Krooninen sairaus

tiivistelmä

Merkittävä haaste potilaiden hoitoon, joilla on eturauhasen syöpä on tunnistaa ne yksilöt riski sairastua etäpesäkkeitä, kuten useimmissa tapauksissa tauti pysyy indolent. Analysoimme Yhdistettyjä seeruminäytteitä 4 ryhmää (n = 5 näytettä /ryhmä), kerättiin prospektiivisesti ja seurataan aktiivisesti vähintään 5 vuotta. Potilaat ryhmät olivat (i) histologinen hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun kanssa mitään todisteita syöpää ”BPH”, (ii) paikallinen syöpä ei ollut näyttöä etenemistä, ei-etenee ”(iii) paikallinen syöpä todisteet biokemiallisia etenemisen” etenee ”, ja (iv) luumetastaasipotilailla at esitys metastaattinen. Yhdistettyä näytettä olivat immunologisesti köyhdytettyä 14 pisimmälle runsas proteiineja ja analysoitiin käyttäen 4-Plex iTRAQ lähestymistapaa. Kaiken kaikkiaan 122 proteiinit tunnistettiin ja suhteellisen määrällisesti. Vertailut edetä

versus

kuin etenee määrittelivät merkittävä ero ilmentymistä 25 proteiinien (p 0,001). Vertailut metastasoituneen

versus

etenee määrittelivät merkittävä ero ilmentymistä 23 proteiineja. Kartoitus differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien päälle eturauhassyövän etenemisen reitti paljastivat säädeltyyn ilmentyminen yksittäisten proteiinien, paria proteiinien ja ”paneelit” proteiinien liittyvän erityisesti vaiheissa taudin kehittymistä ja etenemistä. Mediaani immunovärjäyty- intensiteetti eukaryoottitranslaatioon pidentymisen 1 alfa 1 (eEF1A1), yksi ehdokkaista tunnistettu, oli merkitsevästi korkeampi osteoblastien lähellä etäpesäkekasvainten soluihin verrattuna osteoblastien ohjaus luun (p = 0,0353, Mann Whitney U). Meidän proteomic lähestymistapa on tunnistettu johtaa potentiaalisesti hyödyllisiä seerumin biomarkkereita, jotka liittyvät metastasointiin eturauhassyöpää. Paneelit tunnistettu, mukaan lukien eEF1A1 optio lisätutkimukset ja validointi.

Citation: Rehman I, Evans CA, Glen A, Cross SS, Eaton CL, Down J, et al. (2012) iTRAQ tunnistaminen Candidate Serum biomarkkerit Associated kanssa metastasointiin of Human Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (2): e30885. doi: 10,1371 /journal.pone.0030885

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 elokuu 2011; Hyväksytty: 27 joulukuu 2011; Julkaistu: 15 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Rehman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia PROMET (projekti no. FP6-LSH-5-2004-018858), ja P-MARK (sopimus nro. LSHC-CT-2004-503011), EU: n kuudennen puiteohjelman ja NCRI nopeasti (Eturauhasen syöpä mekanismit etenemisen ja hoito) yhteistyönä apurahan tohtori Hamdy, ja avustusta Engineering ja fysikaalisten tieteiden tutkimusneuvosto (EPSRC) Dr. Wright: EP /E036252 /1 ja GR /S84347 /01. Olemme kiitollisia Dr. Nicholas Hoyle at Roche Diagnostics, Penzberg, Saksa hänen tuestaan ​​kohti kulutushyödykkeet ja reagenssit projektin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Olemme kiitollisia Dr. Nicholas Hoyle at Roche Diagnostics, Penzberg, Saksa hänen tuestaan kohti tarvikkeet ja reagenssit projektin. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Euroopassa ja Yhdysvalloissa, eturauhasen syöpä on toiseksi yleisin syöpä diagnoosi ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten [1], [2]. Lisäksi ilmaantuvuus on kasvanut laajamittaisen käyttöönoton prostataspesifisen antigeenin (PSA) testaus [3]. Useimmat potilaat, joilla on eturauhasen syöpä diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa, mutta vaikka seulonta yli 7%: ssa tapauksista kehittää etäpesäkkeitä [4]. Miehillä etäinen etäpesäke ennuste on huono, ja keskimääräinen elinaika 24 48 kuukauteen. Bone on yleisin eturauhassyövän etäpesäkkeiden ja liittyy luukipua, selkäydinkompressio ja luuytimen vajaatoiminta [4]. Tällä hetkellä luu etäpesäkeleesioita määräytyvät kuvantamisen kuten isotooppi luun skannaus kuitenkin tunnistaminen seerumin perustuvan biomarkkereiden (t) ennustamiseksi alttius potilaiden kehittää luumetastaasipotilailla voisi mahdollistaa tarkemman kliininen arviointi taudin ja ohjata terapia.

diagnoosi eturauhasen syöpä on yleisimmin tekemä kolmikko seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) mittauksiin, eturauhasen (DRE), ja histologinen arviointi transrectal ultraäänellä (TRUS) opastettu biopsialaitteet [ ,,,0],5]. Vaikka PSA on FDA: n hyväksymä biomarkkeri eturauhassyövän havaitsemiseen, sen käyttökelpoisuus on kiistanalainen, koska sen on osoitettu olevan epäluotettavia taudin diagnosointiin, ja erityisesti erottamaan indolent aggressiivisia tautimuodoille [6], [7]. Lisäksi PSA liittyy korkea väärien positiivisten ja väärien negatiivisten testitulosten, koska tasot saattavat kohota kuin syöpä olosuhteissa eturauhasen, kuten eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH). Siten ylimääräinen biomarkkerit tarvitaan kiireellisesti, jotka voisivat parantaa diagnostista spesifisyyttä PSA ja ennustaa todennäköisyyttä taudin etenemisen.

Veri ja sen tuotteita, kuten plasma ja seerumi ovat ihanteellisia nesteitä tunnistamiseksi syöpä biomarkkereita, koska ne sisältävät proteiineja sekä erittyvä ja irtoa syöpäsolujen yhdistettynä helppouteen näytteenottoa. Kuitenkin vaihteleva koostumus ja laaja dynaaminen alue proteiineja plasmassa (arviolta 10

10 kertaluokkaa tai enemmän), asettavat suuria haasteita tunnistamaan kliinisesti merkittäviä biomarkkereiden keskuudessa taustalla runsaasti proteiineja, kuten albumiini, immunoglobuliini ja transferriini [8]. Niistä 22 tai niin runsain proteiineja plasmassa, nämä muodostavat yli 99% massasta koko plasman proteiineihin, ja loput 1% arvellaan muodostuu keskimääräinen /alhainen runsautta proteiineja ja sisältävät biomarkkereiden allas [9 ]. Suuri suuruusluokkaa proteiinipitoisuus ovat vaikeuttaneet edellinen massaspektrometrialla perustuu ponnisteluja, joilla pyritään tunnistamaan kliinisesti relevantteja biomarkkereita, lähinnä vaimennusta ionisaation alhainen runsautta proteiinien korkeampi runsaus proteiinit [10]. Kuitenkin ennen poistamista joitakin erittäin runsaasti proteiineja on osoitettu parantavan havaitsemista suhteellisesti vähemmän runsaasti proteiineja [11], [12]. Vaikka on olemassa monia erilaisia ​​proteiinia fraktiointi menetelmiä erojen perusteella molekyylipainon, muoto, maksu, pl, hydrofobisuus ja affiniteetti erityisillä biomolekyylitason vuorovaikutusten, on raportoitu, että korkea runsaasti proteiinia erottaminen käyttämällä vasta-ainetta, joka perustuu IgY-12 immunodepletion järjestelmä on hyvin toistettavissa [13].

joukossa proteomic teknologioita käytetään biomarkkerina tunnistamiseen, ”isobaaristen Tägit Suhteellinen ja absoluuttinen kvantitointi” (iTRAQ) on edut ovat suhteellisen korkea suoritusteho ja voi samanaikaisesti antaa tietoa peptidin kvantitointi ja tunnistaminen kuten aiemmin raportoitu meidän ja muiden [14] – [16]. Lyhyesti, tyypillinen työnkulku näytteet vähennetään, alkyloidut ja proteolyyttisesti pilkottiin tuottaa peptidejä. Peptidit on merkitty joukko iTRAQ reagenssien (joka 4 tai 8-Plex-muodossa), yhdistettiin ja fraktioitiin voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX). Sitten fraktiot analysoidaan nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS), ja tuloksena massaspektri antaa sekvenssi-informaatiota (alkaen peptidifragmenttien), ja suhteellinen kvantifiointi (alkaen toimittaja ryhmän ionit).

Kun pyritään tunnistamaan uusia proteiineja, jotka liittyvät metastasointiin ihmisen eturauhassyövän, olemme suorittaneet 4-plex iTRAQ analyysi käyttäen Yhdistettyjä seeruminäytteitä kerätään takautuvasti 4 määritelty potilasryhmille, jotka aktiivisesti seurattava vähintään 5 vuotta, ja valittu edustamaan kirjo eturauhasen sairaus. Sen jälkeen data-analyysi, joukko ehdokkaita havaittiin merkittävästi differentiaalisesti ilmaistut syöpänäytteissä verrattuna hyvänlaatuinen näytteitä. Yksi ehdokkaista tunnistetaan olevan merkittävästi säädellään ylöspäin syövän ryhmissä oli eukaryoottitranslaatioon venymään 1 alfa 1 (eEF1A1), ja tutkittiin lisäksi immunohistokemiallisesti käyttäen eturauhasen kudosnäytteitä lokalisoitu ja metastaattisen tapauksissa. Biomarkkerin liidit tunnistettu meidän ”löytö” vaiheen tutkimuksessa, mukaan lukien eEF1A1 käsitellään suhteessa niiden merkitystä eturauhassyövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja seerumin keräys

Perifeerisen veren kerättiin takautuvasti potilailta osallistuvat urologian klinikan Royal Hallamshire sairaalan aikaan niiden käynnin jälkeen kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Verinäyte kokoelma hyväksyttiin eettisen komitean Sheffieldin yliopiston. Seerumi otettiin talteen antamalla veren hyytyä 30 min, sentrifugoitiin 1200 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja säilytettiin sitten -80 ° C: ssa 100 ul: n eriä. Kaikki verinäytteet kerättiin ennen antamisen mitään hoitoa. Kaksikymmentä seeruminäytteet huolella valittu edustamaan eri vaiheissa ja laatuja eturauhasen sairaus ja yhdistetään (n = 5 potilasta /ryhmä), jolloin muodostuu 4 potilasryhmille. Kaikki potilaat olivat aktiivisesti seurattiin vähintään 5 vuoden ajan niiden alkuperäisen verinäytteiden ottoa. 4 potilasryhmät olivat: Ryhmä 1: histologisia hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun ”BPH”, ei ollut näyttöä syövän vähintään 2 riippumatonta sarjaa eturauhasen koepaloja, ja PSA taso alle 10 ng /ml (keski-ikä 61 vuotta) . Ryhmä 2: histologinen diagnoosi eturauhassyövän PSA taso alle 10 ng /ml, eikä mitään näyttöä nouseva PSA seuraavat 5 v aktiivinen seuranta – ”ei-etenee ryhmä, (keski-ikä 67 vuotta); Ryhmä 3: histologista diagnoosia kliinisesti paikallinen syövän alkuperäiseltä PSA taso alle 13 ng /ml, jota seurasi 3 peräkkäistä nousu PSA tasoilla aikana 5 v aktiivisen seurannan -’progressing ryhmä, (keski-ikä 69 vuotta); Ryhmä 4: potilaalla on PSA 19 ng /ml ja todisteita luuetäpesäke positiivinen radionukleotidi luukuvaus – metastaattinen ryhmä, (keski-ikä 73 vuotta). Erot mediaani-iät potilaista ei havaittu olevan tilastollisesti merkitsevä 4 ryhmän väliin (p = 0,146, Kruskal-Wallisin testi). Tauti ominaisuudet 20 potilasta, joka käsittää 4 ryhmää on esitetty taulukossa S1.

Patient kudoksen

Tissue mikrosiruja (TMA), joka koostuu 56 tapauksessa eturauhasen adenokarsinooma vaihtelevat yhden Gleason laadut (eli luokan 2, n = 5, luokka 3, n = 32; luokka 4, n = 9, luokka 5, n = 10), ja 40 tapauksissa vierekkäisten ei-pahanlaatuista kudosta, ja rakennettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [17] , [18]. Lisäksi 23 tapausta Luubiopsien potilaiden sekä ilman eturauhassyövän luuston etäpesäkkeiden saatiin 8 mm trephine biopsia suoritetaan yleisanestesiassa. Tietoon potilaan suostumus ja eettisen komitean hyväksyntä saatiin ennen tutkimusta (South Sheffield Research eettiselle toimikunnalle, SSREC /02/155 ja 00/172).

Solulinjat

Ihmisen eturauhassyöpä solulinjat LNCaP, PC-3, DU145 ja Vcap hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), (https://www.lgcstandards-atcc.org/). DuCaP solut saatiin kautta PRIMA projektikonsortio (https://www.primaproject.org/participants.php). LNCaP-PRO5, LNCaP-LN3, PC-3M ja PC-3M-LN4 solut olivat ystävällinen lahja Dr. Curtis Pettaway (University of Texas, M. D. Anderson Cancer Center), [19]. LNCaP-C4-2 ja LNCaP-C4-2B solulinjat saatiin professori George Thalmann [20]. TE-85 luusarkoomasoluissa oli ystävällinen lahjoitus Prof. J.A. Gallagher, University of Liverpool. Kaikki eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu, ja on vahvistettu olevan vapaa Mycoplasma [15].

IgY-14 affiniteetin väheneminen seeruminäytteistä

Yhdistetyt seeruminäytteet köyhdytettyä 14 eniten yhteinen plasman proteiineihin käyttäen Seppro IgY-14 ehtyminen järjestelmä [21]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin yhdistäminen seuraa ehtyminen korkeimmin runsas proteiineihin tehokas strategia vähentää dynaaminen alue proteiineja ja parantaa tunnistamiseksi seerumin biomarkkerit, osoitettuna käyttäen määrällistä proteomic menetelmän iTRAQ (R) [ ,,,0],22]. Seeruminäytteistä 5 potilasta, jotka edustavat kutakin 4 potilasryhmät olivat yhdistettiin yhtä suuret, jolloin saatiin yhteensä 200 ui kunkin ryhmän (40 ui kutakin näytettä). Yhdistetyt seeruminäytteet kuljetettiin hiilihappojäissä Genway (Digilabs BioVision, Saksa), ja immuno-ehtyminen käyttäen Seppro Ig-Y14-järjestelmä. Läpivirtausfraktio murto (köyhdytetty albumiinin, immunoglobuliini IgG, fibrinogeeni, transferriini, IgA, IgM, haptoglobiini, alfa-2-macroglobin, alfa-1 glykoproteiiniin, alfa-1 antitrypsiini, Apo AI HDL, Apo A-II HDL, komplementti C3 ja LDL (ApoB)), käytettiin seuraaviin iTRAQ analyysiä.

iTRAQ näyte merkinnöistä ja SCX fraktiointiin

Ennen iTRAQ analyysin näytteet keskitettiin ja puskuri vaihdettiin käyttäen 5 kDa molekyylipainon cut-off spin keskittimet (Millipore). Näytteet puskuri vaihdettiin kolme kertaa vastaan ​​500 ui 1 M triethylammoniumbicarbonate (TEAB) puskuria ja konsentroitiin tilavuuteen noin 80 ui. Näytteet leimattiin iTRAQ reagenssien mukaan valmistajan ohjeiden ja kuten aiemmin on kuvattu [14], [15]. Kukin näyte merkitään yhdellä neljästä iTRAQ reagenssit (iTRAQ toimittaja ionien 114,1, 115,1, 116,1, 117,1 massa /varaus-suhde). Tunniste merkintöjen järjestys oli BPH- 117; lokalisoitu kuin etenee syöpään 116; etenevät syöpää 115; etäpesäkkeitä-114). Leimatut näytteet yhdistettiin ja fraktioitiin voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX), käyttäen BioLC HPLC-kolonnia (Dionex, Surrey, UK), ja analysoitiin LC-MS /MS, kuten aiemmin on kuvattu [14], [15].

Tandem massaspektrometria-analyysi

massaspektrometria (MS) suoritettiin käyttäen QStar XL Hybrid ESI Quadrupole aika-of-lennon tandem massaspektrometriä, ESI-QQ-TOF-MS /MS (Applied Biosystems, Framingham, MA, MDS-Sciex, Concord, Ontario, Canada), yhdistettynä online kapillaari- nestekromatografiajärjestelmään (Famos, Switchos ja Ultimate alkaen Dionex /LC Packings, Amsterdam, Alankomaat). Kuivatut näytteet suspensoitiin uudelleen 60 l: 3% asetonitriiliä ja 0,1% muurahaishappoa valmis MS, ja 10-15 l (riippuen peptidin pitoisuus, kuten nähdään huippu intensiteetti SCX kromatogrammin) injektoitiin nano LC-ESI-MS /MS-järjestelmä jokaista analyysia. Alkuerotuksen käytiin PepMap C

18 RP kapillaarikolonnia (LC Packings) tasaisella virtausnopeudella 0,3 l /min. LC puskurit A ja B koostuu 3% asetonitriiliä, 0,1% muurahaishappoa ja 97% asetonitriiliä, 0,1% muurahaishappoa, vastaavasti. Gradientti alkoi 97% puskuria A ja 3% puskuria B 3 minuuttia, minkä jälkeen 3-25% puskuri B: 120 minuuttia, 90% puskuri B: ssa 7 minuutin ajan ja lopuksi 97% puskuria A 7 minuuttia. Tietojen hankinta massaspektrometrimittausta asetettiin positiiviseen ionin tilassa valitun massa erilaisia ​​350-1800 m /z. Tandem-massaspektrometrialla suoritettiin peptidien +2, +3, +4 varaustiloissa poikki skannauksen eri 65-2000 m /z.

Protein tunnistus- ja suhteellinen kvantifiointiin

Protein tunnistaminen ja suhteellinen kvantitointi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. Tunnistaminen peptidiprekursori ja fragmentit tehtiin hakuja tietokannoista vastaan ​​Swiss-Prot ja Trembl

Homo sapiens

proteiinia tietokanta (41070, 71449 ORF vastaavasti ladata UniProt, toukokuu 2010). Parametrit etsimiseen perustettiin seuraavasti: MS siedettävyys oli 0,4 ja MS /MS toleranssi asetettiin: peptidi toleranssi 0,4 Da, lataa +2, +3 ja +4, min peptidin pituus, z-pisteet, max p-arvo ja AC pisteet olivat 6, 6, 10

-6 ja 6 vastaavasti. Phenyx default ”turbo” pisteytys oli otettu käyttöön massan toleranssi rajoittaminen 0,1 Da MS ja MS /MS ja pienin prosenttiosuus peptidisekvenssin kattavuutta b

+ (b), b

2+ (b ++), y

+ (y) tai y

2+ (y ++) fragmentti sarja asetettiin oletusarvoksi 20%. Kohdetietokannassa etsintäavaruus rajoitettiin trypsiinipeptidit Enimmillään 1 miscleavage. Muutokset asetettiin: 4-Plex iTRAQ massa siirtymät (+144 Da, K ja N-termi), metyylitio (+46 Da) ja hapetus metioniinin (+16 Da). False Discovery hinnat (FDR) arvioitiin käyttämällä ketjutettua kohde-houkutuslintujen tietokanta kuvatulla Elias ja Gygi [25]. Proteiini muutoksia päteviä käyttäen t- testiä algoritmi kehitettiin talon [23].

immunohistokemiaallisesti eEF1A1

Immunohistokemia suoritettiin olennaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [18]. Leikkeet, ja eturauhaskudokset leikattiin (4 m) ja asennettu SuperFrost dioja (VWR International, Saksa). Laseja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-eEF1A1 vasta-ainetta (Santa-Cruz Biotechnology, CA, USA Cat. N

o sc21758), 0,4 ug /ml 2% hevosen seerumia yli yön 4 ° C: ssa. Leikkeet pestiin kaksi kertaa PBS-Tween 20 (PBST), ja inkuboitiin 30 min anti-hiiri-IgG ImmPRESS HRP: tä (Vector Laboratories, Cat. N

o MP-7402). Lisäpesun jälkeen PBST, lokalisoinnin vasta-aine /antigeeni-kompleksin visualisoitiin käyttäen ImmPACT DAB-järjestelmän (Vector Laboratories, Cat. N

o SK-4105). Ohjaus leikkeitä inkuboitiin anti-hiiri-IgG isotyyppikontrollilla (Vector laboratories I-2000), laimennettiin 0,4 ug /ml 2% normaalia hevosen seerumia. eEF1A1 Immunovärjäyksen arvioitiin sekä intensiteetti ja sijainti solun kokenut histopathologist (Dr. Simon Cross), joka oli sokkoutettu tutkimus. Kukin tapaus osoitettiin värjäytymisen intensiteetti, jotka vaihtelevat 0-3 missä 0 = poissa; 1 = heikko; 2 = kohtalainen ja 3 = Voimakas värjäytyminen kuten aikaisemmin on kuvattu [18].

Western blotting

Western blotting suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Anti-EF-Tu vuohen polyklonaalinen IgG primääristä vasta-ainetta käytettiin pitoisuutena 1:1000 (Santa Cruz, Cat. N

o. Sc12990). Sekundäärinen vasta-aine oli HRP-konjugoitua kanin anti-vuohi (Abcam), ja sitä käytettiin pitoisuutena 1:1400 (Abcam). Dual väri tarkkuus plus molekyylipainomarkkerit käytettiin koko arvio (Bio-Rad, Hertfordshire, UK).

Käänteiskopiointia PCR ja sekvensointi

Yhteensä RNA uutettiin eturauhassyövän solulinjoissa käyttämällä TRI-reagenssia (Sigma-Aldrich, UK), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti ja 2 ug, tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasia kit 250 ng satunnaisia ​​alukkeita, mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen, UK). PCR-alukkeet spesifinen eEF1A1 isoformin suunniteltu manuaalisesti, käyttäen Ensembl cDNA-sekvenssi: ENST00000316292 (https://www.ensembl.org/index.html). EEF1A1-forward-aluketta sekvenssi oli (5′-3 ’): TCCTTCAAGTATGCCTGGGTCT (eEF1A1-F1), joka vastaa nukleotideja kantoja 157-178. EEF1A1-käänteinen aluke sekvenssi oli: TGGCACAAATGCTACTGTGTCG (eEF1A2-R1), joka vastaa nukleotideja kantoja 555-576, jolloin saatiin odotettu PCR-tuotteen koko 420 emäsparia. Samoin PCR-alukkeet, jotka ovat spesifisiä eEF1A2 isoformin suunniteltiin käyttäen Ensembl cDNA-sekvenssi: ENST00000298049. EEF1A2-forward-alukkeen sekvenssi oli: AGGAGGCTGCTCAGTTCACCT (eEF1A2-F3), joka vastaa nukleotideja asemissa 1004-1024; ja eEF1A2- käänteisaluketta sekvenssi oli: CCGCTCTTCTTCTCCACGTTC (eEF1A2-R3), joka vastaa nukleotideja kantoja 1317-1336, odotetun PCR-tuotteen koko 334 emäsparia. Alukkeet syntetisoitiin käyttämällä kaupallisia laitokseen Eurofinsille MWG Operon (https://www.eurofinsdna.com/products-services/oligonucleotides0.html).

Käänteinen transkriptio PCR suoritettiin käyttäen 1 ui cDNA kustakin solulinjat, 10 pmol kutakin eteen- /taaksepäin-aluketta, ja 0,5 ui AccuPrime Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen, UK), 20 ui määriä. Lämpövuorottelu suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 minuutin ajan; 30 PCR-sykliä 94 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min ja lopullinen laajennus 72 ° C: ssa 7 minuutin ajan. Monistettujen PCR-tuotteiden (10 ui) erotettiin 2,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia, ja kuvattiin käyttäen GelDoc XR

+ Molecular Imager (Bio-Rad). Kaistaintensiteettejä mitattiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

PCR-tuotteet sekvensoitiin Genetics ydin laitos, University of Sheffield (https://www.shef.ac.uk/medicine/research /corefacilities/genetics.html). DNA-sekvenssit tehtiin näkyviksi käyttäen täyteläisyyden Lite-versio 2.01 ohjelmisto, vapaasti ladattavissa https://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.

Tulokset

Hierarkkinen klusterin analyysi proteiiniprofiilit

analyysi 4 yhdistettyjen potilasryhmät tunnistettu 122 proteiinit liittyvät tiedot niiden suhteelliset ekspressiotasot (taulukko S2). Väärät löytö oli 1,4%, joka on sallitulla 5% rajan [25]. Sillä iTRAQ aineisto, 75 proteiineja tunnistettiin ja suhteellisen määrällisesti kanssa ≥2 ainutlaatuinen peptidejä, ja nämä tiedot käytettiin tilastollisia analyysejä määrittää muutokset proteiinin tasot ryhmien välillä. Hierarkkinen klusterointi suoritettiin ryhmän tietojen perusteella samankaltaisuuden BPH ja syöpä ryhmiä. Agglomerative klustereiden käyttäen potenssiin Euklidinen etäisyys log

10 arvo iTRAQ suhteet ja pienin intercluster erilaisuutta sidos menettely suoritettiin (Mathematica 7.0.0 Mac), tuottaa dendrogrammia kuvassa 1. Keskeistä dendrogrammia on erottaminen potilasryhmien mukaan vaiheeseen sairautensa. Potilaat, joilla on etäpesäkkeitä erotti pisimmälle ja ovat siten pidetään kaikkein erilainen BPH-potilaille. Potilaat BPH ryhmittyneet tiiviimmin potilaita ei-etenee ryhmässä verrattuna etenee ja metastaattisen ryhmiä.

Näytteitä ryhmittyneet perustuu samankaltaisuuden niiden proteiinin ilmentymisen profiilit havaittu log

10 iTRAQ suhteet ja dendrogrammi syntyy osoittaa suhdetta näytteitä. Squared Euklidinen etäisyys klustereiden (single sidos) on esitetty. Eripituisia haarapisteet osoittavat samankaltaisuuden aste; lyhyempi haara korkeampi samankaltaisuuden asteesta.

Gene ontologia merkintä

arvioimiseksi erilaisia ​​proteiineja tunnistettu, geeni ontologian (GO) merkintöjä varten biologisten prosessien määrättiin käyttämällä proteiini analyysiin Evolutionary Ihmissuhteet (PANTHER) ohjelmisto, joka yhdistää proteiini liittyminen koodit vastaavat kohdat geenissä ontologian tietokannan [14], [27]. Pantheria analyysi paljasti monia yhteisiä plasman proteiineihin, kuten ne, jotka liittyvät komplementin välittämä immuniteetti (14%), koskemattomuus ja puolustus (27%), proteolyysiä (21%), veren hyytymiseen (7%), ja proteiinien aineenvaihduntaan ja muuttamista (22%).

biologiset verkon analyysi, Metacore alustan (GeneGo, Inc., St. Joseph, MI), käytettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14], joka osoitti, että monet eri tavoin ilmaistuna proteiineja, kuten C4, C4a, C5, C5b, C9 ja C6 kartoitettu klassisen immuunivasteen koulutusjakson (kuva S1).

Diagnostic biomarkkereiden johtaa

erot proteiinien tasot raportoitu t -testi analyysi aikaisemmin kuvatulla [23]. P-arvot laskettiin perustuen määrä peptidejä käytettiin kvantifiointia ja varianssi iTRAQ reportteri tunnusluvut on saatu näitä peptidejä. P-value≤0.01 käytettiin osoittamaan merkittäviä muutoksia proteiinien tasojen näytejoukoille. Tärkeää on, että proteiini muutokset ilmoitetaan merkittävä ero ilmentymisen valittiin perustuen tilastollista merkittävyyttä sijaan kertainen muutos [28]. Jotkut näistä eroista odotetaan olevan mahdollisesti suurempi johtuen tunnetaan arvio liittyy iTRAQ kvantifiointi [24].

Aikana analyysi olimme kiinnostuneita proteiinien osoittaen sekä lisätä ja vähentää ekspressiotasoja, koska aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että sekä merkittävästi up- ja alassäädetty proteiinit voivat olla kliinistä merkitystä [15], [29].

tunnistaminen proteiinien differentiaalisesti ilmaistut kuin etenee, etenee ja metastaattisen potilasryhmiä suhteessa BPH ryhmä olivat kiinnostavia, koska nämä voisivat johtaa potentiaalisesti hyödyllisiä ja ennustavia biomarkkerit (taulukko S3). Näin ollen vertailu ei-etenee syöpä ryhmä vs. BPH ryhmä osoitti merkittävää ero ilmaus 22 proteiinit; 7 joista säädelty ja 15 alassäädetty (taulukko S3a). Samoin vertailu etenee potilasryhmässä verrattuna BPH ryhmä tunnisti ero ilmaus 19 proteiinit; Joista 11 osoittivat merkittäviä yli-ilmentyminen ja 8 osoittivat alassäätöä (taulukko S3b). Vertailuja metastaattisen potilasryhmässä verrattuna BPH ryhmä tunnisti ero ilmentymä 35 proteiinien, 19 proteiineja osoittaa merkittävää yli-ilmentyminen ja 16 osoittaa merkittävää alassäätöä (taulukko S3C). Lisäksi C-reaktiivinen proteiini (CRP) todettiin olevan koholla 41,1 kertaiseksi seerumissa potilaiden etäpesäkkeitä verrattuna potilaisiin, joiden BPH (taulukko S2).

Prognostiset biomarkkereiden johtaa

Kun syöpädiagnoosi on tehty seuraavat vaiheet ovat laajuuden toteamisen (vaihe) sairauden, joka yrittää ennustaa ne potilaat, joilla tauti on todennäköisesti edetä potilaiden, joissa tauti on todennäköisesti edelleen paikallisia, ja saada varoituksia syntymässä olevista. Nykyisin esikäsittely PSA-arvot, koepala Gleason laatu ja kliininen lavastus käytetään antamaan varoituksia syntymässä olevista; kuitenkin, nämä parametrit liittyvät useita rajoituksia. Täten vertailu potilaalla on etenee versus muut etenevät tauti tunnistanut tärkeät ero ilmentymistä 25 proteiinit; 13 säädelty ja 12 alassäädetty (taulukko S4).

Differential proteiinin tasot liittyvät taudin etenemiseen

Lisäksi vertailujen edellä, proteiini erot kartoitettiin mukaan vaiheessa eturauhasen syövän kehittymisen ja etenemisen eli kun syöpä kehitetty hyvänlaatuisen epiteelin ja edennyt paikallisesti edennyt ja etäpesäkkeitä (kuva 2). Luettelot erot perustuvat vertailuja ei-etenee versus BPH ryhmä; etenevät versus muut etenee ryhmä; ja metastasoituneen vs. etenee syöpään ryhmiä. Kuviosta 2 on ilmeistä, että yksittäiset proteiinit, ”paria” proteiinien ja ”paneelit” proteiinien (määritelty ≥3 proteiinit), nähtiin ilmentyä erilailla tietyissä vaiheissa taudin kehittymistä ja etenemistä. Esimerkiksi yksittäisiä proteiineja, kuten alfa-2-makroglobuliini, lumican ja seerumin amyloidi P-komponentin nähtiin ilmentyä erilailla välillä ei etene verrattuna BPH ryhmä. Muita proteiineja, kuten beeta-2-glykoproteiini 1 ja somatomedin-B (sininen fontti), molemmat nähdä olevan suhteellisen pieneni ”pari” in etenee versus muut etenevät näytteet, vaikka sekä apolipoproteiini A-1V ja komplementtikomponentti 4B olivat nähtävä suhteellisen lisääntynyt ilmentyminen metastaattisessa näytteissä verrattuna etenee näytettä (oranssi fontti). Lisäksi kaksi ”paneelit”, nähtiin muutettava kuin tauti kehittyi ja eteni. Ensimmäinen paneeli koostuu 3 proteiineista: afamin, alfa-2-HS-glykoproteiini ketju B ja fibronektiinin 1 (esitetty punaisella), ja nähtiin suhteellisesti kasvanut ilmentyminen ei-etenee verrattuna BPH ryhmä, mutta laski kuten syövän edetessä ja pysyivät suhteellisen alhainen kuin syöpä metastasized. Toinen paneeli koostuu 7 proteiineista: alfa-1-antikymotrypsiini; cDNA FLJ55673, hyvin samankaltainen täydentää tekijä B; cDNA FLJ54228, hyvin samankaltainen leusiinirikkaita alfa-2-glykoproteiini; cDNA FLJ58564, hyvin samanlainen plasman proteaasi C1-inhibiittori; Keruloplasmiini, Täydennä C5 ja komplementtikomponentti C9b (vihreä fontti), ja katsottiin liittyvän suhteellisen vähentynyt ilmentyminen ei-etenee ryhmässä verrattuna BPH ryhmä, ja suhteellisen lisääntynyt ilmentyminen, kun syövän edetessä eli olivat suhteellisesti lisääntynyt etenee ryhmä ja pysyi koholla metastasoituneessa ryhmässä.

luettelo ilmentyvät eri proteiinien näkyy perustuvat vertailun kuin etenee versus BPH; etenevät vs. ei etene ja metastasoitunut vastaan ​​etenee ryhmiä. Huomaa ero proteiinien ekspression joko yksin (musta fontti), pareittain (sininen, oranssi ja violetti fontteja), tai paneelin (≥3 proteiineja, vihreä ja punainen fontteja). (*) = Tunnistettu yhdeksi korkea luottamus peptidi.

Mielenkiintoista, eukaryoottitranslaatioon venymä 1 alfa 1 (eEF1A1), (alias EF-Tu), nähtiin osoittaa merkittävää voimistunutta ilmentymistä in non -progressing syöpä suhteessa BPH, ja sen ekspressio lisääntyi edelleen sairauden etenemistä, ja säilyi etäpesäkkeiden (taulukko S2 ja kuvio 2). eEF1A1 oli alkuun hitti seuraavat BLASTP etsimään VETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVK peptidin yksilöityjen seeruminäytteistä. Vertailu täyspitkän aminohapposekvenssin eEF1A1 sen isoformin eEF1A2, osoittivat, että peptidi sekvenssi oli ainutlaatuinen eEF1A1. Vastaava peptidi eEF1A2 eroaa yhden aminohapon, jossa valiini on substituoitu isoleusiini. Koska nämä aminohapot ovat 14 Da ero molekyylimassa voisimme luottavaisesti antaa identifioitu peptidi vastaamaan eEF1A1 isoformin.

Vahvistus ehdokkaiden tunnistaa iTRAQ

Vahvista ero ilmaus ehdokas proteiinit tunnistetaan iTRAQ, me ryhtyneet harjoittamaan 1D-geelielektroforeesilla käyttäen yhdistettyä seerumia 4 potilasryhmille. Seuraavat värjäys Coomassie-sinisellä, heikko bändi visuaalisesti nähtävissä olla läsnä hieman suurempi intensiteetti näytteissä potilailta, joilla on metastaattinen sairaus, suhteessa muihin 3 potilasryhmissä (tuloksia ei ole esitetty). Tämä juova leikattiin geelistä, digestoitiin trypsiinillä ja saatu peptidien analysoitiin LC-MS /MS: llä. Massaspektrometriasta data tunnistettu 7 peptidien matching CRP sekvenssin kanssa kattavuus 27,6%, ja vahvisti iTRAQ tiedot. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.