasvain-solu, joka sisältää co-viljelmiä verrattiin 2D- tai 3D-(kuvio 3A, alhaalla vasemmalla ja oikealla, vastaavasti) co-viljelmissä, jotka sisälsivät vain normaaleja ihmisen fibroblasteissa ja endoteelisoluissa (HF + HE). CD31-positiivisten endoteelisolujen esiintynyt alus muodostelmia HF + HE kulttuureissa samanlainen kuin mitä on aiemmin raportoitu 3D yhdessä viljelemisen iholle fibroblasteja ja HUVEC [21].

, immunofluoresenssivasta kuvia kiinteä ja värjätään 2D (vasemmanpuoleiset paneelit) ja kiinteä, leikattuna ja värjätään 3D (oikea paneeli) co-viljelmät värjättiin endoteelisolumarkkeri CD31 (vihreä), fibroblastien runsaasti proteiinia vimentiinista (punainen), ja kaikki solujen ytimet (sininen),

baareja,

200 mikronia. Alkuun kaikkein paneelit ovat BT-474 + HF + HE yhteistyötä, kylvetään 1500 BT-474 + 750 fibroblastit + 750 endoteelisolujen kuoppaa kohti. Pohja paneelit ovat HF ​​+ HE yhteistyötä, kylvetään 750 fibroblastien + 750 endoteelisolujen. B, kaavamaisen neljän pitoisuuden seulomisprotokolla BT-474 + HF + HE ja HF + HE viljeltyjen solujen 3D- tai 2D. C, Z ’arvot tuotetaan yhdestä tai kahdesta 96-kuoppalevyille set, inkuboida ja käsitellään kuten on kuvattu ruudulla 2D BT-474 + HF + HE soluja (ylhäällä vasen paneeli), 2D HF + HE soluja (ylhäällä oikealla paneeli), 3D BT-474 + HF + HE soluja (alhaalla vasemmalla paneeli), 3D-HF + HE soluja (alhaalla oikealla paneeli).

näyttö BT-474 + HF + HE ja HF + HE viljelmistä tehtiin yli neljä eri pitoisuutta NCI: n ADC-kirjaston, jolloin lopullinen-kuoppaisilla pitoisuudet 100, 10, 1 ja 0,1 uM (kuvio 3B). Koska suuri määrä 96-kuoppalevyillä tarvitaan seuloa neljällä eri pitoisuuksilla, enemmän automaatiota käytettiin kuin edellisenä näytön monotypic BT-474 ja MCF-10A soluviljelmissä. Sen varmistamiseksi, että määritys oli riittävän vahva puoliautomaattinen seulonta, Z ’arvot laskettiin sekä yhdessä viljelemisen olosuhteissa 2D ja 3D kvantitoimiseksi tilastollinen toistettavuus määrityksen perusteella keinoja maksimaalisen ja minimaalinen vastaanotettujen signaalien kukin hyvin useiden levyjen. Tämä standardi Laskenta suoritetaan sen varmistamiseksi, että jokainen hyvin antaa pois samanlainen ulostulo (kemiluminesenssin osoittaa ATP sisältöä ja siten kannattavuus Tämä näyttö) siten, että kun yhdisteitä lisätään, laskua kemiluminesenssin on todennäköisesti seurausta yhdisteiden vaikutus solujen elinkelpoisuus eikä vain vaihtelua yksittäisissä kuopissa. Havaitsimme Z ’arvo on suurempi kuin 0,7 kaikissa yhdessä viljelemisen olosuhteissa (kuvio 3C), mikä osoittaa erinomaisen suorituskyvyn korkean seulontaan.

Tulokset Yhdessä viljelemisen näytön analysoitiin käyttämällä kaksi- porrastettua lähestymistapaa. Ensimmäinen, osumia määriteltiin yhdisteet saadaan 50% elinkelpoisuuden tahansa neljästä testattujen pitoisuuksien, missä tahansa viljelyolosuhteissa. Tällaisen alhaisen tiukkuuden, 57 89 yhdisteiden havaittiin kuin ”osumia” ensisijaisessa näytössä (tuloksia ei esitetty); jälleen ymmärrettävä tulos luonteen perusteella kirjaston. Toinen, pitoisuus-vaste-käyrät muodostettiin kullekin yhdisteelle kunkin kulttuurin kunnossa, ja EC50-arvot jaettiin tarvittaessa. Me louhitaan EC50 tiedot yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka osoittivat suuremman toksisuuden kohti syöpäsolu co-viljelmät (BT-474 + HF + HE) kuin normaalien solujen yhteisviljelmissä (HF + HE), kun viljellään 3D, jossa perustelut, että pitkän aikavälin tavoitteena on käyttää näitä viljelmiä tunnistaa uusia syöpähoidoissa selektiivisten myrkyllisyys kohti kasvainkudoksen, säästäen normaalia kudosta. Kaksitoista yhdisteet osoittivat suurempaa selektiivisyyttä 3D BT-474 + HF + HE soluja kuin 3D-HF + HE-soluja (taulukko 2), mukaan lukien, jälleen kerran, useita yhdisteitä, jotka kohdistuvat reseptorityrosiinikinaaseja tai mikrotubulusten.

seurannut ensisijainen yhteistyössä kulttuuri näytön toissijainen pitoisuus-vastemääritystä vahvistaa kaksitoista osumia taulukossa 2. yhdisteet poimittiin master kirjastosta levyt valmis näyttö, ja käyttää suorittamaan pitoisuus-vaste-kokeet saman ajan kurssin (48 tunnin hoidon). Mikrotubuleihin kohdistaminen yhdisteitä esillä melko tasainen käyrä yli testatut pitoisuudet, mutta suhteellinen teho lääkkeiden erilaisista yhteistyöhön kulttuureissa varmistettiin toissijaisessa määrityksissä (kuvio 4). [25].