Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant DNA: n metylaatio on havaittu kohdunkaulan syövän; mutta useimmat tutkimukset ovat käyttäneet ei-kvantitatiivinen lähestymistapa mitata DNA: n metylaatio. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää metylaation valikoidulle paneeli geenien aiemmin tunnistettu tavoitteet epigeneettiset hiljentäminen kohdunkaulan syövän ja geenien tunnistamiseen, joilla on kohonnut metylaatio voidaan erottaa syöpä normaaleista kohdunkaulan kudoksissa. Havaitsimme 49 naista, joilla oli invasiivinen okasolusyöpä kohdunkaulan ja 22 naisia, joilla oli normaali sytologia yksilöitä. Bisulfiitti-modifioitua genomista DNA monistettiin ja määrälliset pyrosekvensointi valmistunut 10 geenien (

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

WIF1

,

TIMP-3

,

DAPK1

,

WR

,

FHIT

, ja

SLIT2

). Metylointi Indeksi laskettiin keskimääräinen tiheyden metylaatio kaikilla CpG sivustot analysoitiin per geeni (~ 4-9 CpG) sarjaa kohti. Binäärinen cut pisteen määriteltiin klo 15% metylaatio. Herkkyys, spesifisyys ja ala ROC-käyrän (AUC) metylaation yksittäisissä geenejä tai paneelin tutkittiin. Mediaani metylaatio indeksi oli merkitsevästi korkeampi tapauksissa kontrolleihin verrattuna 8 geenejä, kun taas ei ollut eroa mediaani metylaation 2 geenejä. Verrattuna HPV ja ikä, yhdistelmä-DNA-metylaation tason

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

ja

WR

HPV ja iän merkittävästi parantunut AUC 0,79-0,99 (95% CI: 0,97-1,00,

p-arvo

= 0,003). Pyrosekvensointi analyysi vahvisti, että useat geenit ovat yhteisiä tavoitteita poikkeavalle metylaation kohdunkaulan syövän ja DNA: n metylaatio taso neljä geenien näyttää lisäävän spesifisyys tunnistamaan syövän verrattuna HPV havaitsemiseen yksin. Muutoksia DNA: n metylaatio spesifisten geenien kohdunkaulan syöpiä, kuten

DAPK1

,

WR

,

WIF1

, ja

SLIT2

, voi myös esiintyä aikaisin kohdunkaulan syövän synnyn ja pitäisi arvioida.

Citation: Siegel EM, Riggs BM, Delmas AL, Koch A, Hakam A Brown KD (2015) Quantitative DNA metyloituvuutta Candidate Genes in kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 10 (3): e0122495. doi: 10,1371 /journal.pone.0122495

Academic Editor: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut kokeellisen hematologian ja verensiirtoja, SAKSA

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 22 helmikuu 2015; Julkaistu: 31 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Siegel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tiedot taustalla havainnot tässä tutkimuksessa on saatavilla pyynnöstä eikä vapaasti saatavilla julkisessa arkistoon. Tiedot ei voi julkisesti saataville asettamien rajoitusten vuoksi meidän IRB hyväksynnän, mukaan lukien pieni otoskoko, joka voi vähentää potilaan nimettömyyden ja sisällyttäminen PHI sisällä aineisto on arvioinnissa hoitotuloksia. Lopullinen aineisto ja raaka pyrograms ovat saatavilla pyynnöstä seuraaville: Moffitt Cancer Center Information Shared Services Department ([email protected]) tai opintojakso päätutkijat: Erin M. Siegel (Assistant jäsen Department of Cancer Epidemiology Moffitt Cancer Center 12902 Magnolia Drive, Tampa, FL 33612) Sähköposti: [email protected], Kevin D. Brown (apulaisprofessori Biokemian ja molekyylibiologian University of Florida College of Medicine Gainesville, FL 32610) Sähköposti: [email protected] ( 352) 273-5458.

Rahoitus: Tuki tälle tutkimuksen antamien Floridan yliopiston-Moffitt Collaborative Grant (UF09060) ja National Cancer Institute 1RO3 CA143980-01 avustuksen EMS ja KDB. Tätä työtä tukivat osittain Tissue Core Facility ja Collaborative Data Services Core Facility H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, joka on NCI nimetty Kattava Cancer Center, alle lupanumeroon P30-CA76292. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset geenien kautta tiheä DNA metylaation CpG-saarekkeiden on osoitettu esiintyvän useissa kasvaintyypeissä, kuten ihmisen papilloomaviruksen (HPV) -associated kohdunkaulan syövän [1]. Tuumorisuppressorigeeneille (APT), jotka ovat selkeitä merkitys patogeneesissä kohdunkaulan syöpä ovat yhteisiä tavoitteita geenien tässä sairaudessa [2,3]. Tunnistaminen paneelin poikkeavasti metyloitua APT, jotka edustavat laajaa kirjoa kasvaimen ehkäisevästä toimintojen (

i

.

e

., Solusignalointia, geenin transkription, solusyklin, apoptoosin, ja soluadheesion ) on suuri lupaus tarjota tehokas joukko DNA: n metylaatio biomarkkereita käytettäväksi taudin diagnosointiin ja /tai prognoosi [4].

koodaavat geenit useita keskeisiä säätelijöitä onkogeenisel- Wnt /β-kateniinin reitin, kuten

CDH1

(E-kadheriinin),

APC

, ja

WIF1

, usein vaiennetaan kautta tiheä metylaatio niiden promoottorin alueiden kohdunkaulan syövän [5]. Esimerkiksi

CDH1

geeni hypermetylaation on havaittu useimmissa ensisijaisen kohdunkaulan kasvaimia ja huomattavan määrän korkealaatuisesta CIN-3 (CIN3), mikä viittaa siihen, että epigeneettiset asema tämän geenin on potentiaalia sovellus biomarkkerina kohdunkaulan pahanlaatuisen [6]. Muita geenejä kuulemma hypermetyloitunut kohdunkaulan syövän juurikaan ole metylaatio normaalissa tai huonolaatuisen CINs sisältävät

DAPK1

[7,8],

WR

[8,9],

TIMP-3

[10], CCNA [11] ja

FHIT

[7]. Kuitenkin on ollut epäjohdonmukaisuuksia raportoitu esiintyvyys DNA hypermetylaation useiden TSG sisällä kohdunkaulan syöpiä [2,12], joka voi johtua muiden kuin määrällisiä menetelmiä havaitsemiseksi metyloinnin.

Toistaiseksi suurin osa tutkimuksista tutkitaan epigeneettiset hiljentäminen tapahtumien kohdunkaulan syöpä ovat luottaneet puolikvantitatiivinen tai laadullisia lähestymistapoja pisteet geenin metylaatio [2], kuten metylaatiospesifisen PCR (MSP) tai puolikvantitatiivinen MSP (QMSP) [13]. Nämä analyysit on raportoitu yliarvioida esiintyvyyden poikkeavien metylaation joillekin merkki loci, erityisesti heterogeenisissä populaatioissa DNA [4]. Viimeisen vuosikymmenen aikana, bisulfiitti pyrosekvensointi on noussut kvantitatiivinen mittausmenetelmä DNA: n metylaatio yksittäisiin CpG sivustoja populaation DNA-molekyylien [14,15]. Pyrosekvensointi voidaan käyttää erilaisia ​​biologisia näytteitä (

i

.

e

. Formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE), jäädytetty, kudos naarmuilta,

jne

. ), mikä tekee tästä lähestymistavasta myöntyväinen käyttää kliinisessä [4]. Tähän mennessä on ollut hyvin vähän tutkimuksia DNA: n metylaation kohdunkaulan syövän tällä erittäin tarkka, kvantitatiivinen määritys [16].

Tätä tutkimusta varten valitsimme joukon 10 APT (

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

WR

,

SLIT2

,

TIMP-3

,

ja WIF1

), joka perustuu kyselyn kirjallisuudessa, oli aiemmin osoitettu olevan tavoitteita poikkeava DNA: n metylaation kohdunkaulan syövän mutta ei kattavasti testattu kvantitatiivisia menetelmiä. Lisäksi geenin tuotteet toimivat monissa eri biologisia polkuja, joista kukin on osoitettu vaikuttavan HPV: hen liittyvän kohdunkaulan syövän synty [2]. Nämä geenit tehtiin pyrosekvensointi analyysi näytteistä okasolusyöpä (SCC) kohdunkaula ja normaali kohdunkaulan soluissa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää geenin metylaatio tapahtumia käyttökelpoinen erottavien syövän normaaleista kohdunkaulan soluja, jotka voidaan mahdollisesti lisätä standardin diagnostiikkatestiään kohdunkaulansyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasvalinta ja data

Käyttämällä tapaus-verrokki suunnittelu tunnistimme 49 naisten invasiivisen SCC syöpä jotka olivat taajuus Hyväksytty iän ja etnisen naisille, joilla oli normaali sytologia yksilöt (valvonta). Tapaukset olivat mukana, jos heillä oli (1) kirurgisen vuosien 1991 ja 2006 Moffitt Cancer Center, (2) arkistoitu FFPE kasvainkudospalasta, ja (3) ei sädehoitoa ennen leikkausta. Ohjauskalusteille, keräsimme normaalit kohdunkaulan soluja naisten normaali sytologia ja korkea todennäköisyys olla HPV positiivisia. Lyhyesti, nestepohjaisia ​​sytologia (LBC) yksilöt (N = 22) kerättiin naisia, jotka suostuivat osallistumaan tutkimuksemme aikana klinikalla vierailu joko korkean riskin sukupuolitauti klinikan klo Hillsborough County Health Department tai kolposkopia klinikalla at Tampa General Hospital, Tampa, Fl. Tutkimme myös joukko normaali kohdunkaulan formaliinikiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) korttelin päässä naisia ​​arkistoitu naisilta, joilla oli diagnosoitu joko hyvänlaatuinen pehmytkudoksen kohdun sileälihaskasvain (N = 15) tutkia metylaatiotasoilla poikki kudosten suojelumenetelmiä (LBC vs. FFPE). Kaikki kudokset patologisesti tai sytologisesti tarkistetaan ja tarvittaessa kasvain vaiheessa laatu, ja histologiset diagnoosi vahvistettiin. Kliinis ja tulosten tiedot saatiin Moffitt Cancer Registry.

Ethics lausunto

Kaikki tutkimuksessa toimintaa ja lupamenettelyjen hyväksyi Institutional Review Board yliopistossa South Florida (IRB # 102998) . FFPE kudosta korttelin päässä tapausten ja kontrollien kerättiin osana kliinistä hoitoa. Luopuminen tietoisen suostumuksen hyväksyttiin käyttöön de-tunnistettu arkistoidut kudoksista naisilta, jotka eivät antaneet tietoisen suostumuksen, jonka University of South Florida IRB. Oli mahdotonta saada suostumus hyödyntää jäljellä yksilöiden tunnistettu tähän tutkimukseen, jotka olivat kaikki vähintään 5-vuotias, kun on saatu. Naiset toimitti kirjallisen tietoisen suostumuksensa IRB hyväksytty suostumuslomakkeesta keräämiseksi nestepohjaiseen sytologian näytteet (N = 22).

DNA Isolation ja Extraction

FFPE kudokset macrodissected kolmesta 10gM paksummat kohdat ja DNA eristettiin käyttäen Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Valencia, CA) valmistajan protokollan. LBC yksilöitä, alikvootti 1-4 ml PreservCyt sentrifugoitiin ja DNA uutettiin pelletoidut solut käyttämällä Qiagen QIAmp DNA Mini Kit (Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA: n konsentraatio määritettiin käyttäen NanoDrop1000 Spektrofotometri (Wilmington, DE).

HPV-DNA Detection ja kirjoittaminen

INNO-LiPA HPV genotyypin Extra AMP (Innogenetics, Belgia) suoritettiin monistamaan 65 -bp fragmentti käyttäen SPF

10 PCR asetettu mukaan valmistajan ohjeiden. SFP

10 amplimerit HPV-positiiviset näytteet analysoitiin sen jälkeen kääntää hybridisaatiolla HPV kääntää hybridisaatio- liuskahybridisaatiomääritys (LiPA). LiPA- määritys havaitsee 13 karsinogeenisia (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, ja -68), 3 luultavasti karsinogeenisia (HPV-53, -66, ja -70) ja 9 ei-karsinogeenisia HPV-tyypit (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44, -54, ja -74) [17]. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit sisälsivät DNA HeLa solulinjoista, vesi ja positiivisesta kontrollinäytteestä sisältyy sarjaan.

pyrosekvensointi

Natrium bisulfiittikonversion perimän DNA: (10 ug) suoritettiin käyttäen EZ DNA Metylointi -Suora kit (Zymo Research, Orange, CA) valmistajan suositusten mukaisesti. Kvantitatiivinen DNA: n metylaatio analyysi suoritettiin pyrosekvensointi kuten aiemmin on kuvattu [18]. Segmentit geeneistä monistettiin bisulfiitti-muunnettu DNA PCR: llä käyttämällä alukkeita merkitty S1 taulukossa. Eristämistä varten yksijuosteisen amplikoni, reverse-aluketta käytetään kaikissa PCR-reaktioissa syntetisoitiin biotiiniosa on 5′-päähän. Lyhyesti, PCR suoritettiin 30 ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 1 ui bisulfiitti-modifioitu DNA-templaattia, PyroMark PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), Coral Load Concentrate, 25 mM MgCl

2 ( ja SLIT2), 10 uM kutakin geenispesifisestä eteenpäin ja taaksepäin-aluketta. Lämpövuorottelu suoritettiin käyttäen seuraavia yleisiä ehtoja: 95 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi 50 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 47-55 ° C: ssa 30 sekuntia, 72 ° C 1 min ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 min. Monistuksen jälkeen 5-20μl PCR-tuotetta sekoitettiin streptavidiini-konjugoitua Sepharose-helmiä (GE Healthcare) sitomispuskuriin (Qiagen, Germantown, MD) ja laimennettiin 60-80μl kokonaistilavuus dH

2O. Helmet jälkeen kerättiin tyhjiössä valmisteen työasema, sekvensointialuke (S1 taulukko) lisättiin, ja kuumennettiin 80 ° C: ssa 2 min. Sekvensointi aluketta biotinyloituun DNA-säikeen, kun reaktioseos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Näytteet pyrosequenced käyttäen PyroMark MD järjestelmän ja CpG metylaation mitataan PyroMark CpG-ohjelmisto. Kaikki pyrosekvensointi suoritettiin keskimäärin kaksi itsenäistä PCR-reaktioissa. Kontrollit sisälsivät pyrosekvensointi analyysi yleisesti metyloitua ihmisen genomista DNA: ta (CpGenome DNA, Millipore, Billerica, MA), metyloimattoman ihmisen genomista DNA: ta (ihmisen sperma DNA: ta), ja ilman DNA: ta templaattina lisättiin pyrosekvensointi reaktion.

Tilastollinen analyysi

erot tapauksessa ja säätöominaisuudet testattiin käyttämällä Pearsonin Chi

2, Fishers ”Tarkka tai Opiskelijan T-testi. Metylointi Index (MI) laskettiin keskimääräinen tiheyden metylaatio kaikilla CpG sivustot analysoitiin per geenisekvenssin (~ 4-9 CpG sivusto). Spearmen sijoitus korrelaatiokerroin kanssa Bonferoni korjattu

p-arvo

käytettiin sen määrittämiseksi, MI korreloivat geenien välillä. Erot MI tapausten ja kontrollien välillä, yleinen ja ositettu iän ( 44-v. Vs. ≥ 44 v) ja HPV-tila (positiivinen vs. negatiivinen), määritettiin käyttämällä Mann-Whitneyn testi. Herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus [ala (AUC)] MI erotella tapausten ja kontrollien tutkittiin. Arvioimme vähitellen lisäarvo DNA: n metylaatio tasolla ennustemalleja, jotka sisälsivät tunnettuja riskitekijöitä kohdunkaulan syöpä, ikä (jatkuva) ja HPV-positiivisuuden (mitä tahansa vs. mitään) hyödyntävä menetelmä, Janes

et al

. [19]. Ensinnäkin, logistinen regressio malleja sovi ja ilman metylointi muuttujia; niihin liittyvät ennustetut arvot kaikkien aineiden sisällä aineisto lasketaan kustakin mallista ja piirretään. Testasimme tasa kahden ROC käyrät käyttäen STATA roccomp komento (Stata v12.0) [20]. Binary cut-pistettä luokitella geeniä metyloitu määriteltiin käyttämällä

a priori

cut-pisteen MI 15%. Kriteerit sisällyttäminen DNA metylaatio geenin paneeli olivat: (1) merkittävät MI eroja tapausten ja kontrollien välillä; (2) MI ei merkittävästi vastaavuussuhteessa eri geenit (Rho 0,65); jos Rho≥0.65, vain yksi geeni on mukana; ja (3) AUC 0,60 MI 15% erottaa tapauksia valvontaa.

joukossa tapauksia, arvioimme yhdistyksen välillä metylaatio (geenejä tai geenin paneeli) ja taudista vapaan (DFS) ja kokonaiseloonjääminen ( OS). DFS määriteltiin diagnoosista vasta ensimmäinen uusiutumisen, toisen kasvain tai kuoleman takia kohdunkaulan syövän ja OS kuten diagnoosista kuolinpäivä. Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet ja monimuuttuja Coxin regressiomallien tutkitaan yhdessä DFS ja OS, kontrolloiden tiedossa ennustetekijät (esim paikallisesti pitkälle (≥Stage lib2), luokka, ikä, hoito ja HPV). P-arvo 0,05 (kaksipuolinen) katsottiin merkitseväksi. Kaikki analyysit tehtiin käyttäen Stata /MP versio 12,1 (StataCorp LP, College Station, TX, USA).

Tulokset

Ominaisuudet tapauksista (N = 49) ja hallintalaitteet (N = 22) on esitetty taulukossa 1. keski-ikä tapauksissa oli hieman korkeampi kuin kontrolleilla (47 ± 15 vuotta

vs

. 43 ± 16 vuotta, vastaavasti); kuitenkaan tämä ei ollut merkittävää eroa (

p-arvo

= 0,32). HPV-DNA havaittiin 96% (47/49) tapauksista ja 55% (11/22) valvonnan (

p-arvo

0,0001). Niistä tapauksista, 88% kasvaimista oli HPV-16 tai -18 positiivisia verrattuna 14% valvonnan. Viisikymmentäyksi prosenttia tapauksista oli varhaisessa vaiheessa diagnoosin (vaihe IA1 /1B1), kun taas 41%: lla oli paikallisesti edennyt sairaus (vaihe 1B2 tai korkeampi).

kvantitatiivinen DNA metylointianalyysi

DNA: n metylaatio sisällä

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

WR

,

SLIT2

,

TIMP-3

,

ja WIF1

geenejä, joista kukin on aiemmin osoitettu olevan kohde poikkeavalle DNA: n metylaatio kohdunkaulan syövän [2], kvantifioitiin pyrosekvensointi. Tämä menetelmä määrällisesti, kohdennettuun genominen alue 30-50bp, prosentuaalisen metylaatio yksittäisiin CpG sivustoja populaation DNA-molekyylejä. Tiheä sytosiini metylaation CpG-saarekkeiden ja erityisesti välittömässä läheisyydessä transkription aloituskohdasta (TSS), liittyy haitattu kokoonpano pohjapinta transkription koneen sisällä ytimen promoottori johtaa tukossa transkription aloittamisen ja geenien [21]. Siten pyrosekvensointi määritykset kehittämä ryhmämme oli suunniteltu mittaamaan sytosiinin metylaatio, tai lähellä, TSS (kuvio 1). Rajoitteita, kuten nukleotidisekvenssin alueen analysoitavan ja tekniset näkökohdat määrityksen (

i

.

e

., Vahvistus /sekvenssointialukkeiden saa sisältää CpG dinukleotideissä, tehokas ja spesifinen PCR vahvistus,

jne

.) lopulta vaikuttanut alueen määritettiin kunkin geenin meidän paneelissa. Kaikki pyrosekvensointi määritykset Tässä tutkimuksessa käytetyt kehitettiin ryhmämme ja ei ole aiemmin kuvattu, paitsi kaupallisesti saatavilla määritys

DAPK1

. Kuvio 1 havainnollistaa geeni arkkitehtuuri (

i

.

e

., Sijainti ja koko CpG-saarekkeen, alue ja useita CpG dinukleotidejä analysoitu) ja tarjoaa edustavan pyrogram kutakin geeniä ilmaisevat prosenttia metylaatio kunkin CpG tutkittiin. DNA: n metylaatio indeksi (MI) laskettiin keskiarvo metylaatio kaikkien CpG sivustoja alueella sekvensoidaan pyrosekvensointi.

Illustrated on genomi-arkkitehtuuri kunkin lokuksen tarkastellaan tässä tutkimuksessa. Mukana on suhteellinen sijainti eksonin 1 transkription aloituspaikan (TSS), joka liittyy CpG-saarekkeen, ja alue määritettiin metylaation pyrosekvensointi. Lisäksi esitetään edustava pyrogram ja mitataan sytosiini metylaatio kussakin CpG analysoidaan suunniteltu pyrosekvensointi määrityksessä. Geenit analysoitiin ovat

APC

(A),

CDH1

(B),

CCNA

(C),

CDH13

(D),

FHIT

(E);

WR

(F);

SLIT2

(G);

TIMP-3

(H);

WIF1

(I) ja

DAPK1

(J).

Yleisesti löysimme kaikki pyrosekvensointi määrityksissä toimivan hyvin, joilla on alhainen määritys keskeyttäneiden määrää, korkea sisäiset luokan korrelaatiokertoimet (ICC), ja jatkuvasti korkea metylaatiotasoilla varten positiivisia kontrolleja. Havaitsimme hyvin alhainen keskeyttäneiden määrää (≤1%) testeissä, joissa PCR-amplikonit 190 bps kooltaan. Poikkeuksena oli suunniteltu

TIMP-3

määritys, jossa törmäsimme ~ 6% vikaantumisaste monistamaan kohdealueen ja ~ 8% vikaantumisaste saamiseksi pyrosekvensointi riittävän laadukkaita tietoja. APC, joka oli amplikonin koko 194 bps, oli myös virhetaajuus täydentää suunnattu alue ~ 6%; kuitenkin kaikki amplikonit syntyy laadukkaita pyrosekvensointi data. Saimme korkealaatuista dataa ≥90% potilaan näytteitä, joissa on vain yksi näyte ulkopuolelle riittämättömien DNA monistamista. ICC varten pyrosekvensointi määrityksissä oli 0,94 kaikille geenit paitsi FHIT (ICC = 0,69), joka oli alhainen ja niiden välillä persoonan vaihtelu (1,41 ja 2,11, tässä järjestyksessä). Lopuksi positiivinen kontrolli täysin metyloitua DNA johdonmukaisesti metyloitua kaikissa pyrosekvensointi määrityksissä ja erissä (keskiarvo ± SD = 90 ± 6%). Kun kyseessä on

CCNA

, tutkimuksemme sisältää analyysin 20 tapauksissa ja 22 ohjaa (taulukko 2), riittämättömän määriä DNA täydellinen tutkimus tämän geenin kaikissa näytteissä.

metylaatiotasoilla poikki CpG sivustojen geenin sisällä olivat suhteellisen vakaana esitetty S1 kuviossa varten

DAPK1

,

WR

,

ja SLIT2

. Kuviossa 2 on esitetty jakauma MI (

i

.

e

., Mediaani ja neljännespisteiden väli) kunkin geenin tutkinut pyrosekvensointi. Mediaani MI oli merkitsevästi korkeampi DNA kerättiin SCC yksilöitä verrattuna DNA normaali sytologia yksilöiden 8 ulos 10 geenien tutkittu (

DAPK1

,

WR

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

APC

,

CDH1

, ja

FHIT

). Kääntäen,

CDH13

, ja

TIMP-3

osoittanut mitään merkittävää eroa mediaani MI tapausten ja kontrollien välillä. Taulukossa 2 esitetään yksityiskohtainen yhteenveto MI kaikkien geenien tapauskohtaisesti tilan. Kontrollien joukossa, mediaani MI oli alle 5% kaikkien geenien paitsi

TIMP-3

(12,4%) ja

SLIT2

(7,1%) ja metylaatiotasoilla yli 15% havaittiin vain kaksi geenien (

TIMP-3 ja CDH13)

. Niistä tapauksista, mediaani MI oli 10%

DAPK1

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

ja TIMP-3

(taulukko 2). Mikä korostaa epäyhtenäisyys DNA: n metylaation syöpäsoluissa, mittasimme monenlaisia ​​MI useiden geenien kaikissa tapauksissa analysoitiin. Esimerkiksi mediaani

DAPK1

MI oli 12% vaihteluvälin ollessa 1%: sta 96%. Testasimme mahdollisen korrelaation metylaatio geenien välillä ja vain

SLIT2

ja

CCNA

osoitti merkittävää korrelaatiota (Rho = 0,68;

p-arvo

0,001).

Geenit tilataan Mann-Whitney

p-arvo (

** p-arvo 0,0001 ja * p-arvo 0,05). Metylaatio indeksi (MI) kunkin geenin on esitetty normaalin kohdunkaulan näytettä (N) ja syövän (T) kuin boxplot. Viikset on boxplot merkki 5

th ja 95

th persentiilit, laatikko merkitsee 25

th (alhainen rajan laatikko), mediaani, ja 75. (ylärajan laatikko) persentiilit, ja ääriarvoihin (●).

Tutkimme jos DNA metylaatiotasoilla vaihteli iän ja HPV tila. Kaiken mediaani

WR

,

CDH1

,

ja CDH13

metylaatio oli yleisempää ohjaus naisilla ≥ 44 vuoden ikä (

p-arvo

= 0,02

p-arvo

= 0,01, ja

p-arvo

= 0,04, vastaavasti). Merkittäviä eroja mediaani metylaatio tapausten ja kontrollien välillä säilyi, kun ositettu iän ( 44 vuoden iässä tai ≥44 vuotta)

DAPK1

,

WR

,

CCNA ja WIF; kun taas SLIT2

,

APC

,

CHD1 ja FHIT olivat vain merkittävästi erilaisia ​​nuorempien tapausten ja kontrollien

(tuloksia ei ole esitetty). Kontrollien joukossa, DNA MI oli samankaltainen HPV positiivisia ja HPV negatiivisia naisia. Lisäksi, kun rajoittaminen HPV-positiivisten tapausten ja kontrollien, löysimme hyvin samanlaisia ​​tuloksia mediaani eroja metylaation ja herkkyys /spesifisyys (tuloksia ei ole esitetty).

metylaatiotasoilla erottaa asiat päässä Controls

käyttämällä konservatiivinen

a priori

kynnys MI 15% määritellä geenin metyloitu,

DAPK1

geeni luokiteltiin metyloitavaa 44% tapauksista ja 0% valvonnan.

SLIT2

ja

WR

metyloitiin enintään 15% 61% ja 23%: ssa tapauksista, eikä yksikään valvontaa. Käyttämällä MI 15%,

DAPK1

ja

SLIT2

oli 100% ja spesifisyys 43% ja 61% vastaavasti herkkyyttä (taulukko 3). Kahta lukuun ottamatta kaikki geenit oli korkea spesifisyys (100%) ilman valvontaa luokiteltuja metyloitu yli 15% (

i

.

e

., Ei vääriä positiivisia). Seuraavaksi tutkimme, onko DNA MI mitattujen yhdistelmä geenien paransi erottamista ryhmiä. Paneeli Geenien valittiin käyttämällä

a priori

kriteerit (katso materiaalit ja menetelmät). Niistä 8 geenien merkittävästi suurempi MI tapauksissa, (1)

CCNA

jätettiin vuoksi merkittävää korrelaatiota

SLIT2

ja (2)

APC

,

CDH1

ja

FHIT

jätettiin koska alhainen AUC ( 0,60). Jäljellä olevat geenit (

DAPK1

,

WR

,

SLIT2

ja

WIF1

) arvioitiin niiden kyky tunnistaa kohdunkaulansyövistä suhteessa HPV infektio ja ikä. Arvioimme Lisäysarvo lisäämällä DNA: n metylaatio tasoa ennustemalleja että mukana tunnettuja riskitekijöitä kohdunkaulan syövän, ikä (jatkuva) ja HPV-tila (positiivinen vs. negatiivinen) käyttäen menetelmää, Janes

et al

. [19,20]. ROC malli tahansa HPV-infektio (kyllä ​​vs. ei) ja ikä (jatkuva) oli ennustettu AUC 0,79. Käyttäen tämän viittaukseksi, me tilastollisesti verrattuna ennustettu AUC malleja, jotka lisätään DNA MI neljän geenien kaikissa yhdistelmät. Yhdistelmä

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

ja

WR

(jatkuva) paransi ennustettu AUC +0,79-,98 (95% CI : +0,97-+1,00,

p-arvo

= 0,002) (kuvio 3) tunnistaa tapaukset kontrolleja. Määriteltäessä positiivinen Metylointia MI 15%, yhdistelmä

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

ja

WR

(none

vs

. 1-4 geenit 15% metyloituja) oli korkein herkkyys (90%) ja spesifisyys (100%), jossa AUC 0,95 (95% CI: 0,91-0,99).

ROC ennustettujen herkkyyden ja 1-spesifisyys, kun DNA MI varten

DAPK1

,

WR

,

SLIT2

ja

WIF1

geenit lisättiin malliin HPV asema ja ikä. Testi on tasa-arvon AUC HPV ja ikä (AUC = 79%, katkoviiva) verrattuna metylaatio indeksi

DAPK1

,

WR

,

SLIT2

ja

WIF1

, HPV, ja ikä (AUC = 98%, yhtenäinen viiva),

p-arvo

= 0,0002.

Gene metylaatio, kasvain Ominaisuudet ja Patient Survival

Kohdunkaulan syöpä tapausta ei todettu vuosina 1993 ja 2001, joiden mediaani seuranta-aika oli 5 vuotta (2,4 kuukautta-17 vuotta).

TIMP-3

luokiteltiin poikkeavasti metyloitua ( 15%) useammin huonosti eriytetty kasvaimet verrattuna hyvin kohtalaisen eriytetty (63% vs. 8%;

p-arvo

= 0,004).

DAPK1

oli useammin metyloitu (MI 15) paikallisesti edennyt kasvaimia (vaihe 2B2) (65% vs. 22%,

p-arvo

= 0,007). Oli suuntaus korkeamman

DAPK1

metylaatio kasvaimissa uusiutui distaalisesti (mediaani MI = 36%) verrattuna niihin, jotka eivät koskaan uusiutunut (mediaani MI = 13%) tai uusiutunut paikallisesti (mediaani MI = 5%) (

p-arvo

= 0,08). Mediaani DFS ja OS oli 10,3 vuotta ja 8 vuotta, vastaavasti. Ei ollut merkittäviä assosiaatioita yksittäisten geeni metylaatio tai määritelty paneeli geenien (

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

ja

WR

) ja DFS tai OS (tuloksia ei esitetty).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytettiin määrällistä pyrosekvensointi mittaamaan tasoa DNA: n metylaation 10 TSG normaalissa kohdunkaulan ja kohdunkaulan syöpä yksilöitä. Sen käyttöönoton jälkeen, tämä tekniikka on tasaisesti saavuttanut puolesta, koska edullinen mittausväline DNA: n metylaatio [14]. Useat tutkimukset ovat arvioineet sekä tarkkuuden ja pyrosekvensointi analysointiin DNA: n metylaation heterogeenisissä seoksia DNA. Käyttämällä määritelty suhteet metyloitua ja metyloimattomien DNA, Murphy

et al

. [22] mitattiin tasaisen korkea Pearsonin korrelaatiokertoimet (R

2 0,99), kun korreloidaan mitattuna

vs

. laskettu DNA metylaation paneelin geenejä. Näistä ja muista vastaavista tutkimuksista [23,24], pyrosekvensointi on johdonmukaisesti osoittautunut mitata CpG metylaation heterogeenisiä seoksia DNA. Reed

et al

. [23] havaittiin, että mitattaessa DNA-metylaation sisältäviin seoksiin alhainen (alle 10%) CpG metylaatio, pyrosekvensointi yleisesti hieman liian suuria DNA: n metylaatio, joka on yhdenmukainen saatujen tulosten muiden ryhmien [22,24]. Esimerkiksi, olemme Metylaation arvot vaihtelevat 0-4% CpG metylaatio, kun metyloitumattoman ohjaus DNA-näytteet (ihmisen sperma genominen DNA) analysoitiin

APC

geenin metylaatio (tuloksia ei ole esitetty). Tämä vaihtelu analysointiin alhainen DNA: n metylaatio, joka on samanlainen kuin yhdistetyn bisulfiittimodifiointi Restriction Analysis (COBRA), pyydetään Colella

et ai

. [14] ehdottaa vähintään 10% metylaation kynnys soveltaa julistaa geenin metyloitu. Tästä johtuen huoli, me hyödyntää

ennalta

taso 15% luokitella geenien metyloitu.

käyttö kvantitatiivisia menetelmiä määrittää DNA metylaatiotasoilla on kriittinen tarkasti luokitella metylaatio status. Ei- ja puolikvantitatiivinen arviointiin käytetyistä DNA metylaatio yliarvioivat metylaatio esiintyvyys johtaa suuri määrä vääriä positiivisia (

i

.

e

. Alhainen spesifisyys). Tämä yliarviointi on ilmeistä se, että geenit aikaisemmin raportoitu metyloitavaa kohdunkaulan syövän käyttäen muita tai puolikvantitatiivinen menetelmiä oli hyvin alhainen metylaation mitattu pyrosekvensointi määrityksissä käytettiin tässä tutkimuksessa (

i

.

e

. 10% metylaation). Esimerkiksi keskimääräinen metylointi taajuus raportoitu

CDH1

(58%, vaihteluväli: 0-91%) [2] on suurempi kuin tässä tutkimuksessa havaittu, jossa ei havaittu kasvaimia metyloitiin suurempi kuin 10%. Niistä tutkimuksista, joissa käytettiin puolikvantitatiivinen menetelmillä [6,10,25], Wisman

et al

. myös raportoitu ei metyloinnin

CDH1

SCC [25]. Shivapurkar

et al

. raportoitu mediaani prosenttia Metylointia 3,65 (Range 0-53%); kuitenkin, kun niitä sovellettiin yhteistä QMSP cut pisteen luokitellessaan geeni kuten metyloitu (PFM 0), 89% kasvaimista luokiteltiin ottaa

CDH1

metyloitu [6]. Tämä korostaa potentiaali yliarviointi

CDH1

metylaation esiintymistiheys kohdunkaulan syöpä. Havaitsimme, että vain 7% tapauksista ja mikään valvonta oli

APC

MI 15%, joka on samanlainen kuin kaksi tutkimusta, jotka käytetään QMSP mittaamaan

APC

metylaatio [25,26] ja eroaa Yang

et al

. joka ilmoitti, että 63% kohdunkaulan syövän metyloitiin [9]. Taajuus DNA: n metylaatio raportoitu

FHIT

käyttäen MSP oli 39% (alue 8% -80%) [7,27-29]; kuitenkin samanlainen havaintomme, Wisman

et al

. raportoitu puuttumisen

FHIT

metylaatio SCC käyttäen QMSP [25].

CDH13

metylaation QMSP on raportoitu esiintyvän 40% ja 82% kasvaimista [2], joka eroaa havaintomme 6% kasvainten MI yli 15%.

pyrosekvensointi analyysi vahvisti aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

ja

WR

geenit ovat yhteisiä tavoitteita poikkeavalle metylaation kohdunkaulan syövän [8, 9,25,27-32].

DAPK1

geeni koodaa kalmoduliinia riippuvainen seriini-treoniini-kinaasi, jolla on positiivinen välittäjä gamma-interferoni indusoi solukuolemaa [33] ja

DAPK1

hiljentäminen ajatellaan tuottavan apoptoosin kestävä /pro-eloonjäämisen fenotyyppi [34]. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että

DAPK1

metylaatio oli yksi parhaista yleistä ennustajia kohdunkaulan syöpä.