Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime aikoina perinteisen kiinalaisen lääketieteen ja yrttejä ovat herättäneet lisää huomiota maailmalla antituumoriteholla . Celastrol ja Triptolide, kaksi aktiivisia komponentteja poimittu kiinalainen yrtti

Tripterygium wilfordii

Hook F (tunnetaan Lei Gong Teng tai Thunder of God Vine), ovat osoittaneet antituumorivaikutuksia. Celastrol tunnistettiin luonnollisia 26 s proteasomin estäjä, joka edistää solujen apoptoosia ja estää kasvaimen kasvua. Vaikutus ja mekanismi Triptolide eturauhassyöpään (PCA) ei ole hyvin tutkittu. Tässä olemme osoittaneet, että Triptolide, voimakkaampi kuin Celastrol, esti solujen kasvun ja indusoi solukuolemaa LNCaP-ja PC-3-solulinjojen. Triptolide myös inhiboi merkittävästi ksenosiirrettyjä PC-3 kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Lisäksi Triptolide indusoi PCa apoptoosin kautta caspases aktivaation ja PARP pilkkominen. Epätasapaino SUMOylation ja deSUMOylation ilmoitettiin tärkeä rooli PCA etenemiseen. SUMO-proteaasilla 1 (SENP1) ajateltiin olevan mahdollinen merkki ja terapeuttinen kohde Eturauhassyövän. Mikä tärkeintä, havaitsimme, että Triptolide alassäädetty SENP1 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla annoksesta riippuvia ja aikariippuvainen tavat, pienentäminen parantaa solujen SUMOylation PCA soluissa. Samaan aikaan Triptolide laski AR ja c-Jun ilmentymistä samanlaisia ​​tapoja, ja tukahdutti AR ja c-Jun transkription aktiivisuutta. Lisäksi Knockdown tai kohdunulkoinen SENP1, c-Jun ja AR ilmaisun PCA soluissa esti Triptolide anti-PCa vaikutuksia. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että Triptolide on luonnollinen yhdiste mahdollisia terapeuttista arvoa PCA. Sen antituumorivaikutus saattaa johtua mekanismeja käsittäen alas-säätely SENP1 joka palauttaa SUMOylation ja deSUMOyaltion tasapaino ja negatiivisen säätelyn AR ja c-Jun lauseke, joka estää AR ja c-Jun välitteisen transkription PCA.

Citation: Huang W, hän T, Chai C, Yang Y, Zheng Y, Zhou P, et al. (2012) Triptolide estää proliferaatiota eturauhassyöpäsolujen ja down-regulation SUMO-Specific Proteaasi 1 Expression. PLoS ONE 7 (5): e37693. doi: 10,1371 /journal.pone.0037693

Editor: Matthew Bogyo, Stanford University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 30, 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat metsähallitus Public hyvinvoinnin Industry Research Project (201204603), Program New Century Excellent Talents in University (NCET-08-0467) ja 100 Talents ohjelma Shaanxin maakunnassa Kiinassa Ming Lei. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole, vaikka kaksi yhteistyössä kirjoittajat ovat peräisin kaupallinen yritys (Bio-lääketeollisuuden Corporation), jotka ovat osallistuneet joidenkin reagenssien tai analyysityökaluja kokeissa mukana tässä paperissa. Lisäksi yritys ei ole taloudellisia tai ei-taloudellisia kilpailevia etuja olemassa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

tasainen lisääntymistä ja kuolleisuus syöpien kehottaa tutkijoita tekemään paljon töitä etsimisestä uusia anti-kasvain huumeiden tai hoitomuotoja. Uutetut yhdisteet luonnon yrttejä, kuten Taxol, on laajalti käytetty syövän hoidossa. Perinteinen kiinalainen lääketiede lupaa tärkeä ja käyttökelpoinen vaihtoehto syövän hoidossa. Monet aktiiviset yhdisteet uutetaan kiinalaiset yrtit ovat osoittaneet antituumoriteholla. Triptolide ja Celastrol, kaksi aktiivisia komponentteja poimittu kiinalainen yrtti

Tripterygium wilfordii

Hook F (tunnetaan Lei Gong Teng tai Thunder of God Vine) käytetään nivelreuman hoidossa, ovat osoittaneet, antituumorivaikutuksen ja apoptoosin induktion [ ,,,0],1], [2]. Celastrol on tunnistettu luonnollista proteasomin inhibiittoria, joka aiheuttaa kertyminen ubikitinoituja proteiinien ja proteasomin substraattien IKB-α, Bax ja p27. Celastrol myös indusoi apoptoosia PCa soluissa ja kutistaa ksenosiirrettyjä kasvain hiirillä [1]. Triptolide on diterpeenin laktoni voimakkaita immunosuppressiivisia vaikutuksia ja kasvaimen ominaisuuksia eri syövissä, mukaan lukien melanooma [2], rintasyöpä [3], haimasyöpä [4], eturauhassyöpä (PCA) [5] ja muut. Triptolide indusoi apoptoosin kautta estämällä HSP70 haiman syöpäsoluissa [4], [6], ja keskeyttää IL6R-JAK /STAT-reitin koolonkarsinoomasoluissa [7]. Ihmisen anaplastinen kilpirauhassyöpä soluja, Triptolide vähentää merkittävästi ekspressiota NF-kappa B kohdegeenien sykliini D1, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [8]. Triptolide toimii joko itsenäisesti tai osittain riippuvai- p53 estämään kiinteiden ksenosiirrettyjä kasvainten kasvua hiirissä [9], [10]. Kuitenkin, tehoa ja molekyylimekanismi Triptolide on PCa ovat vähemmän tutkittu.

SUMOylation on uusi ubikitiini-, kuten translaation jälkeisen modifikaation. Neljä eri SUMO proteiineja, SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 ja SUMO-4, on havaittu [11]. Samanlainen ubikitinaatiosta SUMOyaltion liittyy sarja entsymaattisia prosesseja. Kypsä SUMO aktivoidaan konjugoimalla E1-entsyymiä (SAE1 /SAE2), siirretään E2 entsyymin (Ubc9) ja liitettiin erityisiin lysiinitähteeseen kohdeproteiinien toimesta E3 entsyymi [11]. SUMOylation moduloi useita solun biologisten prosessien kuten ydin- liikenne, solusykliä, kromatiinin remodeling, kopioinnin säätely, DNA: n korjaukseen, ja muuttamalla proteiinien ubikitinaatio ja hajoaminen [12]. Runsaasti näyttö on osoittanut, että SUMOylation osallistuu inhimillisen sairauksia kuten syöpää.

SUMOylation on palautuva prosessi. Konjugoitu SUMO molekyylit voidaan lohkaista SUMO-proteaasien (SENPs). Kuusi SENP proteiinit on tunnistettu, jotka deSUMOylate kohdeproteiineissa eri tavoin. SENP1 ja SENP2 voi poistaa kaikki 3 sumos tavoitteesta proteiineista, kun taas muut SENPs osoittavat spesifisyyttä SUMO-2 ja SUMO-3 [13]. DeSUMOylation on osoitettu osalliseksi ihmisen sairauksien etenemistä [14] kuten PCa [15] ja rintasyövän [16]. Aiemmin Cheng et al [15] on raportoitu, että deSUMOylation on tärkeä rooli kehityksessä PCa. He havaitsivat, että SENP1 oli yli-ilmentynyt ihmisen PCa yksilöitä, mutta ei normaalissa ihmisen eturauhasessa soluja. siRNA inhibitio SENP1 vähentää PCa solujen kasvua. Lisäksi niiden alustavat tulokset

in vivo

siirtogeenisissä hiirissä osoitti, että yli-ilmentyminen SENP1 johtaa kehitystä eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) jo varhaisessa iässä. Edelleen SENP1 merkittävästi parantaa aktiivisuutta AR-riippuvaista transkriptiota deSUMOylation of HDAC1 [17] ja c-Jun-riippuvaista transkriptiota deSUMOylating CRD1 verkkotunnuksen P300 [18], johon kaikki osallistuvat kasvainten synnyssä Eturauhassyövän. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat SENP1 tärkeä rooli PCA etenemiseen ja voisi olla uusi PCa merkki ja hoidon kohde.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Triptolide merkitsevästi esti PCa soluproliferaatiota

in vitro

ja ksenosiirrettyjä PC-3 syövän etenemiseen

in vivo

, Triptolide myös indusoi apoptoosia PCA soluissa. Anti-kasvain teho Triptolide oli tehokkaampi kuin Celastrol. Samalla olemme löytäneet Triptolide merkittävästi alas-säänneltiin SENP1 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla pienentäminen parantaa solujen SUMOylation PCA soluissa. Lisäksi Triptolide myös säätelee negatiivisesti AR ja c-Jun ilmaisun ja tukahdutetaan AR ja c-Jun transkriptio. Kaiken kaikkiaan meidän kokeelliset tulokset viittaavat siihen, että Triptolide on luonnollinen potentiaali yhdiste PCA terapia.

Tulokset

Triptolide esti merkittävästi PCa soluproliferaatiota

in vitro

molemmat Triptolide (Fig. 1A) ja Celastrol (Fig. 1 B) kuuluvat terpeenit ja kaksi aktiivista komponentteja poimitaan kiinalainen yrtti

Tripterygium wilfordii

Hook F [1], [19]. Celastrol, kuten voimakas proteasomin inhibiittoria, estää PCa solujen proliferaatiota ja indusoi solujen apoptoosia [1]. Triptolide on raportoitu tukahduttaa solujen lisääntymistä monissa syöpätyypeissä, mutta sen tehokkuus on PCa ja kohdemolekyylien ei ole selvästi tutkittu. Määrittää anti-kasvain aktiivisuus Triptolide on PCa soluja ja verrata Celastrol, teimme kasvukäyrä määritys ja solujen elinkelpoisuuden määrityksessä käytetään kahta PCa solulinjoja, LNCaP (androgeenistä riippuva) ja PC-3-soluja (androgeeni-riippumattomia). Olemme vahvistaneet, että molemmat Triptolide ja Celastrol aiheutti merkittävää proliferaation esto LNCaP ja PC-3-solut. Kasvun käyrä määrityksessä, Triptolide merkittävästi inhiboivat PCa soluja edes annoksilla, 5 nM LNCaP-soluissa (kuvio. 1C), ja 10 nM PC-3-solut (Fig. 1 E). Sen sijaan Celastrol vain tukahdutti PCa solun kasvu suurilla annoksilla kuten 1 uM LNCaP-soluissa (kuvio. 1 D) ja 0,5 uM PC-3 solujen (Kuva. 1 F). Nämä tulokset osoittivat, että Triptolide voidaan tehokkaasti estää PCa solujen lisääntymistä. Täsmentämiseksi sytotoksista vaikutusta Triptolide on PCa solujen ja verrata Celastrol, suoritimme solunelinkykyisyysmääritys käyttäen MTT-menetelmällä. Molemmat PCa solulinjoja käsiteltiin laaja annoksilla Triptolide tai Celastrol, 0,01 uM 5 uM, 48 h. Kuten on esitetty kuviossa 1 G, pieninä annoksina (kuten 0,02 uM), Triptolide oli riittävä tappamaan suurin LNCaP-soluissa, mutta jäljellä elinkelpoisten solujen osuus säilyi, vaikka läsnä ollessa suurempia pitoisuuksia Triptolide. Se oli toisin kuin annoksesta riippuvainen sytotoksinen vaikutus Celastrol. Kuitenkin paljon suurempi annos Celastrol tarvittiin saavuttaa samanlaisen solumyrkkyvaikutuksessa 0,02 uM Triptolide. Vastaavia malli havaittiin solunelinkykyisyysmääritys PC-3-solut (Fig. 1 H). Kvantifioimiseksi tehoa kaksi yhdisteiden PCa solun, laskimme IC

50-arvo mukaan solujen elinkelpoisuuden tiedot. Triptolide oli paljon alhaisempi IC

50-arvot molemmissa solulinjoissa verrattuna Celastrol (taulukko 1). Nämä tiedot osoittivat, että Triptolide on tehokas aine, joka estää PCa solujen lisääntymisen ja aiheuttaa solukuoleman.

(A) ja (B): n kemiallinen rakenne Triptolide (A) ja Celastrol (B), vastaavasti. (C), (D), (E) ja (F) PCa-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide tai Celastrol, elävien solujen määrä laskettiin joka päivä 6 päivää. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Tarkoittaa P 0,05 (kontrolliin verrattuna). (C) vaikutus Triptolide LNCaP-soluissa. (D) vaikutus Celastrol LNCaP-soluissa. (E) vaikutus Triptolide PC-3-solut. (F) vaikutus Celastrol PC-3-solut. (G) ja (H) PCa Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla Triptolide tai Celastrol ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. (G) vaikutus Triptolide ja Celastrol LNCaP-soluissa. (H) vaikutus Triptolide ja Celastrol PC-3-solut.

Triptolide aiheuttaman apoptoosin PCA soluissa

in vitro

Seuraava arvioitava Triptolide- ja Celastrol solukuolema vastasi apoptoottisen vasteen. LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin 1 uM Triptolide ja Celastrol 24 tuntia, vastaavasti, värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua anneksiini V (AV) ja 50 ug /ml propidiumjodidia (PI), sitten analysoitiin fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometria. Samanaikainen havaitseminen fosfatidyyliseriinin ulkoistamisen ja menetys kalvon eheyden AV-FITC ja PI vastaavasti eriarvoiseen varhaisen apoptoosin (AV +), myöhäinen apoptoosin lopulta johtaa toissijaiseen kuolion (AV + /PI +) ja ensisijaisen kuolion (PI +). Kuten on esitetty kuviossa 2A ja kuviossa 2B, hoidon Triptolide ja Celastrol johti korkeampaan solujen osuus, joilla on positiivinen AV ja /tai PI-värjäyksellä. Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että hoito Triptolide ja Celastrol aiheutti vastaavasti 40% ja 30% LNCaP-solujen on AV + /PI, kun taas vain 6% ajoneuvon (DMSO) saaneista soluista osoitti apoptoottisen vasteen. Kaksi yhdisteillä oli suhteellisen maltillista vaikutusta apoptoosin in PC-3-solut, 8,77% ja 15,2% vastaavasti, verrattuna 4% ajoneuvojen (DMSO) -käsitellyssä soluja (Fig. 2C ja kuvio. S1). Nämä tulokset osoittivat, että sekä Triptolide ja Celastrol indusoi apoptoosia PCa soluissa. Lisäksi LNCaP-solut olivat herkempiä Triptolide ja Celastrol kuin PC-3-soluja. On raportoitu, että Triptolide indusoi apoptoosia kaspaasi cascade [4] – [6]. Edelleen onko kaspaasin osallistuu Triptolide aiheuttaman apoptoosin PCa soluissa, tutkimme asemaa kaspaasi-3 PCA soluissa käsiteltiin erilaisilla annoksilla Triptolide tai Celastrol 24 h tai 1 uM Triptolide ja Celastrol varten haluttuina aikoina. Kaspaasien aktivaatio-3 seurattiin Western blot käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta, jotka tunnistavat sekä prokaspaasi-3 ja sen aktiivinen pilkkominen fragmenttien, p17 ja p12. Kuten kuviossa 2D-2E, katkaisun prokaspaasi-3 vahvistui Triptolide käsiteltyjen LNCaP-soluja, ja vähäisemmässä määrin, ja Celastrol-käsiteltyjen LNCaP-soluissa. Vain hyvin pieni kaspaasi-3-fragmentit olivat havaittavissa Celastrol tai Triptolide-käsitelty PC-3-soluja. Sitten seuraa tilan tumaentsyymi poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), joka on yksi tärkeimmistä katkaisun tavoitteet kaspaasi-3. PARP pilkkominen parannettiin Triptolide saaneilla LNCaP, ja vähemmässä määrin vuonna Celastrol käsiteltyjen LNCaP-soluja (kuvio. 2F). Jälleen alhaisempi PARP fragmentit havaittavissa Celastrol tai Triptolide saaneilla PC-3-solut (Fig. 2G). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että Triptolide, ja vähäisemmässä määrin, Celastrol, indusoida apoptoosia PCa liittyvät solut kaspaasi-3 ja lohkaisu PARP.

(A) ja (B) Fluoresenssimikroskopia havainto Triptolide- ja Celastrol- aiheuttaman apoptoosin LNCaP (A) ja PC-3 (B-solut). Käsittelyn jälkeen 1 uM Celastrol tai Triptolide 24 tuntia, LNCaP-ja PC-3-soluja inkuboitiin AV-FITC: tä (vihreä) ja PI (punainen). Edustavia Kirkas ja fluoresoivia kuvia näytetään. (C) virtaussytometrinen havaitseminen apoptoosin LNCaP ja PC-3-solut käsiteltiin kuten edellä. Prosenttiosuus koskemattomien solujen (AV /PI-), varhainen apoptoottiset solut (AV + /PI), myöhäinen apoptoottiset /nekroottisia soluja (AV + /PI +) ja nekroottinen solua (AV /PI +) esitetään. (D) ja (E) Western blot -analyysi kaspaasi-3-proteiinin Triptolide- tai Celastrol-käsitellyn LNCaP (D) ja PC-3 (E) soluja. -Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ja suoritettiin analyysi. Katkaisematon kaspaasi-3 ja katkaistun tuotteet on merkitty. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (F) ja (G) Western blot-analyysi PARP ja kaspaasi-3 proteiinit Triptolide- tai Celastrol-käsitellyn LNCaP (F) ja PC-3 (G) soluja. Soluja käsiteltiin 1 uM Triptolide tai Celastrol varten haluttuina aikoina. Katkaisemattomat PARP ja kaspaasi-3 ja niiden pilkottu tuotteita osoitetaan. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

Triptolide tukahdutetaan ksenosiirrettyjä PC-3 kasvaimen kasvun

in vivo

Havaitsimme, että Triptolide voi estää PCa soluproliferaatiota ja indusoivat solujen apoptoosin

in vitro

. Määrittämään tehoa Triptolide

in vivo

toteutimme ksenograftin tutkimus. PC-3-soluja istutettiin ihon alle nude-hiiriin. Kun kasvaimet tuli kouraantuntuva (-100 mm

3), hiiriä käsiteltiin intraperitonneally joko ajoneuvon hallintaan tai Triptolide 0,4 mg /kg vuorokaudessa 15 päivän ajan. Kasvaimen koot ja kehon paino mitattiin joka kolmas päivä. Kuten on esitetty kuviossa 3, tilavuus (Fig. 3A) ja paino (Fig. 3C) on ksenograftikasvaimissa käsiteltiin Triptolide olivat merkittävästi pienempiä kuin kontrolliryhmässä (Fig. 3d), mikä osoittaa, että Triptolide on voimakas kasvaimen vastainen vaikutus

in vivo

. Samaan aikaan, ei ollut merkittävää eroa painon välillä käsiteltyjen ja kontrolliryhmän (Fig. 3B), mikä viittaa siihen, että annettu annos Triptolide on merkittävää toksisuutta hiirillä.

PC-3-soluja (2 x 10

6 per hiiri) injektoitiin 5 viikon ikäisille karvattomia hiiriä. Kun kiinteät kasvaimet kasvoivat noin 100 mm

3, hiiret käsiteltiin intraperitonneally joko ajoneuvon ohjaus- tai Triptolide 0,4 mg /kg päivittäin 15 päivää. Kasvaimen koot ja kehon paino mitattiin joka kolmas päivä. (A) vaikutus Triptolide on ksenograftin kasvaimen tilavuus. (B) vaikutus Triptolide on nude-hiirten ruumiinpainon. (C) vaikutus Triptolide on ksenograftin kasvaimen painon. (D) Kuva -ksenografti kasvaimen käsitelty tai ilman Triptolide. * Tarkoittaa P 0,05 (kontrolliin verrattuna).

Triptolide alassäädetty SENP1 ilmentymistä PCA soluissa

Koska Triptolide esti PCa solujen lisääntymisen ja indusoi solujen apoptoosin

in vitro

, ja tukahdutti ksenosiirrettyjä kasvaimen kasvua

in vivo

, olimme kiinnostuneita mekanismeista nämä anti-kasvain vaikutuksia. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että SENP1 on yli-ilmentynyt PCa soluissa ja kasvaimia näytteet [15]. SENP1 yli-ilmentyminen siirtogeenisissä hiirissä edistää kehitystä pahanlaatuisten leesioiden eturauhanen [15]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen SENP1 välittää PCa kehitykseen ja SENP1 voisi olla potentiaalinen kohde PCA terapia.

Sen tutkimiseksi, Triptolide säätelee SENP1 ilmaisun ensinnäkin analysoimme SENP1 mRNA-tasolla reaaliaikaisella PCR LNCaP ja PC-3-soluja käsiteltiin erilaisilla annoksilla Triptolide tai Celastrol 24 tuntia, tai käsiteltiin 0,1 uM Triptolide tai Celastrol varten haluttuina aikoina. Kuten kuviossa 4A ja 4B, Triptolide laski merkittävästi SENP1 mRNA-tasot sekä LNCaP-ja PC-3-solujen annoksesta riippuvainen ja ajasta riippuvaa tavoin. Samalla Celastrol vähensi myös SENP1 mRNA-tasolla seuraavat lyhyen käsittelyn pienillä annoksilla. Sen sijaan suurina annoksina ja pidemmän hoitoaika, Celastrol parannettu SENP1 mRNA tasolla sekä käsitellään PCa solulinjoissa. Arvioidaan tehoa Triptolide aiheuttama alas-säätely SENP1 ilmaisun määrittelimme, annosta Triptolide tarvitaan aiheuttamaan 50%: n lasku SENP1 mRNA (IC

50). Sekä LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin yli 6 annosta Triptolide 24 tuntia, kuten on esitetty kuviossa 4C, Triptolide tehokkaasti indusoi lasku SENP1 mRNA-tasolla, jossa IC

50-arvo 0,07579 uM ja 0,07071 uM LNCaP-ja PC- -3-soluissa. Olemme edelleen mitattiin SENP1 proteiinin taso PCA käsitellyissä soluissa Triptolide tai Celastrol. Triptolide pystyi vähentämään SENP1 proteiinin tasolla sekä annoksesta riippuvaa (kuvio. 4D, 4E) ja ajasta riippuvia (Fig. 4F) käytöstapoja. Sen sijaan, Celastrol ei merkittävästi vähentää SENP1 proteiinin tason käsitellyissä PCa soluissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​meidän qRT-PCR-tuloksiin ja osoittavat, että Triptolide estää SENP1 ilmentymistä PCA soluissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla.

(A) Triptolide laski SENP1 mRNA tasolla sekä LNCaP-ja PC-3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ennen analyysiä. qRT-PCR suoritettiin käyttäen spesifisiä alukkeita SENP1 ja β-aktiini (käytettiin sisäisenä kontrollina). (B) Triptolide laski SENP1 mRNA tasolla sekä LNCaP-ja PC-3 solujen ajasta riippuva tavalla. Soluja käsiteltiin 0,1 pM Triptolide tai Celastrol varten ilmoitettu ajat, SENP1 ja β-aktiini-mRNA: n tasot määritettiin qRT-PCR: llä. (C) vaikutus Triptolide on SENP1 mRNA tasolla PCA soluissa. IC

50 osoitettiin laskettuna Prism 5.04. (D) ja (E) Triptolide laski SENP1 proteiinin taso LNCaP (D) ja PC-3 (E), annoksesta riippuvalla tavalla. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ennen Western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (F) Triptolide laski SENP1 proteiinin tason PCa solujen ajan riippuvalla tavalla. PC-3-soluja käsiteltiin 1 uM Triptolide ja ilmoitettuina ajankohtina ennen Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (G) Triptolide parannettu solu SUMOylation PC-3-solut. PC-3-soluja käsiteltiin 1 uM Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ennen Western blot -analyysillä käyttäen SUMO-1-vasta-aine. NEM käytettiin positiivisena kontrollina varten SUMO proteaasinestäjä.

SENP1 tärkeä rooli SUMOylation prosesseissa. Kuten isopeptidase, SENP1 deconjugates SUMO päässä SUMOylated proteiinia. Alentunut SENP1 ilmentymistä Triptolide saaneilla PCa solujen johtaisi parannettu solujen SUMOylation. Tämän varmentamiseksi odotuksia, solun SUMOylation tason PC-3-soluja käsiteltiin 1 uM Triptolide tai Celastrol 24 tuntia havaittiin Western blot käyttäen SUMO-1-vasta-aine. Soluja ilman hoitoa, mutta lyysattiin lyysauspuskurissa, kun läsnä on 20 mM N-etyylimaleimidi (NEM), joka on voimakas inhibiittori deubiquitinating entsyymien ja SUMO hydrolaasiaktiivisuutta, käytettiin positiivisena kontrollina [20]. Kuten kuviossa 4G, vertaa valvoa, Triptolide hoito merkittävästi parannettu yhteensä SUMOylation tasolla. Kiinnostavaa, Celastrol myös parannettu yhteensä SUMOylation tasolla, mutta vähemmän hyötysuhde kuin Triptolide, mikä saattaa johtaa sen proteasomin suppressioaktiivisuutta. On raportoitu, että SUMOylation joidenkin proteiinien, kuten HIF1 [12] ja PML [21], ja se edistää näiden proteiinien ubikitiinipromoottori riippuvainen hajoamista. Koska proteasomin estäjä, Celastrol voisi tukahduttaa hajoaminen näiden SUMOylated proteiinien ja aiheuttaa niiden kertymistä. Vahvista tämä tulos, suoritimme samanlaisia ​​kokeita käyttäen toista SUMO-1 monoklonaalinen vasta-aine. Western blot Tulokset osoittivat, että tasot SUMO-1 heterodimeerit korotettiin Triptolide käsiteltyjen näytteiden (Fig. S2A, S2B). Huomasimme myös, että taso SUMO-1 monomeerin pienennettiin Triptolide käsiteltyjen näytteiden (Fig. S2C). Tämä voi johtua joko alassäädetty SENP1 lauseke tai lisääntyminen SUMO-1 heterodimeerejä. Kaiken Triptolide pystyy säätelemään negatiivisesti SENP1 ilmentymistä sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoilla, tuloksena on parannettu solujen SUMOylation tason PCA-soluissa.

Triptolide tukahdutetaan androgeenireseptorin (AR) ilmentyminen LNCaP

AR on tärkeä rooli normaalissa eturauhasessa kehittämiseen ja ylläpitoon ja eturauhassyövän etenemiseen. Celastrol raportoitiin tukahduttaa AR ilmentymisen LNCaP-soluissa [1]. Me esiin kysymyksen siitä Triptolide estää AR ilmaisun ja AR-välitteistä transkriptiota PCA soluissa. Analysoimme AR mRNA tasolla LNCaP käsiteltiin erilaisilla annoksilla Triptolide ja Celastrol 24 h tai 0,1 uM Triptolide ja Celastrol varten haluttuina aikoina reaaliaikaisella PCR: llä. Kuten on esitetty kuviossa 5A ja 5B, Triptolide vähensi AR-mRNA: n tasolla annoksesta riippuvainen ja ajasta riippuvaa tavoin. Olemme edelleen analysoineet AR proteiinin taso LNCaP käsitelty solu Triptolide, jossa Celastrol käsiteltyjä soluja positiivisena kontrollina. Kuten kuviossa 5C ja 5D, Triptolide vähentää AR proteiinin ilmentymisen samalla tavoin kuin mRNA-tasolla. Koska AR toiminnot sitoutumalla androgen-vaste-elementtejä (ARE) promoottorialueella kohdegeenien ja säätää näiden androgen vastaus geenien transkription indusoimiseksi soluproliferaatiota [22], Triptolide aiheuttama suppressio AR ilmaisun voisi estää AR-välitteistä transkriptiota. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, ilmaus useiden AR tavoitteita geenejä AR-positiivisten LNCaP käsiteltiin erilaisilla annoksilla Triptolide 24 tunnin havaittiin qRT-PCR (Kuva. 5E). Ilmaisu PSA, BARD1, CDK1, Cdk2- ja FKBP51, tiedetään positiivisesti säädellä AR, todellakin tukahdutetaan. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Triptolide esti AR transkription aktiivisuutta tukahduttamalla AR ilme. Lisäksi AR kohdegeenien, prostataspesifinen antigeeni (PSA) on tärkeä biologinen merkkiaine kliinisen diagnoosin ihmisen eturauhassyövän [23], [24]. Siksi olemme edelleen havainneet PSA-proteiinin taso LNCaP solulysaatista ja viljelyalustasta kemiluminesenssi immunomääritys (CLIA). PSA-proteiinin taso LNCaP-soluissa ja että erittyvän alustaa jälkeen vähentynyt 1 uM Triptolide hoitoon (Kuva. 5F), kun taas saman pitoisuuden Celastrol osoittivat vähemmän estävä vaikutus PSA: han. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että Triptolide tukahduttaa AR ilmaisun ja indusoi AR-välitteistä transkriptiota eston.

(A) Triptolide laski AR mRNA tasolla LNCaP annoksesta riippuvaisella tavalla. LNCaP-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide 24 tuntia ennen analyysiä. qRT-PCR suoritettiin käyttäen spesifisiä alukkeita AR ja β-aktiini. (B) Triptolide laski AR mRNA tasolla LNCaP solujen ajasta riippuva tavalla. LNCaP-soluja käsiteltiin 0,1 uM Triptolide varten osoitettu kertaa ennen analyysiä. (C) Triptolide ja Celastrol laski AR-proteiinin tason LNCaP-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. LNCaP-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ennen Western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (D) Triptolide laski AR proteiinin taso LNCaP solujen ajasta riippuva tavalla. LNCaP-soluja käsiteltiin 0,1 uM Triptolide varten osoitetun kertaa ennen Western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (E) Triptolide laski AR kohdegeenien ilmentymistä LNCaP. LNCaP-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide 24 tuntia, ennen kuin qRT-PCR-analyysi käyttäen vastaavia alukkeita. (F) Triptolide esti PSA-proteiinin taso LNCaP-soluissa. LNCaP-soluja käsiteltiin Triptolide tai Celastrol 24 h tai 48 h. Väliaineen alikvootit ja solujen hajoamisen käsitellystä solut kerättiin ja koko PSA taso mitattiin CLIA.

Triptolide alassäädetty c-Jun ilmentymistä PCA soluissa

onkoproteiinia c -Jun joka on usein yli-ilmentynyt syöpäsoluissa on mukana PCa transformaatio [25]. c-Jun on merkittävä osa transkriptiotekijän AP-1 [26], [27]. Lisäksi c-Jun yhteistyössä aktivoi AR transkription toimintaa, ja SENP1 estää c-Jun ilmaisun [18]. Sen määrittämiseksi, onko Triptolide säätelee c-Jun ilmaisun, käsittelimme PCa solujen eri annoksilla Triptolide tai Celastrol 24 tuntia, tai 0,1 uM Triptolide tai Celastrol varten haluttuina aikoina. Kuten on esitetty kuvassa 6A-6D, c-Jun ilmaisu, mRNA ja proteiini tasoilla, vaimeni Triptolide annosriippuvaisia ​​ja ajasta riippuvaa tavoin. Sen sijaan, Celastrol ei ollut vaikutusta c-Jun ilmentymistä. Lisätutkimuksia vaikutusta Triptolide aktiivisuuteen c-Jun, olemme analysoineet c-Jun kohdegeenin ilmentymisen qRT-PCR: llä. c-Jun kohdegeenien sykliini A2, sykliini-D1, ETV1 ja p21, joiden tiedetään olevan ajan säätelee c-Jun tukahdutettiin seuraavat Triptolide hoidon (Fig. 6F). Nämä tiedot osoittavat, että Triptolide estää c-Jun ilmentymistä mRNA ja proteiini tasolla ja resultes in c-Jun välitteisen transkription inhibition.

(A) Triptolide väheni c-Jun mRNA tasolla LNCaP ja PC-3 solujen annoksesta riippuvaisella tavalla. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide 24 tuntia ennen RNA: n uutto- ja qRT-PCR: llä käyttämällä spesifisiä alukkeita c-Jun ja β-aktiini. (B) Triptolide väheni c-Jun mRNA tasolla LNCaP ja PC-3 solujen ajasta riippuva tavalla. Soluja käsiteltiin 0,1 uM Triptolide varten ilmoitettuina ajankohtina ennen RNA ja qRT-PCR. (C) ja (D) Triptolide väheni c-Jun-proteiinin tason LNCaP (C) ja PC-3 (D) solujen annoksesta riippuvalla tavalla. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Triptolide tai Celastrol 24 tuntia ennen Western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (E) Triptolide väheni c-Jun-proteiinin tason LNCaP solujen ajasta riippuva tavalla. LNCaP-soluja käsiteltiin 0,1 uM Triptolide ja ilmoitettuina ajankohtina ennen Western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. (F) Triptolide esti c-Jun kohdegeenien ilmentymistä LNCaP. LNCaP-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden Triptolide 24 tuntia, ennen kuin qRT-PCR-analyysi c-Jun kohdegeenien käyttäen vastaavia alukkeita.

Down-asetuksen tai yli-ilmentyminen SENP1, c-Jun tai AR esti Triptolide anti-PCa teho

Koska havaitsimme, että Triptolide tukahdutetaan SENP1 ilme, parannettu solu SUMOylation, esti AR ja c-Jun ilmaisun ja tukahdutetaan AR /c-Jun-välitteisen transkription, kysyimme Triptolide anti -PCa teho perustuu SENP1, c-Jun: n tai AR ilmaisun LNCaP ja PC-3-solut. Voit vastata tähän kysymykseen, ensinnäkin meillä tippuu alas SENP1, c-Jun: n tai AR ilmentymisen erityisiä siRNA LNCaP (siRNA of SENP1, c-Jun tai AR) ja PC-3 (siRNA on SENP1 tai c-Jun) soluissa. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun siRNA transfektiosta solut käsiteltiin 100 nM Triptolide tai ajoneuvon ohjaus 48 tuntia, elinkykyisten solujen lukumäärä laskettiin sen jälkeen. Tehokkuus siRNA jolloin uusi SENP1, c-Jun ja AR arvioitiin Western blot (kuvio. 7C). Mielenkiintoista on, että ei ole Triptolide hoidon vaimentaminen SENP1, c-Jun: n tai AR LNCaP-soluissa vähentää solujen elinkelpoisuus (Fig. 7A). Samoin vaimentaminen SENP1 tai c-Jun PC-3-solujen väheni myös solujen elinkelpoisuuden (Fig. 7B). Tämä havainto voi osoittaa, että sytotoksisuus Triptolide PCA soluissa voi johtua Triptolide aiheuttama downregulation SENP1, AR tai c-kesäkuu Jotta paljastaa vaikutus Triptolide on SENP1, AR tai c-Jun vaiennetaan soluja, otimme käyttöön arvo ”elinkelpoisuuden välinen suhde, joka saadaan jakamalla elävien solujen määrä Triptolide-käsitellyn ryhmän, että ohjaus- ryhmä ilman Triptolide-hoitoa. Mielenkiintoista on, että pudotus on SENP1, c-Jun: n tai AR vaikutti lisäävän solujen elinkelpoisuuden suhteen mukaisesti Triptolide hoitoon (Fig. 7A, 7B), mikä viittaa siihen, korkeampi Triptolide vastus. Olemme edelleen tarkastetaan vaikutusta SENP1, c-Jun tai AR yli-ilmentyminen on Triptolide anti-PCa tehoa. PCa solut transfektoitiin tai kotransfektoitiin SENP1, c-Jun: n ja AR: ekspressioplasmidien (Fig. 7F). Irrelevantti proteiinia käytettiin EGFP: tä negatiivisena kontrollina ja Triptolide sitovan proteiinin XPB käytettiin positiivisena kontrollina. 48 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin Triptolide vielä 48 tuntia ja elinkelpoisten solujen lukumäärä laskettiin. Ektooppinen ilmentyminen näiden proteiinien arvioitiin Western blot (kuvio. 7F). Kuten on esitetty kuviossa. 7D-7E, ektooppinen ilmentyminen SENP1, c-Jun: n tai AR lisääntynyt merkittävästi PCa solujen elinkelpoisuuden suhteen alle Triptolide hoito, mikä osoittaa, että pelastaminen nämä kolme Triptolie alaspäin säätäminen proteiinien ilmentyminen voi estää Triptolide solun myrkyllisyyttä. Lisäksi yhdessä näiden proteiinien ilmentymisen siirrettävä suurempi solujen elinkelpoisuuden suhteen kuin vastaavat yksittäiset ilmaisua, mikä viittaa siihen, että kaikki nämä proteiinit ovat osallisena Triptolide cytotoxity.