Krooninen sairaus

tiivistelmä

1α-25 (OH)

2 D-vitamiinin

3 (1- 25D), aktiivinen hormonaalista D-vitamiini

3, on tunnettu chemopreventive ja pro-erilaistumisaineena,. Sen on osoitettu estävän kasvun useita eturauhassyövän solulinjoissa. Aukkoliitokset, muodostuu kutsuttujen proteiinien konneksiinit (Cx), ovat kokonaisuuksista solu-solu-kanavia, jotka voidaan vaihtaa pienen kasvun säätelymolekyyleja vierekkäisten solujen. Solu-solu viestintä välittyy rako junktionaalinen kanavilla on tärkeä homeostaattinen ohjaus säätelevä mekanismi solujen kasvua ja erilaistumista. Olemme tutkineet vaikutusta 1-25D muodostumiseen ja hajoamiseen aukkoliitokset androgeeni-reagoiva eturauhassyöpä-solulinjaa, LNCaP, joka ilmentää retroviruksella käyttöön Cx32. Connexin32 ilmaistaan ​​luminaalisen ja hyvin erilaistuneita soluja normaalin eturauhasen ja eturauhasen kasvaimia. Tuloksemme dokumentoida että 1-25D parantaa ilmaus Cx32 ja sen myöhemmän kokoamista aukkoliitokset. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että 1-25D estää androgeenisäädellyn hajoamista Cx32, posttranslationaalisesti riippumatta androgeenireseptorin (AR) -välitteisen signalointi. Lopuksi, meidän havainnot dokumentoida että muodostuminen aukkoliitokset herkistää Cx32 ilmentävien LNCaP solujen kasvua estäviä vaikutuksia 1-25D ja muuttaa niiden morfologiaa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kasvua estäviä vaikutuksia 1-25D LNCaP-soluissa saattaa liittyä sen kyky muokata kokoonpanoon Cx32 rakoon liittymissä.

Citation: Kelsey L, Katoch P, Ray A, Mitra S, Chakraborty S, Lin MF, et ai. (2014) D-vitamiini

3 Säätelee muodostus ja hajoaminen aukkoliitokset androgeenistä reagoiva ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (9): e106437. doi: 10,1371 /journal.pone.0106437

Editor: Michael Koval, Emory University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 marraskuu 2013; Hyväksytty: 06 elokuu 2014; Julkaistu: 04 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Kelsey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health CA113903, DOD PCRP PC-081198 ja PC-111867, Nebraska State Grant LB506 ja R0-1DE12308. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

rooli D-vitamiini

3, ja sen aktiivinen hormonaalista 1α-25 (OH)

2 D-vitamiinin

3 (1-25D), koska kasvaintenvastaise-, pro -differentiating, ja pro-apoptoottisten aine on perustettu erilaisia ​​normaalien ja pahanlaatuisten epiteelisolujen, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCA) [1] – [4]. Toimintaa 1-25D välittyvät sitoutumalla D-vitamiinin reseptoriin, yksi jäsenistä tumareseptorisuperperheen, joka on ilmaistu erilaisia ​​soluja, mukaan lukien eturauhasen. D-vitamiini- reseptoriin heterodimerizes RXR-reseptorin ja sitoutuu D-vitamiinin reseptorin vaste-elementin muuttamaan geenin ilmentymistä [1]. Perustuen havaintoon, että PCA kuolleisuus Yhdysvalloissa ovat kääntäen verrannollisia maantieteellisesti tapaus altistumista ultraviolettisäteilylle auringon, ja että ultraviolettivaloa on välttämätön vitamiini D

3 synteesiä ihon rooli tätä vitamiinia alenevassa riski kehittää PCA on ehdotettu [5], [6]. Lukuisat

in vitro

tutkimukset osoittavat johdonmukaisesti kasvua estävän ja erilaistumista indusoiva vaikutus D-vitamiinin

3 eturauhasen syöpä solujen ja eläinten tutkimukset osoittavat, että se ei ainoastaan ​​vähennä esiintyvyys PCA toimimalla chemopreventive aineena mutta myös estää etäpesäkkeiden [7] – [10].

Gap risteykseen (GJ) s ovat kokonaisuuksista solu-solu-kanavia että signaali ei canonically, sallimalla suora vaihto pienten molekyylien (≤1500Da) välillä sytoplasmisen sisätilat vierekkäisiä soluja, [11]. Perustava proteiinit gjs, nimeltään konneksiinit (CXS), koodataan 21 geenejä, jotka on nimetty niiden molekyylimassan [12]. Solu-solu-kanavat ovat bicellular muodostamat rakenteet yhteistyönä kaksi solua. Muodostetaan GJ solu-solu-kanava, CXS ensin oligomeroitua endoplasmakalvostossa tai trans-Golgi verkon heksameeris-, nimeltään connexon, jotka telakat kanssa connexon näytetään vierekkäin solun [13], [14]. Monirivisille todisteita nyt antaa valtakirjan käsitystä siitä, että solu-solu viestintä välittyy rako junktionaalinen kanavilla on tärkeä homeostaattinen ohjaus säätelevä mekanismi solujen kasvua ja erilaistumista ja hillitsemiseksi kasvaimen edistämisen. Esimerkiksi heikentynyt Cx ilmaisu tai menetykseen GJ toiminto, on patogeneesiin useiden syöpien ja sairauksien [15] – [19]. Lisäksi, mutaatiot useissa Cx-geenit on havaittu geneettisiä häiriöitä tunnusomaista poikkeava solujen lisääntyminen ja erilaistuminen [13], [20].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että ilmentyminen Cx32, joka ilmaistaan ​​luminaalisen solut eturauhasen, samaan aikaan hankinnan eriytetyn tilan onteloerityssolut [21], [22]. Lisäksi olemme dokumentoitu, että etenemistä PCA peräisin androgeeniriippuvainen valtion invasiivisen, androgeeni-riippumaton valtion leimasi poikkeava kaupan Cx32 ja /tai heikentynyt kokoonpano gjs [22] – [24]. Lisäksi meidän tutkimukset osoittivat, että koneellinen ilmentymistä Cx32 osaksi androgen reagoiva ihmisen PCA solulinjassa, LNCaP, jälkeenjäänyt solujen kasvuun

in vivo

ja

in vitro

[22]. Olemme myös osoittaneet, että LNCaP-soluja, jotka ilmentävät Cx32, muodostuminen ja hajoaminen gjs säädeltiin androgeenien, joka kontrolloi ilmentymisen taso Cx32 translaation estämällä sen hajoamiseen solulimakalvoston liittyy hajoamista (ERAD) [25]. Androgeenit ylläpitämiseen tarvitaan sekretorisen (erilaistumiseen liittyviä) funktio luminaalisen epiteelisolujen normaalin eturauhasen ehtyminen androgeenien kirurgisesti tai kemiallisesti laukaisee apoptoosin ja /tai erilaistamattomuuden näiden solujen [26] – [29]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että retinoidit, jotka säätelevät myös lisääntymistä ja erilaistumista eturauhasen epiteelisolujen [28], [30], myös parantaa kokoonpanoon Cx32 osaksi gjs [31]. Nämä tutkimukset antoivat uskoa käsitystä, että muodostuminen ja hajoaminen gjs voidaan liittää lisääntymistä ja erilaistumista Ontelonsisäisen eturauhasen epiteelisolujen.

Kuten androgeenien ja retinoidit, D-vitamiini

3 on välttämätön normaalille kehitykselle eturauhasen ja on myös dokumentoitu moduloivan PCA etenemisen [7], [9]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että D-vitamiini vaimentaa eturauhasen epiteelisolujen neoplasia in Nkx3.1 /PTEN siirtogeenisiä hiiriä [32]. Epidemiologisissa, soluviljelmissä, ja kliiniset tutkimukset ovat sekaantuneet antituumorivaikutukset 1-25D PCA ja on ehdotettu olevan voimakas chemopreventive aine [3], [4]. Kuitenkin toisin kuin paksusuolensyöpä [1], [33], mahdollisuudet tehokkuuden 1-25D vuonna kemopreventatiivisesti PCA on pysynyt kiistanalainen huolimatta lukuisista tutkimuksista siirtogeenisen hiiren mallia PCA ja sen käyttö kliinisissä kokeissa [1], [2]. Aikaisemmat tutkimukset, myös meidän, ovat osoittaneet, että kasvua estävää ja erilaistumista indusoiva vaikutus kemopreventiivisten aineiden saattavat liittyä niiden kykyyn parantaa aukko junktionaalinen viestintä [34] – [38]. Luminal soluja normaalin eturauhasen ilmaista Cx32 ja muodostaa suuria gjs ja etenemisen PCA liittyy menetys kyky muodostaa gjs [22], [23]. Muodostuminen gjs on liitetty säilyttää polarisoitunut ja eriytetty tila epiteelisolujen [39]. Nämä tutkimukset sai meidät tutkimaan vaikutusta 1-25D sen kokoonpanoon Cx32 osaksi gjs androgeeni-reagoiva ihmisen PCA LNCaP. Koska 1-25D on osoitettu lisäävän ilmentymistä AR LNCaP-soluissa [40], me rationalisoida, että se voi moduloida androgeenireseptorin-säännelty muodostuminen ja hajoaminen gjs ja vaikuttaa kasvuun androgen reagoiva PCA-solut, jotka ilmentävät Cx32. Käyttämällä androgeenin reagoiva LNCaP-solut, jotka ilmentävät retroviruksella käyttöön Cx32 [25], osoitamme, että 1-25D parantaa kokoonpanon Cx32 osaksi gjs. Lisäksi olemme osoittavat lisäksi, että 1-25D estää androgeenisäädellyn hajoaminen gjs posttranslationaalisesti riippumatta AR-välitteistä signalointia. Lopuksi, meidän tulokset osoittavat, että muodostuminen gjs herkistää LNCaP-solujen kasvua estäviä vaikutuksia 1-25D ja muuttaa niiden morfologiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Androgeenien -responsive ihmisen PCA solulinjaa, LNCaP, kasvatettiin kuvatulla [41], [42]. LNCaP-32-solut, yksi useista klooneista LNCaP-soluja, jotka ilmentävät retroviruksella transdusoitujen rotan Cx32, ja LNCaP-N-solut, yksi useista valvonnan kloonit valittiin G418 infektion jälkeen ohjaus retrovirus, on kuvattu [25], [ ,,,0],31]. Vanhempien LNCaP, jäljempänä LNCaP-P soluja, kasvatettiin RPMI, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia atmosfäärissä 5% CO

2/95,% ilmaa taas LNCaP-N ja LNCaP-32-soluja ylläpidettiin RPMI, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia, joka sisälsi G418: aa 200 ug /ml, kuten on kuvattu [25], [31]. Steroidi-köyhdytettyä (hiilellä erotettua) seerumia ja fenoli-puna-RPMI saatiin HyClone Laboratories (Salt Lake City, UT).

Vasta-aineet ja Immunovärjäys

lähteet sekä monoklonaalisia polyklonaalisia vasta-aineita vastaan, Cx32 on kuvattu aikaisemmin [24], [25], [31], [43], [44]. Hiiren anti-occludin (klooni OC-3F10) oli peräisin Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA). Kanin vasta-aineita vastaan ​​α- ja β-kateniinin ja hiiren anti-β-aktiinin (klooni C-15) olivat yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO). Monoklonaalisia vasta-aineita E-kadheriinin (E-cad), α-kateniinin, β-kateniinin, avokätisesti Drs. Johnson ja Wheelock (Eppley Institute), on kuvattu [25], [43], [44]. Kanin polyklonaalinen anti-AR-reseptorin vasta-aine oli Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, CA). -Soluja (1,5 x 10

5), ympättiin kuudella hyvin sisältävät ryhmät lasipeitelevyihin ja annettiin kasvaa noin 50% konfluenssiin, immunovärjättiin eri vasta-aineilla, kuten on kuvattu [24], [25], [31], [ ,,,0],43] – [45]. Toissijainen vasta-aineita (kani tai hiiri), konjugoitu Alexa 488 ja Alexa 594, suoritettiin tarvittaessa. Kuvia immuno- soluja hankittiin Leica DMRIE mikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzler, Saksa) varustettu Hamamatsu ORCA-ER2 CCD-kamera (Hamamatsu-City, Japani) ja analysoitiin käyttäen kuvankäsittelyohjelmisto (Volocity, Version 6.3, Improvision, Inc; Perkin Elmer) kuvatulla [43] – [45].

Stock Solutions

Synthetic androgeenireseptorin mibolerone (MB) ja luonnollisen androgen dihydro-testosteroni (DHT), 1-25D, ja Casodex ( bikalutamidi) ostettiin BIOMOL (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). Kantaliuoksia MB ja DHT valmistettiin 1 mM etanoliin ja varastoitiin -20 ° C: ssa pienissä erissä valolta suojassa. Kantaliuos 1-25D (10 uM), valmistettiin etanoliin ja säilytettiin erinä -80 ° C: ssa valolta suojattuna. Kantaliuos Casodex (10 mM) valmistettiin DMSO: hon ja varastoidaan erinä -20 ° C: ssa. Ne laimennettiin asianmukaisesti keskipitkällä aikaan hoidon. Kaikki kokeet suoritettiin keltaista valoa kuvatulla [36], [37].

Androgeenien väheneminen ja muut hoidot

Solut ympättiin kuudella hyvin klustereiden lasipeitelevyihin (1,5 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja 6 cm: n (2 x 10

5 solua astiaa kohti) ja 10 cm astiat (3,5 x 10

5 solua maljaa kohti) 2, 4 ja 10 ml täydellistä alustaa vastaavasti. Soluja käsiteltiin täydennystä tuoreella alustalla, joka sisälsi eri reagenssit halutussa konsentraatiossa, kun he saavuttavat 50% konfluenssin. Kontrollit käsiteltiin etanolilla siten, että lopullinen pitoisuus liuottimen ei ylittänyt 0,1%. Kun soluja on kasvatettu androgen-köyhdytettyä olosuhteissa, normaalien solujen viljelyalusta korvattiin androgen-köyhdytettyä soluviljelyalustassa (fenoli-punaista RPMI, joka sisälsi 5% hiilellä erotettua seerumia). Kontrollit saivat tuore fenoli-puna-väliaineessa, johon on lisätty seerumia. Käytimme fenoli-puna-väliaineessa koska fenoli-punaista on dokumentoitu olevan steroidien vaikutuksia kasvuun hormonia reagoivien solulinjojen, kuten LNCaP [46], [47].

Western Blot analyysi ja Pesuaine liukoisuus Connexin32

Solut (5 x 10

5) ympättiin 10 cm: n maljoille kaksoiskokeina 10 ml: aan täydellistä alustaa ja kasvatetaan yhtenäisiksi läsnä ollessa ja puuttuessa eri reagensseja. Solulyysiksen, pesuaine-liukoisuus määrityksessä 1% Triton X-100 (TX100) ja ilmentymistason Cx32 analysoitiin Western blot-analyysillä, kuten on kuvattu [25], [43], [44]. Lyhyesti, hajotuksen jälkeen puskurissa SSK (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM NEM, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM jodiasetamidi, 1% TX100: n, pH 7,4 ), koko, pesuaine-liukeneva ja -insoluble uutteet erotettiin ultrasentrifugoimalla 100000 x g 60 min (35000 rpm analyyttisen Beckman -ultrasentrifugissa; Malli 17-65 käyttäen SW50.1 roottori). Pesuaine liukenematon pelletit liuotettiin puskuriin C (70 mM Tris /HCI, pH 6,8, 8 M ureaa, 10 mM NEM, 10 mM jodiasetamidi, 2,5% SDS: ää, ja 0,1 M DTT: tä). Seuraavat normalisointi, joka perustuu solujen määrä, koko ja TX100-liukoinen ja -insoluble fraktiot sekoitettiin 4xSDS lastaus puskuriin lopulliseen pitoisuuteen 1 x ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, ennen kuin SDS-PAGE-analyysi. Blotit kehitettiin C-Digit (Li-COR, Lincoln, NE) käyttäen SuperSignal WestFemto Suurin herkkyys Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Viestintä Analyysit

Gap junktionaalinen viestintä analysoitiin by microinjecting Lucifer Yellow (MW 443 Da; litiumsuola), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da, A-10436), ja Alexa Fluor 594 (MW 760 Da, A-10438) käyttäen Eppendorf InjectMan ja Femtojet mikroinjektio järjestelmät (mallit 5271 ja 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY) asennettuna Leica DMIRE2 mikroskoopilla. Kuvauksen jälkeen kuvien mikroinjektoidusta solujen avulla CCD-kamera (Retiga 2000R, FAST 1394) käyttäen QCapture (British Columbia, Kanada), läpäisevyys eri fluoresoivien merkkiaineiden kvantitoitiin pisteyttämällä määrä fluoresoivia soluja 1 min (Lucifer Yellow ), 3 min (Alexa 488) ja 15 min (Alexa 594) jälkeen mikroinjektio testikenno kuvattu [22], [25], [43], [48].

Colony Formation and Cell Growth Analyysit

Solun kasvu määritettiin joko pesäkkeitä muodostavien määrityksessä tai laskemalla solujen lukumäärä, kuten on kuvattu [22], [48]. Sillä pesäkkeitä muodostavien määritystä, 1 x 10

3-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoille kolmena kappaleena 3 ml: ssa viljelyalustaa. 24 tunnin kuluttua yksi ml alustaa, joka sisälsi 1-25D, MB tai DHT lisättiin ruokia, jolloin saatiin haluttu lopullinen pitoisuus. Soluja kasvatettiin 21 päivää, ja keskipitkän vaihtuvat 4 päivää, joka sisältää sopivan pitoisuuden edellä mainituista reagensseista, kun ne on muodostettu näkyvissä pesäkkeitä. Siirtomaat ruokia fiksoitiin 3,7% puskuroitua formaldehydiä, värjättiin 0,025% liuos kristalliviolettia PBS, ja valokuvataan. Mittaamiseen solujen kasvua, 5 x 10

4-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoille replikaatteina ja käsiteltiin 1-25D edellä on kuvattu. Solujen annettiin kasvaa 10 päivän ajan ja keskipitkän muutos päivänä 5. Solut trypsinoitiin ja laskettiin hemosytometrillä.

Tulokset

D-vitamiini

3 Parantaa Cx32 Expression Level

Käytimme LNCaP-32-solut, jotka ilmentävät retroviruksella transdusoitujen rotan Cx32 aiemmin on kuvattu [25], [31]. Osoitimme aikaisemmin, että LNCaP-32-solujen Androgeenit säädellään muodostumista gjs, translaation jälkeen, ohjaamalla ilmentymistason Cx32 estämällä sen ERAD-välitteisen hajoaminen [25]. Meidän myöhemmät tutkimukset osoittivat, että androgeenisäädellyn hajoaminen Cx32 kumottiin all-trans retinoiinihappo (ATRA) ja 9-cis retinoiinihappo (9-CRA) [31]. Olemme näin rationalisoida että 1-25D saattaa toimia samanlainen ATRA ja 9-CRA. Perustui aikaisempaan tutkimukset osoittavat vaikutusta D-vitamiinin LNCaP solujen kasvua [10], [49] – [52], käsittelimme LNCaP-32-solujen kanssa eri pitoisuuksilla 1-25D tutkia sen vaikutusta ilmentymistason Cx32 . Olemme havainneet, että 1-25D lisääntynyt Cx32 ilmentymistaso annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Merkittävä parannus havaittiin jopa konsentraatio oli niin alhainen kuin 1 nM (kuvio 1 B, vasen kaavio). Suurempina pitoisuuksina 10 nmol olivat myrkyllisiä näihin soluihin arvioituna pesäkemuodostusta (julkaisematon data). Myöhempinä tutkimukset valitsimme 10 nM 1-25D. Aika kurssi tutkimukset osoittivat, että merkittävä kasvu Cx32 ekspressiotaso alkoi jo 12 h jälkikäsittelyn 1-25D ja saavutti tasanteen 72 h (kuvio 1CD, oikea kaavio). Vaikutus 1-25D on Cx32 ilmentymisen taso oli yhtä voimakas kuin synteettisten androgeenin, MB, ja 9-CRA. Lisäksi yhdistettynä hoidon 1-25D ja MB oli tehokas lisäämään Cx32 ekspressiotason (kuva 2AB). D-vitamiini

3 oli aikaisemmin osoitettu vaikuttavan ilmaus tason E-cad, olennainen proteiini vyöliitos, paksusuolen syöpäsoluissa [33]. Sen määrittämiseksi, onko 1-25D vaikuttaa myös ilmentymisen taso vyöliitos liittyviä proteiineja, mittasimme ilmentymisen taso E-cad ja siihen liittyvien proteiinien α- ja β-catenins 72 tuntia hoidon jälkeen 1-25D. Tulokset osoittivat, että 1-25D ei ollut vaikutusta ilmentymistason E-cad ja α- ja β-catenins (kuvio 2C). Mitattuna semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi, 1-25D ei indusoi endogeenisen Cx32 LNCaP-P tai LNCaP-N-soluja (tuloksia ei ole esitetty) eikä muuttanut ekspressiotaso retroviruksella transkriptoidaan Cx32-mRNA: n LNCaP-32 dokumentoituna aiemmin [25].

. Annoksesta riippuvainen parantamiseksi Cx32 ekspressiotason kun 1-25D hoitoa 48 tuntia. B. kvantitatiivinen analyysi ilmentymistason esitetyistä tiedoista A. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 4-17 kokeiluja. Huomaa, että merkittävä parannus havaitaan jopa 1 nM. Tähdet (**) osoittavat P-arvo ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen. C. kinetiikka parantamiseksi Cx32 ekspressiotason käsittelemällä 1-25D (10 nM) ja osoitetut ajat. Huomaa, että lisälaite on havaittiin jo 12 h ja tasankoja 72 tuntia. D. kvantitatiivinen analyysi ilmentymistason esitetyistä tiedoista C. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 3-11 kokeiluja. Tähti (*) osoittaa P-arvo on ≤0.0016 ja tähdellä (**) osoittavat P-arvo on ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen.

Cx32 ilmentävien LNCaP-32-soluja käsiteltiin 1-25D, 9-CRA, DHT ja MB kuten. A. Yhdistetty hoito 1-25D kanssa MB tai 9-CRA on tehokas lisäämään Cx32 ilmentymisen tasoa kuin hoidon ainoana lääkkeenä yksinään. B. kvantitatiivinen analyysi ilmentymistason esitetyistä tiedoista A. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 4-13 kokeiluja. Tähdet (**) osoittavat P-arvo ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen. C. Vaikutus 1-25D on vyöliitos liittyviä proteiineja. Expression of vyöliitos proteiinien E-kadheriinin (E-cad), α-kateniinin (α-cat), ja β-kateniinin (β-cat) analysoitiin Western blot -analyysillä kokosolulysaattia (10 ug). Huomaa, että ei ole vaikutusta.

D-vitamiini

3 Parantaa Gap Junction Assembly ja junktionaalinen Communication

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus 1-25D sen kokoonpanoon Cx32 osaksi gjs. Huomasimme, että samanaikainen kasvun kanssa ilmentymistason Cx32, 1-25D myös lisääntynyt GJ kokoonpanon arvioimana immunosytokemiallisessa analyysi (kuvio 3A) ja biokemiallisesti Western blot-analyysi koko, TX100 liukeneva ja -insoluble otteet 48 h käsittelyn jälkeen (kuvio 3BC). Tämä biokemiallinen menetelmä perustuu siihen periaatteeseen, että CXS, jotka on otettu osaksi gjs tullut liukene TX100 taas CXS, joita ei ole sisällytetty gjs pysyvät liukeneva [53]. Tämä määritys on toistettavasti osoitettu mitata kokoonpanoon CXS osaksi gjs dokumentoimat aiemmissa tutkimuksissa [24], [25], [53]. Lisäksi olemme havainneet, että tehostaminen GJ kokoonpano oli mukana 2-3 kertaiseksi samanaikainen lisääntyminen junktionaalinen viestinnän määritettynä junktionaalinen siirsi kolme GJ läpäisevä fluoresoiva merkkiaineiden, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570), ja Alexa 594 (MW 760). Esimerkiksi, 1-25D lisääntynyt junktionaalinen siirto Alexa 594 2-3 taittuu verrattuna kontrolleihin (taulukko 1). Vaikutus 1-25D on junktionaalinen viestintää oli yhtä voimakas kuin synteettisten androgeenin, MB, ja luonnollisen androgen DHT (taulukko 1). Sen määrittämiseksi, 1-25D vaikutti kokoonpano muiden junktionaalinen komplekseja, tutkimme myös pesuaine-liukoisuutta adherens ja tiiviin liitoksen liittyviä proteiineja. Perusajatus Näissä tutkimuksissa oli, että E-cad on osoitettu helpottaa kokoamista CXS osaksi gjs [43], [44], [54], ja Cx ilme on osoitettu helpottamaan kokoonpanoa tiiviiden liitosten ja niihin kuuluvia proteiineja [39]. Olemme havainneet, että 1-25D ei ollut vaikutusta liukoisuuteen E-cad ja siihen liittyvät proteiinit, α- ja β-kateniinin, ja tiiviin liitoksen liittyvien proteiinien, ZO-1 ja occludin, TX-100 viittaa siihen, että niiden kokoonpano ei ole entisestään vastaaviin soluliitos (kuvio 3B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen 1-25D, kuten androgeenit ja retinoideja, parantaa ekspressiotaso Cx32, ja sen myöhempi kootaan gjs ilman havaittavasti muuttamatta ekspressiotason muiden soluliitos liittyviä proteiineja.

LNCaP -32 soluja, kasvatettu joko kuusi hyvin klustereissa tai 10-cm astioita, käsiteltiin 1-25D (10 nM), MB (5 nM) ja 1-25D plus MB 48 tuntia. A. Assembly of Cx32 (vihreä) otetaan gjs arvioitiin immunosytokemialli-. E-cad näkyy punaisella ja ytimet ovat sinisiä. Bar = 20 uM. Huomaa, että GJ muodostuminen tehostui käsittelemällä 1-25D ja MB. B. TX100- liukoisuus määritystä käytettiin mittaamaan kokoonpano Cx32 osaksi gjs, tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin (Occl) ja ZO-1 ja vyöliitos proteiini, E-kadheriinin (E-cad) ja α-kateniinin (α-cat). T = yhteensä fraktio; S = liukoisen jakeen ja I = liukene murto. C. kvantitatiivinen analyysi ilmentymistason Cx32 esitetyn B. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 4-17 kokeiluja. Huomaa, että sekä kokonaistaso ja pesuaine liukenematon osa Cx32 kasvoi merkittävästi. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 3-11 kokeiluja. Tähti (*) osoittaa P-arvo on ≤0.0016 ja tähdellä (**) osoittavat P-arvo on ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen. Huomautus puuttuminen vaikutus vyöliitos liittyviä proteiineja, E-cad, ja tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin (Occl).

D-vitamiini

3 moduloi androgeenisäädellyn Formation ja hajoamista Gap liitokset

Aiemmat tutkimukset LNCaP-32-solut olivat osoittaneet, että androgeenien väheneminen aiheutti hajoamisen Cx32, jonka ERAD, ja että androgeenien parantaa GJ muodostuminen uudelleen reititys ERAD kohdistetun allas Cx32 solun pinnalle , joten se alistaa GJ kokoonpanoon [25]. Seuraavina tutkimuksissa osoitimme, että androgeenisäädellyn muodostuminen ja hajoaminen gjs estivät 9-CRA ja Atrás [31]. Me rationalisoida että 1-25D saattaa lisätä GJ osineen pelastaa ERAD kohdistetun allas Cx32 kuten 9-CRA ja ATRA. Siksi tutkimme ilmentymistason Cx32 ja sen kokoamista gjs kun androgen ehtyminen läsnä ja poissa ollessa 1-25D LNCaP-32 soluihin. Näitä tutkimuksia varten käytettiin androgeeni-köyhdytettyä (hiilellä erotettua) ja fenoli-punaista soluviljelyelatusaineella kasvaa soluissa, koska fenoli-punaista on heikko steroidien vaikutusta [46]. Kuten havaittiin aiemmissa tutkimuksissa [25], olemme huomanneet, että androgeenin ehtyminen laski ilmentymisen taso Cx32 12 h, joka ei ainoastaan ​​estyi lisättäessä MB mutta myös 1-25D (kuvio 4AB). Lisäksi, yhdistetty hoito MB ja 1-25D näytti olevan tehokkaampi parantaa ilmentymisen taso Cx32 (kuvio 4A, ylempi blot). Olemme myös havainneet, että androgeenien väheneminen alensi ilmentymisen taso AR, joka on myös estetty, kun hoito ei vain androgeenien, mutta myös 1-25D (kuvio 4A, pohja blot). Perustelemaan nämä tiedot olemme edelleen arvioi muodostumista gjs immunosytokemialli- (kuvio 5A) ja toiminnallisesti mittaamalla junktionaalinen siirtoa Lucifer Yellow, Alexa 488, ja Alexa 594 (taulukko 2). Tulokset osoittivat, että gjs oli tuskin havaittiin soluissa kasvatettu androgeenista köyhdytettyä väliaine arvioituna puute Cx32-erityisiä immunovärjäys at solu-solu kosketukseen alueilla, kun he olivat havaitaan heti kun androgen-köyhdytettyä alustaan ​​lisättiin 1-25D ja MB (kuvio 5A). Funktionaaliset määritykset osoittivat, että junktionaalinen siirto Lucifer Yellow, Alexa 488 ja Alexa 594 väheni merkittävästi, kun androgen ehtyminen, joka esti upon täydennystä androgeenista köyhdytettyä väliaineessa MB ja 1-25D (taulukko 2), siten perustellen immunosytokemiallisia tiedot.

LNCaP-32 soluja, ympättiin 10 cm ruokia, siirtyneiden hiilellä erotettua (androgeenin köyhdytettyä) väliaineessa (ST). Ilmentymistaso Cx32 ja AR määritettiin Western blot -analyysillä (A) läsnä ollessa ja puuttuessa 1-25D (10 nM) ja MB (5 nM). Huomaa, että Cx32 ja AR hajoavat kun androgen ehtymisen ja kulumisen on estetty kun 1-25D hoitoa. BC. Kvantitatiivisia analyyseja ilmentymisen taso Cx32 (B) ja AR (C) tietojen esitetyn A. Kukin pylväs Mean and Standard keskivirhe 5-11 kokeiluja. Tähdet (**) osoittavat P-arvo ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen.

LNCaP-32-solut, kylvetään kuusi hyvin klustereissa tai 10 cm astioita, oli siirtynyt hiili -stripped, androgeenista köyhdytettyä väliaine (ST). GJ kokoonpano ja ilmentymistason Cx32 määritettiin immunosolukemiallisten (A) ja Western blot (B) analysoi by TX100-liukoisuus määritys läsnä ja poissa ollessa 1-25D (10 nM) ja MB (2,5 nM). (A), Cx32 on vihreä ja E-cad on punainen ja ytimet (sininen) värjätään DAPI. Asteikkoviiva A = 20 uM. (B), T = yhteensä fraktio; S = liukoisen jakeen ja I = liukene murto. TX100-liukoisten ja liukenemattomien fraktioiden sekä immunosolukemiallisten määritys suoritettiin 24 tunnin kuluttua, strippaus, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Huomaa, että gjs jotka hajoavat kun androgen ehtymisen ja kulumisen on estetty kun 1-25D hoito (A). Huomaa myös, että TX100-liukoinen osa E-cad (E-cad), β-kateniinin (β-kissa) ja ZO-1 ei vaikuta. Huomaa myös, että androgeenin ehtyminen lisää liukoinen osa occludin (B) vaikuttamatta yhteensä occludin tasot kvantitoitiin D. tähdellä (*) osoittaa P-arvo on ≤0.0016 ja tähdellä (**) osoittavat P-arvo on ≤0.0001. Kahden tailed Opiskelijan

t

testiä käytettiin laskemiseen P-arvo olettaen että varianssi on erisuuruinen.

immunosolukemiallisten ja junktionaalinen siirtää tietoja tukee myös TX100-liukoisuutta määritys ( Kuva 5BC). Olemme myös tutkineet vaikutusta androgen-heikentymisen pesuaine-liukoisuus E-cad ja β-kateniinin ja tiukka liitos liittyvien proteiinien, ZO-1 ja occludin. Yhdenmukainen aikaisemmissa tutkimuksissa [25], tulokset osoittivat, että androgeenin ehtyminen lisääntynyt pesuaine-liukoisuus occludin mutta ei ZO-1 ja E-cad ja β-kateniinin (kuvio 5BD). Tutkimme myös vaikutusta MB ja 1-25D joko yksin tai yhdessä muodostumista gjs vanhempien LNCaP-P ja G418-resistenttien LNCaP-N-solut ja totesi, että niillä ei ollut vaikutusta (tietoja ei esitetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että 1-25D estää androgeenisäädellyn hajoamista Cx32 ja parantaa GJ muodostumista LNCaP-32 soluihin. Koska yhdistettynä hoidon androgeenien ja 1-25D ei tehostanut GJ kokoonpano edelleen, on todennäköistä, että kokoonpano tehostettiin pelastamiseksi sama pooli Cx32 joka oli suunnattu ERAD kun androgen ehtyminen. Kuten todettiin aikaisemmissa tutkimuksissa, kokoonpano ja pesuaine-liukoisuutta Cx32 ja occludin osaksi soluliitos, tai päinvastoin, näyttää säänneltävä coordinately [25].

1-25D Parantaa Gap Junction Formation riippumaton androgeenireseptorin Function

tulokset osoittivat, että 1-25D esti hajoaminen AR upon androgeenireseptorin ehtymisen (kuvio 4A, pohja blot). Myös hoito LNCaP-solujen 1-25D oli todettu lisäävän AR ekspressiotason [40]. Niinpä harkitsi mahdollisuutta, että vaikutus 1-25D vahvistamista koskevaan GJ kokoonpano riippui toimintaa AR yksin – eikä riippumatonta vaikutusta 1-25D. Testata tätä käsitettä, käsittelimme LNCaP-32-solujen kanssa antiandrogeeni, Casodex (bikalutamidi), estää androgeenin toiminnan [55], [56]. Sekä androgeenireseptorin ehtyminen ja hoitoa Casodex aiheuttama hajoaminen AR (kuvio 6A, ylempi blot, kuvio 6B) ja poisti vaikutuksen MB ja DHT Cx32 ekspressiotason (kuvio 6A, pohja blot, kuva 6B), kuten havaittiin meidän aikaisemmissa tutkimuksissa [25], [31]. Kuitenkin olemme huomanneet, että Casodex ei ollut vaikutusta parantamista ilmentymistason Cx32 johtuva hoidon 1-25D androgeeni-köyhdytettyä väliaineessa (kuva 6AB). Väitteensä näitä tietoja, tutkimme seuraavaksi muodostumista gjs immunosytokemialli- soluissa käsitelty Casodex läsnä ja poissa ollessa Mt 1-25D. Olemme havainneet, että gjs ei muodostunut, kun soluja käsiteltiin Casodex normaalissa seerumissa tai androgeeni-köyhdytettyä alustassa, joka sisältää MB, kuten havaittiin aiemmissa tutkimuksissa (kuvio 7) [25], [31]. Toisaalta olemme havainneet, että gjs oli täysin muodostunut, kun soluja käsiteltiin Casodex ja 1-25D (kuvio 7). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että mekanismi, jolla 1-25D estää hajoamista Cx32 ja parantaa GJ muodostumista, kun androgeeni ehtyminen on riippumaton AR.

LNCaP-32-soluja, ympättiin 6-cm: n maljoihin, kasvatettiin 70% konfluenssiin. Sitten soluja kasvatettiin vielä 24 h tavanomaisessa väliaineessa (NS), androgeenin-köyhdytettyä pelkällä väliaineella (ST), normaali seerumin täydennetty Casodex (CDX; NS + CDX), androgeenin-köyhdytettyä väliaineessa, jota oli täydennetty MB (ST + MB), MB ja Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D ja Casodex (ST + 1-25D + CDX) ja normaalissa seerumissa 1-25D (NS + 1-25D ).