Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti ilman tyydyttävää hoitoa tasalla. Tässä tutkimuksessa testasimme ovatko yhdistetyn syklo-2 (COX-2) ja luokan I histonideasetylaasi (HDAC) voi johtaa parempaan valvontaan haiman adenokarsinooma. Vaikutus samanaikaisen HDAC ja COX-2-estoon solun kasvuun, apoptoosin ja solukierron arvioitiin ensin

in vitro

ihmisen haiman BxPC-3, PANC-1 tai CFPAC-1-soluissa käsitelty kemiallisilla estäjien ( SAHA, MS-275 ja selekoksibi) tai HDAC1 /2 /3/7 siRNA. Potentiaalin testaamiseksi kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus Tämän yhdistelmän

in vivo

, olemme kehittäneet ja tunnettu, hienostunut tipu korioallantoiskalvoon kasvainmuoto että histologisesti ja proteomically jäljittelee ihmisen haiman adenokarsinooma. Yhdistelmä HDAC1 /3 ja COX-2-estoon merkittävästi heikentynyt leviämisen BxPC-3-solujen

in vitro

ja pysähtynyt kokonaan BxPC-3-solujen kasvaimen kasvua päälle korioallantoiskalvoon

in vivo

. Yhdistelmä oli tehokkaampi kuin kumpikaan lääke yksin käytettynä. Johdonmukaisesti, osoitimme, että sekä HDAC1 ja HDAC3 esto indusoi ilmentymisen COX-2 kautta NF-kB-reitin. Tuloksemme osoittavat, että ensimmäistä kertaa Haiman adenokarsinooma (PDAC) malli, merkittävä toiminta HDAC ja COX-2-estäjät on syöpäsolujen kasvua, joka asettaa perustan kehittämiselle potentiaalisesti tehokkaita uusia kombinatoorista hoitomuotojen haiman adenokarsinooma potilailla.

Citation: Peulen O, Gonzalez A, Peixoto P, Turtoi A, Mottet D, Delvenne P, et ai. (2013) antituumorivaikutus HDAC esto in Human Haimasyöpä Malli paranee merkittävästi, jonka samanaikainen syklo 2. PLoS ONE 8 (9): e75102. doi: 10,1371 /journal.pone.0075102

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 7. 2013 Hyväksytty: 12 elokuu 2013; Julkaistu: 11 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Peulen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Belgian kansallisen tieteellisen tutkimuksen rahasto (https://www.frs-fnrs.be) ja Télévie; Keskuksen Anti-Cancéreux près de l’Université de Liège (https://www.cac.ulg.ac.be). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. A. Gonzalez on Télévie kaveri. A. Turtoi ja D. Mottet ovat vastaavasti tutkijatohtori ja tutkimus Associate Belgian kansallisen tieteellisen tutkimuksen rahasto.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) luettelot kaikkein tappavan muodossa syöpien [1]. Varhaisvaiheen tauti on kliinisesti hiljainen ja taudinmääritys on enimmäkseen edennyt pitkälle. Tämä myöhäinen diagnosointi edistää yksi pienimmistä 5 vuoden pysyvyys (vain 3%) [2]. Tänään PDAC hoidetaan leikkauksella ja /tai apuaine gemsitabiinihoito, kasvaa vain hieman mediaanielossaolosta potilaista. Siksi on kiireellisesti kehitettävä uusia tehokkaita hoitoja PDAC potilaille.

On runsaasti näyttöä siitä, että vapauttaminen histoni asetylaatio myötävaikuttaa haimasyöpä kehitykseen ja etenemiseen [3]. Histonideasetylaaseja (HDAC) edustavat perheen entsyymejä, jotka säätelevät ensiarvoisen solujen toimintaa myös epigeneettisellä hiljentäminen kasvainten synnyssä ja modulaatio proteiinia toimintoja. Me ja muut ovat osoittaneet, että HDAC: n inhibitio kykenee sekä syövän ja anti-angiogeneesiä toiminta [4] – [6]. HDAC ilmentyminen on muuttunut PDAC, mukaan lukien HDAC1, HDAC2, HDAC3 ja HDAC7 [7] – [10]. Prekliiniset tutkimukset viittaavat siihen, että HDAC esto merkittävää potentiaalia kehittämistä varten uuden syöpähoitoihin [11]. Niinpä useat HDAC-inhibiittorit ovat äskettäin hyväksynyt Food and Drug Administration hoitoon Ihon T-solulymfooma ja uusia molekyylit ovat parhaillaan faasin III kliinisissä tutkimuksissa. Kuitenkin, kun sitä käytetään ainoana lääkkeenä, HDAC-inhibiittorit osoitti rajoitettu tehoa erilaisissa kiinteissä maligniteettien, mukaan lukien PDAC [3], [12], [13]. Todellakin, LAQ824 tai MS-275 on arvioitu faasin I kliiniset kokeet kiinteiden syöpien, kuten PDAC ilman objektiivista kliininen vaste [14], [15]. Vaihtoehtoisesti HDAC-inhibiittorit on käytetty yhdistelmähoidossa strategioissa [16], [17], joitakin yhdistelmiä tuottaa lupaavia vaikutuksia ihmisten PDAC

in vitro

[18] – [21] tai kokeellisissa kasvaimissa [22] . Valitettavasti nämä tulokset eivät käännä kliinisissä tutkimuksissa [23], [24].

puuttuminen tehoa HDAC-estäjien haimasyövän voitaisiin sidoksissa pleiotrooppisten toimintaa HDAC: t solubiologian [25], [26], joka johtaa ei-toivottujen pro-syöpä vaikutuksia. Esimerkiksi tuore tutkimus osoitti, että yleiseurooppalainen HDAC-inhibiittorit indusoivat COX-2 (COX-2) ilmentymisen keuhkosyöpäsoluissa, mikä stimulaation endoteelisolujen proliferaation [27]. Koska COX-2 on myös liittynyt haimasyövän soluproliferaatiota [28], tai kasvaimen kasvua [29] – [31], me arveltu, että COX-2-yli-ilmentyminen voi myös indusoida PDAC, kun niitä käsitellään HDAC-inhibiittorit, mikä vähentää tehokkuutta ja siten hoidon epäonnistumisen.

testaamiseksi biologista merkitystä yhdistää luokan I HDAC ja COX-2-estäjät

in vivo

olemme kehittäneet hienostunut PDAC poikasen rakkokalvon (CAM) malli perustuu meidän edellinen työ [32]. CAM-mallia on käytetty menestyksellisesti useiden solulinjojen tuottamiseksi kasvainten [33], [34]. Samoin kuin hiiren mallissa, useimmat vaiheet syövän etenemisen on toisteta hyvin lyhyessä ajassa [35]. Aiemmin BxPC-3 haimasyövän soluja jo osoittanut tuottaa vascularized 100 pm pitkä kasvain solmut CAM [32]. Kuitenkin pieni koko kyhmyt muodostivat huomattavan rajoituksen rakenteellisista havainto, tarkka tilavuus arviointi ja tutkimus lääkkeen tehoa. Täällä olemme ottaneet käyttöön hienostunut BxPC-3 PDAC malli jossa dramaattinen kasvu (64-kertainen) kasvaimen koon ja on rakenteellisia arkkitehtuuria ja proteiinin ilmentyminen matkimalla ihmisen PDAC. Tämä malli on onnistuneesti hyödynnetty osoittamaan, että yhdistelmä luokan I HDAC ja COX-2-estäjät aiheuttaa täydellisen kasvaimen kasvun estäminen.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kemikaalit

BxPC-3 (ATCC CRL-1687), PANC-1 (ATCC CRL-1469) ja CFPAC-1 (ATCC CRL-1918) ovat ihmisen haimasyövän solulinjoissa vastaavasti PDAC [36], haima kanava epithelioid syöpä [37 ] ja PDAC maksan etäpesäke [38]. BxPC-3 oli antelias lahja professori Bikfalvi (Inserm u1029, Bordeaux, Ranska), Panc-1 oli antelias lahja professori Muller ja Burtea (NMR Laboratory, University of Mons, Belgia). CFPAC-1 ostettiin ATCC. Selekoksibi saatiin Yliopiston Apteekki (Kemprotec Ltd, Middlesbrough, UK). MS-275 ja SAHA: ostettiin Enzo Life Sciences (Antwerpen, Belgia). Muut kemikaalit hankittiin Sigmalta (Bornem, Belgia).

Soluviljely

BxPC-3 ihmisen haimasyövän solulinja pidettiin RPMI1640 johon on lisätty glukoosia (2,5 g /l), natrium- pyruvaattia (1 mM) ja FBS (10%). PANC-1 pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty FBS: lla (10%). CFPAC-1 pidettiin Iscoven muokattu Dulbeccon elatusaine FBS (10%). Soluja käsiteltiin MS-275, selekoksibia tai molempien yhdistelmää sekä suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) liuotetaan väliaineeseen 0,1% DMSO: ta.

Sirna transfektion

HDAC-specific sirna (siRNA) syntetisoitiin (Scraing, Belgia). NF-kB p65 SMARTpool siRNA ostettiin Thermo Fisher-Dharmacon (Whaltham, MA). Lipofectamine-välitteisen transfektiot suoritetaan siRNA pitoisuutena 40 nM ja noudattamalla valmistajan suositusten mukaisesti (Life Technologies, Carlsbad, NM). GL3 oli merkityksetön siRNA kohdistaminen lusiferaasin. siRNA sekvenssit julkaistiin aiemmin [5].

Solun kasvu

tasa tiheydet soluja ympättiin täydellisessä väliaineessa ja kerättiin osoitetuissa aikapisteissä. Solumäärät olivat epäsuorasti määritettiin Hoechst sisällyttäminen. Tulokset ilmaistiin DNA-pitoisuus.

Western-blotting

BxPC-3-soluissa tai jäädytetty kasvaimia hajotettiin hajotuspuskuriin (1% SDS, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5), että proteaasin läsnä ollessa ja fosfataasi-inhibiittorit. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE (6-12,5%), sitten electrotransfered on nitroselluloosakalvoille. Sen jälkeen ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), anti-HDAC1 (Cell Signalling, Danvers, MA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-HDAC3 (Cell Signalling, Danvers, MA), anti-asetyloitu-histoni-3 (Millipore, Billerica, MA), anti-HDAC7 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-IkBα (Cell Signalling, Danvers, MA ), anti-p65 (Soluviestintä, Danvers, MA), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p27 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), anti-pRB (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ), anti-E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MEK2 (Soluviestintä, Danvers, MA), anti-ORC2 (Soluviestintä, Danvers, MA), anti-kaspaasi-3 (Cell Signalling , Danvers, MA) ja anti-HSC70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Immunodetektio suoritettiin käyttäen asianmukaisia ​​sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuren peroksidaasiin.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-

Yhteensä RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [39] . Ihmisen COX-2: n ilmentymisen havaittiin käyttäen kaupallista RT-qPCR TaqMan-määritys (Hs00153133-M1; Applied Biosystems, Carlsbad, NM). Ihmisen IL-8: n ekspressio havaittiin käyttämällä spesifisiä eteenpäin (5′-GAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAA-3 ’) ja reverse (5′-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAG-3’) alukkeina syntetisoitiin (Scraing, Belgia).

anneksiini V /propidium- jodidi värjäys

Apoptoottiset solut määritettiin anneksiini V-FITC ja ei-vitaaliväri propidiumjodidi (PI) värjäämällä FITC-anneksiini V apoptoosin havaitseminen pakki I (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) mukaan valmistajan ohjeita. Virtaussytometria suoritettiin FACSCalibur II ™ ja näytteet analysoitiin käyttämällä CellQuest ™ ohjelmistoa (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Solusyklianalyysiä

suhteellinen osuus solujen kussakin vaiheessa solusyklin analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [33] virtaussytometrisellä analyysillä FACSCalibur II ™ ja ModFit LT ™ -ohjelmaa.

Kasvaimen kasvu CAM

Hedelmöitettyjä kananmunia avattiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Jälkeinen lannoitus päivä 11, CAM pinta kevyesti naarmuuntunut neulalla ja 3,5 × 10

6 BxPC-3, PANC-1 tai CFPAC-1-solujen suspensiossa 50% matrigeeliä lopullisessa tilavuudessa 100 ui oksastettu CAM ympäröity 6 mm muovinen rengas. Istuttaminen päivä pidettiin päivä 0 kasvaimen kehitystä. Drugs (selekoksibi 8 uM ja /tai MS-275 0,2 uM 30 ul lopullinen tilavuus) levitettiin päivittäin suoraan kasvaimeen alkaen päivänä 2. Päivänä 7, kasvaimet leikattiin CAM ja digitaalisia kuvia otettiin käyttäen stereomikroskoopilla . Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen ellipsoidin kaavalla: Volume = (4 x πxZ

1 × Z

2 × Z

3) /3, missä Z

1-3 ovat tärkeimmät säde kasvain.

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin animal Welfare komitean Liègen yliopiston (hyväksyntä # 1278).

Histologia menettely

BxPC -3 kasvaimia pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin sitten 4% paraformaldehydissä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kasvainten upotettiin parafiiniin ja 5 um leikkeet värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla tai Massonin trikromi.

Immunoperoxydase ja amylaasi-perjodihappo- Schiff (PAS) värjäys suoritettiin 5 um: n leikkeitä, vastaavasti, kanssa BenchMark XT IHC /ISH automatisoitu stainer ja tana NexES Special tahrat (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) mukaan valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen vasta-aineita käytettiin: anti-sytokeratiini 7 (CK7 – Dako, Glostrup, Tanska), anti-sytokeratiini 19 (CK19 – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgia), anti-sytokeratiini 20 (CK20 – Dako, Glostrup, Tanska), anti- CD56 (Novocastra, Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL), anti-syöpä -antigeeni (CEA – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgia), anti-Ki67 (Dako, Glostrup, Tanska), anti-piilevä transformoiva kasvutekijä-beetaa sitovan proteiinin 2 (LTBP2 – Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA), anti-transformoiva kasvutekijä beta-induced (TGFBI – Cell Signalling, Danvers, MA), anti-myoferlin (Sigma, Bornem, Belgia) ja anti-desmiini (Dako, Glostrup, Tanska) käytettiin ensisijaisena reaktiota.

Ki67 kvantitointi suoritettiin otetaan satunnaisesti kuvat (3 kuvaa kunkin kasvaimen, 3 kasvainten kunkin koeryhmän). Kun kanavien halkaisu, sininen kanava kuvat olivat binarized kirkkauden mukaan. Koko pinta-ala kaikkien solujen tai Ki67-positiivisten solujen mitattiin käyttäen ImageJ 1.46r ohjelmistoa.

visualisoimiseksi kasvaimen verisuoniston, paksu rehydratoitiin kudosleikkeet (35 pm) inkuboitiin 30 minuutin ajan in pimeässä 0,05% Triton X-100 PBS: ssä, joka sisälsi 5 ug /ml

Sambucus nigra

agglutiniini (SNA, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Leikkeet pestiin 0,05% Triton X-100 PBS: ssä ja visualisoidaan -konfokaalimikroskoopilla (Leica SP2). Kolmiulotteisten kuvien oli rekonstruoitu Imaris ohjelmisto (Bitplane Scientific Software, Zurich, Sveitsi).

Tilastollinen

Kaikki tulokset raportoidaan tarkoittaa sekä keskihajonta. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista tai kaksisuuntaista ANOVA lukumäärästä riippuen ryhmittymän tekijät. Ryhmä keinot verrattiin jonka Bonferronin testin jälkeen. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki kokeet suoritettiin 3 riippumatonta biologinen toistojen.

Tulokset

Luokka I HDAC esto pienentää haimasyöpä solujen kasvua in vitro

BxPC-3 soluja on kuvattu ilmaista muuttunut tasot I luokan HDAC1, HDAC3 ja luokan II HDAC7 [40], [41]. Arvioidaan rooli näiden HDAC BxPC-3-soluissa, ensin tutkitaan niiden ajasta riippuvia ja pitoisuudesta riippuvainen kasvu läsnäollessa SAHA, luokka I /II-estäjä (kuvio 1A). Meidän Tulokset vahvistivat, että BxPC-3-solut olivat herkkiä SAHA, 50% kasvun vähenemistä (P 0,001), havaittiin 5 uM. Seuraavaksi valikoivasti vaiennetaan HDAC1, -3 tai -7 käyttämällä siRNA tutkia yksittäisiä edistää näiden HDAC että SAHA aiheuttama kasvun vähenemistä. HDAC7 hiljentäminen ei vaikuttanut solujen kasvuun (kuvio 1 B). Kuitenkin HDAC1 ja HDAC3 hiljentämiseen vähensi merkitsevästi BxPC-3 solujen kasvua vastaavasti 50% (P 0,001) ja 20% (P 0,001) (kuvio 1 C). Jotta voitaisiin arvioida tätä vähentää solujen kasvua kliiniseen kuvaukseen sopiva lääke, arvioimme ajasta riippuvia ja pitoisuudesta riippuva kasvu BxPC-3 solujen läsnäollessa MS-275 (HDAC1 ja HDAC3 estäjä). MS-275 (1 uM) vähensi BxPC-3 solujen kasvua 50% (P 0,001), kun taas 5 uM poistuu kokonaan kasvua (P 0,001) (kuvio 1 D).

(A) Aika -riippuvaisella ja annoksesta riippuvaa vaikutusta SAHA soluproliferaatioon. (B) Aika riippuva vaikutus luokan II HDAC7 hiljentäminen soluproliferaatioon. HDAC7 ilmentymistä havaittiin western-blot 48h kuluttua siRNA transfektion. HSC70 käytettiin latauskontrollina. (C) Aika riippuva vaikutus luokan I HDAC1 tai -3 äänenvaimennusjärjestelmien soluproliferaatioon .. HDAC1 ja HDAC3 ilmentymistä havaittiin Western-blot 48h kuluttua siRNA transfektion. HSC70 käytettiin latauskontrollina. (D) ajasta riippuvia ja annoksesta riippuvia vaikutuksia MS-275 soluproliferaatioon *** P 0,001 versus DMSO tai GL3 olosuhteissa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n≥3 kunkin kunnossa.

luokan I HDAC-inhibition indusoiman COX-2: n ilmentymisen in vitro

rajallinen tehokkuus HDAC-estäjien kliinisissä tutkimuksissa lukien PDAC potilaat voitaisiin selittää ainakin osittain mahdollisen säätelyn ilmentymisen COX-2 haiman pahanlaatuisten solujen. Arvioida tämän hypoteesin, ensin analysoidaan COX-2: n ilmentymisen in BxPC-3-solujen vaimentaa HDAC1, HDAC2, HDAC3 tai käsitelty MS-275. HDAC1 tai HDAC3 repression indusoi vastaavasti 6,3-kertaiseksi ja 4,8-kertainen lisäys COX-2: n ilmentymisen-proteiinin taso (kuvio 2A), kun taas HDAC2 hiljentäminen vähentää COX-2: n ilmentymisen (kuvio 2B). HDAC1 hiljentäminen indusoi HDAC2 yli-ilmentyminen.

(A) Western-blot havaitseminen COX-2 ja HDAC 20 ug BxPC-3 proteiinit 48h jälkeen HDAC1 tai HDAC3 siRNA transfektiota. (B) Western-blot havaitseminen COX-2 ja HDAC 20 ug BxPC-3 proteiinit 48h kuluttua HDAC2 siRNA transfektion. (C) annosriippuvaisesti vaikutukset 48h MS-275 hoito COX-2: n ilmentymisen. Asetyloitu-histoni H3 käytettiin kontrollina hoidon tehoa. HSC70 käytettiin latauskontrollina. (D) aika-riippuva suhteellinen ekspressio COX-2: n mRNA: n BxPC-3-soluja käsiteltiin 1 uM MS-275. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D., n = 3.

hoito BxPC-3-solut MS-275 osoitti samankaltaisia ​​vaikutuksia COX-2 kertymistä pitoisuudesta riippuvat tavalla (kuvio 2C). Sen määrittämiseksi, onko COX-2 induktio tapahtuu transkription tasolla, analysoitiin COX-2: n mRNA tasolla RT-qPCR seuraavat 6, 12, ja 24 MS-275 käsittelyä. Huomasimme, että COX-2-geenin ilmentyminen oli säädelty seuraavat MS-275 käsittely on ajasta riippuva tavalla (kuvio 2D).

Tutkia mekanismeja, joiden luokka I HDAC esto indusoi COX-2, selvitimme tiedossa yhteys NF-kB ja HDAC1 /3 [42], [43] ja testattu sitä mahdollisuutta, että MS-275 aiheuttama COX-2 ilmaisun voisi olla NF-kB riippuvainen. Niinpä teemme yhteistyötä käsitellyt solut MS-275 ja BAY-11-7082, joka on IkBα kinaasi (IKK) estäjä. BAY-11-7082 alennetaan 30%: sta 90%: COX-2: n ilmentymisen jälkeen, vastaavasti 6h 48h MS-275 käsittelyä (kuvio 3A), mikä viittaa siihen, MS-275-indusoidun ilmentymisen COX-2 on, ainakin osittain NF-kB riippuvainen. Tämä hypoteesi tukivat p65-hiljentäminen ja p65 translokaation tumaan. COX-2-ekspressio indusoitiin 24 h hoito MS-275 ja esti p65 siRNA (kuvio 3B). Lisäksi, 24 MS-275 indusoi kasvua 50%: n p65-proteiinin tasoa sytoplasmassa ja chromatin osa BxPC-3-soluja (kuvio 3C). Samalla MS-275 indusoi geenin ilmentymisen IL-8 (kuvio 3D), joka on välittömänä kohteena NF-kB.

(A) vaikutus IKK-inhibiittoria (10 uM BAY-11-7082) 1 uM MS-275 aiheuttama COX-2: n ilmentymisen. Fosfo-IkBα käytettiin kontrollina BAY-11-7082 hoidon tehokkuutta. HSC70 käytettiin latauskontrollina. Densitometria ilmaistuna COX-2 /HSC70 tai IkBα /HSC70 suhde. (B) Western-blot havaitseminen COX-2 in 20 ug BxPC-3 proteiinit jälkeen 1 uM MS-275 käsittelyä ja p65 siRNA transfektio. HSC70 käytettiin latauskontrollina. (C) Western-blot havaitseminen p65 15 ug BxPC-3 solulimassa, nucleoplasm tai kromatiinin liittyvien proteiinien jälkeen 1 uM MS-275 käsittelyä. MEK2 ja ORC2 käytettiin latauskontrollina vastaavasti sytoplasmassa ja chromatin jakeet. Densitometria ilmaistaan ​​p65 /MEK2 tai p65 /ORC2 suhde. (D) aika-riippuva suhteellinen IL-8-mRNA: n BxPC-3-soluja käsiteltiin 1 uM MS-275, 10 pM Selekoksibi tai yhdistelmä huumeita. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. *** P 0,001, * P 0,05 versus DMSO. n≥3 jokaisessa kunnossa.

yhdistettyyn esto luokan I HDAC ja COX-2 estää solujen kasvua in vitro

Jotta vahvistaa meidän hypoteesia, että luokan I HDAC välittämää estoa induktio COX-2 voi edistää alhainen tehokkuus HDAC perustuu hoidon PDAC potilailla, olemme yhdistäneet jälkimmäisen selekoksibilla, COX-2-estäjä on IC50 (vastaavasti 1 uM MS-275 ja 10 uM selekoksibin). MS-275-indusoidun COX-2-yli-ilmentyminen johti 50%: n lisäys PGE2-pitoisuus elatusaineet (kuvio 4A). BxPC-3 solu selekoksibihoidon yksinään tai yhdessä MS-275 vähensi merkittävästi PGE

2 pitoisuus solussa media. Sitten analysoimme vaikutukset näistä hoidoista solun kasvuun. Yhdistelmä kahden lääkkeen vähensi merkitsevästi ( 85%, P 0,001) BxPC-3 solujen kasvuun verrattuna joko huumeiden yksinään (kuvio 4B). Seuraavaksi me kysyi onko tämä vähennys johtuu apoptoosin induktion ja suorittamansa anneksiini V /propidiumjodidivärjäys 24, 48 ja 72 (kuvio 4C) hoidon jälkeen. Mikään yksittäinen huumeiden tai niiden yhdistelmä kykenivät indusoimaan apoptoosin. Nämä tulokset varmistettiin western-blot, joka osoittaa ehjä kaspaasi-3 kaikissa näytteissä (kuvio 4C). Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismeja havaitun solun kasvun pysähtymistä, me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus MS-275 /selekoksibin yhdistelmä solusyklin (kuvio 4D). MS-275 yksin, mutta ei selekoksibin, kasvattanut solun G1 50%: iin 48 tuntia. Kuitenkin MS-275 /selekoksibi yhdistelmä laski merkittävästi (P ​​ 0,001) solujen osuus S-vaiheessa 24 (-74%), 48 (-92%) ja 72 (-82%) ja kasvoi merkittävästi (P ​​ 0,001) osuus G1 vaiheessa 24 (+ 48%), 48 (+ 119%) ja 72 (+ 80%). Validoida Näistä tuloksista analysoitiin western blot ilmentymistä solusyklin markkereita ja löysi selvästi kertynyt p21

WAF1 ja p27

Kip1, kaksi solusyklin estäjät, klo 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun samanaikainen antaminen MS- 275 ja selekoksibi (kuvio 4E). Johdonmukaisesti, The hyperfosforyloitunut muoto pRb oli vähemmän runsasta kun BxPC-3-soluja samanaikaisesti käsiteltiin MS-275 /selekoksibia. Hypophosphorylated muoto pRb esiintyi yhteistyössä esto luokan I HDAC ja COX-2. Koko pRb proteiini katosi 48h jälkeen yhteiskäsittely. Tämä katoaminen oli jo muiden nähtävillä jälkeen p21

WAF1 tai p27

Kip1 kertymistä [44]. E2F1 transkriptiotekijä, joka on S-vaihe orchestrator tuli huomaamaton 48h samanaikaisen antamisen jälkeen MS-275 ja selekoksibi. Nämä tulokset osoittavat, että solujen kasvun inhibitio on assosioitunut G0 /G1 vaiheeseen tukos.

(A) ELISA-määritys PGE

2 soluviljelyalustoissa 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun 1 uM MS-275 ja 10 uM selekoksibihoidon. (B) Aika riippuvia vaikutuksia MS-275 ja selekoksibi solun kasvuun. (C) Aika riippuvia vaikutuksia 1 uM MS-275 ja 10 uM Selekoksibin vaikutukset apoptoottinen solu suhde anneksiini V /PI virtaussytometrialla ja kaspaasi-3 pilkkominen. (D) aika-riippuvainen vaikutukset 1 uM MS-275 ja 10 uM selekoksibi solusyklin PI perustamisesta. (E) Western-blot havaitseminen p21, p27, pRb ppRB ja E2F1 20 ug BxPC-3 proteiinit 6 48h jälkeen 1 uM MS-275 ja 10 uM Selekoksibihoidon. HSC70 käytettiin latauskontrollina. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D., *** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 verrattuna DMSO: ssa tai ilmoitettu olosuhteissa. n≥3 kunkin kunnossa.

BxPC-3 on PDAC solulinja, jolle on ominaista KRAS villityypin, kun taas mutaatiot koodaava geeni tämä proteiini on yleisin geneettinen muutos havaitaan ihmisen PDAC. Kuitenkin BxPC-3-solut yli-ilmentävät COX-2, tilanne todettiin 50% ihmisen PDAC. Olemme päättäneet laajentaa huomioita edun yhdistetyn hoidon haimasyövän tutkimalla tehokkuutta Yhdistetyn hoidon kahdella ihmisen haima solulinjoissa raportoitu KRAS mutaatioita. Ensimmäinen solulinja oli PANC-1 ([12 ASP] -KRAS), jossa COX-2 oli huomaamatta proteiinitasolla [45]. Toinen solulinja oli CFPAC-1 ([12 VAL] -KRAS), mutta jossa COX-2 havaittiin proteiinin tasolla [45].

PANC-1 solulinja viljeltiin MS-275, selekoksibi tai molemmat lääkkeet yhdistelmänä. Selekoksibi 10gM ei muuttanut solujen kasvua, kun MS-275 1 uM vähensi merkitsevästi (p , 001) solujen kasvua 32%. Yhdistelmä kahden lääkkeen vähensi PANC-1 solujen kasvun (49%, P 0,001). Kuitenkin yhdistelmä aiheuttama kasvun esto ei ollut merkittävästi erilainen kuin MS-275-indusoidun yksi (kuvio 5A). Tässä solulinjassa, MS-275 ei indusoida COX-2 (tuloksia ei ole esitetty).

(A) aika-riippuvia vaikutuksia MS-275 ja selekoksibi on PANC-1-solujen kasvua. (B) Aika riippuvia vaikutuksia MS-275 ja selekoksibi on CFPAC-1 solujen kasvua. (C) Western-blot havaitseminen Cox-2, p21, p27 30 ug CFPAC-1 proteiinien 48h kuluttua 1 uM MS-275 ja 10 uM Selekoksibihoidon. HSC70 käytettiin latauskontrollina. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D., *** P 0,001 verrattuna DMSO: ssa tai ilmoitettu olosuhteissa. n≥3 kunkin kunnossa.

CFPAC-1-solulinjaa viljeltiin samoissa olosuhteissa. Selekoksibi 10gM vähennetään solujen kasvua 54% (p , 001) ja MS-275 1 uM vähennetään solujen kasvua 59% (p , 001). Tässä yhdistelmä kahden lääkkeen vähenee merkittävästi (79%, P 0,001) CFPAC-1 solujen kasvua verrattuna joko lääkeainetta yksinään (kuvio 5B). Sitten analysoitiin western blot ilmentymistä COX-2 ja solukierron merkkiaineiden CFPAC-1-soluissa 48h kuluttua lääkkeiden annon. Osoitimme MS-275-indusoidun kertymistä COX-2 kuten BxPC-3-soluissa (kuvio 5C). Löysimme myös kertymistä p21

WAF1 ja p27

Kip1 jälkeen samanaikainen antaminen MS-275 ja selekoksibi (kuvio 5C), mikä viittaa solusyklin pysähtymisen.

BxPC-3 CAM kasvain jäljittelee ihmisen PDAC

arviointi uusien lääkkeiden tai huumeiden yhdistelmistä haimasyöpä kevennetään saatavuus helppoa, eettisesti ja taloudellisesti kestävä eläinmalleissa. Niinpä olemme sitoutuneet jalostamaan ihmisen haiman rakkokalvon (CAM) malli perustuu alunperin työstä [32]. Upottaminen BxPC-3 solujen matrigeeliä ennen CAM implantointia syntyy merkittävä parannus tuumorin tilavuuden. Todellakin, istutuksen jälkeen, tuumorin tilavuus kasvaa lineaarisesti (r

2 = 0,87), kunnes päivänä 7 (kuvio 6A). Tuolloin kasvaimen keräys (päivä 7), keskimääräinen kasvaimen 59,95 ± 15,34 mm

3 (n = 10) havaittiin. BxPC-3 CAM kasvaimia kasvoi sisällä CAM sidekudos ainutlaatuinen pallomainen kyhmy. Samaa menettelyä seurattiin BxPC-3, PANC-1 ja CFPAC-1-solulinjat. PANC-1 ei kasva CAM kun CFPAC-1 kasvoi erittäin pieniä kyhmyjä (1 mm).

(A) Soluja istutettiin CAM alkion päivänä 11 ja otettiin talteen 2, 4, 5, 6 tai 7 päivää istutuksen jälkeen. Makroskooppiset kuvat saatiin samaan suurennos ylhäältä, alhaalta ja sivulta katsottuna. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D., n 5 kussakin ajankohdassa. (B) histologisen (hematoksyliini-eosiinilla tai Massonin trikromi-värjäys) analyysi kasvainten talteen 2, 4, 5, 6 tai 7 päivää istutuksen jälkeen. (C) Immunohistologia kasvaimista 7 päivää BxPC-3 istutusta CAM ja ihmisen PDAC kasvaimia. CK7 = sytokeratiinivasta-7, CK19 = sytokeratiini-19, CEA = Karsinoembryonaalinen antigeeni, PAS = amylaasi-perjodihappo- Schiff värjäystä.

BxPC-3 CAM kasvainhistologiaa (kuvio 6B) osoitti suuria saarekkeet yhtenäinen solut, joista oli kehittyvä keskiontelon ja eristettiin toisistaan ​​kollageenia sisältävä soluväliaineen useita harva fibroblastin kaltaisia ​​soluja, jotka osoittavat, että läsnä on interstitiaalinen strooman.

edelleen vahvistaa meidän ihmisten haiman syöpä CAM mallissa, vertasimme ilmentymisen sytokeratiini-7, -19, -20, CD56, CEA ja Ki67 käyttäen immunohistokemia ihmisen PDAC. Olemme myös tarkistettava musiinin ja proteoglykaanin valmistukseen PAS värjäys. Tuumorisolut sekä BxPC-3 CAM kasvain ja PDAC näytteet olivat vahvasti positiivisia sytokeratiini-7 ja -19, CEA ja Ki67 (kuvio 6C), mutta negatiivinen sytokeratiini-20 ja CD56 (aineistoa ei esitetty). Molemmat kasvaimia olivat positiivisia PAS värjäystä. Kaikkiaan data osoitti huomattavaa histologian ja biologisten merkkiaineiden ilmentymisen yhtäläisyyksiä BxPC-3 CAM malli ja PDAC ihmisen potilaista.

Lisäksi meidän äskettäisen työn kohdistettavaksi biomarkkereita ihmisen PDAC [46] löydetty useita biomarkkereiden ehdokkaiden joukossa myoferlin, transformoiva kasvutekijä beeta-induced ja piilevä-transformoiva kasvutekijä beetaa sitova proteiini 2. immunohistokemia ja western-blot varmisti näiden uusien PDAC biomarkkereita on BxPC-3 CAM kasvaimet (kuvio 7A-B). Lopuksi, käyttäen western blot olemme vahvistaneet HDAC1, HDAC2, HDAC3 ja COX-2 on ilmaistu BxPC-3 CAM kasvain (kuvio 7A).

(A) Western-blot havaitseminen HDAC1, HDAC2, HDAC3 , HDAC7, COX-2, TGFBI, MYOF, LTBP2 20 ug PDAC-CAM tai BxPC-3 proteiineja. HSC70 käytettiin latauskontrollina. (B) Immunoperoxydase merkintöjä MYOF, TGFBI, LTBP2, COX-2.

Seuraava osoittaneet, että kasvaimet olivat toiminnallisesti vascularized. BxPC-3 CAM verisuonten värjättiin FITC-konjugoidulla SNA ja 3D rekonstruoida jälkeen konfokaali hankinnan. BxPC-3 CAM kasvaimet näkyvät verisuonten ympärillä haiman saarekkeiden (kuvio 8A). Fluoresenssi Kasvaimen strooman jälkeen fluoresoivan väriaineen injektion CAM verisuonistossa vahvistaa, että alukset ovat toiminnallisia (kuvio 8B) ja havaitsemiseen desmiinille positiivinen perisyyteissä ehdottaa alus vakauttaminen (kuvio 8C).

(A) Imaris 3D jälleenrakennus alkaen 35 um pinota kuvan jälkeen SNA värjäyksen (vihreä). Tumat laskuri värjättiin DAPI (sininen). (B) konfokaali kuva jälkeen FITC (vihreä) injektion CAM verisuonissa. Tumat laskuri värjättiin TOPRO (sininen) (C) desmiinivasta immunodetektioon (punainen) in PDAC-CAM värjätty SNA (vihreä). Tumat laskuri värjättiin DAPI (sininen).

Seuraavaksi BxPC-3 kasvaimia käsiteltiin alkaneet päivä 2 joko 8 uM selekoksibia tai 0,2pM MS-275 tai yhdistelmä kahdesta huumeita niiden vastaavissa konsentraatioissa. MS-275 pitoisuus valittiin sovi plasman pitoisuus mitattuna Human on 5 mg /m

2 viikoittain annosteluaikatauluun [15]. Kun selekoksibi ei vaikuttanut kasvaimen kasvua, MS-275 yksinään indusoi vähentynyt kasvaimen kasvua 50%: lla (P 0,001), ja indusoi ilmentymistä COX-2. Yhdistelmä selekoksibi ja MS-275 poistetaan kokonaan (P 0,001) kasvaimen kasvua, mikä johtaa ei muutosta tuumorin tilavuuden verrattuna hoidon alussa (kuvio 9A-B). Kasvaimet käsiteltiin MS-275 yliekspressoitu COX-2 (kuvio 9C). Kasvaimet käsiteltiin yhdistelmällä selekoksibia ja MS-275 paljasti tyhjät tilat sisällä kasvain. (Kuva 9D). Sitten kysyi, onko tämä on hidastanut kasvaimen supistuminen johtuu apoptoosin induktioon tai leviämisen pidätykseen. Kasvaimet käsiteltiin MS-275, selekoksibi tai molempien lääkkeiden jätettiin pilkotun kaspaasi-3 havaitseminen ja leimattiin Ki67. Täyspitkä kaspaasi-3 havaittiin kaikissa näytteissä, mutta ei lohkaista kaspaasi-3 havaittiin (kuvio 9E).