Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut vaeltavat sisällä 3D mikroympäristön pystyvät siirtymään joko mesenkymaaliset tai amoeboid tilassa muuttoliike. Amoeboid siirtymä ominaista kalvon rakkuloituminen, joka on riippuvainen Rho -efektiboksejamme ROCK1 /2. Tunnistamme LIMK2 kuin edullinen substraatti ROCK1 mutta huomaavat LIMK2 ei indusoinut kalvo kupliminen, mikä viittaa siihen, että LIMK2 koulutusjakson ei osallistu amoeboid-tilassa muuttoliike. Tämän tueksi hypoteesin, uusi FRET tulokset osoittavat suoran vuorovaikutuksen ROCK1 ja LIMK2 in polarisoitunut mutta ei kupliminen soluja. Tuloksemme viittaavat erityinen tehtävä ROCK1: LIMK2 väylän mesenkymaalisten-tilassa muuttoliike.

Citation: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) ROCK1 ja LIMK2 vuorovaikutuksessa Levitä mutta ei kupliminen syöpäsoluja. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10,1371 /journal.pone.0003398

Editor: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Saksa

vastaanotettu: 08 heinäkuu 2008; Hyväksytty: 16 syyskuu 2008; Julkaistu: 14 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Shea et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Medical Research Council (MRC), ja palkinto on CASE stipendi alkaen BBSRC /AstraZeneca plc.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rintasyöpä etäpesäkkeitä riippuu solujen vaeltamiseen, monimutkainen prosessi säännelty tilallisesti sekä ajallisesti että Rho perhe GTPaasit Rho, Rae ja Cdc42 [1]. Nämä GTPaasit saada vastaus solunulkoisia signaaleja aktiinisytoskeletonin läpi erilaisia ​​efektoriproteiinit. 3D-mikroympäristön syöpäsolut voivat hyväksyä sekä mesenkymaalisten ja amoeboid kuten muuttavien fenotyypit [2]. Amoeboid muuttoliike on ominaista kalvo kupliminen [3] – [5] erikoistunut muoto solun ulokkeen, joka on korjattavissa ja voi tapahtua solujen vaeltamiseen tai aikana aloittamisesta sytokineesin [6]. Kalvo kupliminen on osoitettu indusoituvan Rho efektoriproteiini ROCK [7] ja amoeboid kaltainen liike on täysin riippuvainen vuorovaikutuksesta Rho ja ROCK [2], [5].

ROCK-1 ja ROCK -2 ovat seriini /treoniini-kinaaseja, jotka on määrä solusubstraattien, kuten myosiinin kevytketju ja LIM-kinaasi (LIMK) [8]. ROCK-riippuvainen muuttoliike syöpäsolujen tiedetään ohjaavat actomyosin supistukset [9], [10]. Kuitenkin se ei tiedetä, onko ROCK riippuvainen syöpäsolujen amoeboid liikkumiskyky vaatii ROCK: LIMK vuorovaikutus.

Aktivoidut LIMK proteiinit fosforyloivat ja inaktivoida F-aktiini katkaisuvälineestä proteiinia, cofilin ja tämä tarjoaa vaihtoehtoisen mekanismin Rho-ROCK signalointi välittävän sen vaikutukset F-aktiinitukiranka [11]. ROCK-LIMK signalointi ajatellaan edistää takaisinveto neuriittien säätelemällä cofilin toimintaa [12]. Lisäksi rooli ROCK ja LIMK proteiineja ihmisen orvaskeden on tunnistettu [13]. Inhibitiota cofilin aktiivisuuden ROCK-LIMK näyttää olevan edellytyksenä solujen tiivistymistä, joissa lasku LIMK toiminta johtaa kasvuun cofilin aktiivisuus ja vähentää solujen tiivistymistä [13].

kasvu ROCK tasoilla on todettu, että useissa ihmisen syövissä, [14] – [16] ja tasot LIMK-1 lisäys invasiivisen ja metastaattisen rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa [17], [18]. Siksi pyrimme ymmärtämään paremmin aiempia ROCK: LIMK vuorovaikutus syöpäsolujen migraatiota kuvantamisen spatiaalista vuorovaikutusta ROCK ja LIMK rintasyöpäsoluissa näytteille sekä mesenkymaaliset ja amoeboid (kupliminen) morfologioita.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

anti-ROCK1 hankittiin Transduction Laboratories, anti-LIMK2, anti-fosfo-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) Cell Signalling Technology. HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet DAKO ja Alexa-phalloidin Molecular Probes. Expression koodaavat plasmidit GFP, CFP, YFP ja mRFP1 tagged LIMK1, LIMK2 ja ROCK1 luotiin käyttäen Gateway ™ Technology (Invitrogen) ja kaikki plasmidit sekvensoitiin. ROCK estäjä Y27632 hankittiin Calbiochem.

Cell Culture

MDA-MB231-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (Sigma), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Helena Biosciences), L-glutamiinia ja 100 U /ml penisilliini-streptomysiiniä. Solut transfektoitiin ohimenevästi käyttämällä Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen).

Fosforylaatiomääritys

Solut hajotettiin osaksi NP40 lyysipuskuria (1% v /v NP40; 50 mM HEPES pH 7,5; 0,5% w /v natriumdeoksikolaatti; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA). Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin. Autoradiograafit skannattu ja kvantitatiivisesti käyttäen Adoben ohjelmistoja. Mean ja s.e.m. -arvot laskettiin tietojen 3 itsenäisen kokeen.

Immunofluoresenssianalyysi ja analyysi

Solut ympättiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä: PBS: ssä ja permeabilised 0,2% Triton X-100: PBS kuten aiemmin on kuvattu [19]. Sitten soluja inkuboitiin TRITC-konjugoidulla phalloidin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kuvia soluja saatiin käyttämällä Zeiss LSM510 konfokaali laser-skannaus mikroskooppi (Welwyn Garden City, Iso-Britannia) ja käsiteltiin Adobe Photoshop 7.0 ™. Student parillista t-testiä käytettiin vertaamaan eroja ryhmien välillä. Tilastollinen merkittävyys hyväksyttiin P≤0.05

FRET: FLIM Mikroskopia

Solut mikroinjektoitu sopivilla plasmideilla 24 tuntia ennen vahvistamista. Solut kiinnitettiin sitten kuten edellä, ja inkuboitiin tuoreen natriumboorihydridillä (1 mg /ml PBS: ssä) sammuttamiseksi taustafluoresenssi kuten aiemmin on kuvattu. FLIM suoritettiin multiphoton avulla kuten aiemmin on kuvattu [19]. FLIM analyysi laskea GFP käyttöiän ja FRET tehokkuutta suoritettiin käyttäen TRI2 ohjelmiston [19]. Kuvapisteiden määrä kunkin FRET hyötysuhteen arvo saatiin TRI 2 ja normalisoitu jakamalla se summa pikselien että kuva. Tämä normalisoitu pikselimäärä oli keskimäärin yli kuusi solua kunnossa ja sitten piirrettiin FRET hyötysuhde tuottaa FRET tehokkuuden histogrammien.

Tulokset

ROCK1 fosforyloi LIMK1 ja LIMK2 rintasyöpäsoluissa

Useat laboratoriot ovat ehdottaneet, että ROCK voivat fosforyloida ja aktivoida LIMK1 ja LIMK2 [20] – [26], ja näin me pyrkineet luomaan jos tämä on sama MDA-MB231-soluissa. Pre-inkuboitu ROCK estäjän Y27632 puolestaan ​​laskenut LIMK2 fosforylaation soluissa endogeenisen ja yli-ilmentyy CFP-ROCK1. Sen sijaan, Y27632 vähentää suhde fosfo kokonaismäärään LIMK1 soluissa kanssa ilmentynyt CFP-ROCK1 mutta ei niitä, joilla endogeenisten tasojen ROCK proteiinin (Fig. 1). Solujen käsittely Y27632 aiheuttama laski hiukan LIMK1 ja LIMK2 yli-ilmentyminen tasolla (Fig. 1A ja B). Vaikka LIMK2 fosforylaatio on aina herkkä ROCK toiminta LIMK1 fosforylaatio on vain herkkä ROCK aktiivisuutta CFP-ROCK1 yliekspressoidaan. Siten, tuloksemme osoittavat, että yli-ilmentyminen ROCK1 muuttaa tason fosforylaation sekä LIMK1 ja 2, mutta ehdottavat, että LIMK2 on edullinen substraatti ROCK1 näissä soluissa.

A) ja B) CFP-LIMK1 tai 2 ja joko CFP-ROCK1 tai CFP yksin transfektoitiin transientisti MDA-MB231-soluja, ja sitä käsiteltiin 10 uM Y27632 24 tuntia. Saatu lysaatit immunoblotattiin käyttämällä anti-fosfo-LIMK, -LIMK1, -LIMK2 ja -ROCK1 vasta-aineita. (NSB = epäspesifinen sitoutuminen anti-ROCK1 vasta-aine proteiini /s 220 kDa). C) suhde fosfo /yhteensä LIMK1 CFP-LIMK1 ja D) suhde fosfo /yhteensä LIMK2. (* = P 0,05).

ROCK1 mutta ei LIMK2 indusoi kupliminen rintasyöpäsoluissa

Havaitsimme, että vaikka yli-ilmentyminen GFP yksin aiheuttaa pientä mutta tilastollisesti merkittävää kasvua määrä kupliminen solujen yli-ilmentymisen GFP-ROCK1 indusoi erittäin merkittävä kasvu prosentteina kupliminen solujen (Fig. 2A ja B). Vaikka ei ole esitetty, ennen kuin MDA-MB231-soluissa tämä on raportoitu muissa solutyypeissä [9], [27] – [30]. Sitä vastoin yli-ilmentyminen GFP-LIMK2 ei indusoinut korkea kalvon rakkuloituminen, nähtiin myös mitään viitteitä solun kupliminen seuraavista yliekspressio LIMK1 (tuloksia ei ole esitetty). Kaikissa tapauksissa kupliminen solut oli ehjä ydin, joka ei fragmentti (Fig. 2A), mikä osoittaa, että tämä ei ole solukalvon kupliminen liittyy apoptoosin [31].

A) MDA-MB231-solut transfektoitiin GFP-ROCK1 tai GFP-LIMK2, kiinnitettiin ja värjättiin Alexa Fluor 594-falloidiinia ja Dapi. 150-solut yli 3 itsenäistä koetta pisteytettiin näkyvä kupliminen +/- SEM. P 0,05; *** P 0,001. B) Kuvat ovat vaihtelevista optinen siivuja kupliminen yliekspressoivan GFP-ROCK1. (Bar = 20 um).

ROCK1 ja LIMK2 eivät vuorovaikutuksessa kupliminen rintasyöpäsoluissa

tulokset osoittavat, että on olemassa vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2, mutta osoittavat, että tämä vuorovaikutus ei ole mukana kalvo kupliminen. Olemme pyrkineet vahvistamaan tämän hypoteesin suoraan kuvantamisen vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 vuonna kupliminen ja ei-kupliminen soluihin käyttämällä FRET: FLIM mikroskoopilla. Tämä menetelmä ei ainoastaan ​​avulla vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 voidaan havaita myös lokalisoinnin tällaisen vuorovaikutuksen määritetään tilallisesti koko solun. Jotta vertailla vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 in leviämistä ja kupliminen soluja käytimme mikroinjektio kohtalaiseen tasoon ROCK1 ilmaisua. Käyttämällä tätä menetelmää suurin osa soluista (63%), osoitti leviäminen /polarisoitu morfologia, jossa pienempi määrä kupliminen soluja (23%). Vuonna kupliminen soluissa emme ole havainneet FRET välillä GFP-ROCK-1 ja MRFP-LIMK-2 (Fig. 3).

MDA-MB231-soluja mikroinjektoida GFP-ROCK1 ja MRFP-LIMK2, kiinteä, kuvaamisen ja analysoitiin FLIM mikroskopia ja TRI 2 analyysi ohjelmaa. A) Kuvia GFP käyttöikä ja GFP ja MRFP intensiteetit poikki tyypillinen kupliminen kenno näytetään ilmentävän solun sekä GFP-ROCK1 luovuttajan ja MRFP-LIMK2 akseptori ja vertailun, vain GFP -ROCK1 luovuttaja. B) Histogrammi määrän normalisoitu pikselimäärään havaitaan kussakin GFP käyttöikää. n = 9.

ROCK1 ja LIMK2 vuorovaikutuksessa polarisoitunut rintasyövän solujen

Todettuaan, että ROCK1 ja LIMK2 eivät vuorovaikutuksessa kupliminen soluissa olemme analysoineet lokalisointi ja vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 in leviäminen soluissa. In leviämisen soluissa suurin osa LIMK2 ja ROCK ilmentyminen paikantuu sytoplasmassa, mutta ilmentyminen molemmat proteiinit voidaan havaita tumassa (Fig. 4). MDA-MB231-solujen leviäminen /polarisoitunut fenotyyppi havaitsimme vähentynyt GFP käyttöikä, kun ROCK1 ja LIMK2 olivat koekspressoi, joka osoittaa, että ROCK1 ja LIMK2 vuorovaikutuksessa leviämisen soluissa (Fig. 4). GFP käyttöikä pieneneminen nähdään poikki sytoplasmaan on punktuaalista jakeluun. Vertailun vuoksi kaksi polarisoitunut solua mikroinjektoida vain GFP-ROCK1 eivät näy vähenemisen GFP elinaikanaan (Fig. 4). Ei ole mitään merkittävää laskua GFP eliniän alla ohjaus tason, kun solut, jotka ilmentävät ROCK1 ja LIMK2 ovat esi-inkuboitiin ROCK inhibiittorin Y27632 (kuvio 4). Mielenkiintoista on, että monissa soluissa on puuttuminen havaittavaa vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 solun kehällä (korostettu nuolenpäin kuviossa. 4).

MDA-MB231-soluja mikroinjektoidaan, jossa GFP-ROCK1 ja mRFP- LIMK2, kiinteät, kuvaamisen ja analysoidaan FLIM mikroskopia ja TRI 2 analyysi ohjelmaa. A) Kuvia GFP käyttöikä ja GFP ja MRFP intensiteetit poikki tyypillinen pitkänomainen kenno näytetään ilmentävän solun sekä GFP-ROCK1 luovuttajan ja MRFP-LIMK2 akseptori ja vertailun, vain GFP -ROCK1 luovuttaja. B) Histogrammi määrän normalisoitu pikselimäärään havaitaan kussakin GFP käyttöikää. C) Histogrammi keskimääräisestä normalisoidun pikselimäärään havaitaan jokaisessa GFP elinajan soluissa, jotka ilmentävät sekä GFP-ROCK1 luovuttajan ja MRFP-LIMK2 vastaanottavana soluissa pitkänomainen tai kupliminen morfologit rakennettiin yhdessä soluilla, jotka ilmentävät vain GFP-ROCK1 luovuttajan. 18-solut yli kolmen erillisen kokeen oli kuvattu kunakin ajankohtana. D) Histogrammi määrän normalisoitu pikselimäärään havaitaan kussakin GFP käyttöikä soluja, jotka ekspressoivat sekä GFP-ROCK-1 luovuttajan ja MRFP-LIMK-2 vastaanottavana MDA-MB231-soluja esikäsiteltiin Y27632. n = 9.

Keskustelu

Aikaisemmat tutkimukset eivät ole tunnistettu, onko ROCK: LIMK polku osaltaan induktion kalvon kupliminen. Tarjoamme täällä ensimmäistä kertaa todisteita suora ja konkreettinen vuorovaikutus ROCK1 ja LIMK 2 hyvin levinnyt mesenkyymisolujen joka puuttuu pyöristetty kupliminen soluissa. Käyttämällä FRET mikroskopia löysimme mitään vuorovaikutusta ROCK-1 ja LIMK-2 soluissa, jotka näytetään kalvo kupliminen fenotyyppi, vaikka omaa näyttöä siitä LIMK2 on edullinen ROCK alustan näissä soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että ROCK1: LIMK2 vuorovaikutus ei mukana kupliminen /pyöristetty fenotyyppiä ja ei tarvita amoeboid muuttoliikettä. Itse yliekspressio LIMK2 ei indusoi kalvon kupliminen soluissa. Viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että solutapahtumiin alavirtaan ROCK aktivointiin todellakin erikseen koordinoidaan vaikka MLC ja cofilin fosforylaatio [32].

Sen sijaan meidän FRET tutkimuksissa havaittu suoraa vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 väkevään pesäkkeitä sytoplasmassa syövän solut mesenkymaalisten morfologia. Fosforylaation LIMK-2 ROCK-1 solun keskellä lisäisi Fosforyloidun cofilin, mikä vähentää F-aktiini katkaisulaitteen. Tämä vakauttaa actomyosin säikeet läsnä solun elin ja edistää sukupolven kutistusvoimaan tarvittavat hännän takaisinveto ja solumigraatio [33]. Itse asiassa se on aiemmin osoitettu, että TGF-indusoidun aktiini stressi kuidun muodostuminen välittyy ROCK-1 /LIMK-2 /cofilin polku [26]. Äskettäin ROCK: LIMK1 koulutusjakso on osallisena koordinointiin cofilin aktiivisuutta solukalvon invasiivisen rotan rintasyöpä solujen [34], [35]. Tuloksemme viittaavat erillisen toiminnon LIMK1 ja LIMK2 alavirtaan ROCK aikana rintasyövän solujen vaeltamiseen. Me spekuloida, että vuorovaikutus ROCK1 ja LIMK2 ei merkittävä rooli kalvon kupliminen liittyy solujen vaeltamiseen eikä säätelyssä cofilin fosforylaation solussa reuna. Pikemminkin vuorovaikutusta ROCK1 ja LIMK2 rajoittuu soluun ruumiin polarisoitunut hyvin levinnyttä soluihin, joissa on edistää vakauttamiseen actomyosin filamenttien ja sukupolvi supistuvien kohdistuvalla inaktivaation cofilin.