Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoite

Kehittäminen vankka prognoosi- ja /tai ennakoivaa biomarkkereita potilailla, joilla peräsuolen syöpä (CRC) on välttämätöntä edistää hoitostrategioiden tähän sairauteen. Meidän tavoitteena oli selvittää ilmentymistilanne tiettyjen miRNA saattaa olla prognostista /ennustearvo CRC hoidetuilla potilailla tavanomaisten sytotoksisten chemotherapies.

Methods

Tutkimme kohortin 273 CRC yksilöitä vaiheen II /III hoidetuilla potilailla 5-fluorourasiilin kemoterapiaa liitännäishoitona ja vaihe IV potilaat altistettiin 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinipohjaisen kemoterapiaa. Vuonna seulonta sarja (n = 44), 13 21 ehdokkaan miRNA onnistuneesti kvantitoitiin multiplex kvantitatiivinen RT-PCR. Validoinnissa joukko käsittää koko potilaan kohortin miR-148a ilmentymistilanne arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR, ja sen promoottori metylaatio kvantifioitiin bisulfiitti pyrosekvensointi. Lopuksi olemme analysoineet assosiaatiot miR-148a ilmaisun ja potilaan selviytymistä.

Tulokset

Yksi ehdokas miRNA tutkittu, miR-148a ilmentyminen oli merkittävimmin alassäädetty kehittyneiden CRC kudoksissa. Vaiheessa III ja IV CRC, alhainen miR-148a ilmentyminen liittyi huomattavasti lyhyempi taudista vapaan eloonjäämisen (DFS), huonompi hoitovaste, ja yleensä ottaen heikkoa (OS). Lisäksi miR-148a metylaatiostatuksen korreloi käänteisesti sen ilme, ja liittyi elinajan IV vaiheessa CRC. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä miR-148a ilmentyminen oli itsenäinen ennustetekijöiden /ennustava biomarkkereiden pitkälle CRC potilaita (DFS vaiheessa III, matala vs. korkea ekspressio, HR 2,11; OS IV vaiheessa, HR 1,93).

Keskustelu

MiR-148a asema on ennustetyövälineenä /ennustearvo kehittynyt CRC hoidetuilla potilailla tavanomaisen kemoterapian, jossa on tärkeitä kliinisiä parantamisessa hoitostrategioita ja henkilökohtainen hallinnoinnin maligniteetti.

Citation: Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, Hur K, Toiyama Y, Castells A, et al. (2012) kliininen merkitys MiR-148a kuin Ennakoiva biomarkkereiden potilailla, joilla Advanced peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (10): e46684. doi: 10,1371 /journal.pone.0046684

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 03 syyskuu 2012; Julkaistu: 03 lokakuu 2012

Copyright: © Takahashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tuettiin avustuksilla R01 CA72851 ja CA129286 National Cancer Institute, National Institutes of Health, jonka varoja Baylor Research Institute (CRB ja AG), ja avustusta Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-19273), Agencia de gestio d’Ajuts Universitaris i de Recerca (2009 SGR 849, AC), ja Fundación Mútua Madrileña (AP7901-2010, MC), XBTC, BT, Biobanc. MT oli osittain tuettu avustusta Cell Science Research Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tällä hetkellä peräsuolen syöpä (CRC) potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke (TNM-luokitus III) käsitellään adjuvanttihoitoa joka sisältää sytotoksiset lääkkeet kuten 5-fluorourasiili (5-FU) ja oksaliplatiinia, kirurgisen resektion syöpä. Samoin potilailla, joilla on etäinen metastaattinen CRC (vaihe IV) käsitellään eri yhdistelmiä kemoterapeuttisten ja molekyylirakennetta kohdistettuja lääkkeitä, jotka sisältävät anti-VEGF ja anti-EGFR-vasta-aineita. Vaikka nämä hoito-ohjelmat ovat parantuneet tuloksia potilailla, joilla on edennyt CRC, huomattava osa ihmisistä ei saada mitään hyötyä tällaisia ​​hoitoja, ja jonkin verran kokemusta pahemmin seurauksena lääkeliitteisellä toksisuuksien. On välttämätöntä tarve kehittää ennustavia biomarkkerit, jotka voivat valita potilaiden alaryhmässä, jotka hyötyvät perinteisen kemoterapeuttiset lääkkeet, jotta potilaat, jotka eivät hyödy hoitoa voidaan säästynyt huumeiden myrkyllisyys ja tarjotaan vaihtoehtoinen hoitoja.

Mutaatiot

KRAS

ovat ainoat perustettu ennakoivan markkereita valitsemiseksi hoitostrategioiden CRC. Potilaat, joilla on kasvaimia mutaatioita kodonissa 12 tai 13

KRAS

geeniä eivät hyödy anti-EGFR-pohjainen lääkehoito [1], [2], ja näin ollen seulonta tämä mutaatio suositellaan kaikille vaihe IV potilaat, jotka ovat ehdolla anti-EGFR-vasta-pohjainen lääkehoito. Lisäksi mikrosatelliittien epävakaus (MSI), ilmiasuun läsnä -15% of kulutustarviketta, on osoitettu liittyvän paremman kokonaistehon (OS) riippumatta adjuvanttihoitoa sekä puutteesta hyötyä 5-FU-kemoterapian vaiheessa II potilaille [3], [4]. Kuitenkin myös MSI on ennustearvo vaiheen III saaneilla potilailla kemoterapiaa on epävarmaa [5], [6]. Vaikka jotkut tutkimukset ovat viitanneet siihen, että muut molekyylimarkkereita, kuten CpG-saarekkeen methylator fenotyypin tai ilmentymistilanne liittyvien geenien DNA: n korjaukseen tai huumeiden aineenvaihdunnassa (kuten

ERCC1

ja

TYMS

) voi olla potentiaali ennustetekijöitä /ennustava markkereita, ei ole riittävästi johdonmukaista tietoa tukevat hyödyllisyyttä näistä merkeistä [7] – [11]. Yhdessä huolimatta harppauksia tehty genomi- ja epigenomic luonnehdinta CRC ei ole

perustettu

biomarkkerit joka voi luotettavasti ennustaa hoitotulosten tavanomaisista sytostaattihoitoa potilailla, joilla on vaiheen III tai IV CRC.

häiriöstä mikroRNA (miRNA) ilmentyminen on osallisena aikaisin kasvainten synnyssä sekä taudin etenemiseen oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [12], [13]. miRNA aikaansaavat onkogeenisia ja /tai tuumoria tukahduttavan vaikutuksensa sitoutumalla 3′-transloimattomat alueet mRNA, joka johtaa poistaminen käännöksen tai tehostetun hajoamisen vastaava viesti. CRC, säädeltyyn ilmentyminen useiden miRNA, kuten miR-17~92, miR-21, miR-31, miR-34b /c, miR-143, miR-145, ja miR-203 on aikaisemmin raportoitu [14] – [17]. Koska miRNA on keskeinen merkitys ihmisen Karsinogeneesin on kasvavaa kiinnostusta tunnistamisessa prognoosi- tai ennakoivaa miRNA potilailla, joilla on CRC.

Kuitenkin vain kourallinen raportit ovat tutkineet mahdollisuuksia miRNA (t) prognostisia /ennustava biomarkkereita CRC. Vuonna uraauurtava tutkimus, SCHETTER

et al.

Osoittivat, että miR-21 voi olla lupaava prognostinen /ennustava markkeri vaiheen II /III CRC käsiteltiin 5-FU-kemoterapian [17]. Vastaavasti toinen ryhmä on osoittanut, että II vaiheen potilaalla on kohonnut ilmentyminen miR-320 tai miR-498 oli parempi uusiutumista vapaa eloonjääneiden [18]. Kuitenkin otoskoot analysoitu näissä tutkimuksissa olivat suhteellisen pieniä, tulokset eivät ole validoitu muissa tutkimuksissa, ja ei ole yrittää määrittää ennustavan hyödyllisyys tahansa miRNA IV vaiheessa CRC. Oletimme, että ilmaus profiilit erityisiä miRNA (t) saattaa olla prognostista ja /tai ennustearvo potilailla, joilla on vaiheen IV CRC sekä ne, joilla aiemmissa vaiheissa. Tässä on ensimmäinen seulonta vaiheessa, että mukana analyysi 21candidate miRNA, huomasimme, että miR-148a usein vaimentua pitkälle CRC. Tämän jälkeen analysoimalla suuri validointi kohortin 273 CRC tarjoamme uusia todisteita siitä, että miR-148a on usein alassäädetty tässä sairaudessa, ja tämä pääasiassa tapahtuu kautta hypermetylaatiota oletetun promoottorialueen. Lisäksi osoitamme, että matalan miR-148a ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä epäsuotuisaan lopputulokseen potilailla, joilla on vaiheen III CRC käsiteltiin 5-FU-kemoterapian ja huonommalla hoitovasteen ja eloonjäämisen potilailla, joilla on vaiheen IV CRC käsiteltiin 5- FU: hun ja oksaliplatiinia.

Potilaat ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi Institutional Review Boards (IRB) of Hospital Clinic, Barcelona, ​​Espanja, ja kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

potilaat

Formaliinifiksoidusta parafinoidut (FFPE) kudoksiin kohortin 273 potilailla, joilla on CRC (primaarikasvainten 76 vaiheen II, 125 vaiheen III , ja 72 vaiheen IV CRC) ja 20 kudosnäytteiden normaaleista paksusuolen limakalvon terveillä henkilöillä saatiin patologian osaston sairaalan Clinic, Barcelona, ​​Espanja. Potilaat mukana tässä tutkimuksessa otettiin vuosina 1996 ja 2008. Kaikki vaiheen II ja III potilaat saivat 5-FU-pohjainen adjuvanttihoitoa 6 kuukauden jälkeen kasvaimen resektion, ja kaikki vaihe IV potilaat saivat 5-FU: hun ja oksaliplatiinia kunnes hoito on epäonnistunut. Näyttämö II ja III potilaita seurattiin kolmen kuukauden välein kahden ensimmäisen vuoden aikana, ja kuuden kuukauden välein seuraavien kolmen vuoden aikana. Sekä Paikallista uusiutumisen ja /tai kaukana etäpesäke määriteltiin kasvaimen uusiutumisen, kun taas metachronous peräsuolen leesioita ei pidetä toistumisen. Mediaani seuranta ajat ovat 52,2 kuukautta (vaihteluväli; 2,9-173kuukausi) vaiheessa II ja III potilaista ja 19,1 kuukautta (vaihteluväli; 3,7-83,7kuukautta) IV vaiheessa potilailla. Niistä vaiheen II ja III potilaat, 70 potilasta (35%) oli uusiutunut (mediaani; 17,8 kuukautta, alue: +5,5-144kuukausi), ja mediaani DFS ei-uusiutumisen potilailla oli 40,5 kuukautta (vaihteluväli; +7,5-155kuukausi) . Seuranta-potilaiden valmistui marraskuussa 2009. kemoterapeuttisia vaste vaiheessa IV potilailla arvioitiin mukaisesti Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) suuntaviivat [19] kahden kuukauden välein. MSI asema kasvainten määritettiin analysoimalla viisi mononukleotidi markkereita (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, ja NR-24; MSI Analysis System, Promega, Madison, Wisconsin, USA). Kliinis potilaiden ominaisuuksiin on esitetty taulukossa 1.

DNA: n ja RNA

DNA uutettiin 10 pm paksu FFPE kudoksissa käyttämällä QIAmp DNA FFPE kudoksen (Qiagen , Valencia, Kalifornia, USA). Kokonais-RNA mukaan lukien miRNA fraktio uutettiin FFPE kudoksista käyttäen RECOVERALL- yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Inc., Austin, Texas, USA).

Multiplex kvantitatiivinen RT-PCR-

seulonta setti sisältyvät normaalin paksusuolen limakalvoa terveillä koehenkilöillä ja 44 CRC kudosten (16 vaiheen II ja III kussakin sekä 12 vaihe IV potilasta), ilmaus asema 21 ehdokasta miRNA (miR-9, miR-10b, miR-19a, miR -21, miR-31, miR-34a, miR-34c, miR-101, miR-103, miR-137, miR-143, miR-145, miR-148a, miR-148B, miR-152, miR-155 , miR-194, miR-320, miR-335, miR-373 ja miR-519c) kvantifioitiin käyttäen suuren suorituskyvyn Fluidigm mikrofluidistiikka dynaaminen taulukko [20]. Jokainen Taqman miRNA-määritys (osa nro. 4427975, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) käytettiin multiplex RT-PCR-analyysi seuraavasti: määritys ID, 000583, 002218, 000395, 000397, 002279, 000426, 000428, 002253 , 000439, 001129, 002249, 002278, 000470, 000471, 000475, 002623, 000493, 002277, 000546, 000561, ja 001163, vastaavasti. Nämä ehdokas miRNA on aiemmin osoitettu olevan osallisena CRC ja /tai muita ihmisen maligniteettien [16], [18], [21] – [35].

kvantifiointi miRNA ilmaisun reaaliaikaisella RT PCR

validointi joukko, joka sisälsi koko potilaan kohortin miRNA ilmentyminen kvantifioitiin Taqman käänteistranskriptio-PCR (qRT-PCR) käyttäen ABI 7000 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems). Ilmaisu Mir-148a laskettiin delta Ct-arvon menetelmää käyttäen miR-16 ilmentyminen kuin normalisoija [36], [37]. Pitääkseen johdonmukainen mittauksia kaikissa levyt, kolme riippumatonta RNA-näytteet ladattiin sisäisen valvonnan jokaisessa PCR aikavälillä ja tulokset kultakin levyltä normalisoitiin mukaan saatuja tietoja sisäisen valvonnan.

DNA metylointianalyysi

DNA bisulfiitti muutettu käyttämällä EZ DNA metylaatio Gold Kit (Zymo Research, Irvine, Kalifornia, USA). Metylointi otaksuttu miR-148a promoottorialueen kvantifioitiin bisulfiitin pyrosekvensointi (PSQ HS 96A pyrosekvensointi järjestelmä, Qiagen). Seuraavia alukkeita käytettiin; miR-148a eteenpäin, 5′-biotiini-TAGGAAGGAAGGAGAGTG, miR-148a käänteinen, 5′-CCCAACAAAAATAATATTTTAACA, ja miR-148a sekvensointi, 5′-CAAAAATAATATTTTAACAACC. Metylaatiotasot kolme CpG sivustoja analysoitiin ja metylaation tason kunkin tuumorin edustettuina keskiarvo metylaatiotasoilla kolme CpG sivustoja. Seuraavat PCR-sykliä olosuhteita käytettiin: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 7 min, jota seurasi 45 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 52 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 sekuntia.

In situ

-hybridisaatio miR-148a

In situ

-hybridisaatio (ISH) suoritettiin kuten ovat kuvanneet Navarro et ai. [38] pienin muutoksin. Fluoreseiini (FITC) 5′-leimattua lukittu nukleiinihappo-sisällytetty miRNA koetin (miRCURY LNA detektiokoetinta, Exiqon, Woburn, Massachusetts, USA) käytettiin visualisointi miR-148a on 3 pm paksu FFPE kudosleikkeiden. Salattu ja RNU6b koetin sisällytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti (Exiqon). Objektilasit pantiin uuniin 59 ° C: ssa yön yli. Kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät etanolilla ja käsiteltiin dietyylipyrokarbonaatilla vedessä 1 minuutin ajan. Kromogeeninen ISH suoritettiin automatisoidussa alusta Bond Max (Vision BioSystems, Norwell, Massachusetts, USA). Objektilasit esikäsiteltiin proteaasin 1 4 minuuttia 37 ° C: ssa. Yhteensä 300 ui 25-nM koetin hybridisoitiin natriumkloridi, natriumsitraatti hybridisaatiopuskurissa 45 ° C: ssa yön yli. Immunologinen havaitseminen suoritettiin hiiren anti-FITC-vasta-ainetta 37 ° C: ssa 60 min ja sen jälkeen biotiini-vapaa, polymeeriset piparjuuriperoksidaasiin linkkeri-vasta-aine-konjugaattia järjestelmän (Tarkenna Detection System, Vision BioSystems). DAB käytettiin kromogeeni ja hematoksyliinillä käytettiin vastavärinä.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia, USA) tai MedCalc v12 (MedCalc ohjelmisto, Belgia). Erot kahden ryhmän välillä analysoitiin Mann-Whitneyn U-testi. Korrelaatio analyysit tehtiin käyttämällä Spearmanin listalla korrelaatio menetelmä. CRC kasvaimet luokitella korkean ja matalan miR-148 ilmaisu ryhmiä käyttäen Receiver Operating Characteristic käyräanalyysi (vaiheen II /III) tai mediaani lauseke arvot (vaihe IV). Kaplan-Meier-analyysi suoritettiin arvioida jakaumia tautivapaan elinajan (DFS) ja syöpää erityisiä yleistä (OS) vaiheessa II ja III potilaiden, ja ilman taudin etenemistä (PFS) ja OS IV vaiheessa potilailla. Log-rank-testiä käytettiin analysoimaan tilastollisia eroja selviytymistietoa päätellä Kaplan-Meier käyrät. Coxin suhteellisen riskin regressioanalyysi suoritettiin laskemaan HR ja 95%: n luottamusväli kunkin covariable. Lopullinen Monimuuttuja malli perustuu vaiheittaista menetelmää kliiniset tekijät liittyvät hyvä tai huono selviytyminen (p 0,1) in yksiulotteista mallia. Selviytymisen analyysin yksinäinen MSI kasvain jätettiin vaiheen IV ryhmä. Kaikki erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, kun p 0,05.

Tulokset

miR-148a on ehdokas miRNA joka on usein alassäädetty vaiheessa III ja IV CRC

vuonna seulonta asettaa, ensin seulotaan 21 ehdokkaan miRNA jotka ovat sekaantuneet kasvainten synnyssä käyttäen Fluidigm mikrofluidistiikka dynaaminen taulukko (n = 44; täydentävä taulukko S1). Niistä 21 miRNA analysoitu, 13 miRNA onnistuneesti tuottanut ilmaisun tuloksia multiplex RT-PCR. Seitsemän miRNA oli merkittävästi muuttunut ilmaisun välillä normaalin ja CRC kudoksissa. Kaikista vain miR-148a paljasti huomattavan alassäätöä kasvaimissa imusolmuke (vaihe III) tai kaukana etäpesäke (IV) verrattuna tuumoreihin (II), mikä korostaa tämän merkitystä miRNA CRC etenemisen /etäpesäkkeitä. Näiden tulosten pohjalta, me jälkeen määritettiin, onko miR-148a ilmentymisen muutoksen suuremman kohortin CRC ole mitään ennustetekijöiden /ennustearvoa.

Meidän koko kohortti (n = 273), miR-148a ilmentymisen vaiheessa III /IV kasvaimet oli huomattavasti pienempi kuin normaalissa paksusuolen limakalvon (p 0,001; kuvio 1A). Havaitsimme myös suuntaus asteittainen alentaminen miR-148a lausekkeen etenee vaiheeseen CRC: t (kuvio 1A). Tarkemmin sanottuna miR-148a ilmentymisen vaiheessa III ja IV kasvaimet oli merkittävästi alhaisempi kuin normaalissa paksusuolen limakalvon (p 0,001), vaikka se ei ollut merkitsevää eroa vaiheen II kasvaimet ja normaalin limakalvon yksilöt (p = 0,41; kuvio 1A) .

. miR-148a ilmentymisen paksusuolen limakalvoa terveiden verrokkien (NC), ja vaiheen II, III ja IV CRC; potilaiden määrä (N) ja mediaani lauseke (mediaani) on lueteltu alla kaavion. B.

In situ

-hybridisaatio miR-148a CRC kasvaimia ja normaali limakalvo, jossa kromogeeni tahrat punainen, ja vastavärinä sininen. Edustavia mikrovalokuvia on esitetty normaalista paksusuolen limakalvo (ylälevyissä), kasvain on alhainen miR-148a lauseke (keskimmäinen paneeli), ja kasvaimen korkean miR-148a lauseke (alempi paneelit) ilmoitetuilla suurennuksilla. Mikrovalokuva on esitetty kasvaimesta korkean miR-148a ilmentymisen käyttäen ryntäily koetin negatiivisena kontrollina (alhaalla, vasen paneeli). C. miR-148a metylaatiotasoilla IV vaiheessa kasvaimia. Otaksuttu pro- Mir-148a, ja asema pyrosekvensointi alukkeiden on esitetty yläpaneelissa. Sirontakuvaajaan Mir-148a ilmaisun ja metylaatiotasoilla näkyvät pohjapaneelin. D. miR-148a ekspressiotasot näkyvät metyloidut ja metyloitumattomien CRC yläpaneelista. miR-148a metylaatiotasoilla näkyvät kasvainten korkean ja matalan miR-148a ilmentymisen pohjapaneelin. Yksi harha-arvo (metylaatio tasolla 48%) jätetään pois metyloidut ryhmän pohjaan kaavion.

Seuraavaksi vahvistamaan kasvainspesifisen ekspressiokuviota Mir-148a, suoritimme ISH analyysi alaryhmässä vaiheen IV kasvainten korkean ja matalan miR-148a ilme. Havaitsimme, että ilmentyminen normaalissa paksusuolen limakalvon II vaiheen kasvaimista oli korkea, mikä vahvistaa qRT-PCR-tuloksiin (kuvio 1 B). CRC korkean miR-148a ilmentymisen qRT-PCR ilmaisi myös tämän miRNA pääasiassa sytoplasmassa neoplastisten solujen (kuvio 1 B), mutta ei ei-epiteelisolujen stroomasolujen, lukuun ottamatta värjäytymisen tiettyjen tulehduksellisten solujen lamina propria, erityisesti plasman soluja. Lisäksi CRC alhainen miR-148a ilmentyminen varmistettiin qRT-PCR paljasti myös erittäin alhainen tai poissa ilmaus tästä miRNA ISH tasolla (kuvio 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että meidän qRT-PCR tulokset tarkasti heijastanut endogeenisen ilmentymisen miR-148a sisällä syöpäsoluja saatu CRC kudosnäytteet.

Expression of miR-148a korreloi käänteisesti sen promoottorin metylaatiostatuksen

otaksuttu promoottorialue miR-148a sivustojen sisällä CpG-saarekkeen, ja metylaatio näiden CpG sivustoja on ehdotettu mahdollisena mekanismi miR-148a inaktivaatio CRC ja rintasyöpiä [39] – [41]. Kuitenkaan mikään aiemmat tutkimukset ovat perusteellisesti tutkineet suoraa korrelaatiota miR-148a ilmaisun ja sen metylaatiostatuksen suuressa kohortissa syövän yksilöitä. Niinpä olimme kiinnostuneita selvittämiseksi, onko säätely alaspäin miR-148a havaittu meidän kohortissa oli seurausta promoottorin hypermetylaatio. Koska miR-148a oli useimmin alassäädetty IV vaiheessa CRC, fokusoimme metylointianalyysi näissä kasvaimissa. Quantitative bisulfiitti pyrosekvensointi paljasti, että jossakin vaiheessa IV CRC osoitti miR-148a hypermetylaation. Metylaatiotasot vaihteli välillä 4-26% (mediaani, 10%), ja kun metylaatiostatuksen kunkin kasvaimen verrattiin sen qRT-PCR-peräinen ilmentymisen tila, merkittävä korrelaatio havaittiin (Spearmanin kerroin, R

2 = -0,43, p 0,001; kuvio 1C). Lisäksi, kun me luokitellut kaikki kasvaimet osaksi metyloimattoman (metylaatio taso 15%) ja metyloituja ryhmät (≥15% metylaatio), havaitsimme, että metyloitu kasvaimet olivat jatkuvasti alemmat miR-148a lauseke (0,068 vs. 0,088, p = 0,029; Kuva 1D, ylhäällä). Lisäksi CRC alemman miR-148a ilmentyminen useammin metyloitiin verrattuna kasvainten suurempi ekspressio (mediaani, 11% vs. 8%, p = 0,001, Mann-Whitney U-testi, kuvio 1 D, alhaalla). Nämä tulokset korostavat, että hypermetylaatiota oletetun miR-148a promoottorialueen tärkeä sääntelyn mekanismi sen ilmentymistä CRC.

Low miR-148a ilmentyminen liittyy huono tulos, jos potilaalla on vaiheen II ja III CRC

vieressä haluttiin selvittää, onko miR-148a ilmentymistilanne vaikutti ennusteeseen potilailla, joilla on vaiheen II ja III CRC käsiteltiin 5-FU-pohjainen adjuvanttihoitoa. Näissä analyyseissä, vertasimme erot DFS ja OS välisen korkean ilmentymisen (vaihe II = 58, III = 80) ja heikkoa ilmentymistä (II = 18, III = 45) ryhmät. Emme löytäneet merkittäviä assosiaatioita miR-148a ilmaisun ja jokin kliinis tekijät, kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti tai MSI tila (taulukko 1). Kuitenkin alhainen miR-148a-ilmentyminen liittyi merkitsevästi lyhyempi DFS (5 vuoden DFS, matala vs. korkea, 54% vs. 71%, p = 0,023; kuvio 2A), ja osoitti suuntaus huonompi OS (5 vuoden OS, 78% vs. 85%, p = 0,12; kuvio 2B). Seuraavaksi me arvioitiin ennustetekijöiden /ennustearvo miR-148a ilmentymisen Coxin suhteellisen vaaran regressiomallin. Vuonna univariate analyysissä korkeampi TNM (III vs. II, HR 2,06, 95% luottamusväli 1,21-3,52, p = 0,008) ja alemman miR-148a lauseke (HR 1,74, 95% luottamusväli 1,08-2,83, p = 0,025) olivat merkitsevästi liittyy lyhyempi DFS, ja nuorempina osoittivat suuntaus kohti lyhyempiä DFS ( 60, HR 1,57, 95% luottamusväli 0,97-2,56, p = 0,071; taulukko 2). Lisäksi monimuuttujakalibrointiin sisältävä malli nämä kolme tekijää, miR-148a ilmentymistilanne oli itsenäisesti liittyy elinajan (HR 1,83, 95% luottamusväli 1,12-2,99, p = 0,017; taulukko 2).

Kaplan-Meyer käyrät A, Tautivapaa elinaika (DFS) ja B, yleinen (OS) vaiheessa II /III potilaat mukaan miR-148a ilme. Kaplan-Meyer käyrät C, DFS toisessa vaiheessa ja D, vaiheen III DFS riippuen miR-148a ilme.

seuraava analysoitu tietoja vaiheen II ja III CRC erikseen selvittää yhdistyksen välinen matalan miR-148a ilmaisun ja huonompi tulos oli yhdenmukainen koko molemmissa vaiheissa, tai enimmäkseen linjassa yhdessä vaiheessa. Huomasimme, että vaiheessa II, miR-148a ilmaisua ei liittävät DFS (5 vuoden DFS, korkea vs. alhainen, 77% vs. 83%, p = 0,50; kuvio 2C) tai OS (5 vuoden OS, 89 % vs. 87%, p = 0,94; tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin vaiheessa III, alhainen miR-148a ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä heikompaan DFS (5 vuoden DFS, 43% vs. 66%, p = 0,0071, kuvio 2D) mutta ei OS (5 vuoden OS, 75% vs . 81%, p = 0,16; tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi alhainen miR-148a ilme oli ainoa tekijä, joka liittyy kasvaimen uusiutumisen vaiheessa III (taulukko 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-148a ilmentymistilanne on potentiaalia ennustetyövälineenä /ennustava biomarkkeri vaiheen III CRC.

Low miR-148a ilmentyminen liittyy huonompi terapeuttisen vasteen ja elinajan IV vaiheessa CRC

seuraava selvitetty, onko miR-148a asema oli potentiaalinen ennustamiseen hoitotulokseen potilailla, joilla on vaiheen IV CRC käsiteltiin 5-FU: hun ja oksaliplatiinia. Ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, ja suorituskyky tila eivät eronneet merkittävästi välillä korkea ja matala ilme ryhmät (taulukko 1). Kasvaimet ei-vastetta (stabiili tauti ja etenevä tauti) osoittivat suuntaus kohti alemman miR-148a ilmentymisen verrattuna alkaen hoitovasteen (täydellinen vaste ja osittainen vaste) (mediaani, 0,063 vs. 0,092, p = 0,10, kuvio 3A, vasemmalla) . Kuitenkin, kun vaihe IV kasvaimet jaettiin matalan ja korkean miR-148a ilmaisun ryhmien heikkoa ilmentymistä ryhmä merkitsevästi yhteydessä epäsuotuisa hoitovasteen (hoitovaste, 49% vs. 81%, p = 0,006; Kuva 3A, oikea ). Klo Kaplan-Meyer analyysin heikkoa ilmentymistä ryhmä osoitti suuntaus huonompi PFS (mediaani, 8,1 vs. 10,1 kuukautta, p = 0,16, kuvio 3B, vasemmalla) ja merkittävästi huonompi OS (16,1 vs. 25,6 kuukautta, p = 0,024; Kuva 3B, oikealla). Lisäksi ilmaisua tilan, miR-148a metylaatiostatuksen liittyy myös sekä huonompi PFS (metyloitu vs. ei-metyloituja, 6,9 vs. 9,3 kuukautta, p = 0,020, kuvio 3C, vasemmalla) ja OS (10,2 vs. 21,8 kuukautta, p = 0,0015, kuvio 3C, oikealla).

. Hoitovaste mukaan miR-148a ilme. Täydellinen vaste, CR; osittainen vaste, PR; stabiili tauti, SD; etenevä sairaus; PD. B. Kaplan-Meyer käyriä ilman taudin etenemistä (PFS, vasen paneeli) ja OS (oikea paneeli) IV vaiheessa potilaat mukaan miR-148a ilme. C. Kaplan-Meyer käyrät PFS (vasen paneeli) ja OS (oikea paneeli) IV vaiheessa potilaat mukaan miR-148a metylaatio.

arvioitiin myös ennustearvo miR-148a on Coxin suhteellisen riskin malliin. Vuonna univariate analyysi, huonompi PS (HR 2,62, 95% luottamusväli 1,26-5,43, p = 0,010), laske miR-148a lauseke (HR 1,79, 95% luottamusväli 1,08-2,98, p = 0,026) ja miR-148a hypermetylaation (HR 2,76 , 95% luottamusväli 1,44-5,28, p = 0,002) olivat merkitsevästi yhteydessä elinajan (taulukko 3). Lopullisessa monimuuttuja malli, joka sisälsi nämä kolme tekijää, molemmat miR-148a ilmentymistilanne (HR 1,93, 95% luottamusväli 1,15-3,23, p = 0,014) ja miR-148a hypermetylaation (HR 3,04, 95% luottamusväli 1,56-5,93, p = 0,0011) tullut itsenäinen ennustava tekijät olivat yhteydessä heikompaan tulokseen (taulukko 3).

keskustelu

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valottaa onko miR-148a ilmentyminen on väärin säädellystä vuonna CRC, ja lisäksi, jos se on mahdollista toimia prognostinen tai ennakoivaa biomarkkereiden tässä sairaudessa. Tässä tarjoamme todisteita, jotka korostavat merkittävä rooli miR-148a säätelyhäiriötä CRC. Ensinnäkin miR-148a ilmentyminen oli usein säädellä vähentävästi CRC, erityisesti pitkälle kasvaimia. Toiseksi miR-148a ilmentyminen paksusuolen säädettiin ainakin osittain läpi epigeneettisellä mekanismien perusteella käänteinen korrelaatio havaittu sen ilmaisun ja metylaatiostatuksen. Kolmanneksi matalan miR-148a-ilmentyminen itsenäisesti yhteydessä huonoon ennusteeseen vaiheen III saaneilla potilailla adjuvanttihoitoa. Neljänneksi alhainen miR-148a ilmentyminen liittyi myös huonompi hoitovasteen ja huonompi selviytymisen vaiheessa IV saaneilla potilailla kemoterapiaa. Lopuksi metylaatiostatus oli itsenäinen ennustaja huonompaan ennusteeseen vaiheessa IV CRC.

In vitro

tutkimuksissa käytetään muuta kuin paksusuolen solulinjoja ovat osoittaneet, että miR-148a kykenee kasvain ehkäisevästä toiminto kohdistaminen useita geenejä, kuten

PXR

,

TGIF2

,

MSX1

,

CDC25B

,

DNMT1

ja

DNMT3b

[39], [42] – [46]. Häiriöstä miR-148a on liitetty CRC [14], [29], [39], [47], mutta kliininen merkitys muuttunut miR-148a ilmentymistä CRC vielä täysin selvitetty. Tutkimuksessamme olemme analysoineet suurin kohortti CRC potilaiden mennessä (n = 273) ja edellyttäen vankkaa näyttöä siitä, että miR-148a ilme on usein alassäädetty kehittyneiden CRC ja pelkistetyssä ilmentyminen liittyy elinajan vaiheessa III ja IV sairaus. Parhaan tietomme mukaan mikään edellisistä raportit ovat aloittaneet tunnistaminen miRNA biomarkkereina ennustamiseksi hoitovasteen IV vaiheessa CRC potilasta on hoidettu solunsalpaajilla. Kaikkein kliinisesti merkittävä havainto oli, että vaihe IV CRC potilailla, joilla on korkea miR-148a ilmentyminen olivat todennäköisemmin hyötyvät solunsalpaajahoidosta, korostaen mahdollisesti uusi ennustearvo tämän miRNA kuin päätöksenteon väline potilaiden hoidosta CRC.

tarkat mekanismit miR-148a alassäätöä edistämisessä vastus CRC solujen kemoterapia vaativat vielä selvennystä. Kuitenkin viime aikoina todisteita roolista tämän miRNA muissa syövissä ovat tarjonneet vihjeitä ymmärtämiseksi joitakin sen vaikutuksia solun kemosensitiivisyys. Fujita

et al.

Raportoitu että miR-148a suoraan suunnattu

MSK1

ja transfektio sen edeltäjä suurempi herkkyys paklitakselin eturauhassyövän soluissa [43]. miR-148a ilmentymisen on myös osoitettu parantavan vastauksena sisplatiinin ja 5-FU: ruokatorven syöpä soluihin [48]. Näiden lisäksi

in vitro

havaintojen nuorilla potilailla, joilla on akuutti myelooinen leukemia, korkeampi

BAALC

geenin ilmentymisen korreloi käänteisesti miR-148a ilmaisun, ja on osoitettu liittyvän huonompi lopputulos saaneilla potilailla kemoterapiaa [49]. Yhdessä meidän havaintoja potentiaalin miR-148a ilmentymisen aseman ennakoivaa merkki IV vaiheessa CRC yhtyä näihin aikaisemmin julkaistu muita syöpiä.

Tutkimuksemme on myös ensimmäinen yritys vahvistaa metylaatio välittämää hiljentäminen miR-148a suoraan vertaamalla ilmaisun ja metylaatiotasoilla suuressa kohortissa hyvin selityksin CRC. Lisäksi alkuperäisen tutkimuksia Lujambio

et al.

[39], viime aikoina on osoitettu, että miR-148a on hypermetyloitunut 51 ulos 78 CRC [40]. Kuitenkaan kumpikaan näistä tutkimuksia miR-148a ilmentymisen analyysi ja korreloi suoraan niiden tuloksia hypermetylaation kudoksissa. Lisäksi molemmissa tutkimuksissa analysoitiin miR-148a metylaatiostatuksen käyttäen ei-kvantitatiivinen metylaatiospesifinen PCR-menetelmällä, joka on tunnetusti ei-spesifinen metylaation, ja ei ole kynnysarvoa metylaation, joka korreloi transkription inaktivointi geenin. Vahvuus tutkimus on, että päätimme miR-148a ilmentyminen qRT-PCR, ja korreloi ekspressiotietojen määrällisiä bisulfiitti pyrosekvensointi tulosta, joka on vakaampi lähestymistapa osoittamiseksi metylaation välittämää dysregulation tahansa geeni. Niinpä havaitsimme vastakkainen vaikutus välillä metylaatio ja ilme, vahvistaa käsitystä, että miR-148a alassäätöä CRC johtuu osittain promoottori hypermetylaation. Totesimme myös merkittävä ja itsenäinen yhdistys välillä miR-148a metylaatio ja huono selviytymisen vaiheessa IV potilailla, korostaen, että ilmaisun ja metylaatiostatuksen miR-148a voisi olla hyödyllinen ennustetekijöitä /ennustava merkkiaineiden CRC.