Krooninen sairaus

tiivistelmä

MKT-077, joka on rhodacyanine väriaine, osoitettiin tuottaa syöpää erityisiä solukuolemaa. Kuitenkin, komplikaatiot esti käyttää tätä yhdistettä kuin kliinisissä kokeissa. Ohessa kuvataan YM-1, johdannainen MKT-077. Huomasimme, että YM-1 oli sytotoksinen ja lokalisoitu eri tavalla kuin MKT-077. YM-1 osoitti tämän sytotoksisuuden useille syöpäsolun linjat. Tämä myrkyllisyys rajattiin syöpäsolulinjoissa; kuolemattomaksi solumalleja pysyivät muuttumattomina. Lyhyt sovelluksia YM-1 havaittiin olevan myrkyttömiä. Lyhyt hoito YM-1 palautettu tamoksifeenia herkkyys tulenkestävä tamoksifeenia kestävä MCF7 solumallin. Tämä vaikutus johtuu mahdollisesti muuttuneen estrogeenireseptori alfa fosforylaation, lopputulos saostetaan valikoiva vähennykset Akt tasoilla (Akt /PKB). Täten muutokset rhodocyanine tukirakenteen voitaisiin mahdollisesti tehdä vaikutuksen tehokkuuden ja farmakokineettiset ominaisuudet. Lisäksi vaikutus tamoksifeenin herkkyys voisi olla uusi apuohjelma tämän yhdisteen perheelle.

Citation: Koren J III, Miyata Y, Kiray J, O’Leary JC III, Nguyen L, Guo J, et al. (2012) Rhodacyanine Johdannaissopimukset valikoivasti tavoitteet Syöpäsolut ja voittaa Tamoxifen Resistance. PLoS ONE 7 (4): e35566. doi: 10,1371 /journal.pone.0035566

Editor: Leonard Petrucelli, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 helmikuu 2012; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2012 Julkaistu: 26 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Koren et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr. Dickey tukivat Alzheimerin Association, CurePSP (Progressive supranukleaarinen halvaus), National Institutes of Health /National Institute on Aging (NIH /NIA) R00AG031291 ja NINDS (National Institute of neurologiset häiriöt ja aivohalvaus) R01NS073899. Dr. Gestwicki tukivat NIH R01NS059690. Dr. Cheng tukivat James Esther kuningas Grant 1KG02-33967. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MKT-077, kationinen rhodacyanine on osoittanut syöpää spesifistä toksisuutta ja kasvun estäminen

in vitro

ja

in vivo

useiden syövän lajikkeiden [1]. Määritettiin, että MKT-077 lokalisoitu mitokondriot [1]. MKT-077 tuli kliinisissä kokeissa hoitoon kehittynyt ja tulenkestävien kiinteitä kasvaimia erilaisten solujen alkuperä, mukaan lukien: munuaiset, keuhkot, eturauhanen, paksusuoli, adenokarsinoomien, ja melanoomat [2], [3]. Ensisijainen negatiivinen sivuvaikutus havaittu molemmissa tutkimuksissa oli munuaistoksisuutta [2], [3]. Havaitut myrkyllisyys pysähtyi rekrytointia yhdessä tutkimuksessa samankaltaisina Eläinkokeissa osoittivat pysyvän munuaisvaurion antamista seuraava toksisuus MKT-077 [2], [3]. Myöhemmin havaittiin, että MKT-077 vuorovaikutuksessa mortalin (mot-2), joka on 70-kDa lämpöshokkiproteiini (Hsp70) perheenjäsen, ja että vuorovaikutus MKT-077 kanssa mot-2 indusoi vapauttamaan kasvain p53 mistä monimutkainen mot-2 [4]. Tämä mot-2 /p53 kompleksi inaktivoi tuumorisuppressiogeeneksi kykyjä p53 sitomalla se sytosoliin

in vivo

[5].

rintasyövistä yleisimpiä syöpiä diagnosoidaan naisilla [ ,,,0],6]. Julkaistut tiedot toteaa, että hoitoon MCF7-solut, rintasyöpä solumallin, jossa MKT-077 tuottaa sytotoksisuuden ja muuttaa kasvu [1], [2]. Kuitenkin tulokset kahdesta julkaistu faasin I kliinisissä kokeissa, ei potilaita, joilla on kiinteä rinta kasvain tai tulenkestävä rintasyöpäkohteisiin olivat mukana tutkimuksessa [2], [3]. Vaikka on olemassa lukuisia rintasyöpä chemotherapies, vastustuskykyä rintasyövän hoitojen voi syntyä noin 30% naisista hoidettiin rintasyöpä [7]. Tunnetut vastusten rintasyövistä on havaittu paitsi vakio syöpälääkkeen strategioita, kuten doksorubisiini, mutta myös trastutsumabin ja tamoksifeenia (4-OHT) [8], [9], [10].

Rintojen syövät myös suuri esiintyvyys mutaatioiden; mutaatiot, jotka voivat edistää kasvainten synnyssä ja eloonjäämistä [11]. Vaikka nämä mutaatiot tuottavat tavoitteita hoitoja, muut mutaatiot voivat voittaa signalointiryöpyn verkko piiri poistaa alkupään tavoitteet [12], [13]. Tämä vähentää määrä potentiaalisia kohteita, vähentää cadre hoitovaihtoehtoja, ja lisätä mahdollisuuksia vastus genesis. Lisäksi vastus voi syntyä, kun säätelyproteiineihin muutetaan sallimaan pro-selviytymisen proteiinit toimia keskeytyksettä. Useat kinaasit liittyvät solujen selviytymistä ovat sekaantuneet helpottaa kemoterapian resistenssin [14], [15], [16], [17], [18]. Esimerkiksi fosforylaation estrogeenireseptori alfaa (ERa) aiheuttaa ERa tulla aktiivisiksi riippumatta estrogeenin sitoutumisen, jolloin vastus 4-OHT: ta. Siten strategioita uudelleen herkistää tulenkestävien syöpäsolujen olemassa oleviin hoitomuotoihin kipeästi tarpeen.

nämä tiedot, voimme tunnistaa funktionaalisen johdannaisen MKT-077, joka osoitti, lisääntynyt sytotoksisuus useiden syövän lajikkeita, mutta säilyttää syöpää spesifisyys liittyvä MKT-077. Tämä tehostunut vaikutus johtui solunsisäisen lokalisaation yhdisteen. Lisäksi lyhyt käsittelyt YM-1 pystyivät resensitize syöpäsoluja, jotka olivat kehittäneet vastustuskyvyn ERa antagonisti, tamoksifeenin. Yksi tapa, jolla nämä yhdisteet toimivat on vähentää yhteensä Akt tasoja, jotka voivat edistää ERa sieto tamoksifeenia. Yhdistetään, rhodacyanine tukirakenne valtavat mahdollisuudet syövän terapeuttista sekä yksilöllisesti hoitostrategia vaan myös potentiaalisesti kuten monimuotoiset tai synergistinen vaihtoehto käytettäväksi nykyisten hoito.

Methods

Cell Lines

tamoksifeenin resistenttejä (TR-MCF7) ja vanhempien MCF7-solut jalomielinen lahjoitus tohtori Jin Q. Cheng Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). MCF7 line alunperin tuottamat Michigan Cancer Foundation ja saatiin ATCC (Manassas, VA) ja TR-vastus tuotettiin krooninen matala annos hoidon tamoksifeenin. HEK-293, M17, H4, MDA-MB-231, Hs578T ja NIH-3T3-solut hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA). HeLa-solut jalomielinen lahjoitus tohtori Kenneth E. Ugen yliopistossa South Florida. Hän alun perin saatu heidät ATCC (Manassas, VA). Nämä solut syntyvät kohdunkaulan kasvain Henrietta Lacks.

Kemikaalit ja vasta-

Metyleenisininen (MB) ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO). MKT-077 ja YM-1 syntetisoitiin, kuten on kuvattu [19]. Anti-Akt1, Akt2, ja pAktS473 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-ERa, ja pERα S167 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Actin ostettiin Sigma Aldrich. Anti-GAPDH ostettiin Meridian Life Science (Memphis, TN).

Soluviljely ja lääkehoidot

MCF7, MDA-MB-231, Hs578T ja HeLa-soluja kasvatettiin kuten aiemmin kuvattu [ ,,,0],20]. H4 ja HEK-293-soluja viljeltiin OPTI – modifioidussa Eaglen väliaineessa (OPTI-MEM) Invitrogen täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% PenStrep (Invitrogen). M17 soluja viljeltiin OPTI-MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% PenStrep ja 100 mg /l natriumpyruvaattia. NIH-3T3-soluja viljeltiin DMEM alhaisen natriumbikarbonaatilla (1,5 g /L) ATCC täydennetty 10% FBS: ää ja 1% PenStrep. TR-MCF7-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (kuvattu MCF7-soluja), jota oli täydennetty 10 uM 4-OHT: ta. MKT-077 ja YM-1 liuotettiin DMSO. DMSO käytettiin välineenä MKT-077 ja YM-1 toisin mainita. Tarkka hoitostrategioiden mukana tiedot tulososiossa.

Protein Collection, kvantitointi ja Western-blottaus

Solut kerättiin soveltamalla nisäkäsproteiinin uuttoreagenssi (Thermo) kuten aiemmin on kuvattu [20]. Proteiini tasolla mittaus, tasapainotus, Western blotting ja havaitseminen suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [20].

laktaattidehydrogenaasin (LDH) Pitoisuus

osoitti solulinjoja levytettiin nimetty väliaineessa. Kun solut saavuttivat ~95% konfluenssiin, MKT-077 tai YM-1 levitettiin DMEM ilman fenolipunaista. Sen jälkeen kertaa merkitty koetta kohti, väliaine kerättiin jokaisen hoidon ja sentrifugoitiin pelletoimiseksi kuolleita soluja ja roskia. Protokollaa kuten syötetään CytoTox-96 Kit (Promega).

Mitokondrioiden eristäminen ja spektroskopian

MCF7-soluja käsiteltiin 6 tuntia ajoneuvo (DMSO), MB, YM-1, tai MKT-077. Käsittelyn solut otettiin talteen ja subsellulaarisia jakeet kerätään Pierce Mitokondrioiden eristäminen Kit Thermo Scientific (Rockford, IL). Analyysi huumeiden lokalisointi suoritettiin spektroskopialla on Thermo Scientific Nanodrop spektrofotometrillä. Pitoisuudet ja myöhemmät prosentit olivat arvioida luotu pitoisuus: absorbanssikäyrältä (ei kuvassa).

MTT solunelinkykyisyysmääritys

TR-MCF7-solut maljattiin 96-kuoppaiset levy sisälsi 10 uM 4- OHT. Kun solut saavuttivat ~90% konfluenssin soluja käsiteltiin OPTI-MEM yhteen neljästä edellytyksistä 1: 10 uM 4-OHT OPTI-MEM koko 48 h kokeen. 2: YM-1 (tai vehikkeli) on osoitettu pitoisuudet 4 tuntia, mitä seurasi vaihto YM-1 väliaineessa, joka sisälsi 10 uM 4-OHT: ta. 3: YM-1 (tai vehikkeli) on osoitettu pitoisuudet 4 tuntia, mitä seurasi vaihto YM-1 liuoksella, joka sisälsi 95% EtOH: ssa (ajoneuvon 4-OHT: ta). Tai, 4: YM-1 (tai ajoneuvo) ilmoitetuilla pitoisuuksilla koko 48 tunnin kokeen. MTT iinianalyysikitissä hankittiin ATCC ja määritys ajettiin kohti toimitettu protokollaa.

eristäminen Tumaproteiinien

TR-MCF7-soluja kasvatettiin nimetty väliaineessa 10 cm ruokia. Soluja käsiteltiin 4 tuntia 10 uM 4-OHT: ta, 10 uM YM-1, molemmat tai ajoneuvo (t) sekä yhdisteitä. Inkubaation jälkeen solut kerättiin ja tumaproteiinit eristettiin käyttäen reagensseja ja syötetään protokollan Qproteome Nuclear Protein Kit (Qiagen).

Tulokset

sytotoksisuus profiilit sarjan johdannaisia ​​MKT-077 on MCF7-soluja verrattiin pienimuotoista näyttö. Johdannainen YM-1 oli ainoa yhdisteen havaittiin olevan annoksesta riippuvaisella suurempi myrkyllisyys kuin MKT-077 24 tunnin kuluttua (LDH-arvot normalisoitu solujen määrä) (kuvio 1A). Yksi mahdollinen syy parantaa teho oli solusijaintipaikasta. Hyödyntämällä ainutlaatuisia spektrin Näiden yhdisteiden ominaisuuksia, MCF7-soluja käsiteltiin MKT-077 tai YM-1 ja solujen erottaminen mitokondrioita ja sytosolin suoritettiin. Metyleenisininen, yhdistettä, jonka tiedetään paikallistaa mitokondriot, käytettiin kontrollina [21]. Solunsisäisen jakeet analysoitiin spektrofotometrisesti. Näitä arvoja verrattiin syntyy standardikäyrä Abs: pitoisuus (tuloksia ei ole esitetty), jolloin saatiin noin yhdisteen pitoisuus kussakin fraktiossa ja siten prosenttiosuus lääkettä per sijainti. Mielenkiintoista on, että YM-1, toisin MKT-077 oli yleisempää solulimafraktiot (kuvio 1 B).

MCF7-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan kolme pitoisuudet MKT-077 tai YM-1. 24 tunnin kuluttua väliaine kerättiin ja analysoitiin LDH-määrityksellä. Esitetyt arvot ovat% ajoneuvon käsittely ± SD (A). MCF7-soluja käsiteltiin MKT-077, YM-1 tai metyleenisininen (MB). Mitokondrioiden fraktiot kerättiin ja yhdiste sijainti mitattiin spektrofotometrillä (B).

huolissaan siitä, että mitokondrion vuorovaikutuksen vähentäisi sytotoksisia spesifisyys nähdään rhodacyanine n syöpäsoluja, selektiivisyys YM-1 useita syövän ja kuolemattomien solujen linjat testattiin. Näitä olivat: MCF7, Hs578T ja MDA-MB-231 (rintasyöpä), M17 (neuroblastooma), H4 (neuroglioomasoluihin), HeLa (kohdunkaulan syöpä), ja kaksi kuolemattomia solulinjoja: HEK 293 (ihmisen alkion munuainen) ja NIH 3T3 ( hiiren fibroblasti). Tukeva sytotoksisuus (1323% ajoneuvon), mitattuna laktaattidehydrogenaasin (LDH) määrityksessä havaittiin MCF7-soluissa 24 tunnin YM-1 käsittely (kuvio 2A). Kuten odotettua, nämä myrkyllisyyden arvot olivat korkeammat kuin kuviossa 1A, koska käytimme suurempi solupopulaation (1A≈0.2 x 10

6 solua; 2A≈1.2 x 10

6 solua), ja siten enemmän LDH julkaistiin jonka liittyvää toksisuutta. Toinen syöpä tutkituissa solulinjoissa kaikki näkyvissä myrkylliseksi YM-1 hallintoa; ottaa huomioon, että kaksi kuolemattomia solulinjoja näkyy vähän tai ei lainkaan myrkyllisyyttä LDH määrityksellä (kuvio 2B). Tämä osoitti, että sytosolin lokalisointi YM-1 ei vaikuta sen spesifisyys syöpäsoluja.

MCF7-soluja (rintasyöpä) käsiteltiin 24 tuntia kasvavilla pitoisuuksilla YM-1. 24 tunnin kuluttua väliaine kerättiin ja analysoitiin LDH-sytotoksisuusmääritys. Esitetyt arvot ovat% ajoneuvon käsittely ± SD (A). Hs578T ja MDA-MB-231 (rintasyöpä), M17 (neuroblastooma), H4 (neuroglioomasoluihin), ja HeLa (kohdunkaulan syöpä) solua käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla YM-1 ja toksisuutta verrattiin NIH-3T3 (hiiren alkion fibroblasti ) ja HEK 293 (ihmisen alkion munuainen) soluihin syövän spesifistä toksisuutta. Kaikkia solulinjoja käsiteltiin 24 tunnin ajan. 24 tunnin kuluttua, media kerättiin ja analysoitiin LDH-määrityksellä. Esitetyt arvot ovat% ajoneuvon käsittely ± SD (B).

YM-1 teho testattiin sitten solun malli tamoksifeenia-resistenssin. Myrkyllisyys YM-1 tulenkestävään tamoksifeeni (4-OHT) resistenttejä MCF7 (TR-MCF7) solulinja verrattuna emo-MCF7 (ei-resistenttejä) solulinjan. Todellakin, YM-1 tehokkaasti tappoi sekä vakio ja kestävä (TR-MCF7) soluissa, sen jälkeen 48 tunnin inkuboinnin jälkeen (kuvio 3A). Koska edellinen huolenaiheet kroonista MKT-077 käsittelyä, me arveltu, että lyhyempi hoito YM-1 saattaa olla yhtä myrkyllisiä. Tämän testaamiseksi MCF7-solut ja TR-MCF7-soluja käsiteltiin 10 uM YM-1 4 tunnin ajan. Tämä poistettiin ja korvattiin ajoneuvon 44 tuntia. Lisäksi TR-MCF7-soluja käsiteltiin joko 4-OHT: ta tai ajoneuvo, 4-OHT: ta (95% EtOH) (kuvio 3B). Kussakin tapauksessa vähäisiä myrkytysoireita ei havaittu.

TR-MCF7 ja vanhempien MCF7-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 10 uM YM-1. 48 tunnin kuluttua, media kerättiin ja analysoitiin LDH-määrityksellä. Esitetyt arvot ovat% ajoneuvon käsittely ± SD (A). MCF7-soluja käsiteltiin 4 tunnin ajan 10 uM YM-1. 4 tuntia, elatusaine korvattiin standardin kasvualustaa 44 tuntia. TR-MCF7-soluja käsiteltiin 10 uM YM-1 4 tunnin ajan. 4 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja korvattiin standardin TR-MCF7 elatusaineessa, joka sisälsi 10 uM 4-OHT: ta tai 95% EtOH, ajoneuvon 4-OHT: ta, 44 tuntia. 48 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta, media kerättiin ja analysoitiin LDH-määrityksellä. Esitetyt arvot ovat% ajoneuvon käsittely ± SD (B).

Solujen elinkyky (MTT) määritykset käytettiin sitten testata, onko tämä lyhyempi hoidon strategia vaikuttavat solujen lisääntymistä. TR-MCF7-soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 10 uM 4-OHT: ta. Meidän suunniteltu hoitostrategia sisälsi neljä olosuhteissa kaikki päättyy 48 tuntia: 1. 10 uM 4-OHT: ta yksinään 48 tunnin ajan, 2. YM-1 (tai ajoneuvo) käsittely 4 tuntia ja sen jälkeen uudelleen lisäämällä 10 uM 4-OHT: ta 44 tuntia, 3. YM-1 (tai ajoneuvo) hoitoon 4 tuntia ja sen jälkeen 95% EtOH (ajoneuvo 4-OHT), ja 4. YM-1 (tai ajoneuvo) hoitoa koko 48 tuntia. MTT määritykset paljastivat, että 4 tunnin 10 uM YM-1, sen jälkeen 10 uM 4-OHT: ta vähensi elinkelpoisuus 60% suhteessa 4-OHT hoito yksinään. 10 uM YM-1, sen jälkeen 95% EtOH käsittely ei muuta elinkelpoisuuden (kuvio 4A). 48 tunnin 10 uM YM-1 vähensi elinkelpoisuus 40% verrattuna 48 tunnin 4-OHT: ta hoitoa, samanlainen kuva kuin kuvio 3A.

TR-MCF7-soluja käsiteltiin 4-OHT: ta 48 tunnin ajan, YM-1 (tai ajoneuvossa) 4 tuntia, mitä seurasi 44 tuntia joko 4-OHT: ta tai 95% EtOH: ssa, tai YM-1 (tai ajoneuvo) 48 tuntia. 48 tuntia hoidon alussa, MTT-elinkyky määritykset suoritettiin. Elinkelpoisuus arvot kunkin käsittelyn%: na 48 tunnin 4-OHT hoidon ± SD (A). 2-Way ANOVA verrataan kaikkia YM-1 hoitoryhmissä (Gray squares- 4 tunnin YM-1then 4-OHT, avoin Diamonds 48 tunnin YM-1, musta triangles- 4 tunnin YM-1 sitten 95% EtOH), paljasti merkitys poikki pitoisuudet (F (2,30) = 54,22, p 0,0001), ja hoito strategia (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), mutta mitään merkittävää vuorovaikutusta (F (8,30) = 1,83 , p = 0,1107). * – Osoittaa merkittävää eroa (p 0,05) 4 tunnin YM-1, sitten 4-OHT: ta muista kahteen ryhmään lukuun ottamatta 10 uM hoitoja, merkitys kuten (ns = p 0,05) (B). 1-suuntainen ANOVA YM-1 + 4-OHT: ta strategiaa paljastaa merkitys 10 uM (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (C). Analyysi YM-1 + 95% EtOH, 1-suuntainen ANOVA, ei paljastanut mitään merkitystä koko testatut pitoisuudet (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (D). 48 tunnin YM-1 hoito osoitti merkityksen eroja kaikkien pitoisuuksien ja 10 uM, 1-suuntainen ANOVA (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007) (E). 1-suuntainen ANOVA (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001) verrataan kaikkia 10gM YM-1 hoitoja, 48-tunnin 4-OHT, ja ajoneuvo hoidot eivät paljastaneet merkittävää eroa 48 tunnin 4-OHT ja sekä 4 tunnin 10 uM YM-1 + 95% EtOH ja 48 tunnin 10 uM YM-1 hoidot; kun taas 48-tunnin 4-OHT ja 4 tunnin 10 uM YM-1 + 95% EtOH oli merkittävästi erilainen kuin 4 tunnin YM-1 + 4-OHT hoitoa (p 0,05) (F).

Kaikki hoitostrategioita, jotka sisältävät YM-1 analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA: lla (kuvio 4B). Tämä analyysi paljasti merkittävää vaikutusta käsittelemällä strategia ja keskittyminen YM1 (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), (F (2,30) = 54,22, p 0,0001). Vuorovaikutusta hoitostrategia ja pitoisuus ei ollut merkitsevä (F (8,30) = 1,83, p = 0,1107). Bonferroni post-hoc analyysi tämän 2-tie ANOVA ei osoittanut merkittäviä eroja mitä tahansa pitoisuuksien käytetään 48 tunnin YM-1 käsittely ja 4 tunnin YM-1 sen jälkeen 95% EtOH käsittely (kaikki p 0,05) ; ottaa huomioon, että kaikki pitoisuudet, joita käytetään 4-tunnin YM-1 ja sen jälkeen 4-OHT-hoitoon, oli merkittävästi erilainen kuin 4 tunnin YM-1, sen jälkeen 95% EtOH hoitoon (kaikki p 0,05). Kaikki pitoisuudet 4 tunnin YM-1 ja sen jälkeen 4-OHT: ta, ja 48 tunnin YM-1 oli merkitsevästi erilainen (kaikki p 0,05), lukuun ottamatta 10 uM YM-1 pitoisuus (p 0,05). Olemme johtuvan puutteesta merkitys yleisen myrkyllisyyden aiheuttamia 48 tunnin 10 uM YM-1 (katso kuvio 3A B). Yksisuuntainen ANOVA ja YM-1 pitoisuus käyrän 4 tunnin YM-1 käsittely ja sen jälkeen 44 tuntia 4-OHT: ta hoitoa paljasti, että 10 uM pitoisuus oli merkittävästi erilainen kuin kaikki muut pitoisuudet (F (4,10) = 16.49, p = 0,0002) (kuvio 4C). Konsentraatio käyrä 4 tunnin YM-1 käsittely ja sen jälkeen 95% EtOH hoito näkyy, ettei pitoisuus oli merkittävä muista pitoisuus yksisuuntaisella ANOVA (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (kuvio 4D) . Vertailu kaikkien 48 tunnin YM-1 pitoisuudet, jonka yksisuuntainen ANOVA, näytetään, että jälleen 10pM pitoisuus oli merkittävästi erilainen kuin kaikki muut pitoisuudet tätä hoitoa (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007 ) (kuvio 4E). Jatkoimme analyysi vertaamalla 10pM YM-1 pitoisuus, mistä kaikissa hoitoryhmissä, jossa nolla hoitoon. Elinkelpoisuus arvot kaikista edellä mainituista hoidon olosuhteissa, joissa sisällyttäminen 4-OHT 48 tunnin hoito ja ajoneuvon hoitoja erillistä ryhmää, analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001). Tukeyn post-hoc-testi osoitti, että 4 tunnin YM-1 jälkeen 4-OHT oli merkitsevästi erilainen kuin 4-OHT 48 tuntia hoitoa (p 0,05), kun taas sekä 48 tunnin 10pM YM-1 ja 4 tunnin 10 uM YM-1, jonka jälkeen 95% EtOH hoidot eivät merkittävästi merkitystä tuotteen 4-OHT 48 tunnin hoito (kuvio 4F). Tämä analyysi osoitti myös, että 10 uM YM1 jälkeen 4-OHT merkittävästi erilainen 10gM YM1 seurasi 95% EtOH (p 0,05).

Nämä havainnot ehdotti, että vain 4 tunnin hoito 10pM YM -1 voisi uudelleen herkistää TR-MCF7-soluissa tamoksifeenia /4-OHT, estämällä solun kasvua aiheuttamatta ilmeistä toksisuutta. Mahdollinen mekanismit tämän ilmiön Sitten tutkitaan. Yksi uskottava mekanismi oli poikkeava kinaasiaktiivisuuden, jonka tiedetään edistävän tamoksifeenin vastus fosforyloimalla ERa at sivuston tiedetään edistävän estrogeeni itsenäistä toimintaa [14], [15], [16], [17], [18]. Käsittelimme TR-MCF7-soluissa, kuten on kuvattu kokeita kuviossa 4A B. Nuclear proteiinit eristettiin ja testattiin tasojen suhteen ERa pS167, sivusto, joka kun fosforyloidun Ilmaisee tamoksifeenia itsenäisyyttä. Itse asiassa, fosforylaatio ERa pS167 nostettiin, kun läsnä on 4-OHT: ta; kuitenkin, lisäämällä 10 uM YM-1 kumottu Tässä tapauksessa (kuvio 5A B). YM-1 ei muuttanut lokalisoituminen tumaan ERa tumaan (kuvio 5C C). Densitometria analyysi pERα ja ERa tasot näytetään% ajoneuvon käsittely ± SD (B B). Tämä viittaa siihen, että YM-1 voi aiheuttaa myrkyllisyyttä erityisiä syöpäsoluja, samanlainen kantayhdisteen MKT-077, mutta että YM-1 tekee siten vähentämällä pro-eloonjäämisen kinaasien kuten Akt, mikä saattaa johtaa muutoksiin resistenssimekanismeja tulenkestävät kasvaimia. Tämä data on samaa mieltä työn aikaisempi työ osoittaa, että vaikutukset LY294002, estäjä PI3K /Akt-signalointireitin estäjä, on tamoksifeeni: n indusoiman apoptoosin olivat spesifisiä inhiboimaan Akt-aktiivisuutta. [16]

MCF7-solut käsiteltiin jossa huomattava pitoisuudet YM-1 6 tuntia. Solut lysaatit analysoitiin Western blot (A). Densitometria analyysi Akt-1 ja Akt2 tasot esitetään% ajoneuvon käsittely ± SD (B).

Keskustelu

Tässä kuvataan terapeuttisten potentiaalin MKT-077 johdannainen, YM-1. Tämä yhdiste, joka on samanlainen MKT-077, oli erityisesti myrkyllisiä syöpäsoluja. YM-1 oli myös parempaa tehoa ja sytosolin lokalisointi kuin MKT-077. Lyhyt altistuminen YM-1 pystyi uudelleen herkistää tulenkestävä rintasyöpäsolujen tamoksifeenia, yhteinen hoito käytetty klinikalla. Tämä mekanismi osoitettiin olevan Akt riippuvaisen YM-1 pystyi vähentämään Akt tasolla sekä fosforylaation ERa klo Akt konsensus päällä. Nämä tiedot osoittavat mahdollisuuksia rhodacyanine johdannaisten hoidossa tulenkestävä syöpien.

On mahdollista, että sytosolin läsnäolo YM-1, vs. mitokondrio of MKT-077, ohjaa lisääntynyt myrkyllisyys ja Akt välys havaintoja YM -1. Vaikka mitokondrioiden näkökohtia MKT-077 ovat hyvin ominaista [1], [2], [3], viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että MKT-077 voi myös olla vuorovaikutuksessa sytosolin Hsp70 perheenjäsenten [22]. Jos MKT-077 kykenee estämään sytosolin Hsp70, koska se ei mortalin [4], [5], YM-1 voi inhiboida soluliman Hsp70. Hsp70: n estäjät ovat osoittaneet syövän spesifisyyden sekä kyky vähentää Hsp70 asiakkaan proteiinit [20], [23], [24], [25]. Olemme epäillä, että Hsp70 inhibitio voisi olla se mekanismi, YM-1; kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan.

tamoksifeenin hoitojen tyypillisesti menehtyvät resistenssin kehittymistä. Hankitut vastusten vie aikaa kehittyä. Tutkimuksemme ovat osoittaneet, että lyhyt käsittelyt YM-1 voidaan uudelleen herkistää tulenkestävä syöpien tamoksifeenia. Hyöty näin lyhyessä hoito on puute mahdollisuuden resistenssin YM-1 sekä itse pienentää todennäköisyyttä off-tavoite toksisuuksien. Lisäksi kyky kumota nykyisiä vastukset mahdollistaa uudelleen otaksuttu chemotherapies; estää tarve kalliimpaa ja mahdollisesti vaarallisia toisen ja kolmannen asteen hoitostrategioita. Lisäksi YM-1 hoito yksinään saattoi tappaa selektiivisesti vain tietyt syöpäsolut, mikä viittaa paitsi siedettävyyttä lähestymistavan lisäksi tarvitaan vielä luonnehdinta noin erityisiä solutyyppejä, jotka saattavat olla herkkiä näille yhdisteille ja Akt ehtyminen. Nämä hyödyt potilaille yhdistettynä suuri määrä syövän lajikkeiden liittyy Akt toimintahäiriö tarjoaa alustan jatkuvaa tutkimusta ja uusien yhdisteiden heikentävistä Akt manipuloimalla rhodocyanine telineen.

Vaikka muut kinaasien on tunnistettu fosforyloiduille ERa, Akt on merkittävä selviytymisen kinaasi, riippumatta resistenssifenotyyppi, ja sen puhdistuma saattaa tehostavat kemoterapeuttisten. Jos hypoteesia, että YM-1 on Hsp70-inhibiittori on tarkka, tämä tila voi johtua parannettu ubikitinaation Akt, kuten ubikitiinipromoottori ligaasia Akt, CHIP (karboksipäässä Hsc70 vuorovaikutuksessa proteiini) [26], tiedetään olevan vuorovaikutuksessa Hsp70 [27].

Nämä tutkimukset osoittavat, että tarvitaan lisää mekanistinen käsitys toimintatavan rhodacyanines. Pienet muutokset välillä MKT-077 ja YM-1 johtaa lisääntyneeseen sytosolin läsnäolo, joka pystyi säilyttämään samanlainen spesifisyys. Tämä viittaa siihen, että muutoksia tähän telineen voi saada tiettyjä myrkyllisyyttä tai vähentää munuaistoksisuutta, kuten havaittu kliinisissä ja laboratoriokokeilla [1], [2], [3]. Itse asiassa, meidän tiedot, jotka osoittavat lähes edullisesti tapetaan rintasyövän solujen, verrattuna muihin syövän solutyyppejä, viittaa siihen, että spesifisyys ja erityisesti kasvaimen lajikkeiden voitaisiin rakentaa osaksi rhodacyanine tukirakenteen.