Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet kasvaimet ovat jäykempiä kuin niitä ympäröivän kudoksen. Tämä kasvu jäykkyyttä on annettu, osittain Rho-riippuvainen kohoaminen myosiinin II kevyen ketjun fosforylaatio. Luonnehtia tätä mekanismia edelleen, tutkimme myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK), tärkein entsyymi fosforyloi myosiinin II kevyitä ketjuja. Oletimme, että korotukset MLCK ilmaisun ja toiminta edistäisi lisääntyneen jäykkyyden syöpäsoluja. Kuitenkin olemme huomanneet, että MLCK mRNA: ta ja proteiinia tasot ovat olennaisesti vähemmän syövän solujen ja kudosten kuin normaaleissa soluissa. Tämän mukaisesti havainnon, syöpäsolut sopimus 3D kollageenimatriiseihin paljon hitaammin kuin normaalit solut. Mielenkiintoista, estämällä MLCK tai Rho-kinaasi ei vaikuttanut 3D geeli supistukset kun blebbistatin osittain ja sytokalasiini D maksimaalisesti estetty supistuksia. Elävien solujen kuvantaminen solujen kollageenigeeleissä osoitti, että sytokalasiini D esti filopodia ulokkeiden joka muodostuu solujen välillä, kun taas MLCK estäjä ei ollut vaikutusta näihin ennusteisiin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että myosiinin II fosforylaatio on tarpeeton säätelyssä mekaanisia ominaisuuksia kasvaimia.

Citation: Yu H-J, Serebryannyy LA, Fry M, Greene M, Chernaya O, Hu W-Y, et ai. (2013) Kasvaimen Jäykkyys ei liity myosiinikevytketjua fosforylaatio syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (11): e79776. doi: 10,1371 /journal.pone.0079776

Editor: Michael F Olson, Beatson Institute for Cancer Research Glasgow, Iso-Britannia

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 25 syyskuu 2013; Julkaistu 4 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tuettu osittain apurahoja Northwestern University Physical Sciences Oncology Center (CA143869) sub-palkinnon PdeL, National Institutes of Health SG (CA113975), GP (ES018758, ES02207 ja CA172220) ja ZS (Arra HD044713), Leukemia ja lymfooma Society (White Plains, New York, Yhdysvallat), American Gastroenterologinen Association ja UIC Mahalaukun ja maksasairaus rahasto SG, joka on osaamisalueita palkinnon toimiston varakansleri tutkimuksen, UIC NM ja American Heart Association apurahan (13PRE17050060) LAS. Kirjoittajat todistettava, että heillä ei ole kilpailevia taloudellisia etuja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monen tyyppisiä kasvaimia voidaan havaita tunnustelemalla, koska ne ovat jäykempiä tai kovempaa kuin ympäröivään kudokseen. Mekaanisia ominaisuuksia kasvaimen määritetään yhdistetyt vaikutukset ja vuorovaikutukset useiden parametrien [1]. Strooman koostumus ja jäykkyys soluväliaineen, integriinin ligaatio, lisääntynyt verisuonittuminen, nesteen kertyminen ja läsnäolo immuunijärjestelmän solut, kuten makrofagit edistävät yleistä jäykkyyttä kasvaimen [1-3]. Fysikaaliset ominaisuudet transformoitujen solujen, jotka voivat vaikuttaa geneettinen allekirjoitus kasvainsolujen [4] sekä microenvironment [5,6] myös omalta määritettäessä kasvaimen jäykkyys. Cell jäykkyys määräytyy ensisijaisesti aktiini-myosiinin II vuorovaikutukset [7,8]. Aktiini-myosiini II vuorovaikutus ei-lihassoluissa säätelee fosforylaatio myosiinin kevyitä ketjuja (MLC) [9]. Actin ja fosfo-myosiinin II käsittää molekyyli moottori, joka muuntaa ATP mekaaniseksi työksi sileälihaskudoksen ja ei-lihassolujen [9-11] ja kasvu MLC fosforylaation on liitetty määritettäessä kasvaimen jäykkyys [1,2].

on kaksi suurta väyliä, jotka säätelevät MLC fosforylaatio. Yksi reittiin kuuluu myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK). MLCK on kalsium-kalmoduliiniriippuva entsyymi, joka fosforyloi sääntelyn kevytketjun sileän lihaksen ja ei-lihaksen myosiinin II [9,10]. Toisin kuin muut proteiinikinaasit, jotka fosforyloivat useita pohjia, MLC näyttävät olevan ainoa substraatti MLCK. MLC fosforylaatio /defosforylaatio säätelee sileän lihaksen supistumisen [9] ja monet muut energiaa vaativissa prosesseissa, kuten solujen jakautumista [10] ja solun liikkuvuus [11,12]. Koska solujen lisääntymisen ja metastasoituneen kolonisaatio ovat kaksi kaikkein vahingollinen näkökohtia syöpä, on järkevää ennakoida tärkeä rooli MLCK kasvaimen kasvussa ja metastaattisen kolonisaatio. Tämän tueksi ajatusta, MLCK on liitetty solujen eloonjäänti [13,14] ja inhiboimaan MLCK on osoitettu indusoivan apoptoosin [13,15] ja vähentää tuumorin kasvua [15]. Vähentynyt MLC fosforylaatio on myös liitetty sytokineesiin epäonnistuminen syöpäsoluissa [16].

Toinen reitti käsittää Rho GTPaasina välitteisen aktivaation Rho-kinaasia tai ROCK. Vaikka fosforylaatiota MLC mukaan ROCK on raportoitu, ROCK näyttää lisäävän MLC fosforylaation pääasiassa fosforyloimalla ja inaktivoimalla myosiinifosfataasin [17]. Koska taso MLC fosforylaation edustaa tasapainoa entsyymien fosfory- ja defosforyloivat MLC, estämällä myosiinifosfataasin kasvattaa solunsisäisiä tasoa MLC fosforylaation [17]. Rho /ROCK polku on keskeinen rooli viestinnässä solunulkoisia signaaleja, jotka vaikuttavat luonne solun tukirangan, erityisesti signaalit soluväliaineen, joka johtaa lisääntyneeseen solun jännityksen [18]. Tämä reitti on myös keskeinen säätelyssä soluliikkuvuus ja syövän etäpesäkkeiden [12]. Esto ROCK on osoitettu estävän tuumorin kasvua ja etenemistä [2], ja vaikka Rho A ei ole onkogeeni, kasvu Rho A: n eks- havaitaan syövän ja Rho A /ROCK reitti on liitetty Ras-välitteisen transformaation [ ,,,0],4].

Näin ollen on runsaasti tietoja, jotka osoittavat MLC fosforylaatio on keskipiste muutosprosessin, vaste syövän solujen soluväliaineen ja lisääntymistä ja kulkeutumista syöpäsoluja. Ymmärtää merkityksen kahden suuren signalointireittejä, jotka säätelevät MLC fosforylaatio, tutkimme ilmaus MLCK syöpäsoluissa. Meidän hypoteesi oli kasvua MLCK ilmentymistä syöpäsoluissa lisäisi solun tukirangan jännitystä ja solujen supistuvien vastauksia. Yllätykseksemme olemme havainneet, että syöpä kudokset ja solut ilmentävät vähemmän MLCK kuin niiden normaalit kollegansa ja normaalien solujen sopimus 3D kollageenigeelien nopeammin kuin syöpäsoluja. Lisäksi estämällä MLCK tai ROCK ei vaikuta 3D geelillä supistukset taas sytokalasiini D, joka häiritsee aktiinisäikeiden, tukossa nämä supistukset.

Methods

Solut ja Tissue viljely

Mononuclear solut (MNC) ( 1,077 g /ml) saatiin tiheyssentrifugaatiolla Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Ruotsi), kuten aikaisemmin on kuvattu [19]. Ihmisen kohdun fibroblasteissa (HUF solut) eristettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [20]. Seuraavat ihmisen soluja, saada kaupallisesti (lähde ja luettelonumero mukana), käytettiin myös: HeLa kohdunkaulan syövän soluja (ATCC, CCL-2), ECC-1 kohdun limakalvon epiteelin adenokarsinoomasolut (ATCC, CRL-2923), ensisijainen eturauhasen epiteelisolut (1 ° eturauhasen) taudista vapaan miehiä, LNCaP eturauhassyövän solut (Lonza, CC-25555), HCT116 paksusuolensyöpä soluja (ATCC, CCL-247), MCF10A ei-transformoidut rintarauhasen epiteelisolujen (ATCC, CRL-10317), MCF-7 (ATCC HTB-22) ja T47D (ATCC, CRL-2865) rintarauhasen syöpäsoluja, H520 squamous keuhkosyövän soluja (ATCC HTB-182), Hec-1A kohdun limakalvon adenokarsinooma (ATCC HTB-113), HEK293T kuolemattomaksi munuaisen soluista (ATCC, CRL-11268), Beas-2B muuttaneet keuhkon keuhkoputken epiteelisoluissa (ATCC, CRL-9609), ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) (Lonza, CC-2517), ihmisen keuhkovaltimon endoteelisolujen ( HPAEC) (Lonza, CC-2530), ihmisen normaali keuhkovaltimon sileän lihaksen soluissa (HPASMC) (Lonza, CC-2581) ja ihmisen normaali keuhkojen mikrovaskulaarisessa endoteelisolujen (HLMEC) (Lonza, CC-2527). Käytimme MCF10A ja Beas-2B solujen valvontaa, koska, vaikka ne kasvavat jatkuvasti kulttuuriin, ne eivät muodosta kasvaimia kun ruiskutetaan immuunivajaisiin hiiriin [21,22]. Viisi paria ihmisen syövän kudosten (virtsarakon, paksusuolen, keuhko-, munasarja-, ja kohdun) ja ympäröivä normaali kudos saatiin Cooperative Human Tissue Network, Midwest Division (Columbus, OH) ja säilytettiin pakastettuna nestemäisen typen. Jokainen pari kudosten oli samasta potilaasta.

RNA: n eristäminen ja PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista ja kudoksista käyttämällä Trizol kuin valmistajan suosittelemia (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA käänteiskopioitiin SuperScript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja RT-PCR suoritettiin käyttäen 2 ui cDNA: ta ja 0,5 uM, kutakin, ja 3BF forward-aluketta ja 3aR taaksepäin-aluketta kuvanneet Merkki-Arpon et ai . [23]. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden. Alukkeet yhteensä MLCK P4610 (5 ’AGG AGC CCG AGG TTG ATT AC 3’) ja R4762 (5 ’ACT TCC CTG CCC AGA CTT TT 3’) tavoite eksonit 26 ja 27. spesifisyys alukkeiden vahvistama dissosiaatiokäyrä analyysi ja kertainen muutos ilmentymisen kunkin geenin laskettiin käyttämällä ΔΔCt menetelmää, jossa H3F3A sisäisenä kontrollina.

Western blot analyysit

Osia kunkin pakastetun kasvain ja normaali kudos oli irrotettiin taas jäädytetty, homogenisoitiin 10X paino /tilavuus kuuma SDS-näytepuskuria ja kuumennettiin kiehuvassa vesihauteessa 5 minuuttia. Supernatantit kerättiin sentrifugoimalla, ja 10 ui kutakin näytettä levitettiin 4-20% polyakryyliamidigradienttigee- SDS-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosalle. Yläosan kunkin blot koettimena kanin, affiniteettipuhdistettuja vasta-ainetta MLCK [24] ja pohja seulottiin vasta-aineen GAPDH. Solut kerättiin, suspendoitiin PBS: ään, inkuboitiin 2 mM di-isopropyylifluorifosfaatti 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja uutettiin 9M ureaa, 50 mM DTT: tä, 50 mM Tris, pH 6,8. Supernatantit kerättiin talteen sentrifugoimalla, proteiini pitoisuudet määritettiin käyttämällä Bradfordin määritys ja 10 ug proteiinia per näyte pantiin 4-20% polyakryyliamidigradienttigee- SDS-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosalle.

mittaus MLC-fosforylaation

MLC fosforylaatio kvantifioitiin HUF ja HeLa-soluissa käyttämällä urea /glyserolia geelit kuten ovat kuvanneet Chew et al. [25] pienin muutoksin. Soluja käsiteltiin estäjien 2 tuntia, pestiin isotonisella sakkaroosia 2X ja uutettiin 9M ureaa, 5 mM DTT, 20 mM Tris, pH 6,8. Supernatantit kerättiin talteen sentrifugoimalla, proteiini pitoisuudet määritettiin ja 100 ug HUF solu-uutetta ja 225 ug HeLa solu-uutteen erotettiin käyttäen glyseroli-urea PAGE. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosalle, auki- ja fosforyloitu muotoja MLC tunnistettiin käyttäen vasta-ainetta MLC ja stoikiometria fosforylaation (mol PO

4 /mol MLC

20) laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [26] .

kollageeni Gel supistuminen määritys ja lääkehoito

Valmistele kollageeni geeli ratkaisu, solujen kasvualusta oli täydennetty 1 mg /ml kollageenia tyyppi 1 rotan hännän kollaasi (BD Biosciences), neutraloidaan 1 N NaOH: ta pH 7,5 ja puskuroitu 10 mM HEPES, yhdistettiin soluviljelyelatusaineella ja pidettiin jäillä. Solut kerättiin, laskettiin ja 5×10

5-solut suspendoitiin uudelleen 200 ui: aan kollageenin liuosta ja lisättiin yksittäisiin kuoppiin 48-kuoppalevyllä (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Geelit inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa 15-20 minuutin ajan, kunnes ne kiinteytetään ja sitten irrottaa seinät kuopat pipetinkärjet. Kasvualustaan ​​(200 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja geelit annettiin yhteyttä 18 tuntia tai määritelty. Kaikki geelit valokuvattiin ennen ja jälkeen supistuminen. Alueet geelien mitattiin Image J ja prosenttiosuus geelin koosta jälkeen supistuminen, normalisoitu poikkipinta-ala hyvin, laskettiin.

lääkehoitojen kollageenia Cells

ML-7, Y 27632 ja blebbistatin ostettiin EMD Biosciences ja sytokalasiini D ostettiin Enzo Life Sciences. Drugs laimennettiin kasvualustaan ​​ja lisättiin geeleihin. Lääkeainepitoisuudet laskettiin perustuen kokonaismäärä median ja kollageenin geelin. Käsittelemättömiä soluja ja soluja, käsiteltiin DMSO: käytettiin kontrolleina.

Live-Cell Imaging 3D Kollageeni Geelit

HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi elektroporaatiolla käyttämällä BioRad Gene Pulser Xcell kanssa joko pLL7. 0 mCherry-LifeAct (lahja tri Robert Wysolmasky) tai pEGFP-LifeAct (lahja Alexander Bershadsky), joka sitoutuu F-aktiini [27]. Lyhyesti, 10 cm: n maljalla 95% konfluentteja Hela-solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 10 ml: aan kasvualustaa. Solut sentrifugoitiin 2000 Xg: ssa 5 minuuttia ja suspendoitiin uudelleen 400 ul Opti-MEM® I Reduced Serum Medium, jota oli täydennetty 4 ui 1 M Hepes, 1 ug joko LifeAct plasmidin ja 10 ug ja lohen maidin DNA: ta. Elektroporaatio tehtiin 4 mm kyvetti (BioRad käyttämällä seuraavaa asetusta (Jännite = 240 V, kapasitanssi = 950uF, vastus = ∞). 1: 1 suhde mCherry-LifeAct ja EGFP-LifeAct transfektoituja HeLa-soluja sekoitettiin yhteen ja yhteensä 2,5 x 106 solua sekoitettiin 1 ml 1 mg /ml kollageenia [28]. kollageeni-soluja lisättiin hyvin lasin pohja Mat Tek kuvantaminen astia (P35G-1,5-14-C), jähmettynyt 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja 2 ml kasvualustaa lisättiin kattamaan solu-geelimatriisiin ja asetetaan 5% CO 2-inkubaattorissa. asianmukaiset inhibiittorit lisättiin median ja solut kuvattiin Nikon A1 laserskannaus -konfokaalimikroskoopilla, käyttäen Apo 100×1. 45 NA tavoite, joissa Tokai ympäristön kammioon.

Ethics lausunto

kudokset saatiin Cooperative Human Tissue Network, Midwest Division (Ohio State University, Columbus, OH), joka on NCI rahoitetaan kudos arkistoon (https://htrn.osu.edu). Muut tutkijat saattanut saada näytteitä samoista aiheista. Ihmisen napanuoran verestä saatiin New York Blood Center (New York, NY, http: /nybloodcenter.org) mukaan Institutional Review Board (IRB) ohjeet. Pöytäkirjat eristämiseksi ihmisen CB CD34 + solujen NM hyväksyi IRB on University of Illinois at Chicago. HUF solut eristettiin decidua peritalis leikeltiin istukan kalvot jälkeen normaali emättimen toimitus aikavälillä ZS kanssa ennakkohyväksyntää IRB at University of Illinois at Chicago. Eläimiä ei käytetä.

Tulokset

MYLK-geeni sijaitsee kromosomissa 3q21 (GenBank U48959) ihmisillä. MYLK geeni jännevälit 272 kb, sisältää vähintään 34 eksonia ja koodien 3 proteiineja [29]: nmMLCK (~ 210 kD), smMLCK (~ 150 kD) ja pieni proteiini nimeltään telokin. Ihmisen nmMLCK ja smMLCK transkriptoidaan eksonit 1-34 [23] ja 18-34 [30], tässä järjestyksessä. Analyysi eksoni-intronirakenne ihmisen MYLK geeni on paljastanut silmukoitumisvariantteja nmMLCK, jotka ovat ainutlaatuisia lokalisointi kuviot epiteelisoluissa [30]. Vähintään neljä ei-lihaksen MLCK isoformit (MLCK2, 3a, 3b ja 4), jotka ovat seurausta vaihtoehtoisesti silmukoituneet varianttien mRNA prekursorin on kuvattu [31]. Sen sijaan, smMLCK, koodaa eksonit 18-34 [29], saadaan pääasiassa sileän lihaksen soluissa ja alhainen smMLCK havaitaan epiteeli- ja endoteelisoluissa (katso alla). Vaikka smMLCK ja nmMLCK ovat rakenteellisesti erilaisia, molemmat ilmeisesti vain fosfory- sääntelyn kevytketjun sileän lihaksen ja ei-lihaksen myosiinin II [9].

Käytimme alukkeita kuvanneet Brand-Arpon et al. [23] analysoida ilmentymisen MYLK ihmisen kudosten ja solujen. Saimme kudos ihmisen kasvaimista ja ympäröivää kudosta, jotta voisimme verrata ilmaus MYLK. Kvantitatiivinen PCR käyttäen alukkeita, jotka on kohdistettu sekvenssien eksonit 26 ja 27, ja tunnistaa kaikenlaisen MLCK, paljasti MLCK mRNA-tasot ovat huomattavasti vähentyneet virtsarakko-, koolon-, keuhko-, munasarja- ja kohtusyöpä kudoksiin verrattuna normaaliin kudokseen (kuvio 1A). Vastaavasti, qPCR on laaja normaalin ihmisen (ihmisen kohdun fibroblastit, endoteelisolut, eturauhasen epiteelissä ja mononukleaariset solut), ei-transformoitu tai transformoitujen solujen paljasti myös alemmilla yhteensä MLCK mRNA: ta (kuvio 2A) syöpäsoluissa. Tiedot kuviossa 2A normalisoitiin tasoon MYLK ilmentymisen HeLa-soluissa. Useimmat normaalit solut (HUF, HPAEC, HUVEC, 1 ° eturauhasen) ja ei-tuumorigeeniset BEA-2B-soluja ovat edellä, kun taas kaikkein syöpäsolujen, lukuun ottamatta ECC-1-solut, ovat alapuolelle MYLK ilmentymisen HeLa-soluissa.

Kvantitatiivinen PCR (A) ja western blot (B) analysoi normaalien ja syövän kudoksissa. RNA eristettiin erilaisista normaaleista ja syövän kudosten ja yhteensä MLCK (A), mukaan lukien kaikki silmukoitumisvariantteja nmMLCK ja smMLCK, havaittiin käyttäen alukkeita kohdistamista eksonit 26 ja 27. geenin H3F3A käytettiin sisäisenä kontrollina kaikissa kokeissa. Tiedot paneelissa A kuvaavat keskiarvot qPCR analyysit suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja virhepalkkien osoittavat keskihajonnan. Paneeli B esittää western blot-analyysi käyttäen affiniteettipuhdistettua vasta-aineita MLCK. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

Kvantitatiivinen PCR havaita yhteensä MLCK (A) ja Western blot (B) analysoi normaalien ja syöpäsolujen viljelmässä. RNA ja proteiini eristettiin eri soluihin ja analysoitiin, kuten on kuvattu kuviossa 1. tiedot paneeli A kuvaavat keskiarvoja qPCR analyysit suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

seuraavan määritetään, onko proteiinin ilmentyminen korreloi mRNA-tasoja . MLCK proteiinin ilmentyminen normaaleissa ja syöpäkudoksissa ja soluja määritettiin suorittamalla western blotit käyttäen affiniteettipuhdistettua vasta-ainetta MLCK [24]. Normaali virtsarakon, paksusuolen ja kohdun kudoksissa ilmaisivat sekä ei-lihas- ja sileän lihaksen isoformeja MLCK taas normaalissa keuhkokudoksessa vain ilmaistaan ​​smMLCK (kuvio 1 C). Tasaisesti, kaikki syöpä kudoksiin lähinnä ilmaisseet smMLCK ja nmMLCK oli vaikea visualisoida näissä kudoksissa. Mielenkiintoista on, että kuvio MLCK proteiinin ilmentymisen on hyvin samanlainen normaalissa ja keuhkosyövän kudoksissa, vaikka mRNA: n tasoon on vähentynyt keuhkosyöpä kudoksessa (kuvio 1). Analyysi kudosviljelmän soluista osoitti, että ihmisen kohdun fibroblasteissa (HUF solut) ilmentävät suuria määriä sekä muotojen MLCK, kun taas ihmisen ei-lihaksen soluissa (endoteeli-, epiteeli- ja johto veren mononukleaariset solut) ilmentävät enimmäkseen suurempi, nmMLCK (kuvio 2B). Ekspressiokuvioanalyysi syöpäsoluissa, on kuitenkin monimutkainen. Syöpäsolut (HeLa kohdunkaulan syöpäsolut, T47D breast cancer solujen, LNCaP eturauhas- syöpäsolujen ja HL60 promyelosyyttinen solut), ilmaista smMLCK. Mielenkiintoista on, että kasvu smMLCK ilmentymistä syöpäsoluissa näyttää mukana lasku ilmentymisen nmMLCK verrattuna niiden normaaleihin kollegansa (esim vertaa LNCaP ja 1 ° eturauhasen). Yhdenmukainen PCR tiedot, käy ilmi kuviosta 2B, että kokonaistaso MLCK ilmentyminen väheni syöpäsoluissa kontrolliin verrattuna (eli normaali) solut.

Selvitimme toiminnallinen seuraukset väheni MLCK ilmaisun kasvattamalla normaalit ja syöpäsolut 3D geelit ja vertaillaan niiden kyky supistaa geelejä. Neste kollageenia, joka sisältää yhtä suuri määrä soluja levitettiin 24-kuoppaisille maljoille, ja niiden annettiin kovettua 37 ° C: ssa. Ne vapautetaan sitten kaivojen seinämille ja valokuvattiin määrävälein. Kuvio 3 esittää, että HUF ja 1 ° eturauhasen solujen supistavat geelit nopeasti. Lisääminen kollageenipitoisuudesta 2 mg /ml vähensi nopeus ja laajuus supistuminen ja 3 mg /ml esti supistuminen (kuvio S1). HeLa-solut ja MCF10A solujen sopimuksen geelit välituotteiden tasolla, kun taas MCF7, T47D ja LNCaP tuskin supistui geelit (kuvio 3 ja kuvio S1).

HeLa, LNCaP, MCF7, MCF10A, HUF ja ensisijainen eturauhasen solut ympättiin 24 kuopan astioihin nestemäisessä kollageenia. Sen jälkeen, kun kollageeni kovettunut, geelit vapautettiin puolin kuoppiin ja annettiin supistuvan 24 tuntia. Kuopat kuvattuna ylhäältä aikoina esitetty. Huomaa, että HUF ja ensisijainen eturauhasen solujen supistavat geelit suuremmassa määrin kuin HeLa ja LNCaP-soluja, ja että MCF 10A solut sopimuksen yli MCF-7-soluissa. Asteikko bar = 2 mm.

olivatko supistukset voitaisiin estää pienmolekyylisalpaajilla solun tukirangan. Tutkimme HUF ja HeLa-solut, koska ne supistui geelejä. Soluja käsiteltiin ML-7, joka on MLCK inhibiittori [32], Y27632, joka on Rho-kinaasi-inhibiittori [33], blebbstatin, myosiinin II: n inhibiittori [34] ja sytokalasiini D, joka estää aktiini polymerointi [35]. ML-7 ei ollut vaikutusta supistuminen geelejä, jotka sisältävät forinttia tai HeLa-solut (kuvio 4). Y27632 ja blebbistatin oli minimaalinen, vaikkakin tilastollisesti merkitsevä, vaikutuksia supistuminen geelejä, jotka sisältävät HUF soluja. Y27632 ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta HeLasoluista supistuminen samalla blebbistatin oli selvempi, tilastollisesti merkitsevä vaikutus geelejä valmistettu HeLa-soluissa. Mielenkiintoista on, sytokalasiini D oli voimakkain vaikutus geelin supistuksia ja estää lähes täysin supistukset sekä solutyypeissä (kuvio 4). Huuhtomalla sytokalasiini D johti nopeaan supistuminen geelien sekä solutyypeissä (ei esitetty).

HUF (vasemmalla) ja HeLa (oikealla) soluja kasvatettiin 3D viljelmissä ja käsiteltiin inhibiittoreilla, kuten on kuvattu. Geelit valokuvattiin 24 tuntia myöhemmin, ja pinta-ala yksittäisten geelien kvantifioitiin. Tiedot edustavat keskiarvoa + SEM. Yksi tapa ANOVA * = p-arvo 0,05, *** = p-arvo 0,001.

Voidakseen todeta, että ML-7 ja Y27632 olivat itse asiassa estämällä MLCK ja Rho-kinaasia ja vähentämällä MLC fosforylaatiota, käytimme glyseroli geelejä määrällisesti muutoksia MLC20 fosforylaatioon. He osoittivat, että MLC20 fosforylaatio on vähentynyt HeLa soluun verrattuna HUF soluille ja että ML-7 ja Y27632 lasku MLC20 fosforylaatiota (kuvio 5). Yllättäen blebbistatin ja sytokalasiini D myös vähentää MLC20 fosforylaatiota hieman.

Fosforyloidulla ja fosforyloitumaton MLC erotettiin urea-glyseroli geelielektroforeesi, blotattiin nitroselluloosalle ja tunnistettiin käyttämällä vasta-ainetta 20-kD MLC.

Käytimme myös elävien solujen kuvantamiseen tarkkailla solujen geelejä. Näitä geelejä ei vapaudu puolella kuoppiin, koska liikkeen käyttöön supistuminen geelin oli mahdotonta kuvan soluihin. Kuva 6 ja elokuvan S1 osoittaa, että käsittelemätön solu ovat hyvin leviämistä ja laajentaa filopodia, joissa on paljon aktiini, että tavoittaa ja koskettaa toisiaan. Solut käsiteltiin ML-7 tai Y27632 pysyi levitä ja edelleen laajentaneet filopodia. Solut käsiteltiin sytokalasiini säilyi levinnyt ja laajennettu paljon suurempi, valejalka kaltaisia ​​rakenteita sijaan filopodia. Tärkeää on, että aktiini näissä soluissa näytti sulautua suuria aggregaatteja solujen sisällä.

HeLa-solut transfektoitiin Lifeact mCherry (punainen) tai Lifeact-GFP ja kasvatetaan kollageenigeeleissä. Näitä geelejä ei vapaudu kuoppien seinämiin estämiseksi liikehäiriöitä. Paneeli A esittää kontrolli (käsittelemättömät) solut ulottuvat filapodia että kosketus naapurisoluja (katso myös elokuvan kuvassa S2). Paneelit B C esittävät soluja, jotka oli käsitelty 20 uM ML-7 (B) tai 6 uM sytokalasiini D (C). Solut käsiteltiin ML-7 edelleen aktiivisesti laajentamaan filopodia. Solut käsiteltiin sytokalasiini D lopettaa ulottuvat filopodia ja aktiini näissä soluissa näyttää kerätä suuria aggregaatteja. Sisäkkeet ovat isku ups boxed alueilla. Koko bar = 10 pm.

Keskustelu

Kasvaimet voivat olla isompi, koska he tuntevat kovemmin kuin ympäröivään kudokseen ja monet tekijät, kuten on kuvattu johdannossa, voi edistää jäykkyyttä kasvain. Yksi näistä tekijöistä on supistuvien tila syövän solujen kasvain. Yksi keskeisiä oletuksia kun aloitimme Näissä tutkimuksissa oli, että syöpäsolut olisi säätää ylös komponentteja supistuvien laitteen. Tämä perustui raportteja, että actomyosin contractility [2] ja ilmentymistä rho proteiinien [4], myosiinin II [36,37] ja MLCK [38] ovat lisääntyneet ihmisen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Lisäksi kun kasvainsolujen etäpesäkkeitä ne on tehtävä tiensä läpi metsän kollageenin kuituja ja se on kohtuullista, että he tarvitsevat enemmän aktivoituu supistuvien proteiinien ajaa läpi soluväliaineen.

Kuitenkin, lähempi tarkastelu kirjallisuudessa viittaavat toisin. Kokeet käyttäen vetovoima mikroskopia ovat löytäneet käänteinen suhde voiman tuotanto- ja metastaattinen kapasiteetti [39]. Mekaaninen fenotyyppaus käyttäen atomivoimamikroskooppi [40-42] ja muita menetelmiä [43,44] ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että syöpäsolut ovat pehmeämpiä kuin normaalit solut. Lisäksi tuore tutkimus on ehdottanut, että vähentynyt jäykkyys saattaa parantaa selviytymistä syöpäsolujen verenkierrossa [45]. Olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentävät aktiivinen muoto MLCK lisää MLC fosforylaatiota ja jäykkyys fibroblasteissa [46]. Näin ollen meidän havainto lasku MLCK ilmentyminen on hyvin johdonmukainen väheneminen jäykkyys transformoiduissa soluissa on raportoitu muiden laboratorioiden [39-44].

Kuvio 2 osoittaa, että MLCK ilmentyminen on vähentynyt kasvainsoluissa kasvatettu kulttuuri. Kuitenkin, kasvaimet eivät ole homogeenisia, ja lisäksi kasvainsolujen, sisältävät immuunisolujen, myofibroblasteja ja muita stroomasolujen, jotka olisi voinut MLCK tasoilla ja siten edistää yleistä jäykkyyttä kasvain. Kuitenkin kasvain kudosta analysoitiin kuviossa 1 ja tiedot kertovat kaikkien asiaan solutyyppien kussakin kasvain. Vaikka tulokset osoittavat selvästi pienenee MLCK ilmentymisen verrattuna ympäröivään normaaliin kudokseen, me emme voi poistaa sen mahdollisuuden, että lisääntynyt supistumiskykyä ei-kasvainsolujen edistää jäykkyyttä kasvaimia. Yksi lähestymistapa on käsitellä tämä mahdollisuus on värjätä kasvainkudoksen vasta-aineiden kanssa MLCK ja määrittää tason värjäytymisen syöpäsoluissa verrattuna ympäröivään normaaliin kudokseen ja ei-syöpäsolujen massan sisällä kasvain. Olemme perustamassa menetelmiä suorittamaan tällaisia ​​kokeiluja.

Mekanismi vastaa alaspäin säätäminen MLCK ilmentymistä syöpäsoluissa ei ole selvä. Brand-Arpon et al. [23] ovat raportoineet, että läsnä on pseudogeenin (pMYLK) kromosomissa sijainti 3p21 vain todettu ihmisillä, simpanssit, gorillat ja Orangutans, mutta ei Gibbons tai paviaanit tai muiden lajien kanssa. He osoittivat myös, että pMYLK sisältää 73 bp: n poistuman ja käytettiin PCR erottelemaan ilmaisua MYLK (667 emäsparia) ja pMYLK (594 emäsparia). Käyttäen samoja alukkeita, Han et al. [47] ovat raportoineet, että ilmentyminen pMYLK lisääntyy syöpäsolujen kasvu ekspression pMYLK vastaa vähentynyt ilmentyminen MLCK. Käytimme samoja alukkeita analysoida ilmaus MLCK ja pMYLK ihmisen kudosten ja solujen. Vaikka me selvästi nähdä laskua MLCK mRNA ja proteiinin ilmentyminen syöpäsoluissa ja kudoksissa, emme pystyneet jatkuvasti havaitsemaan pMYLK ilmentymistä syöpäsoluissa tai puuttuminen ilmentymisen normaaleissa soluissa. Näin ollen sääntelyn MLCK ilmentymisen transformoiduissa soluissa epäselvää tällä hetkellä.

Havainto, että 3D-geeli supistuksia ei estänyt ML-7 ja Y27632 myös takaa kommentti. Nostamalla MLC fosforylaation on välttämätöntä aktivoida actin- aktivoitu ATPaasiaktiivisuutta sileän lihaksen ja ei-lihas- myosiinien [9-11]. Osittainen esto blebbistatin viittaa siihen, että myosiinin II rajat siltojen osansa näissä supistukset. Kuitenkin kyvyttömyys ML-7 ja Y27632 estää nämä supistukset viittaa siihen, että MLC fosforylaatio on tarpeeton. Sen sijaan aktiini dynamiikka näyttävät olevan keskeisessä asemassa 3D geeli supistukset. Tämä havainto on sopusoinnussa raportissa, että häiriö aktiinisytoskeletonin lohkot kaikentyyppisten kollageenin geelin supistusten [48]. Lisäksi keskeisintä elävien solujen kuvantamiseen soluja kollageenigeeleissä (kuvio 6) on läsnä erittäin dynaaminen aktiini filopodia. Vonna et ai. [49] ovat tutkineet taudinaiheuttaja kaapata makrofagien ja arvioi, että filopodia voi tuottaa satoja PN voima yli 10 pm etäisyyksillä. Toisessa tutkimuksessa tunnettu filopodia kuin ”phagocytic lonkerot”, joka vetäytyy hiukkaset kohti solun elin [50]. Nämä tutkijat havaitsivat, askelkoko supistukset oli 36 + 13 nm, mikä sulkee pois myosiinin II mahdollinen moottorin [50]. Vaikka he eivät pystyneet sotkea mitään myosiinin vuonna filopodial takaisinveto, depolymeroituminen aktiinisäikeiden kanssa latrunculin myös estänyt filopodial supistukset [50]. Yhdessä kirjallisuudessa ja meidän tiedot viittaavat siihen, että 3D kollageenigeelissä supistukset välittyvät aktiini kautta filopodia riippumatta myosiinin II.

Yhteenvetona tietomme yksiselitteisesti osoittavat, että MLCK ilmaisua, MLC fosforylaatio ja 3D geeli supistuminen ovat alhaisemmat syövän solujen ja kudosten kuin niiden normaalissa kollegansa. Lisäksi, huomaamme, että laskeva MLC fosforylaatiota, estämällä MLCK tai rho-kinaasia, ei ole mitään vaikutusta 3D-geelillä supistukset normaali tai transformoituja soluja. Sen sijaan, estämällä myosiinin II oli osittainen vaikutus ja depolymeroimiseksi aktiini käytännössä poisti supistuminen. Lisäksi elävien solujen kuvantamisen ehdotti, että filopodia keskeinen rooli 3D supistukset. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että kasvain jäykkyys, lähtökohdat itsensä havaitseminen kasvaimia, on riippumaton myosiinin II fosforylaation. Meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​viimeaikaiset tutkimukset, jotka ovat osoittaneet, että syöpäsolut ovat vähemmän jäykkiä kuin ei-transformoitujen solujen [40-44]. Lopuksi olemme aiemmin osoittaneet, että inhiboiva MLCK indusoi apoptoosia in vitro ja voimistaa vaikutukset syöpälääkkeiden apoptoosin indusoimiseksi ja estää kasvaimen kasvua in vivo [17]. Nykyinen osoitus siitä, että MLCK ilmentyminen on vähentynyt tuumorisoluissa viittaa kohdistettu ikkunan erityisesti apoptoosin indusoimiseksi syöpäsoluissa ja provosoi lisätutkimuksia MLCK mahdollisena terapeuttisena kohteena.

tukeminen Information

Kuva S1.

Yhteenveto kollageenin geelin supistuminen määrityksissä. Geelejä inkuboitiin 24 tuntia, kuvattuna ylhäältä ja pinta-ala lasketaan, kuten on kuvattu menetelmissä. Paneeli A osoittaa, että HUF ja ensisijainen eturauhasen solujen supistavat geelejä yli HeLa ja LNCaP. MCF10A rintasyövän soluja myös supistaa geelien enemmän kuin aggressiivinen MCF7 ja T47D syöpäsoluja.