Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant kinaasiaktivaatiota johtuvat mutaatiosta, vahvistus tai translokaatio voi ajaa kasvua ja selviytymisen osajoukko ihmisen syövän.

FGFR2

monistetaan rinta- ja mahasyövän, ja raportoimme tässä ensimmäinen luonnehdinta

FGFR2

geenivahvistus peräsuolen syövän NCI-H716 peräsuolen syövän solulinja.

FGFR2

ilmentyy voimakkaasti ja aktivoitu NCI-H716-soluissa, ja FGFR selektiiviset pienmolekyylisalpaajien tai FGFR2 shRNA esti voimakkaasti solujen elinkelpoisuuden

in vitro

, mikä osoittaa ”riippuvuus” NCI-H716-solujen FGFR2. NCI-H716 kasvua ksenograftimallia myös estää tuomalla FGFR pienmolekyylisalpaaja-. FGFR2 tarvittiin aktivointia varten useiden alavirran signalointia proteiinien, mukaan lukien AKT, ERK, S6RP ja NFKB. Esto loppupään kinaasien kuten AKT tai ERK yksin ollut vähäinen vaikutus proliferaatioon, kun taas yhdistetty inhibitio AKT ja ERK signalointi johtivat elinkelpoisuuden samanlainen FGFR2 estymiseen. Tunnistimme koholla

FGFR2

ilmaisun pienessä määrässä ensisijainen peräsuolen syöpä, mutta

FGFR2

vahvistusta ei havaittu. Vaikka

FGFR2

vahvistusta ei ole yleinen ensisijainen paksusuolensyöpä tai imusolmuke ja maksametastaaseista, muut subsets kolorektaalisyövän kuten askites, josta NCI-H716 solulinja saatiin, ei ole vielä testattu. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kehittyvien FGFR estäjä hoitomuotoja voi olla tehoa osajoukko paksusuolensyöpä ohjaavat

FGFR2

vahvistusta.

Citation: Mathur A, Ware C, Davis L, Gazdar A, Pan BS , Lutterbach B (2014)

FGFR2

monistuu NCI-H716 peräsuolen syövän Cell Line ja tarvitaan kasvun ja Survival. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10,1371 /journal.pone.0098515

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 helmikuu 2014; Hyväksytty: 02 toukokuu 2014; Julkaistu: 26 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Merck Research Labs. Rahoittaja antoi tukea muodossa palkkojen tekijöille (AM, CW, LD, BP, BL), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät paitsi AG ovat työntekijöitä Merck Research Labs. AM, CW, LD, BP, ja BL on kilpailevien etujen työntekijöinä Merck, mutta toteaa, että tämä kuuluminen ei muuta niiden noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Ei ole mitään rajoituksia tietojen jakaminen ja /tai materiaaleja.

Johdanto

Advanced, myöhäisessä vaiheessa peräsuolen syöpä liittyy merkittävä kuolleisuus ja edelleen lääketieteellinen tarve. Varhainen diagnoosi johtaa erittäin suotuisa ennuste, niin että vaihe 1 ja vaihe 2 tautia on 80-90% viisi vuotta selviytymisen. Sen sijaan vaihe 3 ja vaihe 4 etäpesäkkeitä liittyy viiden vuoden pysyvyys 60% ja 8%: lla [1]. Geneettinen poikkeamia syntyvät alkuvaiheessa tauti kuuluu

APC

mutaatioita, kun taas

KRAS, BRAF, p53

, ja

PIK3CA

mutaatioita esiintyy myöhemmissä vaiheissa kasvaimen kehitystä [2] – [4]. Kuitenkin, nämä geenin mutaatiot eivät vaikuttaneet kolorektaalisyövän hoitoon, koska ne ovat joko toiminnan menetys mutaatioiden (

APC, p53

) tai jotka eivät ole herkkiä MEK tai PI3K-estäjien (

BRAF, KRAS, PIK3CA

). Vaikka tyrosiinikinaasin vahvistus, translokaatio, tai mutaatiot eivät ole yleisiä kolorektaalisyövässä,

EGFR

vahvistus löytyy osajoukko peräsuolen syöpiä, [5], [6]. EGFR estävä vasta kuten Setuksimabi voi johtaa vastauksia ja eloonjäämisen hyödyn

KRAS

villityyppiseen syöpiin, mutta rooli

EGFR

vahvistusta ei ole selvää, [7].

ErbB2-

vahvistus on myös raportoitu [6], [8], ja voi liittyä vastauksena trastutsumabi [9].

FGFR2

monistus on kuvattu 5% mahasyövistä [10] ja 1-4% rintasyövistä [11], [12], mutta sitä ei ole raportoitu paksusuolen syöpä. Rinta- ja mahasyövän solulinjoissa kätkeminen

FGFR2

vahvistus ovat erittäin herkkiä

FGFR2

estäjien kokeellisissa malleissa [13] – [15], ja vahvistus sekä rinta- ja mahasyövän liittyy vahvasti huonosti eriytetty, myöhäisessä vaiheessa kasvaimia [11], [16]. Mahasyövän

FGFR2

vahvistus voi tapahtua etäpesäkekasvainten mutta ei niihin liittyviä primaarikasvaimen, myös sopusoinnussa rooli metastaattisen ja myöhäisessä vaiheessa syöpä [16], [17].

tässä määritellään uusi

FGFR2

vahvistus NCI-H716 peräsuolen syövän solulinja, joka oli peräisin askites huonosti eriytetty paksusuolen adenokarsinooma.

FGFR2

geenin monistamisen tulokset FGFR2 yli-ilmentymisen ja konstitutiivisen aktivaation. Tärkeää on, NCI-H716 solujen kasvua ja selviytymistä

in vitro

ja hiiren ksenograftimallia olivat riippuvaisia ​​FGFR2. Immunohistokemia paljasti

FGFR2

yliekspressio alaryhmässä ensisijainen paksusuolensyöpä, mutta emme tarkkailla vahvistusta. Nämä taulukot eivät sisällä askites-johdettu edustavien näytteiden alkuperä NCI-H716-soluissa. Vaikka

FGFR2

vahvistusta ja yli-ilmentyminen ovat harvinaisia ​​kolorektaalisyövässä, meidän

in vitro

ja

in vivo

mallit viittaavat siihen, että kehittyvien FGFR estäjät voivat olla tehoa osajoukko paksusuolisyövän kätkeminen tätä vahvistusta.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

solulinjat olivat American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä ylläpidettiin RPMI plus 10% vasikan sikiön seerumia ja 100 ug /ml Pennicillin /streptavidiini (Sigma). PD173074 oli Sigma (St Louis, MO). MK2461 oli Merck [18].

FISH-analyysillä

DNA FISH suoritettiin NCI-H716-soluissa käsitelty Kolkisiinia (0,02 ug /ml 3 tunnin ajan) ja microarray kudosten ytimien kuvatulla aiemmin [19], [20] käytettiin bakteeri- keinotekoinen kromosomi klooneja RP11-62L18 varten

FGFR2

antureista. Tämä FISH koetin sisältää genomisen sekvenssin CHR 10: 123,224,100-123,398,498, joka kattaa koko ja FGFR2 geenin CHR 10: 123,237,844-123,353,481. Koettimet leimattiin suoraan käyttäen Spectrum Orange dUTP ja Spectrum Green dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).

immunohistokemia

H80-aineella (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) oli käytettiin laimennuksessa 1:50 on NCI-H716 vierassiirrettä ja Asterand mahasyövän kohdat ja laimennetaan 1:20 siitä array porausnäytteistä US Biomax Inc (Rockville, MD): CO802 (78 ensisijainen kasvaimia, 2 normaali), CO702 ( 69 näytettä-30 ensisijainen kasvaimia, 25 imusolmukkeet, 8 maksametastaaseista, 9 normaali), CO992 (33 ensisijainen kasvaimia ja 33 imusolmukemetastaaseja), BCO5115 (69 yhteensä, 60 primaarikasvainten, 7 maksametastaaseista), näissä taulukot, 20 potilasta oli alle 35-vuotiaita. Värjäys suoritettiin Ventana Discovery XT käyttäen Rabbit Ultra-HRP. Ilmaisu kanssa ChromoMap Kit (Ventana Molecular Discovery Systems, Tucson, AZ).

ShRNA tuotanto ja infektio

shRNA sekvenssit olivat:

F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC,

F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC

F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC

F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC

Luciferase: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC

AAA. Salatun: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG

GAGACAAAA Oligoja hybridisoitiin ja 5’BbsI ja 3 ’Spel käyttää kloonaamaan osaksi omaa ENTR plasmidi seuraa muuntaminen Plenti6 /Block-IT-DEST (Invitrogen, Grand Island NY) käyttäen yhdyskäytävän ( Invitrogen, Grand Island NY). Virus tuotanto ja tiitteri määritys olivat ohjannut Invitrogen. Jotta kasvu analyysiä varten solut ympättiin tiheydellä 4000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille, ja Western-analyysiä varten solut siirrostettiin 40000 solua 12-kuoppaisilla levyillä. Virussupernatantit lisättiin 20 tunnin ajan, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä, jossa vaiheessa viruksen Supernatantit poistettiin ja korvattiin kasvatusliuoksella, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Lysaatit valmistettiin Western-analyysi 48 tuntia myöhemmin.

Yhdiste hoitoa ja kasvun määritykset

PD173074 (Sigma, St. Louis MO) ja MK2461 laimennettiin DMSO luoda titraussarjasta kuten aikaisemmin on kuvattu [ ,,,0],14]. Gleevec, Lapatinibin, PHS665753 ja PD168393 olivat ChemieTek (Indianapolis IN) Anti IGF1 R-vasta-aine AF305 oli R /D systems. Soluja käsiteltiin kolmena rinnakkaisena, ja sen jälkeen 3 päivää solujen lukumäärät määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen Vialight reagenssia (Vialight Assay Kit, Cambrex, Rockland ME). Luminenssi määrällisesti Topcount NXT HTS (Perkin Elmer, Waltham, MA) ja IC 50 määritykset tehdään käyttäen logistinen 4 parametrin käyrän sovitus. Kvantitoimiseksi Fosfotyrosiinin vuonna FGFR2 ja blotit skannattu ja kvantitatiivisesti käyttäen ImageQuant ohjelmistoa. Arvot vastaavat bändi intensiteetti piirrettiin lääkeainepitoisuuden perustaa IC50 huumeiden eston. ScanMAX profilointi 442 kinaasien oli Ambitin Biosciences (San Diego, CA).

Western blotting, immunosaostus, vasta-aineet ja kasvutekijät

Lysaatit valmistettiin 30 mmol /L Tris-HCI, pH 7,5, 50 mmol /L NaCl, 5 mmol /l EDTA: a, 50 mmol /L NaF, 30 mmol /L Nappi, 1% Triton, 0,5% IGEPAL, 10% glyseroli, 1 mmol /L Vanadate, 1 mmol /L bpPhen (Calbiochem), ja proteaasinestäjä (Roche) ja western blotting ja immunosaostus tehtiin kuvatulla [21], [22]. Vasta-aineet FGFR2 sisältyy N-päähän MAB6841 (R & D Systems, Minneapolis, MN) ja H80 (Santa Cruz), C-pää C-20 (Santa Cruz) ja Y653 /654 erityiset 3471 ((Cell Signaling Technology, (CST) , Danvers MA.)). Muita vasta-CST olivat: Pakt S473 (4060), AKT (9272), Perk (4370), ERK (9102), pS6RP S235 /236 (2217), S6RP (2211), pilkotaan PARP (9542), beeta aktiini (4967 ), P105 NFKB S933, P105 NFKB, GAB1 Y672, FRS2 Y436, SHC Y317 CRKII Y221, PRAS40 T246, PDK1 S241, GSKIII S9, PKC S660, RSK S227 (PDK1 site), RSK S359 /363 (ERK site), AMPK T172 (LKB site) ja GAPDH. 4G10 fosfotyrosiinivasta- vasta-aine oli Upstate (Charlottesville VA). Rekombinantti FGF2 oli R & D Systemsiltä (Minneapolis MN).

Virtaussytometria

Becton Dickinson FACS Calibur käytettiin virtaussytometrialla NCI-H716-soluissa. Solut kiinnitettiin yön yli 1 ml: lla jääkylmää 70% etanolia pestiin sitten PBS: ssä ja värjättiin PI /RNAasi (BD Pharmingen, San Diego), 3 tunnin ajan. ModFit ohjelmistoa käytettiin määrittämään suhteellinen jakelua G1, S, G2 /M, ja manuaalinen gating määrittää subG1 sisältöä.

Vieraslajisiirteen

Eläinkokeiden mukaisesti toteutettiin IACUC (Institutional Animal Care ja Käytä komitea) suuntaviivat ja kokeet hyväksynyt Merck tutkimuslaboratoriot eettisen toimikunnan. Järjestelmällinen seuranta ja tallennus hyvinvoinnin hiirien mukaisesti ARRIVE suuntaviivat ulkonäkö, koko, turkin kunto, ryhti, kävely, toiminnan taso, vuorovaikutus ympäristön ja kliinisiä oireita. Eutanasia oli coducted jonka paljastus eläinten CO

2, kunnes täydellinen lopettaminen hengitys havaittiin vähintään 2 minuuttia (yhteensä noin 5 10 minuuttia). Eläimiä silmämääräisesti ilman liikkeen ja hengityksen. Kuolema oli myös varmistettu poistamalla kasvain kudoksen tai useita elimiä.

5 x 10

6 NCI-H716-soluja istutettiin subkutaanisesti BALB /c-nude-hiirissä. Saavuttamisen jälkeen 200 mm

3, kasvaimia vehikkeliä, 300 mg /kg tai 800 mg /kg, kerran päivässä 24 päivää. 10 hiirtä oli jokaisessa ryhmässä, ja kasvaimen koko määritettiin mittaamalla mittaharpilla. Ei eläimiä kokenut yli 5% laihtuminen aikana hoitoja. FGFR2, AKT, ja ERK esto

in vivo

mitattiin annostelun eläimiä ja kerätä kasvaimia 4 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kasvaimia laitettiin nestemäiseen typpeen ja sitä käsitellään häiriöt 600 ul lyysipuskuria kudoksessa lyzer (Qiagen). Lysaatit kvantitoitiin ja käsiteltiin SDS-PAGE ja Western blotting kuvatulla solulysaateista.

Tulokset

FGFR2

vahvistetaan, ja aktivoituvat NCI-H716-solujen

Koska

FGFR2

vahvistus voi ajaa maha- ja rintasyöpä solujen kasvua, etsittiin uusia solulinjoja, jotka satama samankaltaisia ​​

FGFR2

kopioi vahvistuksen. DNA-siru vahvisti tunnettuja

FGFR2

amplifikaation KATOIII ja SNU16 mahasyövän solulinjoissa [23], [24] ja tunnistaneet uuden erittäin keskeinen vahvistus NCI-H716 peräsuolen syövän solulinja (kuvio S1A File S1. Oncomine tietokanta [25] paljasti myös korkea

FGFR2

messager RNA ilmentymisen NCI-H716-soluissa. fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) paljasti silmiinpistävää

FGFR2

kopioi voitto ja geeni päällekkäisyyksiä tasaisesti värjäyksen alueilla (Kuva 1A). vihreä sentromeeriantigeenin koetin ei paljastanut kopioida vahvistuksen, sopusoinnussa erittäin polttoväli amplikoni on

FGFR2

lokuksen (Kuva S1A File S1). KALA koetin

Met

paljastaneet mitään kopio vahvistusta NCI-H716 tässä kromosomissa 7 lokuksen, ja

FGFR2

koetin ei osoittanut amplifikaation DLD1 koolonkarsinoomasoluissa puuttuu

FGFR2

kopioi vahvistuksen (tuloksia ei ole esitetty). Me vertasi

FGFR2

ilmaisun ja aktivoinnin NCI-H716-soluissa suhteessa paneelin yhdeksän peräsuolen syövän solulinjoista ilman

FGFR2

vahvistusta, ja löysimme silmiinpistävää FGFR2 yli-ilmentymisen ja fosforylaatio vain NCI-H716 -solut (kuvio 1 B). FGF2 ei vielä aktivoi FGFR2 NCI-H716-soluissa, paljastaen, että reseptori on maksimaalisesti fosforyloitu (tuloksia ei ole esitetty). Taso FGFR2 aktivaation NCI-H716-soluissa oli samanlainen tasoille

FGFR2

monistettiin SNU16 mahasyövän solulinjassa (kuva S2 File S1). Olemme päätellä, että meidän paneelissa koolonsyöpäsolulinjaa että

FGFR2

on erittäin yli-ilmennetään ja aktivoitu vain NCI-H716-soluissa.

. NCI-H716-soluja käsiteltiin Colcemid (0,02 ug /ml: ssa 3 tuntia), kiinnitettiin metanoli /etikkahappo, ja pudotetaan mikroskoopin objektilasille mukaan materiaaleja ja menetelmiä. Bakteerien keinotekoinen kromosomi kloonata RP11-62L18 leimattiin Spectrum Orange dUTP ja sentromeeriantigeenin koetin leimattiin Spectrum Green dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) ja hybridisoitiin kiinnitetyissä soluissa. Punainen osoittaa

FGFR2

ja vihreä tarkoittaa Sentromeeri. B. FGFR2 on yli-ilmentynyt ja sisältää runsaasti tyrosiinifosforylaation NCI-H716-solulinja. A, Solulysaatit (valmistettu materiaalit ja menetelmät) käsittelemättömästä tai FGF2 käsiteltiin (30 ng /ml, 5 min) solut hajotetaan ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-pakkausta (Pierce Thermo Fisher Rockford III). Equal lysaattia määrät (50 ug) altistettiin SDS-PAGE ja western blottauksella FGFR2 vasta-aineita, joita on kohdistettu N-päässä (H80. MAB6841), C-pää (C20) ja aktivoinnin loop fosforylaatio Y653 /654 (3471, s-FGFR2) ja aktiini.

FGFR2 tarvitaan kasvuun NCI-H716-soluissa

FGFR2

vahvistus ja aktivoinnin NCI-H716-soluissa ehdotti tätä kinaasi voidaan tarvita solujen kasvu. Me käsitellään NCI-H716-solujen kahdella FGFR pienmolekyylisalpaajien testata rooli FGFR2 NCI-H716 solujen kasvua. Suuressa paneelissa kinses, löysimme PD173074 olevan erittäin selektiivinen FGFR-1, -2, -3 [14], ja me vahvistivat lisäksi merkittävästä selektiivisyys täällä jossa erillinen iso paneeli kinaasien (kuva S3 File S1). Meillä on myös käsitelty solujen MK2461, Met-kinaasin pienmolekyylisalpaaja-, että myös inhiboi FGFR2 fosforylaation ja kasvu

FGFR2

monistettiin maha- ja rintasyövän solulinjat [13]. PD173074 ja MK2461 esti voimakkaasti FGFR2 fosforylaatiota NCI-H716-solut (kuvio 2A), jonka IC50 on 18 nM (PD173074) ja 165 nM (MK2461, kuvio S4A File S1). Molemmat yhdisteet inhiboivat voimakkaasti NCI-H716 kasvun IC 50-arvot 25 nM PD173074 ja 130 nM MK2461 (kuvio 2B). Tärkeää on, että IC50 kasvun esto ja FGFR2 fosforylaation inhibition olivat samanlaisia, ja molemmat arvot olivat myös samanlaiset arvot aikaisemmin saatu SNU16 ja KATOIII solulinjat [13], [14]. Ottaa havaittu voimakas inhibitio NCI-H716 solujen kasvua, seuraavan kerran testattu sekä yhdisteiden inhibitio paneelin koolonsyöpäsolulinjoissa. Molemmat FGFR inhibiittoriyhdisteet näytetään silmiinpistävä selektiivisyyttä NCI-H716-soluissa, joissa on yli 80-kertainen (MK2461) tai 400-kertaisesti (PD173074) alempi IC50 suhteessa kuin

FGFR2

monistettiin paksusuolen solulinjoja ( kuvio 2C). FGFR-inhibiittori AZD4547 myös selektiivisesti inhiboi kasvua NCI-H716-soluja (tietoja ei esitetty). Lopuksi, NCI-H716 kasvu ei inhiboitunut käsittelemällä estäjä yhdisteet puuttuu FGFR inhibitio, mukaan lukien Tarcevalla, Lapatinibin, Gleevec, PHA665752 (Met-estäjä) PD168393 (irreversiibeli EGFR-inhibiittoria) ja IGF1 R estävää vasta-ainetta (kuvio S4b Tiedosto S1 ).

. PD173074 ja MK2461 estävät FGFR2 fosforylaatiota. Soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan titraus PD173074, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Lysaatit valmistettiin ja 50 ug proteiinia ajettiin SDS-PAGE ja western blottauksella fosfo Y653 /654 FGFR ja MAB6841 yhteensä FGFR2-vasta-ainetta. B. PD173074 ja MK2461 estävät NCI-H716 solujen kasvua. Solulinjat maljattiin 4000 solua /kuoppa ja inkuboitiin yön yli. NCI-H716-soluja käsiteltiin titraus PD173074, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solukasvu mitattiin Vialight reagenssilla, ja kasvun esitettiin suhteessa käsittelemättömiin soluihin. C. PD173074 ja MK2461 selektiivisesti estävät kasvua NCI-H716-soluissa. Koolonsyöpäsolulinjoissa lueteltu maljattiin 4000 solua /kuoppa ja 24 tunnin kuluttua käsiteltiin titraus yhdisteitä. 4 päivää myöhemmin solujen kasvua mitattiin vialight ja IC50-arvot laskettiin kuvaajan pad prisma. D.

FGFR2

shRNA pienenee FGFR2 proteiinin NCI-H716-soluissa.

FGFR2

shRNA valmistettiin ja NCI-H716-solut infektoitiin, kuten on kuvattu menetelmissä. Vasen, FGFR2 ilmentyminen analysoitiin fosfo- Y653 /654 ja koko proteiini MAB6841. E. Kasvua analysoitiin 5 vrk infektion Vialight reagenssilla.

varmistettiin edelleen kriittinen rooli FGFR2 NCI-H716 solujen kasvua käyttämällä

FGFR2

shRNA. Ensin tunnistettiin kaksi hiusneuloja (F2 ja F4, kuvio 2D) tehokkaalla

FGFR2

knockdown. Nämä shRNA hiusneulat aiheuttama voimakas kasvun estäminen NCI-H716-soluissa (kuvio 2E). Sitä vastoin, ohjaus shRNA ja shRNA, jotka eivät vähennä FGFR2-proteiinin tasot (V ja F1) eivät inhiboineet kasvua NCI-H716-soluja (kuvio 2D, E).

useita signaali- proteiinien, mukaan lukien AKT, ERK ja NFKB aktivoituvat FGFR2

aiemmin raportoitu, että

FGFR2

aktivoitu AKT ja ERK signaalireaktioteissä FGFR2 monistetaan mahasyövässä solulinjoissa [14]. Siksi määritelleet FGFR2 signalointiverkon NCI-H716-soluissa analysoimalla fosforylaatio useita adaptoriproteiineja ja signalointireitteihin jälkeen FGFR2 esto. Kahden tunnin kuluttua hoidon titraus MK2461 ja PD173074 havaitsimme menetys fosforylaation kinaasin adaptoriproteiineja GAB1 /2, FRS1 /2, ja SHC. Havaitsimme myös menetyksen ERK- ja AKT-fosforylaation (kuvio 3A). Mielenkiintoista, tavoitteet alavirtaan AKT ja ERK kuten PRAS40 ja S235 /236 S6RP (ja S9 GSKIII, tuloksia ei ole esitetty) pysyi fosforyloitua Tämän 2 tunnin aikapisteessä. Olemme ensi anlayzed estämällä AKT ja ERK tavoitteet myöhempinä ajankohtina hoidon jälkeen 100 nM PD173074. Tutkimme myös useita muita reittejä onko viivästynyt kinetiikka eston myös esiintyy. Toisin kuin 2 tunnin aikapisteessä, sekä S6RP ja PRAS40 fosforylaatio oli esti voimakkaasti 12 tunnin kuluttua yhdisteen lisäksi (kuvio 3B). Olemme myös löytäneet samanlaista viivästyneen esto seriini-933 fosforylaatiota NFKB p105, viittaa siihen, että NFKB signalointi on osa NCI-H716 kasvu (kuvio 3B). NFKB P50 ja P105-proteiinin tasot laskivat vain 72 tuntia. Vaikka esto 12 tuntia käsittelyn jälkeen voi johtua laajennettu puoliintumisaika signalointi proteiineja, esto myöhäisemmässä vaiheessa, kuten 72 tuntia saa olla toissijainen kasvun estoon (ja solukuolemaa alla kuvatulla tavalla kuviossa 4). CRKII Y221, AMPK T172, ja PDK1 S241 estyi vain 48-72 tuntia hoidon, jälleen viittaa siihen, että menetys näistä sivustoista voi olla toissijainen kasvun estäminen. CRKII, AMPK, ja PDK-proteiinin tasoa ei laskenut aikana rata (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi muut sivustot kuten GSKIII S9 (AKT- fosforylaatiokohdan), PKC S660, RSK S227 (a PDK1 fosforylaatiokohdan) pysyi fosforyloitu jopa 72 tunnin jälkeen (kuvio 3B). Tämä tulos osoittaa, että PDK1 pysyy aktiivisena ja pystyy fosfory- kohdesivustoa huolimatta solukasvuneston. Vaikka S227 PDK1 fosforylaatio sivuston RSK ei inhiboi, ERK fosforylaatio seriinin-359 /363was esti 2 tunnin kuluessa PD173074 hoidon (kuva S5 File S1). GSKSIII seriini-9 pysyi fosforyloitua myöhempinä ajankohtina, ja se voi olla mahdollista, että muut kinaasit lisäksi AKT säilyttää fosforylaatio tällä sivustolla. Lopuksi, koska MEK inhibitio vaikutti NCI-H716 kasvua, olemme edelleen määritelty MEK signaloinnin verkkoon 100 nM allosteerisen MEK estäjä PD0325901 [26]. Seriini-933 P105 NFKB ja seriini-265 FRA1 kuvataan ERK fosforylaatiopaikat ja varmistimme menetystä näillä paikoilla. Seriini-235/236 S6RP Myös MEK tavoite NCI-H716-soluissa (kuvio 3C). Olemme päätellä, että FGFR2 esto johti kaksivaiheisesti rakenteessa koulutusjakson esto, jossa ERK ja AKT esti varhaisessa ajankohtina, kun taas PRAS40, S6RP, ja transkriptiotekijöiden kuten NFKB p105 osoitti viivästyneen esto. Muita signalointi proteiineja, kuten PDK1 ja PKC-isoformit pysyi fosforyloitua jopa myöhempinä ajankohtina. Kuitenkin on yhä mahdollista, että huolimatta fosforylaatiota proteiinien, kuten PKC isoformit saattavat olla aktiivinen johtuen muista tekijöistä, kuten solujen mislocalization. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset varoittavat, että analyysi signalointiverkko vasta varhaisessa ajankohtina jälkeen estäjä kohtelu ei täysin määritellä välillä signalointi efektorien.

. Lysaatit käytettiin kuvassa. 2A analysoitiin western-blottauksella fosforyloidun tai kokonaan proteiinien kuluttua 2 tunnin käsittely osoitetun yhdisteen annosta. ”P” tarkoittaa Fosfopro- ja fosforylaatio sivustot luetellaan Methods. B. aikakäyrä eston useita signalointi proteiineja. NCI-H716-soluja käsiteltiin 100 nM PD173074 varten ilmoitettu ajat ja signalointireitteihin analysoitiin SDS-PAGE ja western-blottauksella. 100 nM PD173074 valittiin, koska tämä määrä aiheutti täyden eston lisäansiot klo 2 tunnin kohdalla. ”P” tarkoittaa Fosfopro- ja fosforylaatio sivustot luetellaan Methods. Terminologia oikealla puolella kuvion ryhmien proteiinien mukaan aika, jolloin estäminen tai proteiinia katoaa. C. NCI-H716-soluja käsiteltiin 100 nM PD0325901 varten osoitetun ajan. Lysaatit valmistettiin SDS PAGE ja western blotting ilmaistuilla vasta-aineilla. D. NCI-H716-solut maljattiin 4000 solua /kuoppa käsiteltiin 24 tunnin kuluttua 1 uM L-547 (Akti), 100 nM PD0325901 (Meki), 5 nM Rapamysiini (rapamysiini), 100 nM PD173074, tai 1,5 uM MK2461, tai ilmoitettu yhdistelmiä. 5 päivän jälkeen yhdiste ja media poistettiin ja korvattiin tuoreella yhdisteen ja media. Sen jälkeen vielä 5 päivää (10 päivää yhteensä määritys) suhteellinen solukasvu määritettiin käyttämällä Vialight reagenssia.

. Lysaatit Kuva 3B paljastaa kasvoi PARP pilkkominen. Fosfo S6RP sisällytetään viitteenä ja GAPDH käytettiin latauskontrollina. B. Solujen sykliprofiilia käsiteltyjen solujen. 1 x 10exp6 NCI-H716-soluja käsiteltiin 100 nM PD173074, MEK-estäjä (100 nM) tai MEK + AKT-estäjällä (L-547, 1 uM) tai DMSO: ta (käsittelemätön) eristettiin osoitettuina ajankohtina ja käsitellään propidiumjodidia värjäystä ja FACS-analyysiä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B. ilmaisee taulukkomuodossa edustus solukierron profiilien määritettynä manuaalinen gating G1, S, G2 /M ja subG1 alueilla. C on solusyklin profiileja.

yhdistettyyn eston AKT ja ERK vaaditaan täysin estää NCI-H716 kasvu

NCI-H716-soluissa ERK, AKT ja S6RP fosforylaatio vaatii FGFR2 , ja seuraavan kerran käytetään selektiivisiä allosteerinen estäjiä MEK, AKT, ja mTOR määritellä rooli näiden reittien NCI-H716 kasvua. Vaikka MEK estäjä PD0325901 laski NCI-H716 kasvu, jonka IC50 on 60 +/- 14 nM, joka on ajan myötä osoitti, että NCI-H716-soluissa jäi asteittaisen kasvun (kuvio 3D, turkoosi viiva). Huomasimme, että 1 uM AKT-estäjällä L-547 tai 5 nM rapamysiinin yksin tai yhdessä oli vain vähäisiä vaikutuksia kasvuun huolimatta vahva esto AKT ja S6RP fosforylaatio (kuva S6 File S1). Sitä vastoin, yhdistelmä AKT-estäjällä ja MEK-estäjä estää kasvua ja vähensi solujen määrä samanlaisia ​​FGFR inhibitio (kuvio 3D). Siksi sekä AKT ja ERK ovat kriittisiä efektoreita FGFR2 NCI-H716-soluissa. Sen sijaan yhdistelmä MEK eston ja rapamysiini ollut parempi MEK esto yksin. Tämä on sopusoinnussa myös biokemiallisia tuloksia (kuvio 3C), joka S6RP on alavirtaan MEK tässä solulinjassa niin, että ERK inhibitio jo johtaa inhibitioon S6RP. Lisäksi, ei ole ilmiasuun rapamysiinin viittaa siihen, että useita efektoreita ERK täytyy estää yhdessä matkia kasvun inhibition havaittiin MEK estäjä.

Apoptoosi on mekanismi, kasvun estäminen

lähtöaineena solujen lukumäärä väheni käsitellyissä soluissa PD173074 kanssa ja AKT ja MEK-inhibiittorin yhdistelmä, mikä viittaa siihen, nämä inhibiittorit aiheutti solujen kuoleman. Pilkotaan PARP, merkki apoptoosin, oli indusoituu voimakkaasti jälkeen PD173074 hoidon (kuvio 4A) ja MK2461 (ei esitetty). Virtaussytometria ja solukierron sisällön paljasti kasvun pysähtymisen 24 tunnin kuluttua hoidon FGFR estäjien tai MEK /AKT-estäjällä yhdistelmät nähty menetys S-vaiheeseen väestöstä (kuvio 4B, C) 48 tunnin kohdalla ja myöhemmin ajankohtina kasvua pidätys seurasi tunnetut induktio subG1 väestöstä. Itse asiassa 4 päivän kuluttua hoidon subG1 osa edusti puolet solupopulaation. Sen sijaan, MEK esto väheni solujen S-vaiheessa 24 tuntia, mutta kumpikaan eliminoidaan S-vaiheen solujen myöhempinä ajankohtina eikä aiheuttanut samanlaisia ​​näkyvä solukuolemaa (kuvio 4B, C). Lopuksi, kuvia NCI-H716-soluissa paljastaa laajaa solun pirstoutuminen 72 tunnin jälkeen hoidon PD173074 tai 1 uM MK2461, sopusoinnussa solukuolemaa (kuvio S7 File S1). Nämä tulokset paljastavat, että NCI-H716 solun eloonjääminen on riippuvainen FGFR2, ja tukee myös aikaisemmin todettu, että sekä AKT ja ERK aktiivisuus ovat välttämättömiä selviytymisen.

FGFR2 vaaditaan NCI-H716 vierassiirrettä kasvaimen kasvua

Voimakkaat NCI-H716 herkkyys FGFR estäjien

in vitro

ehdotti, että ksenograftin kasvaimen kasvua voi estyä

in vivo

. NCI-H716 on johdettu askites, ja yhdenmukaisia ​​sopeutumista tähän ympäristöön, solulinja lisääntyy irrallinen suspensiossa. Siksi yritettiin luoda askites mallia käyttämällä lusiferaasia ilmentävät NCI-H716-solut injektoidaan vatsaonteloon. Kuitenkin lusiferaasi kuvantaminen paljasti puute kasvainsolun laajennus (tietoja ei esitetty). Siksi testattiin kasvaimen kasvun estäminen tavallisessa ihonalaisen ksenograftimallissa. Koska PD173074 on huono farmakokineettiset ominaisuudet, käsittelimme hiiriä MK2461. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 200 mm

3 koko, MK2461 annosteltiin kerran päivässä (QD) on joko 300 tai 800 mg /kg. Aikana 21 päivää tutkimuksen, 800 mg /kg käsittely aiheutti täyden tuumorin kasvun estäminen, kun taas 300 mg /kg johti osittaiseen-esto, joka ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5A). Kumpikaan annos johti kehon painon ylittää 5% (tuloksia ei ole esitetty). Sekä korkea ja pieniä annoksia MK2461 aiheutti täyden eston FGFR2, ERK, ja AKT fosforylaatio kasvaimissa 2 tuntia lääkkeen ottamisen jälkeen (kuvio 5B). Kuitenkin 23 tuntia annostuksen jälkeen, vain 800 mg /kg: n annos oli merkittäviä eston FGFR2 ja ERK fosforylaatio. Kyvyttömyys 300 mg /kg: n annos aiheuttaa jatkuvan inhibition FGFR2 ja ERK signalointi voi selittää puute liittyy tehoon. Vaikka 800 mg /kg aiheutti täyden kasvun estäminen, ei pilkottu PARP havaittu

in vivo

, toisin kuin

in vitro

hoidon MK2461 (tuloksia ei ole esitetty). Puute katkaistun PARP

in vivo

on sopusoinnussa myös ilman taantumista ksenograftimallia, ja se voi johtua puute voimakas esto AKT fosforylaation. Esimerkiksi kun vain ERK oli voimakkaasti esti

in vitro

(jossa MEK estäjä PD0325901), siellä oli vähentynyt kasvu, mutta ei solukuolemaan. Siksi puute voimakas AKT esto voi selittää, miksi regressio ei havaittu ksenograftimallissa. Syynä puute AKT esto

in vivo

ei ole selvä, mutta voisi mahdollisesti johtua korvaavien reitin aktivaatio endogeeninen hiiren kasvutekijöiden tai sytokiinien ole läsnä soluviljelyelatusaineella.

. 5 x 10exp6 NCI-H716-soluja istutettiin ihonalaisesti Balb /c-nude-hiirillä ja käsiteltiin MK2461 joko 300 mg /kg tai 800 mg /kg QD annostusaikataulun. Suhteellinen kasvaimen kasvu näkyy Y-akselilla. B. Kasvaimen joissa hiiriä käsiteltiin yhdellä annoksella MK2461 joko 300 mg /kg tai 800 mg /kg. Kasvaimia eristettiin joko 4 tai 24 tuntia käsittelyn jälkeen, ja laitetaan nestetypessä. Kasvaimet käsiteltiin käyttämällä kudosta lyzer (Qiagen), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät ja analysoitiin SDS-PAGE: lla ja VVestern-blottauksella, jossa on esitetty fosfo ja koko vasta-aineita.

FGFR2 yli-ilmentyminen, mutta ei vahvistus on löydetty osajoukko ensisijainen paksusuolensyöpä ja imusolmukemetastaaseja

määritelty esiintyvyys FGFR2 yli-ilmentymisen ja vahvistus perusterveydenhuollossa paksusuolensyöpä käyttäen immunohistokemia (IHC) varten FGFR2 ilmaisun ja FISH varten

FGFR2

vahvistusta. Koska meillä on ennakkotapaus valikoiva

FGFR2

vahvistus on etäpesäkkeitä, mutta ei primaarikasvaimen analysoimme myös 15 maksa- ja 58 imusolmukemetastaaseja yhdessä niihin liittyvine primaarikasvaimia. Koska aikaisemmin on kuvattu C-terminaalissa vasta-aineet eivät tunnista FGFR2 isoformien NCI-H716-solujen western-blottauksella tai IHC (tietoja ei esitetä), me optimoitu IHC värjäytymistä N-päähän H80-vasta-aine. Olemme vahvisti vahvan IHC reaktiivisuus NCI-H716-ksenograftissa ja joilla on

FGFR2

monistettiin mahasyövän kasvain (kuvio 6).