Krooninen sairaus

tiivistelmä

Expression of Caveolin-1 (Cav1), keskeinen osa solun pinnan kaveoleja, on kohonnut eturauhassyövän (PCA) ja liittyy PCa etäpesäke ja huono ennuste PCA potilaille. -Polymeraasi I ja Transcript Release Factor (PTRF) /cavin-1 on sytoplasminen proteiini tarvitaan Cav1-riippuvainen muodostuminen kaveoleja. Expression of PTRF vähentää motiliteettia PC3-soluja, metastaattinen eturauhassyöpä-solulinjaa, joka endogeenisesti ilmentää runsaasti Cav1 mutta ei PTRF eikä kaveoleja, mikä viittaa rooliin ei-caveolar Cav1 domeeneja, tai Cav1 telineitä, PCA solujen vaeltamiseen. Tyrosiinifosforyloitunutta Cav1 (pCav1) toimii yhteistuumin galektiini-3 (Gal3) ja galektiini ristikko vakauttamiseksi fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) sisällä paikallisia tarttumista (FA) ja edistää syövän solun liikkuvuus. Kuitenkin onko PTRF sääntely Cav1 funktion PCA solumigraation liittyy Gal3 ilmaisun ja toiminnallisuus on vielä määritettävä. Tässä osoitamme, että PTRF ilmentymistä PC3-soluissa vähentää FAK vakauttaminen paikallisessa tarttumisessa ja vähentää soluliikkuvuus vaikuttamatta pCav1 tasoilla. Eksogeeninen Gal3 stabiloitu FAK paikallisessa tarttumisessa on PTRF-ilmentävien solujen ja palauttaa solun motiliteettia PTRF ilmentävien PC3-solujen tasot PC3-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla, ja optimaalinen pitoisuus on 2 ug /ml. Eksogeeninen Gal3 vakiintui FAK paikallisessa tarttumisessa on Gal3 Knockdown PC3-soluissa, mutta ei Cav1 knockdownin PC3-soluissa. Cav1 Knockdown esti myös Gal3 pelastaminen FA liittyvien FAK vakauttamista PTRF ilmentäviä PC3-soluissa. Tuloksemme tukevat rooli PTRF /cavin-1 kautta kaveoleja muodostumista, koska vaimenninta ei-caveolar toimivuus Cav1 in Gal3-Cav1 signalointi ja sääntelyn fokaalisen adheesion dynamiikan ja syöpäsolun muuttoliike.

Citation : Meng F, Joshi B, Nabi IR (2015) galektiini-3 ohitukset PTRF /Cavin-1 vähentäminen PC3 Eturauhassyöpä Cell Migration. PLoS ONE 10 (5): e0126056. doi: 10,1371 /journal.pone.0126056

Academic Editor: Christophe Lamaze, Institut Curie, FRANCE

vastaanotettu: 28 marraskuu 2014; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2015; Julkaistu: 05 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Eturauhassyöpä Canada, Canadian Institutes for Health Research (MOP-126029), Kiina Scholarship neuvosto-UBC jatko stipendi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat kilpailevia intressejä: Co-kirjailija Ivan Nabi on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Caveolin-1 (Cav1), jäsen caveolin proteiini perhe, on keskeinen osa kaveoleja , pullo-muotoinen kohtiin, solun pinnalla mukana monissa solun prosessit, kuten vesicular liikenteen, solunsisäinen signalointi ja mekaaniset transduktio [1]. Cav1 on mukana sääntelyn Lipidilauttojen ja useiden syöpään liittyvien prosessien kuten solukuoleman ja selviytymistä, solumigraatio ja invaasio ja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [1-4]. Cav1 ilmentyminen on kohonnut metastaattisessa eturauhassyöpä (PCA) solut ja Cav1 on arvioitu ennustetyövälineenä merkki aggressiivisen PCa [5-7]. Cav1 on myös todettu liittyvän PCa etäpesäkkeitä hiiren ja ihmisen PCa solulinjoissa [5, 8]. PC3 on metastaattinen eturauhassyöpä solulinjaa, joka ilmentää runsaita tasoja tyrosiinifosforyloituu Cav1 (pCav1), mutta siitä puuttuu solun pinnan kaveoleja puuttumisen vuoksi polymeraasi 1 ja transkripti julkaisu kerroin (PTRF) /cavin-1, vaaditaan yhdessä Cav1 varten kaveoleja muodostumiseen [7, 9-11]. N yli-ilmentyminen PTRF PC3-soluissa vähenee soluliikkuvuus alhaisimpina matriisi-9 (MMP-9) tuotanto [12]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että PTRF /cavin-1 ilmentymisen muuttaa PC3-solujen secretome vaikuttamalla kolesterolin dynamiikka ja aktiinisytoskeletonin, ja vaimentaa edistäminen PCa etenemistä ei-caveolar Cav1 microdomain [13, 14].

Cell muuttoliike, kriittinen tekijä etäpesäkkeitä, on dynaaminen ja monivaiheinen prosessi säännellään spatiotemporal palautteen välillä actomyosin supistuminen, aktiini polymerointi ja jatkuva purkaminen ja kiinnikkeen muodostumisen [15-17]. Focal kiinnikkeistä (FA) ovat makromolekyyliyhdisteiden kokoonpanot, jotka yhdistävät soluväliaineen ja solun tukirangan ja välittää mekaanisen voiman ja säätelysignaalit [18, 19]. Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on merkittävä kinaasi mukana FA signalointi ja säätelee polttovälin tarttuvuus dynamics kautta kinaasidomeeniin (FRNK) ja tyrosiini 397 (Y397) autofosforylaatio. Alennettu FAK Y397 fosforylaatio liittyy lisääntynyt FAK välisen FA ja sytosolin, hitaampi FA purkaminen ja vähentää solujen vaeltaminen [20, 21]. pCav1 lisää membraanilipidiin järjestystä FA ja edistää FAK vakauttamisen FA useissa syöpäsolulinjoissa lukien PC3 PCa solulinja, solulinjaa, joka ilmentää ei endogeenista PTRF eikä näin ollen kaveoleja, viittaavia rooli kuin caveolar Cav1 tukirunkoja [4 , 11, 22]. Cav1 on merkittävä substraatti Src Se fosforyloituu tyrosiini 14 (Y14) [23-26]. Ihmisen rinta-, paksusuolen ja eturauhasen syöpä solulinjoja, Src-riippuvainen fosforylaatio Cav1 edistää FAK vakauttaminen paikallisessa tarttumisessa, fokaalisen adheesion liikevaihdon, RhoA signalointi ja solujen vaeltaminen ja invaasiota [11]. Galektiini-3 (Gal3), galaktoosia lektiiniä perheen sitoutuu ensisijaisesti solun pinnan GlcNAc-transferaasi V (Mgat5) modifioituja N-glykaanien, stimuloi FAK ja PI3K aktivointi, parantaa integriini aktivointi ja rekrytointi fibrillaarisessa kiinnikkeistä, ja kasvaa F- aktiini vaihtuvuus [27-30]. Olemme osoittaneet, että pCav1 ja Gal3 toimivat yhdessä vakauttamiseksi FAK sisällä FA ja edistää FA dynamiikkaa ja solujen vaeltaminen ja koordinoida ilmaus Cav1 ja Gal3 erottaa kilpirauhassyöpäpotilailla hyvänlaatuisesta [4, 31].

Kuitenkin on vielä selvitettävä, miten ilmaus PTRF ja siten, kaveoleja, vaikuttaa yhdenmukaistetut Cav1-Gal3 sääntely FA dynamiikkaa ja solujen vaeltamiseen. Siksi käytetään PC3 PCa soluja, joilta puuttuu PTRF ja kaveoleja mutta ilmaista Cav1 ja pCav1, nimenomaan roolin määrittämiseksi PTRF in Cav1-Gal3 sääntely FA dynamiikan ja syöpäsolun muuttoliike.

Tulokset

Expression of PTRF /Cavin-1 vähenee PC3 solujen vaeltamiseen ja häiritsee FAK vakauttamiseen paikallisessa tarttumisessa

PC3 syöpäsolujen jotka ilmentävät pysyvästi PTRF-GFP (PC3-GFP-PTRF) määrä aleni soluliikkuvuus verrattuna PC3-solujen vakaa ilmentävien GFP (PC3-GFP) tai ei-transfektoituja PC3-solujen (kuvio 1A), kuten aikaisemmin on raportoitu [12]. Pienentynyt migraatio PC3-PTRF-GFP-solujen ei liittynyt muuttunut määrä paikallisessa tarttumisessa merkitty FAK (kuvio 1 B). Määrittää FAK vakauden FA, PC3-solut transfektoitiin FAK-GFP yksin, FAK-GFP plus mCherry tai FAK-GFP plus PTRF-mCherry ja alistettiin fluoresenssin toipuminen Valovalkaistuminen (FRAP) määritys. Kuten kuviossa 1C, ilmentymisen PTRF-mCherry lisäsi mobiili osa FAK-GFP FA suhteessa PC3-soluja, jotka on transfektoitu FAK-GFP yksin tai FAK-GFP mCherry. Lisääntynyt liikkuva osa, lisääntynyt fluoresenssi talteenotto FAK-GFP suhteessa ennalta valkaisuaine fluoresenssin intensiteetin, kuvastaa suurempia vaihto FAK-GFP välillä polttovälin tarttuvuus ja sytosolin siten vähemmän vakauttamista FAK-GFP sisällä FA. PTRF ilme ollen vähenevät FAK vakautuksen FA, ohjeelliset lisääntyneestä vaihtoa soluliman FAK ja vähentää FA purkaminen [20, 21].

(A) TranswellTM migraatiokokeessa osoittaa, että PC3-GFP-PTRF solut vaeltavat hitaammin kuin villi tyyppinen PC3 ja PC3-GFP-soluissa. (B) edustaja konfokaali kuvia PC3, PC3-GFP: n ja PC3-GFP-PTRF solujen ja kvantifiointi FA per solu kussakin solulinjat osoittavat, että määrä FA per solu ei merkittävästi vaikuta PTRF ilmentymistä solussa. (C) Fluoresenssi Recovery jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP) määritys osoittaa, että FAK-GFP intensiteetin palautumistaso lisääntyy PTRF-mCherry kotransfektioon verrattuna FAK-GFP yksin tai FAK-GFP ja mCherry kotransfektiojärjestelmää. FAK-GFP intensiteetin talteenotto käyrä kuvaaja yhdessä edustavassa kokeessa ja baari kuvaaja FAK-GFP mobiili murto (laskettu fluoresenssi- elpyminen tasangolla) tiivistetysti kaikista kokeista näkyvät. (N≥3; ***: p 0,001; **: p 0,01; *: p 0,05.)

PTRF ilmaisu ei vaikuta PCAV1 tasoilla, mutta ylimääräisiä GAL3 hoitoa restrores FAK vakauttaminen FA ja solun motiliteettia PTRF ilmentävien PC3-solujen

tyrosiinifosforyloitunut Cav1 (pCav1) säätelee muuttoliike useiden syövän solulinjojen PC3 [4, 11]. Vakaa PTRF ilmentyminen PC3-soluissa, mutta ei muuttanut Cav1 ekspressiotasoja tai fosforylaation (kuvio 2). Kuten Gal3 on osoitettu toimivan yhdessä pCav1 säännellä FAK vakautta FA [4, 31], testasimme eksogeenisiä Gal3 voisi palauttaa FAK vakaantumisesta FA PC3-PTRF-GFP-soluissa. Lisääminen His-merkitty Gal3 (Gal3-His) pitoisuuksina 1-4 ug /ml ei vaikuttanut FAK vakauttamisen FA PC3-soluissa. Kuitenkin PTRF ilmentäviä PC3-solut, lisäämällä 1,5 tai 2 ug /mlGal3-His merkittävästi palautti vakauttamista FAK in FA, 2 ug /ml Gal3-His vakauttava FAK FAS merkittävimmin (p 0,001); Lisäksi korkeampi (3 tai 4 ug /ml) tai alempi (1 ug /ml), pitoisuudet Gal3-His ei palauttaa FA liittyy FAK stabilointi (kuvio 3A). Annos-riippuvuus Gal-His vakauttaminen FAK in FA on sopusoinnussa käsite galektiini ristikko, jossa kriittinen suhde Gal3 jotta glykaanitähteen alustoille mahdollistaa optimaalisen glykoproteiini silloittuminen, joka johtaa reseptoriin dynamiikka ja signalointi [32, 33] . Transwell solumigraation testi osoitti, että optimaalinen 2 ug /ml Gal3-His parantaa siirtymistä kaikkien kolmen solulinjojen (PC3, PC3-GFP: n ja PC3-GFP-PTRF) ja suuressa määrin ja samalla tasolla (kuvio 3B) . 1, 1,5 ja 3 ug /ml Gal3-His ei ollut vaikutusta solun migraation ohjaus PC3 ja PC3-GFP-soluissa, mutta kohonnut PC3-GFP-PTRF solumigraation tasoa käsittelemättömien PC3 ja PC3-GFP-soluissa (kuvio 3B). 4 ug /ml Gal3 ei merkittävästi vaikuta solujen migraation tahansa solulinjoista (kuvio 3B). Eksogeenisen Gal3 proteiinin vuoksi palauttaa puutteellinen FAK vakauttamista FA ja vähentää kulkeutumista PTRF ilmentävien PC3-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla.

Western blot osoittaa ekspressiotasot GFP, GFP-PTRF, Cav1 ja pCav1 PC3 villityypin solujen (PC3), PC3-solut transfektoitiin stabiilisti GFP (PC3-GFP) ja PC3-soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu GFP-PTRF (PC3-GFP-PTRF). Western blot bändi intensiteetti Cav1 ja pCav1 on laskettu ja normalisoitu kuin β-aktiini ja osoita mitään merkittävää eroa Cav1 ilmaisun tai fosforylaation välillä PC3, PC3-GFP ja PC3-GFP-PTRF soluissa. (N≥3; ***: p 0,001).

(A) FRAP määritys FAK-GFP näkyy FA-liittyvä FAK vakauden PC3 transfektoiduissa soluissa FAK-GFP yksin tai FAK GFP plus PTRF-mCherry ja alistettiin Gal3-His hoidon ilmoitettuina pitoisuuksina (1, 1,5, 2, 3, tai 4 ug /ml). Alennettu FAK vakauttamiseen FA of PTRF ilmentävien PC3 soluihin palautettu Gal3-His annoksesta riippuvaisella tavalla. Janagrafiikka on FAK-GFP mobiili murto tiivistetysti kaikista kokeista ja edustava FAK-GFP palautumiskäyrä kuvaajan yhdestä koe (näytetään NT ja 2 ug /ml Gal3-His käsittely vain) näkyvät. (B) kvantifiointi PC3, PC3-GFP: n ja PC3-GFP-PTRF solumigraation käyttäen transwell määritystä ilman hoitoa tai käsitelty Gal3-His (1, 1,5, 2, 3 tai 4 ug /ml) osoittaa, että 2 ug /ml Gal3-His hoito lisää solumigraation kaikkien solulinjojen samassa määrin. Muut pitoisuudet Gal3 kasvu migraation PC3-GFP-PTRF solujen vähäisemmässä määrin, mutta ne eivät vaikuta kulkeutumista PC3 tai PC3-GFP-soluissa. (NT: ei käsitelty; n≥3 *: p 0,05; **: p 0,01, ***: p 0,001; ns: ei merkittävää.)

GAL3 pelastaminen FA-liittyvä FAK vakauttaminen on CAV1 riippuva

Voit selvittää endogeeninen Gal3 stabiloi FAK FAS PC3-solujen, me köyhdytetyn Gal3 siRNA saadaan yhdenmukainen 90%: n vähennys Gal3 tasoilla 48 tunnin jälkeen (kuvio 4A). 24 tunnin kuluttua me transfektoidut solut FAK-GFP yksin tai FAK-GFP yhdessä PTRF-mCherry, ja kohteli heitä tai ei 2 ug /ml Gal3-His ennen FRAP analyysi FAK-GFP vakauden FA. Kuten kuviossa 4B, knockdovvn Gal3 (Gal3 KD) vähensi FAK vakautuksen FA, samassa määrin kuin havaittiin PTRF ilmentävien PC3-soluissa, kun taas siCTL ollut vaikutusta FAK vakauttamiseen verrattuna transfektoimattomiin soluihin. Tärkeää on, hoito Gal3-His pelastettu FAK vakaantumisesta FA sekä PTRF ilmentävien ja Gal3 taintumisen soluja (kuvio 4B).

(A) Western blot osoittaa tehokkuutta Gal3 siRNA knockdown. (B) FRAP määritys osoittaa FA liittyvä FAK-GFP vakauden PC3-soluissa, jotka on transfektoitu ilman siRNA, sekoituskoodin ohjaus siRNA (siCTL) tai siRNA ihmisen Gal3 (siGal3), ja alistettiin 2 ug /ml Gal3-His hoitoon. FAK-GFP intensiteetin talteenotto käyrä kuvaajat yhdessä edustavassa kokeessa ja baari kuvaaja FAK-GFP mobiili murto tiivistetysti kaikista kokeista näkyvät. (N = 3; ***: p 0,001).

sitten pudotettiin Cav1 PC3-soluissa siRNA (siCav1) (kuvio 5A) ennen transfektiota joko FAK-GFP yksin tai FAK GFP plus PTRF-mCherry ja hoito eksogeenisen Gal3-His (2 ug /ml). siCav1 lisäsi liikkuva osa FAK-GFP FA PC3 muttei PTRF ilmentävien PC3-soluissa, jotka osoittavat, että Cav1 selektiivisesti säätelee FA dynamiikka PC3-soluissa puuttui PTRF (kuvio 5B). Gal3-His pystynyt edistämään FAK vakauttamiseen FA PC3 tai PC3-PTRF solut, joissa Cav1 pudotettiin (kuvio 5B). Cav1 vuoksi on välttämätöntä, Gal3 riippuvaisten FAK vakauttamista FA PC3-solujen. Koordinoivan sääntely FA dynamiikan Cav1 ja Gal3 vuoksi vaikuttaa ilmaus PTRF ja Cav1 rekrytointi kaveoleja. Tämä viittaa siihen, että rekrytointi Cav1 jotta kaveoleja voi muuttaa suhdetta ei-caveolar Cav1 ja Gal3 joka on kriittinen niiden koordinoitua sääntelyä FA dynamiikan ja syöpäsolun muuttoliike.

(A) Western blot osoittaa tehokkuutta Cav1 siRNA knockdown. (B) FRAP määritys FAK-GFP esittää FA-liittyvä FAK vakaus PC3-soluja, jotka oli transfektoitu ilman siRNA, sekoituskoodin ohjaus siRNA (siCTL) tai siRNA ihmisen Cav1 (siCav1), ja alistettiin 2 ug /ml Gal3-His hoidon . FAK-GFP intensiteetin talteenotto käyrä kuvaajat yhdessä edustavassa kokeessa ja baari kuvaaja FAK-GFP mobiili murto tiivistetysti kaikista kokeista näkyvät. (N = 3; ***: p 0,001).

Keskustelu

cavin perheeseen kuuluu PTRF /cavin-1, SDPR /cavin-2, PRKCDBP /cavin- 3 ja MURC /cavin-4, joka jakaa konservoitunut N-terminaalinen domeeni, joka koostuu heptad toistojen hydrofobisia aminohappoja, mahdollisesti muodostaen coiled kelat, ja seuraavissa alue useiden emäksisten aminohappojen [34]. Ilmentymisen cavins liittyy ilmentymisen ja vakauttamiseen Cav1 ja muodostumista ja toimintaa kaveoleja [34]. Niistä cavins, PTRF /cavin-1 on välttämätön kaveoleja muodostumista ja menetys PTRF johtaa menetykseen kaveoleja ja downregulation Cav1 proteiinin tasoja [9, 35]. Cav1 on lauseketta ei-caveolar toiminnot [36-38] ja stoikiometria välillä caveolins ja cavins väistämättä vaikuttaa ilmaus paitsi kaveoleja vaan myös ei-caveolar Cav1 verkkotunnuksia tai Cav1 tukirunkoja. PC3-solut ovat erinomainen solun malli tutkia ei-caveolar toimintoja Cav1 koska sillä ei ole PTRF ja kaveoleja mutta osoittavat kohonneita Cav1 [7]. Todellakin, ilmentyminen PTRF PC3-soluissa neutraloi kuin caveolar Cav1 mikrodomaineja ja muuttaa solun liikkuvuus, eritys polkuja ja angiogeneesiä ja imusuonten kykyjä PC3-soluissa [12-14, 39, 40]. Johdonmukaisesti, osoitamme tässä, että PTRF ilmentyminen PC3-soluissa rajoissa Cav1-Gal3 sääntely FAK vakauttamisen FA ja solun liikkuvuus.

Gal3 ja pCav1 toimivat konsertti edistää FA dynamiikkaa ja solun liikkuvuus. pCav1 edistää solujen polarisaatio ja muuttoliike ja säätelee membraanilipidiin järjestyksessä FA [4, 22, 26]. Gal3 sitoutuminen solun pinnan Mgat5-modifioitu N-glykaanien muodostaa galektiini ristikko, joka stimuloi FAK ja PI3K aktivointi, ja edistää integriinin aktivaation ja F-aktiini liikevaihdon [27-30]. Gal3 indusoi integriini α5β1 aktivointi ja FAK (p397FAK) fosforylaatio, joka liittyy FAK vakautuksen FA, lisääntynyt FA signalointi ja purkaminen, ja siten solujen muuttoliike [20, 21, 28]. Lisäksi soluissa, joilta puuttuu galektiini ristikko puuttumisen vuoksi Mgat5, pCav1 ei riitä edistämään FA liittyviä FAK vakauttamiseksi; ilmaus Mgat5 ja galektiini ristikko lisää solujen leviämisen ja indusoi FA mutta vaatii pCav1 vakauttaa FAK sisällä FA [4]. Johdonmukaisesti, koordinoitu ilmaus Cav1 ja Gal3 havaitaan kilpirauhassyöpäpotilailla solulinjat ja siRNA Knockdown määritykset samassa solulinjoissa osoittavat, että sekä Cav1 ja Gal3 tarvitaan edistämään FAK vakauttamiseen FA ja solumigraatio verrattuna hyvänlaatuinen kilpirauhasen lesion- peräisin olevat solut [31]. Uudemmat tiedot osoittavat, että Gal3 tarvitaan epidermaalisen kasvutekijän (EGF) signalointi, joka indusoi Cav1 fosforylaatiota ja edistää pyöreä selkä ruffle (CDR) muodostumista, solujen vaeltamiseen ja fibronektiinin fibrillo-; nämä tutkimukset johtivat ehdotusta, jonka Gal3-integriini-pCav1 signalointi moduuli, joka välittää EGF signalointi Rho [41]. Tämä viittaa siihen, että ulkona-integriinin signalointia välittää yhteisiä Gal3-pCav1 sääntely FA dynamiikkaa, jossa solunulkoinen Gal3 vuorovaikutuksessa ja aktivoi integriinien joka sitten rekrytoi pCav1 johtaa alavirran RhoA signalointi ja migraatiota.

Tuloksemme osoittavat, että PTRF ilmentyminen PC3-soluissa ei muuta Cav1 tai pCav1 tasoa, mikä viittaa siihen, että PTRF säätelee pCav1 toimintoa FA dynamiikan kautta Cav1 rekrytointi kaveoleja, vähentää saatavuus toiminnallisten pCav1 ulkopuolisissa caveolar rakennusteline verkkotunnuksia. Muodostaminen kaveoleja voi säädellä ilmentymistä ja toimintaa ei-caveolar Cav1 tukirunkoja rekrytoimalla pCav1 ja kaveoleja. Cav1 Y14 fosforylaatio on tarpeeton kaveoleja muodostumista, mutta pCav1 on paikallistettu kaveoleja [42, 43]. Itse asiassa on osoitettu, että etuoikeutettu ilmentyminen Cav1 ei-caveolar Cav1 domeenien puuttumisen vuoksi on PTRF liittyy pitkälle PCa ja että ilmentyminen PTRF /kaveoleja neutraloi ei-caveolar Cav1 domeenien hidastaa PCa etenemistä [14] . Se, että ylimääräinen Gal3 voi palauttaa pCav1 riippuvainen FA signalointi osoittaa, että yhteisiä vuorovaikutus Gal3 ja pCav1 on kriittinen niiden kyky säädellä FA signalointi ja dynamiikkaa. Ja konsentraatioalueella 1-4 ug /ml, 2 ug /ml oli optimaalinen pelastamaan PTRF-ilmentävien solujen esiin riippuvuutta pitoisuudesta ja Gal3 hilan toiminnon. Samoin Gal3 stimulaatio integriini-riippuvaisen fibronektiini fibrillo- riippuu pitoisuudesta [28]. Integriinit muuttamat Mgat5 ja Gal3 aktivoi α5β1 integriinin ja värvää sen säikeisen kiinnikkeistä [28, 44]. pCav1 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa integriinien ja moduloida lipidien järjestyksen FA [22, 45-47]. Meidän tiedot osoittavat, että suhteellinen pitoisuus Gal3 ei-caveolar pCav1 on kriittinen säätelijä Gal3-pCav1 signalointi ja että PTRF on uusi säätelijä tämän signaloinnin moduulin. PTRF on osoitettu muuttavan exosomal eritystä PC3-solujen [13] ja siitä, onko PTRF häiritsee Gal3-pCav1 moduuli rajoittamalla Gal3 eritystä, tai sitomalla pCav1 osaksi kaveoleja ja pois ei-caveolar Cav1 telineitä, tai jopa suoraan vuorovaikutuksessa muiden -caveolar Cav1 rakennustelineet, on vielä määrittämättä (kuvio 6).

Extracellular Gal3 ja ei-caveolar pCav1 kunkin stabiloi FAK sisällä FA toisistaan ​​riippuvaisia. Expression of PTRF häiritsee tätä toimintoa kolmella tavalla: 1) rekrytoimalla pCav1 pois ei-caveolar Cav1 tukirunkoja ja osaksi kaveoleja; 2) suoralla vuorovaikutus ulkopuolisten caveolar pCav1; 3) vaikuttamalla Gal3 eritystä ja siten solunulkoisen Gal3 pitoisuus. Jonka kautta polku PTRF vaikuttaa Gal3-pCav1 toiminto FA dynamiikan jää tutkittavaksi.

Sekä Cav1 ja Gal3 tärkeä rooli PCa etenemistä. Gal3 on tunnustettu tärkeäksi säätelijänä PCa etäpesäkkeiden [48-50] ja useita yrityksiä on tehty kohdistaa Gal3 PCA, käyttäen joko Gal3 sitovan syöpään liittyvän Thomsen-Friedenreich glycoantigen (TF-Ag) -mimic laktoosittoman L-leusiini tai korkean affiniteetin Gal3-bingding glykopeptidi puhdistettiin turskan [51, 52]. Cav1 on arvioitu ennustetyövälineenä merkki aggressiivisen PCa 1990-luvulta lähtien [5, 6].

Uudemmat tiedot viittaavat siihen PTRF neutraloi Cav1 toiminta syytetään ratkaiseva rooli kuin caveolar verkkotunnuksia PCA [14]. Meidän osoitus että Gal3 voi kääntää pienentää FAK vakauttamista FA ja soluliikkuvuus aiheuttama PTRF tunnistaa Gal3 ja pCav1 kriittisiksi säätelijöinä toiminta ei caveolar verkkotunnuksia PCA solujen vaeltamiseen. Koordinoida toimintaa Cav1 ja Gal3 voi siksi olla tärkeä rooli PCA etäpesäke ja edustavat potentiaalinen terapeuttinen kohde PCA.

Materiaalit ja menetelmät

Antibodies, plasmidit, siRNA Rekombinanttilinturokko ihmisen Gal3-His

naudan seerumin albumiinia (BSA), ja hiiren anti-β-aktiini-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma-Aldrich. Kanin anti-FAK ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc., kanin anti-pY14Cav1 Cell Signaling, Inc., ja hiiren anti-PTRF ja kanin anti-Cav vasta BD Transduction Laboratories. HRP-konjugoidut hiiren ja kanin sekundaarinen vasta-aineet hankittiin Jackson Immuno- Laboratories. Falloidiinia ja toissijainen vasta konjugoitu Alexa 488, 568 tai 647 hankittiin Life Technologies, Thermo Fisher Scientific. PTRF-mCherry ja mCherry plasmidit olivat antelias lahja tri Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, The University of Queensland, Translational tutkimuslaitos, Brisbane, QLD, Australia). FAK-GFP-plasmidi, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Validoitu-KOHDE plus SMARTpool pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) ihmisen Cav1, ohjaus siRNA (siCONTROL ei kohdistettu siRNA no. 1) ja mukautettuja siRNA-dupleksit varten Gal3 [53] hankittiin Dharmacon.

Rekombinantti ihmisen Gal3 koodattu 6xHis C-terminaali synnytettiin käyttäen plasmidia, pHIS-Parallel2, kuvattu aiemmin [54]. Tämä plasmidi ja protokollat ​​olivat ystävällinen lahja Ludger Johannes (Institut Curie, Pariisi, Ranska). Jotta saadaan aikaan Gal3-His, käytettiin BL21-DE3 bakteerien (New England Biolabs). Lyhyesti, yön viljelmä uudelleen siirrostettiin (1: 5) tuoreeseen LB täydennetty ampisilliinia ja viljeltiin 37 asteen lämpötilassa 225 rpm ravistimessa kunnes optinen tiheys 600 saavutti 1 ja indusoitiin sitten käyttäen 0,4 mM IPTG 3 tuntia 30 asteen lämpötilassa on 225 rpm ravistimessa. Rekombinantti Gal3-His puhdistettiin Talon affiniteettimatriisiin (Clontech) mukana toimitetulla protokollaa, siirretään 1x PBS ennen pakastus nestemäisessä N2.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen PC3 solulinja oli American Type Culture Collection (ATCC) ja ylläpidetään täydellisessä RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). PC3 solulinjat ilmensivät stabiilisti GFP tai PTRF-GFP (PC3-GFP ja PC3-GFP-PTRF) oli antelias lahja tri Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, Brisbane, Australia) [13]. Kaikkia solulinjoja siirrostettiin vähintään kahdesti toipumisen jälkeen jäädytetty varastoista ennen aloittamista kokeiluja ja pidettiin viljelmässä enintään 8-10 kohtia minimoimiseksi fenotyyppisen ajelehtia.

plasmiditransfektiolla tehtiin 24 tunnin kuluttua pinnoitus solujen tai siRNA transfektio käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) seuraten valmistajan protokollaa. Kokeet suoritettiin 24 tunnin kuluttua plasmiditransfektiolla. Jotta pudotus Cav1, soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa 24 tuntia ennen transfektiota, joilla on erityisiä hiiren Cav1 siRNA tai ohjata siRNA smartpools (hiiren siCav1: L-0058415-00, siCONTROLS: D-001210-01, Dharmacon) käyttäen Lipofectamine 2000 transfektion reagenssia (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) seuraten valmistajan protokollaa. Sillä Gal3 Knockdown käytimme aiemmin kuvattu mukautettuja siRNA oligonukleotidisekvenssit ja protokolla [53]. Lyhyesti, solut transfektoitiin erityisen altaan neljän mukautetun syntetisoitiin hiiren Gal3 siRNA oligonukleotidien dupleksit tai ohjata älykkäitä allas siRNA (siCONTROLS) käyttäen Lipofectamine 2000 Soluja kasvatettiin 48 tuntia ennen koetta.

Western blotting

Solupelletit 80% konfluentteja viljelmiä pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl: a, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA: ta, joka sisälsi tuoretta lisättiin 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 mM natriumvanadaattia, 2,5 mM natriumfluoridi, ja 1 uM leupeptiiniä) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pelletoitiin 13000 rpm 4 ° C: ssa, ja supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 ° C. Yhtä suuret määrät proteiineja erotettiin 12% SDS-PAGE, ne elektroblotattiin nitroselluloosalle (GE Healthcare Life Science), tutkittiin vasta-aineiden kanssa ja HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita, ja paljastettiin ECL (Merck Millipore).

Immunofluoresenssi merkintöjä

Solut kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä (PFA) ja 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, huuhdeltiin PBS: lla, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS /CM, estettiin PBS /CM, joka sisälsi 0,2% naudan seerumin albumiini (BSA), ja inkuboitiin sitten primääri- ja fluoresoivia sekundaarisia vasta-aineita PBS: ssä /CM, joka sisälsi 0,2% BSA: ta. Sen jälkeen Tuoteselostemerkintöjen peitelaseja asennettu CelVol (Celanese, Ltd.), ja kuvia hankittu 100 × planapochromat tavoitteisiin (NA 1,35) olevan FV1000 Olympus -konfokaalimikroskoopilla.

FRAP mittaukset

FRAP suoritettiin -konfokaalimikroskoopilla (FV1000, Olympus) varustettu 60x planapochromat tavoite (NA 1,35, öljy) ja SIM-skanneri. Solut maljattiin alhaisella tiheydellä FN (10 ug /ml) 24 h 8 hyvin μ-dia kammio (ibidi), transfektoitu FAK-GFP tai FAK-GFP plus mCherry tai FAK-GFP plus PTRF-mCherry, ja kokeet suoritettiin 24 tuntia myöhemmin 37 ° C: ssa. siRNA transfektoitiin 48 h ennen FRAP kokeita. Soluja käsiteltiin Gal3-His muuttamalla väliaineen seerumia sisältävät osoitettu pitoisuus Gal3-His 10 min ennen kuin se siirtyy takaisin bikarbonaatti-free RPMI. Kunkin FRAP analyysin mukaan prebleach runko hankittiin jälkeen yksi yksittäinen valkaisuainetta tapahtuma käyttäen samanaikaisesti ja riippumaton stimulaation 405 linja SIM skannerin. Fluoresenssi talteenotto seurasi 4-aika välein, kunnes intensiteetti saavutti tasanteen. Fluoresenssi palautumisen aikana normalisoitiin prebleach intensiteettiä. Intensiteetti suhdeluvut valkaistu alueella verrattiin ennen valkaisua ja talteenoton jälkeen laskea mobiili jakeet Prism 4 (GraphPad). Kuvaajat edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen, jossa 10 ja 25 paikallisia tarttumista valkaistiin.

migraatiokokeessa

migraatiokokeessa, solut trypsinoitiin ja laskettiin, ja 200000 solua /kuoppa siirrettiin päällystämättömän 8 um soluviljelmässä insertit (BD Falcon) kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 2% seerumia, ja kokoonpano asetettiin 24-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät täydellistä kasvualustaa. 16 tunnin kuluttua, ei-siirretyn solut poistettiin ylhäältä suodattimen vanupuikolla, ja siirtyneet solut pohjalle suodattimen kiinnitettiin 3% PFA, värjättiin 5% kristalliviolettia, ja leimattujen solujen laskettiin. Solulaskennat normalisoida PC3 ryhmään. Vaihtoehtoisesti, 200000 solua /kuoppa siirrettiin inserttejä seerumia tai ilman 2 ug /ml Gal3-His ja kokoonpano asetettiin 24-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät täydellistä alustaa 14 tuntia ennen kiinnitystä ja värjäystä. Solujen määrä normalisoitiin PC3 ei-käsitellyssä ryhmässä.