Krooninen sairaus

tiivistelmä

aiemmin osoitti, että L-arginiini (Arg) kertyy peräsuolen syöpä kudoksiin. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mekanismia, jolla Arg kertyy ja määrittää sen biologista merkitystä. Pitoisuus Arg ja sitrulliini (Cit) seerumeissa ja kasvaimen kudoksia peräsuolen syöpä (CRC) potilaat analysoitiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC). Ilmentyminen Arg kuljettajat analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR (qRT-PCR) ja immunohistokemiallista analyysiä kudoksen microarray. Meillä on myös transfektoitu paksusuolen syövän solulinja HCT-116 siRNA spesifisiä Arg transporter CAT-1 ja mitataan apoptoosin induktion virtaussytometrialla ja soluproliferaatiota MTT-määrityksellä. Yhdenmukainen aiempien tulosten, seerumin Arg ja Cit pitoisuudet kolorektaalisyövässä potilaat olivat merkitsevästi alhaisempia kuin terveillä vapaaehtoisilla, kun taas Arg ja Cit pitoisuudet kolorektaalisyövässä kudoksissa olivat huomattavasti korkeammat kuin Hyväksytty viereisten normaalissa paksusuolen kudoksiin. Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että

CAT-1

geeni erittäin yli-ilmentynyt 70,5% paksusuolen syövän kudosnäytteiden suhteessa viereisiin normaaliin paksusuolen kudokset kaikissa 122 potilailla, joilla peräsuolen syöpä. Immunohistokemiallinen analyysi kudos mikrosirun vahvisti, että ilmaus CAT-1 oli suurempi kaikilla 25 kolorektaalisyövässä testatuissa kudoksissa. CAT-1 siRNA merkittävästi indusoi apoptoosin HCT-116-solujen ja myöhemmin esti solun kasvua 20-50%. Tuloksemme osoittavat, että kertyminen L-Arg ja Cit ja solujen kasvua peräsuolen syöpä kudoksiin liittyy yli-ilmentyminen Arg kuljettajan geeni CAT-1. Tuloksemme voi olla hyötyä kehittämiseen molekyyli diagnostiset välineet ja täsmähoitoihin paksusuolisyövän.

Citation: Lu Y, Wang W, Wang J, Yang C, Mao H, Fu X, et al. (2013) yli-ilmentyminen arginiini Transporter CAT-1 liittyy kertyminen L-arginiini ja Cell Growth in Human peräsuolen syövän Tissue. PLoS ONE 8 (9): e73866. doi: 10,1371 /journal.pone.0073866

Editor: Joao P.B. Viola, National Cancer Institute (INCA), Brasilia

vastaanotettu: 20 tammikuu 2013; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2013; Julkaistu: 06 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (81172157) ja Bingguan Chen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa ja Kiinassa parannuksista huolimatta hoidossa usean viime vuoden ajan [1], [2]. Hoitovaihtoehdot CRC kuuluvat leikkaus, kemoterapia, sädehoito, ja kohdennettuja hoitoja, joista leikkaus on edelleen tehokkain. Kuitenkin, vaikka kokonaisvaltainen hoito ennuste on edelleen huono potilaille, joilla on Dukes vaiheessa D sairaus, joiden kokonaispituus 5 vuoden pysyvyys 6,6% -11,9%. Jossa on parannettu ymmärtäminen molekyyli patologian syövän, äskettäin kehitetty täsmähoitoihin yhdistettynä 5-FU ja oksaliplatiinipohjaisen kemoterapia on osoittanut parantunut tulos metastaattisessa CRC (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) potilasta. Kuitenkin vain noin 20% metastasoitunutta kolorektaalisyöpää tapauksista vastaamaan nykyisiin täsmähoitoihin vaihtoehdot [3].

Hyväksytty suunnattu terapeuttisia reagensseja käytettäväksi metastasoituneen kolorektaalisyövän kuuluu Bevasitsumabi (Avastin ™, Genentech /Roche, CA, USA), joka on monoklonaalinen vasta-aine suunnattu verisuonten endoteelin kasvutekijää (VEGF) ja setuksimabi (Erbitux ™, Imclone Systems, NJ, USA) tai panitumumabipitoisuus (Vectibix ™, Amgen, CA, USA), monoklonaalisia vasta-aineita suunnattu epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR). Tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten erlotinibi ja gefitinibin, ovat toinen luokka reagenssien suunnattu EGFR. Bevasitsumabi on yleisesti käytetty yhdessä standardin kemoterapia-aineiden (esim. 5-FU) ensimmäisenä hoitona potilaille metastasoituneen kolorektaalisyövän ja parantaa eloonjäämisaste näistä potilaista noin 5 kuukautta. Kuitenkin haittavaikutuksia, kuten kohonnut verenpaine, ruokahaluttomuus, proteinuria, ja ruoansulatuskanavan puhkeama on rajoitettu sen soveltaminen joissakin tapauksissa. EGFR osallistuu suoraan solujen lisääntymisen ja metastasointiin molemmista RAS /RAF /MAPK ja fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) signalointireittejä. Vaikutus anti-EGFR-hoidon riippuu siitä, onko kasvain on KRAS mutaatio; EGFR hoito ei tehoa potilaille, joilla on mutaatio kodonissa 12 tai 13 KRAS. Siksi paljon vaivaa on käynnissä tutkia biomarkkereita CRC ja kehittää uusia hoitoja lisäämiseksi 5 vuoden pysyvyys ja parantaa yleistä elämänlaatua potilailla, joilla on tämä tauti [1].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet kohonneet polyamiinien ja muuttuneen tasot nopeutta rajoittavan entsyymien mukana sekä biosynteesiin ja hajoamista paksusuolen syövän ja useita muita syöpiä. On näyttöä siitä, että kasvaimen kasvu ehdottomasti edellyttää polyamiinien syövän solujen lisääntymisen [4], joten polyamiini reitin tunnustetaan järkevä tavoite kemopreventiolle ja kemoterapia-[4], [5], [6]. Polyamiinit valmistetaan toiminnan ornitiinidekarboksylaasin (ODC) on ornitiini, joka on tuotettu kataboliaa L-arginiini (Arg), jonka arginases, jotka yli-ilmentyvät syöpäsoluissa [4], [7], [8]. Tämän mukaisesti biosynteesipolun, useita rivejä todisteita ovat osoittaneet, että Arg on välttämätön syövän kehittymisen ja etenemisen [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Molemmat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat osoittaneet, että Arg vaaditaan syövän solujen lisääntymistä, varsinkin kun omien Arg synteesi on edennyt, koska puutteellinen arginiinimeripihkahapposyntetaasi (ASS) lauseke [10], [11], [12], [13]. Kasvaimen huolto syöpäsoluja yli-ilmentävät entsyymin endoteelin typpioksidisyntetaasin (eNOS), joka kuluttaa suuria määriä Arg [15], [16]. Koska huomattavasti nopeuttaa Arg aineenvaihduntaa syöpäsoluissa, Arg puutteesta hoito on kehitetty hoitamaan syöpiä, jotka ovat ASS negatiivisia, kuten maksan karsinooma, munuaissolukarsinooma, ja eturauhassyövän [10], [11], [12], [13 ].

Kun Arg on katabolisoitua NOS, co-tuote NO-reitin, Cit, voidaan kierrättää ASS ja arginiinimeripihkahappolyaasi (ASL) syntetisoimaan Arg endogeenisesti kautta Citrulline-NO tai arginiini-sitrulliini polku [17], [18], [19]. Vaikka synteesi Arg alkaen Cit tapahtuu alhaisella tasolla monissa soluissa, solunsisäinen Arg synteesi voi merkittävästi lisätä tietyin fysiologinen tai patologinen olosuhteista, jotka vaikuttavat homeostaasiin verenkierron tai solunsisäisten Arg ja Cit. Siksi vaikutus Arg puutteen hoito syöpään riippuu siitä, onko endogeeninen synteesi reitti on puutteellinen. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että ihmisen keuhko- ja paksusuolikarsinoomat olivat lähes aina positiivisia ASS [20]. Lisäksi häiriö L-Arg hyötyosuus liittyy monia sairauksia, kuten sydämen vajaatoimintaa, immuunipuutos, ja syövän etenemistä [9], [21], [22], [23].

koskevassa tutkimuksessa syöpäimmunologian, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, makrofageja ja dendriittisoluja on havaittu olevan toiminnallisesti puutteellisia syöpäkudoksiin alhaisen Arg saatavuus kasvaimen mikroympäristössä [18], [21], [24]. Näiden pohjalta koetuloksiin muutama ryhmä aloitti Arg lisäravinteena hoitoa syöpäpotilaille [25]. On kuitenkin kiistaa rooli Arg lisäravinteen tai Arg puutteen syövän hoidossa, pitkälti siksi ei ole olemassa suoraa tietoa tarkasta hyötyosuuteen Arg kasvaimen mikroympäristössä, erityisesti CRC. Selventämään tätä asiaa, olemme kehittäneet menetelmän määrittää Arg veren ja CRC kudosten [26], [27]. Alustavissa tutkimuksissa havaitsimme pieninä pitoisuuksina Arg ja sen metaboliitin Cit seerumeista CRC potilaiden ja korkeammat pitoisuudet Arg ja Cit syövän kudoksissa. Täällä me edelleen määritetty saatavuutta Arg kasvaimen mikroympäristössä ja tutkittiin mekanismia taustalla lisääntynyt solunsisäinen Arg tasolla analysoimalla ilmaus Arg kuljettajat ja endogeenisen Arg synteesi entsyymit ASS ja ASL CRC kudoksissa. Tuloksemme osoittivat, että Arg aineenvaihdunta kiihtyy CRC ja tunnistaa Arg kuljettaja SLC7A1 mahdollisena molekyylikohteena CRC terapia.

Methods

Näytteet ja HPLC

Serum, kasvain kudos, ja vieressä normaali paksusuolikudos otettiin samanaikaisesti saatu kirurgisen näytteistä CRC potilaista. Kaikkiaan 122 pariksi kasvain kudosten ja viereisen normaalissa paksusuolen kudoksessa kerättiin 122 CRC potilaista (79 urosta ja 43 naista), joiden keski-ikä oli 60 ± 11 vuotta (vaihteluväli 37-79 vuotta) osastolta Surgery Shanghai Changzheng Hospital. Potilaat mukana 27 kanssa sigmasuolessa syöpä, 5 paksusuolen alenevassa syövän, 46 ja peräsuolen syöpä, 16 paksusuolen nouseva syöpä, ja 28 paksusuolen poikittaisen paksusuolen syöpä. Kaikki potilaat olivat patologisesti diagnosoitu adenokarsinooma (taulukko 1). Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Tongji yliopiston lääketieteellisessä ja kirjallinen suostumus saatiin kaikille yksilöille. Kudosnäytteitä määrittämiseksi ilmentymisen Arg kuljettajat säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Niistä 122 pariksi näytteistä keräsimme 30 pariksi kudosnäytteitä ja seeruminäytteiden erikseen HPLC edelleen pitoisuuden määrittämiseksi Arg ja Cit. Emme voineet testata kaikki yksilöt johtuen vähäisestä näytteen saatavuuden. Seerumit 28 terveillä vapaaehtoisilla, jotka saivat vuosittaisen terveystarkastuksen ja ollut mitään todisteita taudeista kerättiin kontrollina. Väestörakenteen ominaisuudet 28 tervettä vapaaehtoista ja 30 peräsuolen syövän potilaista on esitetty taulukossa 2.

tasot L-Arg ja L-Cit seerumin ja kudosten määritettiin RP-HPLC käyttäen ultravioletti havaitseminen kuin me raportoi äskettäin [24], [25]. Kasvain ja normaali kudos oli punnitaan tarkkaan, ja 0,1 g kudosta homogenoitiin 0,5 ml trikloorietikkahappoa (0,1 g /ml) jäähauteessa. Homogenaatteja siirrettiin Eppendorf-sentrifugissa putkiin ja analysoitiin samalla tavalla kuin seeruminäytteistä. Analyyttinen pitoisuus laskettiin käyttäen standardikäyrää tai regressiivinen yhtälö. Tasot L-Arg ja L-Cit seerumeista ilmaistiin mikromol /l ja tasot L-Arg ja L-Cit kudoksissa ilmaistiin ug /g.

kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR

)

RNA eristettiin peräsuolen kudoksista käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA välittömästi käänteiskopioitua eristetty RNA: SuperScript III Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR-kittiä (Qiagen, Valencia, CA). Alukkeet, joita käytetään kunkin arginiini kuljetuksen geeni on lueteltu taulukossa S1. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina vertailua varten. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7900HT (ABI, Foster City, CA), ja vertaileva Ct menetelmää käytettiin arvioimaan suhteelliset muutokset mRNA-tasojen kahden näytteen välillä.

Tissue Microarray

parafinoidut kudoksen microarray (CO951, US Biomax, Rockville, MD) käytettiin immunohistokemiaa analyysiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Tissue array käsiteltiin lämmöllä aiheuttama antigeeni haku käyttämällä 10 mM natriumsitraatti, pH 6,0. Array värjättiin sitten CAT-1-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA) ja visualisoidaan käyttämällä DAB -värjäyspakkausta.

Cell Culture

Ihmisen koolonisyöpäsolulinja HCT 116 hankittiin The Cell Bank of Kiinan tiedeakatemian ja viljeltiin kostutetussa, 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. Käytetty elatusaine oli McCoyn 5A-Medium (Sigma, St. Louis, MO), joka sisälsi 10% v /v lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS).

transfektio Sirna (siRNA)

Ei-kohdistaminen siRNA (Sint) ja siCAT-1 (Santa Cruz, Dallas, TX) käytettiin pitoisuutena 10 nM ja transfektoitiin HCT 116-soluihin käyttämällä Lipo 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden ohjeet. 24 tunnin kuluttua solut ympättiin chambered dioja tai 24-kuoppalevyille, ja annettiin kasvaa vielä 24-48 tunnin ajan ennen RNA: n eristämistä tai alusta kokeissa. Pudotus geenin ilmentymisen vahvistettiin q-PCR: llä.

virtaussytometria ja Cell Proliferation analyysi

apoptoottisten solujen määrässä määritettiin käyttäen anti-anneksiini V-mAb (BD, Franklin Lakes, NJ) ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu kirjallisuudessa [29]. Solujen lisääntyminen määritettiin MTT iinianalyysikitissä (R 0,005), kun taas Cit taso CRC kudoksissa oli 11,01 ± 4,16 ug /g verrattuna 5,60 ± 2,61 ng /g normaalissa paksusuolen kudoksessa (

P

0,01, taulukko 4 ja kuvio 2). Nämä tulokset osoittavat, että hyötyosuutta Arg ja Cit on kohonnut paksusuolensyöpä kudoksissa, jotka voivat edistää alempia sekä Arg ja Cit seerumeista CRC potilailla, kuten aiemmin on raportoitu [26].

yläpaneeli (a) esittää tuloksia saatuna viereisen normaalin sigmasuolessa kudoksen potilaan sigmasuolessa syöpä. Alempi paneeli (b) esittää tulosta sigmasuolessa syöpäkudoksessa samalla potilaalla. Yksittäiset merkityt piikit (1) ja (2) edustavat L-Citrulline ja L-arginiini vastaavasti.

pitoisuudet sekä Arg ja Cit olivat merkittävästi korkeammat peräsuolen syövän kudoksissa verrattuna pariksi viereisen normaali paksusuoli kudoksiin (

P

0,05 ja

P

0,01 vastaavasti). Yksityiskohtaiset pitoisuudet ja tilastollisia analyysejä on esitetty taulukossa 4.

yli-ilmentyminen CAT-1 in CRC kudoksissa qRT-PCR-analyysi

kertymistä Arg ja Cit vuonna CRC kudokset kannustanut tutkimuksen identiteettiä Relevanttia kuljettajaa ja mahdollisuus, että se voisi säädellä syövän etenemistä. Kationiset aminohapot kuljettajat (kissat), alaryhmä liukenevan aineen kantaja perheen 7 (SLC7A), ovat tärkeimmät kuljettajat vastuussa Arg tulva. On neljä vahvistettu liikenne proteiineja kationisia aminohappoja, CAT-1 (SLC7A1), CAT-2A (SLC7A2A), CAT-2B (SLC7A2B), ja CAT-3 (SLC7A3). Toiminto Ihmisen SLC7A3 ja SLC7A4 on tuntematon, kun taas hattujen 4F2hc /y + LAT1 ja 4F2hc /y + LAT2 (SLC3A2 /SLC7A7 ja SLC7A6) hyväksyvät L-tyypin kationisia ja neutraaleja aminohappoja. Mittasimme geenien ilmentymistä, jotka koodaavat näitä arginiini kuljettajat CRC ja pariksi viereisen normaalin syövän kudoksissa 122 potilailla, joilla on CRC käyttäen qRT-PCR: ää.

Kuten kuviossa 3 on esitetty, kun enemmän kuin 3-kertainen verrattuna-ilmentyminen oli asetettu raja-arvo,

CAT-1

geenin ilmentyminen oli koholla CRC kudoksissa 86 122 potilasta (70,5%), johon ilmentymistason CAT-1 in CRC kudoksissa oli 3.6- ja 181-kertainen verrattuna normaalissa paksusuolessa kudoksissa, kun taas ilmaus SLC7A2A ja SLC7A2B oli koholla vain 6/122 ja 12/122 (4,9 ja 9,8%) potilaista. Havaitsimme myös, että SLC7A4 ilmentyminen koholla 8/122 (6,6%) potilaista. Expression of SLC3A2, SLC7A6 ja SLC7A7 kohosi 8, 14, ja 12 122: lla potilaista (6,6%, 11,5%, ja 9,8%) (kuvio 3). Tuloksemme osoittavat, että yli-ilmentyminen CAT-1 saattaa olla merkittävä tekijä Arg kerääntymistä CRC kudoksiin.

Ilmaisu CAT mRNA kolorektaalisyövässä kudoksissa mitattiin qRT-PCR, ja yli-ilmentyminen määritettiin ainakin 3-kertainen ilmaisun kuin normaalissa paksusuolen kudoksessa. Kuvassa osuus näytteistä ylieks- ( 3-kertainen) yksittäisten arginiini kuljettajan geenejä among122 CRC kudosnäytteistä.

CAT-1

geeni yli-ilmentynyt 86 122 (70,5%) CRC kudoksiin.

Lisääntynyt CAT-1 Protein Expression CRC Kudokset

Vahvista yli-ilmentyminen CAT-1 CRC kudoksista määritettiin edelleen CAT-1-proteiinin tason immunohistologinen värjäys 25 paksusuolensyöpä näytteiden kudoksessa microarray (kuvio 4). Ilmaisu CAT-1-proteiini oli heikko normaalissa viereiseen paksusuolen mutta koholla paksusuolen adenokarsinooman. CAT-1 ilmentymisen taso korreloi erilaistumista laadut kasvaimia; löysimme kohtalaisesti kohonnut CAT-1 hyvin eriytetty koolonadenokarsinooma (n = 8), ja laajalti säädelty CAT-1 in huonosti eriytetty yksilöiden (n = 17). Nämä tulokset vahvistivat lisääntyminen CAT-1-proteiinin tason CRC kudoksissa, sopusoinnussa qRT-PCR havaintoja.

CRC kudos microarray (TMA) värjättiin CAT-1-vasta-aineen ja visualisoitiin DAB -värjäyspakkausta . Tiheys CAT-1 ilmentymisen normaalissa paksusuolen, hyvin eriytetty CRC, ja huonosti eriytetty CRC näytteitä TMA verrattiin. Kuvat otettiin 40-kertaisella suurennuksella.

CAT-1 RNAi inhiboivat CRC Cells

tulosten perusteella Arg keskittymisen ja korkeamman CAT-1 ilmentymisen CRC kudoksissa me edelleen hypoteesi, että CAT-1 voi korreloida syövän solujen lisääntymistä ja myöhempää syövän etenemistä. Siksi suorittanut

in vitro

määrityksessä tutkia vaikutuksen CAT-1 tukahduttaminen RNAi koolonkarsinoomasoluissa. Kuten kuvioissa 5A ja B, CAT-1 siRNA onnistuneesti pudotettiin (80% vähennys määräytyy qRT-PCR) ilmentymistä CAT-1 in HCT 116 koolonkarsinoomasoluissa, vastaa tuloksia, rintasyöpäsoluissa [30]. Transfektion CAT-1 siRNA laski kasvainsolujen elinkelpoisuuden edistänyt apoptoosin (kuvio 5C-E), ja siksi estivät solukasvua

in vitro

20-50% (Kuva. 5F). Tuloksemme viittaavat siihen, että Arg metaboliareittiin voisi olla potentiaalinen molekyylikohteena CRC terapia.

koolonisyöpäsolulinja HCT-116 viljeltiin

in vitro

6-kuoppalevyille ja transfektoitiin yksittäisten siRNA: t, minkä jälkeen analysoimalla CAT-1 ilmentymisen qRT-PCR: llä (A, B), apoptoosi 72 tunnin kuluttua siRNA transfektion virtaussytometrialla (C-E), ja solujen kasvua MTT: llä (F). CAT-1 siRNA onnistuneesti pudotettiin noin 80% CAT-1 ilmentymisen (B). Verrattuna ei käsittelyä (C) ja ohjaamaan siRNA (D), CAT-1 siRNA aiheuttaman apoptoosin jopa 16,37% (E). CAT-1 siRNA (kolmio) vähensi solujen elinkelpoisuuden HCT116 koolonkarsinoomasoluissa verrattuna ilman hoitoa ja valvontaa siRNA transfektio (F). Tulokset olivat toistettavissa kolmen erillisen kokeen. ** Osoittaa

P

0,01.

Keskustelu

jatkoa edellisessä tutkimuksessa [26], [27], me tutki vielä seerumin tasot Arg ja Cit CRC potilaiden ja niiden biologinen CRC kudoksessa. Olemme johdonmukaisesti osoitti vähentynyt seerumin Arg ja Cit CRC potilaiden ja kertymistä sekä Arg ja Cit CRC kudoksissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että pienempi hyötyosuus kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja kasvaimeen liittyvien immuunisolujen ei ehkä liity Arg pitoisuus syöpä mikroympäristössä, vaan saattavat liittyä kasvaimen solujen aineenvaihdunnan ominaisuudet ja niiden kykyyn ottaa Arg. Samanaikainen korkeat solunsisäiset Arg ja Cit voi johtua kiihtyvyys solunsisäisten synteesi reittejä koska Arg ja Cit voidaan vastavuoroisesti metaboloituu solunsisäisen ASS /ASL ja NOS. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että kasvain endoteelisolut ilmentävät korkeita NOS, joka edistää imusuonten etäpesäke ja angiogeneesiä [15], [16], [31]. Siten kohonnut Cit pitoisuus syövän potilaiden kudosten tutkimuksessamme voisi johtua nopeutetun Arg metabolia NOS, vaikka kuljettaja syöpäkudoksessa ja sen spesifinen aktiivisuus Cit jäävät epäselviksi.

Solunsisäinen synteesi Arg alkaen Cit on Arg-Cit polku vaatii kaksi entsyymejä, ASS ja ASL. Useat ryhmät ovat raportoineet puute endogeenisen Arg synteesissä melanooma, maksan karsinooma, munuaissolukarsinooma, ja eturauhasen syöpien seurauksena puutteellinen ASS [10], [11], [12], [13], [20]. Joitakin muita ihmisen syövissä, mukaan lukien sarkoomat, invasiivinen rintasyöpä, ja munuaissolukarsinooma, on osoitettu olevan ASS puutteesta joissakin tutkimuksissa, mutta ihmisen keuhko- ja paksusuolikarsinoomat olivat lähes aina positiivisia ASS [20]. Olemme johdonmukaisesti havaittu olevan ilmaus ASS ja ASL CRC kudoksessa verrattuna normaaliin paksusuolikudos immunohistokemiallisesti, mikä viittaa siihen, että endogeeninen synteesi Arg CRC solut voivat olla ehjä, ja jopa parantaa, pikemmin kuin puutteellinen (kuva S1 ja S2). Parannettu ekspressiotaso ASS ja ASL CRC voi olla osittain vastuussa korkea Arg havaitun syövän kudoksissa.

Tiedetään, että pitoisuutta solun Arg pitkälti vaikuttaa toiminnan Arg kuljettajat jossa kationinen aminohappo kuljetukset (kissat) ovat tärkein kuljettajat Arg tulva [32], [33], [34]. Kertyminen Arg CRC soluissa voi johtua lisääntyneeseen ekstrasellulaarisista interstitiaalisen altaat kautta Arg kuljettaa. Varhaisessa

in vitro

tutkimuksessa lisääntynyt L-Arg kulkeutuminen Na (+) – riippumaton y + järjestelmä havaittiin CRC-soluissa, kun taas läsnä ollessa kasvutekijän (EGF) ja transformoivan kasvutekijä alfan (TGFa) stimulaatio L-arginiini otto voi tapahtua läpi Na (+) – riippuvainen transporter [14]. Siksi meidän seulotaan ilmaus kaikkien kationisten aminohapon kuljettaa CRC kudoksissa käyttäen qRT-PCR ja paljasti, että CAT-1 ilmentyi korkeammalla tasolla CRC kudoksissa kuin normaalissa paksusuolen kudoksiin. Toinen tutkimus osoitti, että muutokset CAT-1-mRNA-tasot eivät välttämättä vaikuta CAT-1-proteiinin tasot [35]. Kuitenkin meidän kokeiluja osoittivat johdonmukaisesti yliekspressio sekä CAT-1-mRNA ja proteiini CRC kudoksissa. Vaikka CAT-2 on tärkeä Arg liikenteen, erityisesti NO-tuotannon aikana makrofagien toimintaa [35], emme löytäneet mitään todisteita tästä CRC kudoksissa. Tämä ero saattaa heijastaa elimen tai solujen erityispiirteet ja erilaiset vaatimukset solujen toimintaa. Tuoreessa

in vitro

tutkimus osoitti, että CAT-1 on tärkeä rooli Arg oton ja selviytymistä rintasyövän soluja, ja jopa NO-tuotannon [30]. Varhainen kudos transcriptome tutkimuksessa todettiin, että ihmisen CAT-1 on lähes ilmentyy kaikkialla, mutta hyvin ilmaista vain peräsuolen syövän soluja, varhainen erytroidisolut, endoteelisolujen, ja CD34 kantasolujen [36].

Vaikka on epäselvää miksi syöpäsolut ensisijaisesti käyttää CAT-1 Arg aineenvaihduntaa, useita rivejä todisteita voivat antaa vihjeitä. Ensinnäkin, CAT-1 voidaan voimistuvan useat tekijät kasvaimen mikroympäristössä, kuten polyamiinit, patologisen stressi, signaalit nopeaa jako, ja proinflammatoristen sytokiinien, että myös rooleja syövän kehittymisessä ja etenemisessä [32], [37], [38 ], [39]. Toiseksi, vaikka sen lähes kaikkialla läsnä olevan, CAT-1 ilmentyminen on hyvin säädeltyä geneettisesti. Aikuisen normaalin hepatosyyteissä CAT-1 ei ilmenny, koska korkeat ekspressiotasot ehkäisevän mikroRNA, miR-122 [40]. Kuitenkin paksusuolen epiteelisolut ilmentävät hyvin alhainen ehkäisevästä miR-122 [41], mikä johtaa suurempiin CAT-1 ilme. CRC soluissa miR-122 oli jopa alassäädetty, mikä osoittaa hallinnan menetys CAT-1 ilme [42]. Kolmanneksi, vaikka CAT-1 proteiinin solukalvon välittää sekä virtaa /ulosvirtauksen ja vaihtaa sen substraattien, arginiini, lysiini, ja ornitiini, välillä solunsisäisen ja solunulkoisen altaat, tasauspyörästö ilmentyminen CAT-1-proteiinin solukalvon eri organellien sisällä solut voivat säädellä näitä aminohappo altaita eri soluelimiin [32]. Solunsisäinen Arg tiedetään olevan yksi tärkeimmistä aminohapon aktivointi mekanistinen rapamysiinin kohde (mTOR), erityisesti mTORC1 signalointireitin, joka edistää tuumorigeneesiä, solujen selviytymisen, ja proliferaatiota [42]. Aktivointi mTORC1 edellyttää translokaatiota mTORC1 peräisin huonosti tunnettu sytoplasmisen sijainnin lysosomaalisen pinnan läsnä ollessa aminohappojen [43], [44]. Siksi tarkka allas aminohappojen organellin sytoplasman tai lysosomiin on tärkeä aminohappo tunnistus ja sen jälkeen mTORC1 signalointia. Lisäksi CAT-1-proteiini on solukalvojen on tärkeä rooli solunsisäisessä kompartmentalisaatio ja kanavointi Arg erillisiä metaboliareittien sytoplasmassa [32]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että solunsisäisen sijainnin CAT-1 voi edistää altaan Arg eri soluelimiin solujen sisällä. Kuitenkin tulokset Arg keskittymisen ja yli-ilmentyminen CAT-1 in CRC kudoksissa esitetään tässä takaa lisäselvityksiä solunsisäistä jakelua CAT-1 in CRC-soluissa ja sen biologista merkitystä kasvainten synnyssä.

Lisäksi meidän

in vitro

tutkimus osoitti, että knock-down CAT-1 in CRC-soluissa indusoiman apoptoosin ja estivät solujen kasvua, mikä viittaa siihen, että CAT-1 voi olla ainutlaatuinen molekyyli biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde CRC. Varhaiset tutkimukset osoittavat, että kuljettaminen tietyt aminohapot on yleinen ominaisuus neoplastisten solujen; itse asiassa kuljetukseen 2-deoksi-D-glukoosi on käännetty kliininen käyttö PET-TT [45]. Samanlaisella periaate havaintomme saattavat kliinistä sovelluksiin, kuten Arg-pohjainen röntgendiagnostiikkaan tai sädehoitoa ja CAT-1-pohjainen molekyylikohteena hoito. Yksityiskohtaisemmat tutkimus molekyylimekanismin Arg liikenteen kasvain soluissa on perusteltu, koska monia ratkaisemattomia kysymyksiä on edelleen, kuten sääntely ja jakelu CAT-ilmentymisen syöpäsoluissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Voimakas ilmentyminen ASS paksusuolen syöpä kudoksessa määritettynä immunohistokemiallisella värjäyksellä. Näytteet ovat matched kudosnäytteiden: (a ja b) syövän kudosta, (c ja d) viereiseen normaaliin paksusuolikudos. Patologinen ominaisuudet paksusuolen adenokarsinooma (a) ja viereisen normaalin paksusuolen kudos (c) tuumorinäytesylinterin ovat osoitti hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys dia. Tiheys ASS proteiinin ilmentymisen paksusuolen adenokarsinooma (b) ja viereisen normaalin paksusuolen kudos (d) on osoitti kuvan immuunihistokemiallisesti ASS vasta-aineella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073866.s001

(TIF )

Kuva S2.

Voimakas ilmentyminen ASL paksusuolen syöpä kudoksessa määritettynä immunohistokemiallisella värjäyksellä. Esitetyt tiedot ovat peräisin Hyväksytty kudosnäytteiden: (a ja b) viereiseen normaaliin paksusuolikudos, (c ja d) syöpäkudoksessa. Samasta näytteestä osoitti 10 kertaa vahvistus (a, c) ja 20 kertaa vahvistus (b, d). Tiheys ASL proteiinin ilmentymisen paksusuolen adenokarsinooma (c, d) ja viereisen normaalin paksusuolen kudosta (a, b) on osoitti kuvan immuunihistokemiallisesti ASL vasta-aineella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073866.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Alukesekvensseillä käytettiin kvantitatiivista PCR-analyysi Cats.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073866.s003

(DOC) B