Krooninen sairaus

tiivistelmä

Osoitimme ensimmäistä kertaa erinomainen kyky rosiglitatsonin välittäjänä syvällinen parantamiseksi LA-12: n indusoiman apoptoosin liittyy aktivaatio mitokondrioiden reitin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tämä vaikutus ensisijaisesti havaittiin G1 solusyklin vaihe, riippumaton p53 ja PPARy proteiineja, ja mukana merkittäviä muutoksia valittujen Bcl-2-perheen proteiinin tasoja. Edelleen stimulaatio yhteistoiminnan synergisiä sytotoksisen toiminnan rosiglitatsonin ja LA-12 osoitettiin soluissa puutteellinen varten PTEN, joissa mitokondrioiden apoptoottista polku oli stimuloitua ja G1-vaiheen liittyvä kuolevien vahvistui. Tuloksemme viittaavat siihen, että yhdistetyn rosiglitatsoniannokset ja LA-12 voisi olla lupaava syövän vastaista strategiaa paksusuolen johdettuja kasvainten riippumatta p53 aseman, ja myös suotuisa niissä puutteellinen PTEN toiminto.

Citation: Lauková J, Kozubík A, Hofmanová J, Nekvindová J, Sova P, Moyer MP, et al. (2015) menetys PTEN Helpottaa Rosiglitatsoni välittämää Enhancement of Platinum (IV) kompleksi LA-12: n indusoiman apoptoosin in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 10 (10): e0141020. doi: 10,1371 /journal.pone.0141020

Editor: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2015 Hyväksytty: 02 lokakuu 2015; Julkaistu 22 lokakuuta 2015

Copyright: © 2015 Lauková et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Tšekin tiedesäätiön (15-06650S) (https://www.gacr.cz, AHV) sekä IGA ministeriön terveys- Tsekin (NT 11201-5 /2010) (https://iga.mzcr.cz, AK). Platinum Pharmaceuticals, a.s. (Dr. Petr Sova) ja INCELL Corporation LLC (Dr. Mary Pat Moyer) tukenut muodossa tutkimusaineisto, ja niiden erityinen rooli on myös esitetty eurooppalaisen Kirjoittaja maksut osa online-lomakkeella.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Petr Sova on työntekijä omistavan yhtiön immateriaalioikeuksia koskevat LA-12 ja mukana kirjoittamassa patenttien alalla LA-12. Mary Pat Moyer on työntekijä omistavan yhtiön immateriaalioikeuksia koskevat NCM460 solulinjassa. Nämä kaupalliset liitokset eivät muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (PPARy) on jäsen ydin- hormonin reseptoriin superperheen ligandin transkriptiotekijöitä, jotka ovat mukana energia-aineenvaihdunnan säätelyyn, syövän kehitystä ja anti-inflammatorinen vaste [1]. Vaikka tärkein tehtävä PPARy on esitetty adiposyyttien erilaistumiseen ja insuliini herkistymistä [2], PPARy on myös hyvin tiedetään vaikuttavan kasvuun ja solukierron [3, 4], erilaistumiseen [5] ja apoptoosin [6] erilaisten syöpäsolujen kuten paksusuoli-. Samoin kuin adiposyyttien, PPARy ilmentyminen säilyy myös suhteellisen korkealla tasolla useissa ihmisen paksusuolen syövän solulinjat ja primaariset paksusuolen kasvaimissa [7]. Mutaatiot PPARy geeni on raportoitu harvinainen tapahtuma ihmisen maligniteettien kuten paksusuoli- [8]. On ehdotettu, että PPARy aiheuttama geeni sääntely saattaa myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn, mutta tämän merkitystä reseptorin reitin paksusuolen syövän kehittymisessä ja hoidossa on edelleen kiistanalainen.

rosiglitatsoni, synteettinen ligandi PPARy on laajalti käytetty anti -diabetic agentti perheen huumeita kutsutaan tiatsolidiinidionien. Koska sen kyky estää proliferaatiota ja /tai aiheuttaa syöpää solukuoleman, rosiglitatsonia on myös tutkittu lukuisissa tutkimuksissa keskitytty syövän hoidossa. Vaikka riittämätön antitumor tehokkuutta rosiglitatsonia on osoitettu monissa tapauksissa, kun niitä käytetään monoterapiassa, sen potentiaalin adjuvanttina yhdessä säteilyn [9] tai eri antineoplastisten aineiden on raportoitu. Rosiglitatsoni parantaa paksusuolen syöpäsolu herkkyyttä sytotoksisille vaikutuksille 5-FU: [10], sytokiinin TRAIL [11], tai all-trans-retinoiinihappo [12]. Mielenkiintoista on, että lisäaine /synergicanticancer vaikutuksia rosiglitatsonin ja tavanomaisesti käytetään platinapohjaista lääkkeiden sisplatiini tai karboplatiini on osoitettu koolon-, keuhko- tai munasarjasyöpä solulinjoja

in vitro

[13, 14]. Yhdistelmä karboplatiinin ja rosiglitatsonin vähensi polyyppi muodostumista hiirillä malli azoxymethane aiheuttaman paksusuolen syövän synty [13], kasvaimen koko nude-hiirissä, joilla injektoidaan subkutaanisesti A549 keuhkosyövän soluista peräisin ksenografteissa [13], tai indusoi regression K- Ras-odotuksiin hiiren keuhkon adenokarsinooman [14]. Esikäsittely rosiglitatsoni myös synergized syövän vastaista aktiivisuutta sisplatiinin DMBA aiheuttama nisäkasvaimia rotilla [15]. Vaikka jotkut molekyylitason mekanismeista näitä vaikutuksia on ehdotettu, monet heistä vielä epäselviä. Lisäksi täydellinen puuttuminen tietojen olemassa koskien mahdollisia osuuskunta syöpää ehkäisevistä vaikutuksista rosiglitatsonin kanssa uusia platinapohjaisen kemoterapeuttisten.

LA-12, (OC-6-43) -bis (asetato) (1- adamantyyliamiinin) amminedichloroplatinum (IV), edustaa äskettäin platina (IV) kompleksi, joka sisältää tilaa vievä hydrofobinen ligandia 1-adamantyyliamiinia, joka mahdollistaa sen korkeampi hydrofobisuus verrattuna muihin platinapohjaiseen lääkkeet, kuten sisplatiinin [16]. Toiminnan LA-12 on tutkittu intensiivisesti meidän ja muiden sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja tulokset korostanut suotuisa syövän vastaista potentiaalia useiden tavanomaisesti käytetään platinapohjaisen kemoterapia-lääkkeet [17]. LA-12 aiheutti voimakkaan sytotoksisen vaikutuksen erilaisissa sisplatiini kestävä syöpäsolun linjat eri alkuperää kuten paksusuoli- [18-20]. Lisäksi, LA-12 voisi voittaa yhtymäkohdassa riippuvainen vastus paksusuolen syövän soluja, jotka on kuvattu platina (II) yhdisteet, sisplatiinin ja oksaaliplatiinin [21]. Olemme lisäksi osoittaneet, että suurempi teho LA-12 koolonkarsinoomasoluissa liittyi sen kyky voittaa lohkon M-vaihe tulo laukaisi oksaliplatiinin jotta korjata soluvauriot [22]. Viime aikoina olemme raportoitu korkeammalla /ainutlaatuinen kyky LA-12 verrattuna sisplatiiniin aiheuttavan säätelyä useita tärkeitä proteiineja, jotka liittyvät apoptoosin asetuksessa kuten Noxa, Bim, c-Myc tai DR5 [23, 24]. Lisäksi ottoa solun sisään LA-12 on osoitettu nopeammin ja tehokkaammin verrattuna sisplatiiniin, ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [25]. Lupaava syövän vastaisia ​​ominaisuuksia LA-12: n osoitettiin myös

in vivo

nude-hiirissä, joilla on ihmisen ksenografteja paksusuolen, eturauhasen ja munasarjojen alkuperää, jossa LA-12 oli tehokkaampi tuumorin poistamista verrattuna satraplatin [26]. Kuitenkaan ei yksityiskohtaista molekyylitason mekanismeja sytotoksisen ja sytostaatit toimintaa LA-12 koolonkarsinoomasoluissa vielä täysin ymmärretä, eivätkä sen sovellusmahdollisuuksia yhdistelmähoitoa.

Tässä tutkimuksessa olimme ensimmäistä osoittaa kykyä rosiglitatsonin stimuloida antiproliferatiivisia ja apoptoottisen vasteen laukaisee LA-12 HCT116 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa. Olemme tutkineet molekyylimekanismeja vastuussa osuuskunnan toiminnan huumeiden kanssa keskittyen erityisesti modulaatio solusyklin etenemisen, PTEN osallistuminen ja aktivointi mitokondrioiden apoptoottisen reitin. Sytotoksinen vasteesta, jonka rosiglitatsonin ja LA-12 tutkittiin myös muissa koolonkarsinoomasoluissa linjat ja solut ovat peräisin normaalista paksusuolen epiteelissä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

Ihmisen paksusuolen adenokarsinooman solulinjoja HCT116 p- (p53

+ /+, Bax

+/-, Chk2

+ /+, PTEN

+ /+), p53

– /-, Bax

– /-, Chk2

– /- ja PTEN

– /- (saatu professori Bert Vogelstein, John Hopkins University, Baltimore, MD, USA, ja T. Waldman , Georgetown University School of Medicine, Washington, USA, 2007) [27] [28] pidettiin McCoy’s 5A väliaineessa (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, USA), jota oli täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml) ja 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta ja Gibco, Invitrogen). Ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa DLD-1 (ATCC, CCL-221, saatiin vuonna 2009) ja RKO (ATCC, CRL-2577, saatiin vuonna 2007) ylläpidettiin RPMI tai DMEM (molemmat Gibco, Invitrogen, Life Technologies), tässä järjestyksessä, täydennettynä penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml) ja 10% FBS: ää. NCM460 aikuiselle ihmiselle normaalia paksusuolen epiteelin-solulinjaa saatiin (vuonna 2010), jonka materiaalin siirto sopimuksen INCELL Corporation (San Antonio, Texas, USA) [29], ja rutiininomaisesti lisätyistä standardiolosuhteissa M3: 10TM keskipitkän (INCELL Yhtiö). Soluja viljeltiin TPP (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sveitsi) viljely astiat, pullot tai levyjä kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO

2, siirrostettiin kahdesti viikossa altistumisen jälkeen EDTA /PBS ja trypsiini ratkaisuja. Määrä soluja määritettiin käyttäen CASY Model TT-Cell Counter ja Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Saksa).

Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen solut esikäsiteltiin (24 h) ja 50 uM rosiglitatsonin (RGZ ) (5 – [[4- [2- (metyyli-2-pyridinyyliamino) etoksi] fenyyli] metyyli] -2,4-tiatsolidiinidioni, Cayman Chemical, Michigan, USA) ja sen jälkeen käsiteltiin (48 h) ja 0,75 uM LA- 12 ([(OC-6-43) bis (asetato) (1-adamantyyliamiinia) aminedichloroplatinum (IV)], Platinum Pharmaceuticals, kuten, Brno, Tsekin tasavalta). MEK1 /2 Inhibitor U0126 (# 9903, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ja yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk (# 550377, BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, USA) lisättiin soluihin 1 h ennen hoidon RGZ. Kantaliuokset laimennettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma-Aldrich, Praha, Tsekin tasavalta).

Solun transfektio ja RNA-interferenssi

RNA transfektiot suoritettiin käyttäen X-tremeGENE siRNA transfektioreagenssia (Roche, Basel, Sveitsi) tai Lipofectamine ™ 2000 transfektioreagenssi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan suositusten mukaisesti. Solut ympättiin McCoyn elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää, ilman antibiootteja, ja inkuboitiin yön yli. Vähän ennen transfektioväliaine muuttunut Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco, Invitrogen). Solut transfektoitiin 100 nM siRNA-dupleksit suunnattu PPARy (# 29455, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) tai ei-kohde ohjaus siRNA (# 37007, Santa Cruz Biotechnology). 4 tunnin jälkeen elatusaine vaihdettiin ja McCoyn elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää (PAA Laboratories GmbH ja Gibco, Invitrogen) ja antibiootteja. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut esikäsiteltiin (24 h) RGZ ja sitä käsiteltiin sen jälkeen (48 h) ja LA-12.

immunoblottaus-analyysi

Solut hajotettiin 1% SDS-lyysipuskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (# P2714, Sigma-Aldrich), tai proteaasiestäjäseostabletit Set I (# 5391313, Calbiochem, Merck Millipore, Bedford, MA, USA), ja fosfoproteiinin havaitsemiseen NAvó

4 ja NaF lisättiin lyysausliuos. DC ™ Protein Assay (# 500-0113, Bio-Rad Laboratories, Praha, Tsekin tasavalta) käytettiin proteiinien kvantifiointiin. Proteiinit erotettiin sitten 15% SDS-polyakryyliamidigeelillä, ja blotattiin PVDF-kalvolle (Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa tai BSA: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin TBS: llä (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI ja 0,1% Tween), ja niitä inkuboitiin yön yli primaaristen vasta-aineiden laimennettu 5% ei- kevytmaitoa 4 ° C: ssa. Immunodetektio suoritettiin käyttäen seuraavia primaaristen vasta-aineiden: hiiren monoklonaalinen anti-p53 (1: 000, DO-1, # 126) nostetaan aminohappoja 11-25 p53 ihmisestä peräisin, polyklonaalista kanin anti-Akt (1: 500, # 8312) aminohappoja 345-480 Akt1 ihmisperäisiä, monoklonaalisia hiiren anti-sykliini B1 (1: 1000, # 245) vastaan ​​rekombinanttiproteiinin, joka vastaa ihmisen sykliini B1, monoklonaalinen hiiren anti-sykliini D1 (1: 1000, # 20044), rekombinantti ihmisen täyspitkän proteiinin, monoklonaalinen hiiren anti-PTEN (1: 500, # 7974) aminohappoja 388-400 PTEN ihmisestä peräisin, kanin polyklonaalista anti-p21 (1: 000, # 397) vastaan ​​nostetut peptidi kartoitus on C-päähän p21 ihmisestä peräisin, kanin polyklonaalista anti-p27 (1: 1000, # 528) peptidiä vastaan ​​nousseen kartoitus C-päähän p27 ihmisestä peräisin (kaikki Santa Cruz Biotechnology), polyklonaaliset kanin anti-fosfo-Akt (Ser473) (1: 500, # 9271) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen fosfo-peptidi, joka vastaa tähteitä ympäröiville Ser473 hiiren Akt-puhdistettiin proteiini-A, polyklonaalista kanin anti-Bak (1: 1000, # 3792) on tuotettu immunisoimalla kaneja synteettisellä peptidillä (KLH-kytketty), joka vastaa amino-terminaaliset tähteet ihmisen Bak-proteiini puhdistettiin proteiini A, polyklonaalista kanin anti-Bax (1: 1000, # 2772) on tuotettu immunisoimalla eläimet, joilla on synteettinen peptidi (KLH-kytketty), joka vastaa amino-terminaaliset tähteet ihmisen Bax-puhdistettiin proteiini-A, polyklonaalista kanin anti-Bid (1: 1000, # 2002) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi (KLH- kytketty), joka vastaa tähteitä ympäröiville pilkkomiskohdan ihmisen Bid-puhdistettiin proteiini-A, monoklonaalinen kanin anti-Bim (1: 1000, # 2933) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa tähteitä ympäröiville Pro25 ja Bim, monoklonaalinen hiiren anti -Chk2 (1: 000, # 3440) on tuotettu immunisoimalla eläimiä katkaistun rekombinantti GST-Chk2, polyklonaalista kanin anti-katkaistuun kaspaasi-3 (1: 500, # 9661) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa amino-terminaali tähteet vieressä (Asp175) ihmisen kaspaasi-3, polyklonaalista kanin anti-katkaistuun kaspaasi-9 (1: 500, # 9505) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa aminopään tähteiden ympäröivän ja Asp330 inhimillisten kaspaasi-9 – puhdistettiin proteiini-A, polyklonaalista kanin anti-ERK (1: 1000, # 9102) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi (KLH-kytketty), joka on peräisin sekvenssin C-terminukseen rotan p44 MAP Kinase-puhdistettiin proteiini A polyklonaaliset kanin anti-fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (1: 1000, # 9101) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen fosfo-peptidi, joka vastaa tähteitä ympäröiville Thr202 /Tyr204 ihmisen p44 MAP-kinaasilla puhdistettiin proteiini A polyklonaaliset kanin anti-katkaistuun PARP (Asp214) (1: 1000, # 9541) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa karboksipäähän tähteet ympäröivän Asp214 ihmisen PARP-proteiini puhdistettiin proteiini A, polyklonaalista kanin anti-peroxisome proliferator- aktivoituvan reseptorin γ (PPARy) (1: 500, # 2435) on tuotettu immunisoimalla kaneja synteettisellä peptidillä, joka vastaa tähteitä ympäröiville Asp69 ihmisen PPARy, polyklonaalista kanin anti-Puma (1: 1000, # 4976), joka on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa karboksipään alue, ihmisen Puma-puhdistettiin proteiini-A, monoklonaalinen kanin anti-surviviiniperäisten (1: 1000, # 2808) on tuotettu immunisoimalla eläimiä synteettinen peptidi, joka vastaa tähteitä ympäröiville kysteiinin 60 ihmisen surviviinin ( kaikki Cell Signaling Technology), hiiren monoklonaalinen anti-Noxa (OP180; Calbiochem-MERC, Praha, Tsekin tasavalta) kanssa immunogeenillä GST-fuusio ihmisen yhdistelmä-Noxa, hiiren anti-sytokromi c (1: 500, # 556433, BD Pharmingen ™, San Jose, USA) kanssa synteettisiä peptidejä kyyhkynen sytokromi C immunogeeni, monoklonaalinen hiiren anti-kompleksi IV alayksikkö II (anti-cyt oksidaasi alayksikkö II) (# A-6404, Invitrogen ™, Life Technologies) ihmisen kompleksi IV alayksikkö II immunogeeninä. Kalvot pestiin sitten ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineilla anti-hiiri-IgG: tä (1: 3000, # NA931) ja anti-kani-lgG-vasta-ainetta (1: 3000, # NA934) (molemmat Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 1 h RT: ssä. Havaitsemisen vasta-aineen komplekseja suoritettiin piparjuuriperoksidaasiin substraattien Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (# WBKLS0500, Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Anti-β-aktiini-vasta-ainetta (1: 5000, A5441, Sigma-Aldrich), jossa on hieman muutettu β-sytoplasminen aktiini N-terminaalinen peptidi, Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile- Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys, konjugoitu KLH immunogeeninä, käytettiin latauskontrollina.

solufraktioiden valmistus

solut kerättiin trypsinoimalla, sentrifugoitiin 200 g 5 min, suspendoitiin uudelleen osa puskuriin (150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0,2 mM EGTA, 5 mM Tris ja 0,01% digitoniinia pH 7,2-7,4), ja jätettiin huoneenlämpötilaan 20 min hajottavat. Hajotetut solut sentrifugoitiin 13 000 rpm: llä, supernatantit käytettiin sytoplasmisen jakeet ja pelletit suspendoitiin uudelleen samaan määrään osa puskuria sekoitetaan 4x Laemmlli puskuria, keitettiin 10 min ja näytteitä sen jälkeen, kun proteiinin määrän käytettiin immunoblottauksella analyysissä.

Analyysi mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) B

Detection of MMP suoritettiin käyttäen 0,2 uM tetrametyylirodamiini etyyliesteri perkloraatti (TMRE, Molecular Probes®, Eugene, OR, USA), kuten aiemmin on kuvattu [30] ja analysoitiin virtaussytometrillä (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Tiedot arvioitiin CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson) ja tulokset ilmaistiin prosenttiosuudet solujen vähentynyt MMP.

anneksiini V /propidiumjodidia apoptoosimäärityksessä

ulkoistaminen fosfatidyyliseriinin markkerina apoptoosin, solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja värjättiin anneksiini V FITC-konjugoitu vasta-aine (# ANXV-FT100, Apronex, Praha, Tsekin tasavalta) 20 minuutin ajan RT: ssä valmistaa erityisiin toimitetun puskuri. Juuri ennen määritystä, 5 ug /ml propidiumjodidia (PI) (# P-4170, Sigma-Aldrich) lisättiin. Fluoresenssi mitattiin sitten käyttämällä virtaussytometriä (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson). Käyttämällä Cell Quest ohjelmisto, tulokset ilmaistiin prosenttiosuutena solujen positiivisia anneksiini V: n ja negatiivisia propidiumjodidilla (apoptoottisten).

Solusyklianalyysiä

Soluja käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [22], ja analysoitiin virtaussytometrialla (FACSVerse

TM, Becton Dickinson); vähintään 20 000 tapahtumaa kerättiin näytettä kohti. Aineisto analysoitiin ModFit LT versio 3.1 -ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Roskat ja dubletti solut ulkopuolelle ja vain yksittäisiä soluja otettiin solusyklin analyysi. Tulokset ilmaistiin prosentteina solujen G1, S ja G2 /M-vaiheessa.

Aktiivinen kaspaasi-3 havaitseminen

Solut kerättiin, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin ja värjättiin FITC aktiivinen kaspaasi-3 apoptoosin kit (# 550480, BD Pharmingen ™) mukaan val- mistajan protokollaa. Solujen prosenttiosuus, joilla on aktiivinen kaspaasi-3 havaittiin virtaussytometrialla (FACS jae

TM, Becton Dickinson) ja analysoitiin BD FACSuite ohjelmistoversion 1.0.5 (Becton Dickinson).

Samanaikainen havaitseminen aktiivisen kaspaasi-3 ja solusyklin etenemisen

solut kerättiin, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin ja värjättiin FITC aktiivinen kaspaasi-3 apoptoosin kit (# 550480, BD Pharmingen ™) mukaan val- mistajan protokollaa. Tämän jälkeen solut pestiin ja värjättiin propidiumjodidilla solusyklin analyysi edellä kuvatulla tavalla. Prosenttiosuus soluja G1, S ja G2 /M-vaiheeseen, joilla on aktiivinen kaspaasi-3 havaittiin virtaussytometrialla (FACS jae

TM, Becton Dickinson) ja analysoitiin BD FACSuite ohjelmistoversion 1.0.5 (Becton Dickinson).

RNA: n eristys ja reaaliaikaisen RT-PCR

RNA: n eristämistä.

Heti kokoelma, 1×10

6 solut suspensoitiin 200 ul PBS, homogenisoitiin 400 pl kit Lysis /Binding Buffer ja pakastettiin -80 ° C: ssa siihen asti, kun RNA: n eristämistä. Kokonais-RNA: eristäminen suoritettiin käyttäen korkean Pure RNA Isolation Kit (Roche, Sveitsi) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA määrä ja puhtaus arvioitiin UV-spektroskopialla ja alikvootti RNA käänteisesti cDNA: ksi.

cDNA-synteesi.

cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Sveitsi) valmistajan ohjeiden käyttäen jos oligo-dT-alukkeita (1 ui) ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita (2 ui) kokonaistilavuudessa 20 ui.

Real-Time kvantitatiivinen PCR.

0,5 ui kutakin cDNA: ta analysoitiin kvantitatiivisella PCR: llä käyttäen TaqMan Gene Expression Master Mix ja TaqMan Gene Expression määritykset (Life Technologies, USA) CCND1, sykliini D1 (Hs00765553_m1), BIRC5, surviviini (Hs04194392_s1), CDKN1A, p21 (Hs00355782_m1), CDKN1B, p27 (Hs01597588_m1), CCNB1, sykliini B1 (Hs01030099_m1), HPRT1 (Hs99999909_m1) valmistajan ohjeiden yhteensä reaktiossa 10 ui. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin kolmessa tekninen rinnakkaisnäytettä on RotorGene 6000 instrumentti (Corbett Life Science, Australia). PCR terminen profiili oli seuraava: 50 ° C 2 min (UDG inkubointi), 95 ° C: ssa 10 min (entsyymin aktivointi), jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. NTC ja RT kontrollia sisällytettiin kuhunkin aikavälillä. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen ddCt menetelmää HPRT1 käytettiin housekeeping-geeni.

Tilastotiedot analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SEM of kolmen erillisen kokeen, ja tilastollisesti analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Fisherin pienin merkitsevä ero (LSD) testi tilastollinen merkitsevyys p 0,05 käyttäen Statistica- for Windows ohjelmisto, V 10 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) .

jotta voidaan tutkia tarkemmin vuorovaikutteinen (synergia tai additiivisuutta) sytotoksisten vaikutusten välillä huumeiden, tulokset apoptoosin analyysin (anneksiini V /propidiumjodidi määrityksessä, virtaussytometria, prosenttiosuus anneksiini V positiivinen, propidiumväriä jodidi negatiivinen HCT116-solut) minkä useiden eri rosiglitatsonia (jopa 75 uM) ja LA-12 (enintään 1,5 uM) tai niiden yhdistelmät tutkittiin. Rakentaminen regressio käyriä ja niiden laskemista ja equieffective määriä aineita seoksessa tehtiin käyttäen isobolographic analyysi GraphPad Prism 6 ohjelmisto. Lääkkeen annokset riittävät synergistinen vaikutus laskettiin ja tyypin vaste määritettiin.

Tulokset

RGZ parannettu HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsolu herkkyyttä LA-12-indusoiman kaspaasi-riippuvaista apoptoosia

esikäsittely HCT116 ihmisen wt adenokarsinoomasolulinja rosiglitatsonilla tehokkaasti stimuloi LA-12: n indusoiman apoptoosin, mistä on osoituksena huomattava kasvu prosentteina solujen erityisiä fosfatidyyliseriinin eriyttämisestä (kuvio 1A, S1 kuvassa), ja pilkkominen kaspaasi-3 ja sen alustan PARP (kuvio 1B). Isobolographic analyysi apoptoottisen vasteen HCT116-solujen useita erilaisia ​​annoksia rosiglitatsoni ja LA-12 käytetään yhdessä (katso materiaalit ja menetelmät), osoitti selvästi, merkittävä synergistinen vaikutus (tuloksia ei ole esitetty). Käyttäen pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk, olemme vahvistaneet, että apoptoottisen vaikutusten lääkeyhdistelmän täysin riippuvainen kaspaasin aktivaation (kuvio 1A ja 1 B). Merkittävä stimulaatio apoptoottisen vaikutusten (fosfatidyyliseriini ulkoistaminen) aiheuttama LA-12 ja rosiglitatsonin yhdistelmä verrattuna yksittäisten lääkkeiden osoitettiin myös ihmisen koolonin adenocarconima DLD-1 ja RKO solulinjoissa (kuvio 1C).

(a) prosentuaalinen apoptoottisten (anneksiini V positiivinen /propidiumjodidia negatiivinen, virtaussytometria) HCT116 p- soluissa ja (b) pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP (Western blotting) esikäsittelyn jälkeen (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM) ja seuraavaksi käsittelemällä (48 h) ja LA-12 (0,75 uM), puuttuessa (DMSO) tai sen läsnä ollessa z-VAD-fmk (10 gM). (C) Prosenttia apoptoottisten (anneksiini V positiivinen /propidiumjodidia negatiivinen, virtaussytometria) RKO tai DLD1 solujen esikäsittelyn jälkeen (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM) ja sen jälkeinen käsittely (48 h) ja LA-12 (0,75 uM ). Tulokset ovat keskiarvoja + SEM tai edustajat kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkitys: P 0,05, * kohdalla kontrollia, ‡ vs. RGZ, Ο versus LA-12, ja Δ varten /ilman z-VAD-fmk.

Mitochondria pelata korvaamaton rooli parantamiseksi HCT116 solun apoptoosin kuluessa niiden yhdistettynä rosiglitatsoniannokset ja LA-12

apoptoottista vastetta HCT116 paino- käsiteltyjen solujen rosiglitatsonin ja LA-12 liittyi stimulaation mitokondrioiden reitin, kuten on osoitettu tehostetun sytokromin c vapautumiseen osaksi sytoplasmassa (kuvio 2A), lohkaisu kaspaasi-9 (kuvio 2B) ja tippa MMP (kuvio 2C). Toiminnallinen rooli mitokondrioiden vahvistettiin edelleen käyttäen HCT116 Bax – /- solut, joissa apoptoottisen vaikutusten lääkeyhdistelmän merkittävästi tukahdutetaan. Tämä osoitettiin tukos kaspaasin 9 ja PARP pilkkominen (kuvio 2B), ja pisara MMP (kuvio 2C) in HCT116 Bax – /- solut käsiteltiin rosiglitatsonin ja LA-12 verrattuna niiden paino kollegansa. Jälkeen HCT116 paino- solu Lääkehoito yhdistelmä, kohonnut taso proapoptoottisten BH3 vain proteiineja Noxa ja Bim (23 ja 15 kDa, mikä vastaa EL ja L muoto, vastaavasti) havaittiin, kun taas taso Puma ja Bid pysynyt pääosin ennallaan. Lievää Bax ja Bak-proteiinin taso näkyi myös LA-12-käsiteltyjen HCT116 wt-soluja (kuvio 2D).

(a) vapauttaminen sytokromi c sytoplasmaan (solulimafraktio) ja HCT116-solujen esikäsitellyt (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM) ja sen jälkeen käsiteltiin (48 h) ja LA-12 (0,75 uM), havaitaan Western blottauksella jälkeen solufraktioinnin. (B) lohkaisu kaspaasi-9, PARP, Bax-proteiinin taso (Western blotting), ja (c) muutokset mitokondrion kalvon potentiaali (MMP, virtaussytometria) in HCT116 paino ja Bax – /- solut käsiteltiin kuten a). (D) taso Noxa, Bim, Puma, Bid, Bax ja Bak proteiinia (Western blotting) in HCT116 p- soluissa käsiteltiin kuten a). Tulokset ovat keskiarvoja + SEM tai edustajat kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkitys: P 0,05, *: lla kontrolliryhmään verrattuna, ‡ verrattuna RGZ tai Ο versus LA-12, ja Δ wt versus Bax – /- solut.

Euroopan rosiglitazone- ja LA-12: n indusoiman apoptoosin tapahtuu ensi sijassa G1 vaihe HCT116 solusyklin

samanaikainen virtaussytometria-analyysi solun apoptoosin (kaspaasi-3 pilkkominen) ja solusyklin osoitti, että käsiteltyjen solujen lääkeyhdistelmän edullisesti kuolee G1 (ja vähäisessä määrin myös S ) vaiheen (kuvio 3A ja 3B). Olosuhteissa Bax: n puutos, huomattavasti pienempi prosenttiosuus käsiteltyjen solujen lääkeyhdistelmän tehtiin apoptoosin verrattuna niiden Bax ilmentävät kollegansa, ja nämä apoptoottisten solujen olivat G1 solusyklin vaiheessa (kuvio 3A).

( a) kaspaasi-3 aktivaation (% kaikista soluista aktiivisella kaspaasi-3) liittyvät solusyklin etenemisen (virtaussytometria) in HCT116 paino ja Bax – /- solut seuraavat niiden esikäsittelyn (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM ), ja seuraava käsittely (48 h) ja LA-12 (0,75 uM) (b) prosentuaalinen apoptoottisten solujen (aktiivinen kaspaasi-3) in G1 solusyklin vaiheessa määrällistä dataa). Tulokset ovat keskiarvoja + SEM tai edustajat kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkitys: P 0,05, *: lla kontrolliryhmään verrattuna, ‡ vs. RGZ, Ο versus LA-12, ja Δ wt versus Bax – /- solut.

p53 ja Chk2 voi toimia tärkeänä solukierron (mukaan lukien G1 tai M-vaihe tulo) ja apoptoosisäätelijät, tutkimme niiden mahdollinen osallistuminen modulaatio rosiglitatsonin välittämää parantamiseksi HCT116 solun herkkyyttä LA-12: n indusoiman apoptoosin. Tuloksemme osoittivat, että sekä p53 ja Chk2 ovat tarpeeton apoptoosin laukaisi lääkeyhdistelmä, koska vastaavia vaste (kaspaasi-3, kaspaasi-9, PARP pilkkominen) havaittiin vanhempien ja asianmukaista tyrmätä (p53 – /-, Chk2- /-) solulinjoja (kuvio 4).

lohkaisu kaspaasi-9, kaspaasi-3, PARP ja taso Chk2 ja p53-proteiinien ilmenemistä HCT116 paino, Chk2 – /- ja p53 – /- solut esikäsiteltiin (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM), ja sen jälkeen käsiteltiin (48 h) ja LA-12 (0,75 uM), havaittiin Western blottauksella. Tulokset ovat edustajia kolmen erillisen kokeen.

PTEN puutos tuettu G1 vaiheeseen liittyvä parantamiseksi mitokondrioiden riippuvaisten indusoiman apoptoosin rosiglitatsoni ja LA-12 HCT116-soluissa

Yhdistetty hoito HCT116 p- solujen rosiglitatsoni ja LA-12 aiheuttama lasku PTEN tasolla (kuvio 5A), joka liittyy lisääntynyt aktivaatio Akt (fosforylaation at Ser473), ilman muutoksia koko proteiinikinaasi tasolla (S2 Kuva). Sen tutkimiseksi, toiminnallista roolia PTEN, sytotoksisen vastaus lääkeyhdistelmän verrattiin HCT116 soluissa, jotka ilmentävät tai puuttuu proteiinia. HCT116 PTEN – /- solut olivat herkempiä apoptoottisen vaikutusten LA-12 yksin ja vielä enemmän sen yhdessä rosiglitatsonin, kuten osoitti vahvistetulla PARP ja kaspaasi-9 pilkkominen (kuvio 5A), ja lisääntynyt pisara mitokondrion kalvon potentiaali (kuvio 5B) verrattuna niiden HCT116 paino- kollegansa. Edulliseen tappaminen G1-solukierron vaiheen aiheuttama lääkeaineen yhdistelmän HCT116-p- soluissa oli edelleen vielä tuettu ilman PTEN, joissa prosenttiosuus apoptoottisten solujen (kaspaasi-3 aktivaatio) kasvoi merkittävästi (kuvio 5C). Stimulaatio lääkeyhdistelmän aiheuttama G1-vaiheen liittyvät apoptoosin näkyi myös myöhemmin olevia hoitoja (tuloksia ei ole esitetty).

(a) Pilkkominen PARP, kaspaasi-9 ja PTEN tasolla (Western blotting), (b) muutokset mitokondrion kalvon potentiaali (MMP, virtaussytometria), ja (c) prosentuaalinen apoptoottisten solujen (aktiivinen kaspaasi-3) in G1 solusyklin vaihe HCT116 paino- tai PTEN – /- solut esikäsitellyt (24 h) kanssa rosiglitatsonin (RGZ, 50 uM), ja sen jälkeen käsiteltiin (48 h) ja LA-12 (0,75 uM). (D, e) Prosenttia HCT116 paino- ja PTEN – /- solut yksittäisissä solusyklivaiheista (virtaussytometrialla) käsittelyjen jälkeen määritelty A-C). Tulokset ovat keskiarvoja + SEM tai edustajat kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkitys: P 0,05, *: lla kontrolliryhmään verrattuna, ‡ vs. RGZ, Ο versus LA-12, ja Δ wt versus PTEN – /- solut.

Vaikka rosiglitatsonin yksinään ei vaikuta solusyklin jakautumisen verrattuna kontrolliin, havaitsimme merkittävä lasku prosentteina HCT116 p- solujen G1 vaiheessa, ja samanaikainen kasvu G2 /M jälkeinen altistuminen LA-12 tai sen yhdessä rosiglitatsonin (kuvio 5D). Kolmen riippumattoman kokeen. Kolmen riippumattoman kokeen.