Krooninen sairaus

tiivistelmä

puutteet ATM-geeni ovat perimmäinen syy ataksia telangiectasia, oireyhtymä ominaista neurologinen, moottori- ja immunologisia puutteita, ja syöpäherkkyys. MikroRNA (miRNA) ovat hyödyllisiä työkaluja syövän profiloinnin ja ennustaminen terapeuttisen vaikutuksen kliiniseen hoito. Tutkimme seuraukset ATM vajauksen miRNA ilmaisun ja liittyvän geenin ilmentymistä normaaleissa ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen (HME-CC). Havaitsimme 81 merkittävästi ilmennetty eri miRNA ATM-puutosta HME-sertiä käytetään pieniä RNA sekvensoinnilla. Monet näistä ovat sekaantuneet kasvainten synnyssä ja lisääntymistä ja sisältävät alassäädetty tuumorisuppressoriproteiinia miRNA, kuten HSA-miR-29c ja HSA-miR-16, sekä yli-ilmentynyt pro-onkogeenisen miRNA, kuten HSA-asennuspalveli- 93 ja HSA-miR-221. MicroRNA muutoksia integroitiin genomin laaja geeniekspressioprofiilien selvittämään mahdollisia miRNA tavoitteita. Ennustettu mRNA tavoitteita miRNA merkittävästi säädellä jälkeen ATM ehtyminen mukana monia geenejä, jotka liittyvät syövän muodostumisen ja etenemisen, kuten SOCS1 ja esikasvaintekijän MAF. Vaikka useat miRNA on raportoitu muutettu syöpäsoluissa, on vain vähän ymmärrystä siitä, miten näitä pieniä RNA: t saattavat ajaa syövän muodostumisen tai miten niitä voitaisiin käyttää biomarkkereita syöpäalttiutta. Tutkimus tarjoaa alustavaa tietoa määriteltäessä miRNA profiileja, jotka voidaan käyttää prognostisia tai ennakoivaa biomarkkereita rintasyöpään. Integroitu analyysi miRNA ja mRNA: n ilmentymisen avulla voimme ymmärtää paremmin signaloinnin mukana rintasyövän alttius ja ehdottaa mekanismi rintasyövän altis fenotyyppi nähdään ATM-puutteesta kärsivillä potilailla.

Citation: Hessen JE, Liu L, Innes CL, Cui Y, Palii SS, Paules RS (2013) Genome-Wide Pienet RNA Yhdistelmät ja geeniekspressioanalyysiä paljastaa microRNA profiili syöpäalttiutta ATM-puutteellinen ihmisen nisäepiteelisoluissa. PLoS ONE 8 (5): e64779. doi: 10,1371 /journal.pone.0064779

Editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 joulukuu 2012; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2013; Julkaistu: 31 toukokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural ohjelmaansa National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES021157). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) proteiini on keskeisessä asemassa laaja valikoima soluvasteita, myös solukierron säätelyssä, apoptoosin, ja DNA-vaurioita vastauksia. Yksilöiden täydellinen puutteita ATM kärsivät vakavista ataksia, immuunijärjestelmän häiriöt, ja ovat nostaneet riski lymfoproliferatiivisten syöpiin [1]. Sen lisäksi, että täydellinen menetys ATM toimintoja, on arvioitu, että jopa 1% Yhdysvaltojen väestöstä kantaa yhtä mutatoitua kopion ATM [2], [3], ja niihin sovelletaan seurauksia haploinsufficiency. Vaikka heterotsygoottinen harjoittajat eivät kärsi ataksia telangiectasia oireyhtymä, heillä on suurentunut riski sairastua sydänsairauksiin, diabetekseen, ja syövät, erityisesti rintasyöpä, verrattuna yksilöiden normaalin ATM ekspressiotasot [2], [3]. Uudemmat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ATM mutaatiot, jotka aiheuttavat ataksia teleangiektasia vuonna homotsygoottinen tilassa, ovat myös rintasyöpä alttiusalleelien heterotsygoottisessa kantajia [4], [5], [6], [7], [8], [9 ], [10]. Lisäksi se on ollut mukana, että epigeneettisellä vaiennettu ATM kautta metylaatio voi myös olla rooli rintasyövän herkkyys [11], [12]. Tästä huolimatta yhteys pienentää ATM tasojen ja rintasyövän, puutteita ATM proteiinit eivät ole usein havaittu ei-familiaalinen rintasyövän populaatiot [13]. Tämä havainto viittaa siihen mahdollisuuteen, että signalointipolkujen tai geeniekspressiomalleja jotka ovat alle ATM ohjaus voisi olla uskottava mekanismi, joka liittää ATM ilmentymistilanne rintasyöpään alttiutta. Tässä ehdotamme ATM riippuvia muutoksia epigeneettiset sääntelyn, erityisesti miRNA geenin ilmentymisen säätelyyn, on rooli muodostumista rintasyöpä.

MikroRNA (miRNA) ovat suuri sääntelyn luokan pieniä RNA: iden, jotka ovat olleet kuvattu transkription jälkeen muuttaa geeniekspressiota. Korkeaa suojelun miRNA sekvenssit eri lajeissa korostaa niiden tärkeä säätelevä rooli. Ensisijainen toimintatapa on miRNA geenin ilmentymisen säätelyyn sitoo 3’UTR-alueella lähetti-RNA (mRNA), joka johtaa laskuun mRNA: n määrää solussa käytettävissä, joko RNA: n hajoamisen tai ehkäisyyn käännös. MikroRNA kriittisiä rooleja kehityksen, erilaistumisen ja taudin etenemiseen, ja ennustetaan kohdistaa yli 60% mRNA ihmisellä [14]. Viime aikoina miRNA on käytetty diagnosointiin, tunnistaminen ja ennustaminen terapeuttisen vaikutuksen syöpien [15], [16], [17], [18], [19], [20]. MicroRNA profilointi eri syöpätyyppien on käytetty tunnistamaan syöpää aiheuttavia miRNA, kutsutaan oncomirs, sekä tuumorisuppressorigeenin miRNA [20], [21], [22]. Monia erilaisia ​​ryhmiä ovat tuottaneet miRNA profiilit rintasyöpäsoluissa kehittämiseksi mahdollisia biomarkkereita diagnosoinnissa ja hoidossa [23]. Useat miRNA näkyvät monissa miRNA profilointi kokeissa vapautumassa rintasyövässä. Kuitenkin, suurin osa näistä tutkimuksista tehtiin syöpäkasvaimia. Tässä me tutkimme rooli ATM ekspressiotasot ja koostumus miRNA normaalissa ei-syöpä ihmisen rintarauhasen epiteelisolut (HME-CC). Olemme kiinnostuneita ymmärtämään miten muutokset miRNA ilmaisun takia ATM puutos voi edistää syövän alttiuden ja saada muutoksia normaali fysiologinen reittejä. Hyödyntämällä Illumina Next-Generation Sequencing, suoritimme genominlaajuisten sekvensointi pieniä RNA: iden normaalista villityypin (WT) ja ATM-puutteellisia HME-sertiä. Sen lisäksi, syvä sekvensointi pieniä RNA: iden, suoritimme koko genomin geenien ilmentymisen analyysi käyttäen Agilent koko genomin mikrosiruja. Yhdistelmä molempien geenien ilmentymistä ja miRNA profiileja antanut meille mahdollisuuden tunnistaa mahdolliset geenikohteet merkittävästi säänneltyjen miRNA. Ymmärtämällä koostumusta ja ilmaus miRNA ATM-puutosta rintarauhasen epiteelisolujen toivomme perehtyä mekanismeja ja taustalla fysiologia joiden kautta syöpäsolunäytteen muodostuminen etenee.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

HME-CC-LacZ (villityypin) ja HME-CC-ATM1 (ATM-puutosta) ihmisen rintaepiteelisolulinja solulinjat saatiin kuvatulla [24]. Soluja kasvatettiin ja ylläpidettiin HUMEC- Ready Media (Invitrogen 12752010) 4 ug /ml blastisidiinia (Invitrogen 46-1120).

Solun Harvest ja RNA

Villityypin ja ATM-puutteellisia ihmisen rintaepiteelisolulinja logaritmisesti kasvavat solut kerättiin käyttäen 0,25% trypsiini-EDTA: ta (Invitrogen 25200072), joka neutraloitiin käyttäen TNS (Lonza CC-5002). Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Ambion Mirvana miRNA eristyspakkausta käyttäen vakioprotokolla koko RNA: n eristämistä. Eristetty kokonais-RNA sitten jakaa erinä siten, että samassa RNA: ta käytettiin pienten RNA-sekvensointi ja geeniekspressioanalyysiä varten.

Illumina Pieni RNA-sekvensoinnilla

kolminkertaisia ​​biologisten näytteiden kokonais-RNA oli toimitettu NIH Intramural Sequencing Centerin. Kirjastot Small RNA cDNA luotiin käyttäen Illumina Small RNA Näytteen valmistus Vaihtoehto v1.5 Protocol vain pieniä poikkeamia valmistajan protokollaa. Nämä cDNA-kirjastot sitten sekvensoitiin sen Illumina Genome Analyzer IIX 35 emäsparin lukee mukaan valmistajan ohjeiden. Jokainen kirjasto ajettiin yhden kaistan virtauksen solun 36 sykliä käyttäen Illumina versiota 5 kemiaa. Sen jälkeen kohdistus genomiin, lue lukemat normalisoitiin laskettaessa miRNA miljoonasosaa miRNA rinnastuksia. Luettelo merkittävästi säänneltyjen miRNA luotiin käyttäen t-testiä analyysi (p≤0.05) ja taita muutos (≥1.5) cut-off välillä ATM-vajaiden solujen verrattuna villityypin soluihin.

Agilent Whole Genome Array

eristetty kokonais-RNA toimitettiin NIEHS microarray Core järjestely mikrosiruanalyysillä. Geenien ilmentyminen analyysi tehtiin käyttämällä Agilent kaikkiaan Human Genome 4 × 44 multiplex-muodossa oligo pakat (Agilent Technologies, 014850) jälkeen Agilent 1-väri microarray-pohjainen geeniekspressioanalyysissä protokollaa. Aloittaen 500 ng kokonais-RNA: ta, Cy3 leimattu cRNA mukaisesti valmistettu valmistajan protokollan. Jokaisesta näytteestä, 1,65 ug Cy3 leimatun cRNA: t olivat hajanaiset ja hybridisoitiin 17 tuntia pyörivässä hybridisaatio uunissa. Levyjä pestiin ja sitten skannattu Agilent Scanner. Tiedot saatiin käyttämällä Agilent Feature Extraction ohjelmisto (versio 9.5), käyttäen 1-väri oletusarvot kaikille parametreille. Agilent Feature Extraction Software suoritettu virheen mallintaminen korjattuna lisäaineen ja multiplicative melua. Tuloksena tiedot käsiteltiin ja analysoitiin Partek Genomics Suite (Partek® Genomics Suite -ohjelmisto, versio 6.6beta, Copyright © 2009 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). T-testi suoritettiin väliin villityypin ja ATM-puutteellinen näytteitä, generointi liittyvä

p

-arvot. Yhdessä kertainen muutos +/- 1,5,

p

-arvo on ≤0.05 käytettiin tuottamaan luettelon differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

integrointi MicroRNA ja Gene Expression Data

Käyttämällä TargetScan 5.2 [14], [25], [26], luettelo biologisesti ennusti tavoitteiden meidän ilmentyvät eri miRNA määritettiin. Luettelossa tavoitteiden verrattiin sitten lista differentiaalisesti ilmentyvien geenien esitetään mahdolliset miRNA – mRNA vuorovaikutusta.

Toiminnot Analyysit Ingenuity

Merkittävästi säännelty miRNA ja mRNA: t analysoitiin Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) [25], [26]. Verkot ja toiminta-analyysejä luotiin perustuu 40 merkittävää miRNA ja 202 merkittävä ennustettu geenikohteet selityksin IPA. Oikea-pyrstö Fisherin testiä käytettiin laskemiseen p-arvo määrittää todennäköisyys, jokainen biologinen toiminta ja /tai sairaus osoitettu, että datasarja johtuu mahdollisuus yksin. Toiminnot, joiden

p

-arvo alle 0,01 pidettiin merkittävinä.

Data Access

Tiedot mikrosiruja ja Small RNA sekvensointi käytettiin tässä tutkimuksessa on arkistoitu Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

GEO tulonumeroon pienten RNA sekvensointi on GSE36267 ja luettavissa http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jxezrakumucekru acc=GSE36267.

GEO liittymistä numero Agilent koko genomin ilmaisun array data on GSE36082 mainos voi tarkistetaan https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jvixzkwsaqiqwps acc=GSE36082.

Accompanying Lisätietovarasto koostuu 7 taulukoita, jotka löytyvät verkosta.

Tulokset

Yhdistelmät ja data-analyysin

Illumina syvä sekvensointia käytettiin tuottamaan pieniä RNA lukee 3 biologisista rinnakkaista kussakin villityypin ja ATM-puutteellisia ei-syöpä HME-sertiä. Suodatus perustuu laatupisteet ja sekvensointi esineitä sallitaan valintaan vain vankka järjestyksessä lukee (kuvio 1A). Käyttäen FastX työkalusarja [27], sovitin sekvenssit leikattu alkaen 3′-pään sekvenssin lukee ja sekvenssit, joilla ei ole sovitin sekvenssin tai on vähintään 16 nukleotidia jäljellä sen jälkeen, kun sovitin poistamisen jätettiin pois lisäanalyysistä. Leikatut lukee rinnastettiin käyttämällä Bowtie [28], että hg19 ihmisen genomin rakentaa. Annoimme ei epäsuhta on 15bp siemenen alueen sekvenssin lukee ja annettiin enintään 3 linjauksia sarjaa kohti lukea. Lähentämisiä selityksin kanssa UCSC pieni genomin kappaleen (WgRNA) on hg19. Lue lukemat normalisoitiin laskemalla tagit miljoonasosaa miRNA rinnastuksia (TPM). Sequence suodatus, adapteri leikkaaminen, ja Bowtie linjaus suoritettiin käyttämällä yhdistelmää komentorivin ohjelmien ja avoimen web-pohjainen alusta Galaxy [29], [30], [31]. Yhteenvetotilasto kaikista 6 näytteet jäljitetään varmistaa samankaltaisuus sekvensointi kulkee, rinnastukset, ja merkinnät (Figure1B).

A) Small RNA Sekvensointi putki yleiskuva. B) Yhteenvetotilasto Small RNA sekvenointitulosten eri vaiheissa tietojen analysointi.

kokoonpano miRNA Wild Type ja ATM-vajaiden solujen

Uuden sukupolven syvä sekvensoinnin mahdollistaa suuren dynaaminen alue havaitsemisessa miRNA (taulukko S1). Kun otetaan huomioon kaikki meidän näytteitä, tunnistimme 390 miRNA läsnä kahdessa kolmesta näytteistä joko villityypin tai ATM-puutosta näytteissä on vähintään 1 TPM (kuvio 1 B). Rajoittaa analyysimme vain vahvimmista miRNA, me katsotaan vain miRNA kanssa vähintään 10 TPM kahdessa kolmesta näytteestä joko villityypin tai ATM-puutteellisia näytteet tarkempaa analyysiä. 259 miRNA katsottiin läsnä kaikissa näytteissä ja siirtynyt seuraavaan vaiheeseen analyysin (taulukko S2). Sekvenssimerkkejä miljoonasosaa miRNA rinnastuksia (TPM) on tuotu Partek Genomics Suite tarkempaa analysointia (Partek® Genomics Suite -ohjelmisto, versio 6.6beta, Copyright © 2009 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Alustavia katsoa ilmentymisen tasoilla 259 miRNA korostetaan laajan dynaamisen alueen ilmaisun havaita seuraavan sukupolven syvä sekvensointi. Pystyimme tunnistamaan miRNA vain muutamia kopioita sekä miRNA luotettavalla ilme, kuten HSA-miR-21, jonka keskimääräinen WT ilmaus 113949 TPM. Korkea katsaus alustavan miRNA profiilin paljastaa erityisiä vaikutuksia ehtyminen ATM ilmaisun. Havaitsimme paitsi miRNA kuka ilmentyminen vaikutti menetys ATM, mutta pystyimme myös tunnistamaan miRNA jotka näyttävät vaikuta ATM ehtyminen.

Muutokset Expression profiilit miRNA jälkeen väheneminen ATM

arvioimiseksi suuruus ja merkitys muutoksen miRNA ilmaisun jälkeen ehtyminen ATM teimme t-testi 259 miRNA pidetään läsnä sekä villin tyypin ja ATM-puutteellinen näytteitä. Associated

p

arvot laskettiin ja yhdistettiin kertamuutos tuottaa luettelon merkittävästi säädellään eri tavalla (

p

≤0.05; kertainen muutos ≥1.5) miRNA. Tämä tunnistettiin 81 miRNA kuin merkittävästi ilmentyvät eri kahden HME-CC genotyyppien (kuva 2 taulukko S3), jolloin yli 30%: n miRNA katsoi läsnä analyysimme merkittävästi säädellään eri tavalla sen jälkeen, kun ehtyminen ATM. Löysimme useita hyvin tunnettu miRNA jotka olivat tilastollisesti jälkeen ennallaan ehtyminen ATM, kuten let-7 perheen ja HSA-miR-21. Niistä 81 huomattavasti säännelty miRNA meillä on 55 miRNA korkeasti ilmaisun ja 26 alemmilla ilmentymisen verrattuna villityyppiseen HME-sertiä. Mielenkiintoista nämä säännellyt miRNA sisältää useita, jotka ovat sekaantuneet syövän muodostumisen tai etäpesäkkeiden. Hyödyntämällä TAM työkalu kommentointiin miRNA [32] ja ihmisen miRNA tauti tietokanta [33], tunnistimme 4 tukahdutettu miRNA tuumorisuppressoreilla ja 7 yli-ilmentynyt oncomirs [21], [22], [34] ATM-vajaiden solujen (esimerkkejä, katso kuva 3). Tämä havainto vapauttaminen miRNA tärkeitä syövän muodostumisen tai vaimennus viittaa ATM-riippuvaista miRNA ilmaisu voivat muuttaa biologisia reittejä ja toimintoja, jotka edistävät syövän muodostumista. Perustuen miRNA syövän profilointi projekteja, useita ATM-riippuvainen miRNA ansaitsee lähempää tarkastelua (kuva 3). Esimerkiksi menetys ATM johtaa vähentynyt ilmentyminen tuumoria tukahduttavan miRNA, luki- 96, jonka tiedetään kohdistaa KRAS [35], ja miR-29 perhe, joka sisältää miR-29b-1, miR-29b- 2, ja miR-29c. Väheneminen ilmaus kaikkien kolmen jäsenen miR-29 perhe on yhdistetty moniin syöpiin [36] ja on korrelaatio ennusteen [37]. Lisäksi menetys ATM johtaa kasvuun ilmentymisessä miR-10b, joka on erittäin ilmaistaan ​​metastaattisessa rintasyöpiä [38], [39] ja miR-221, joka voi aiheuttaa lisääntymistä ja solujen eloonjäämistä [40]. Jotta edelleen ymmärtää biologiset vaikutukset miRNA ilmentyminen muuttuu, suoritimme koko genomin geenin ilmentymisen analyysi.

Differential miRNA ilmaisun välillä villityypin ja ATM-puutteellisia HME-sertit on saatu kolmesta itsenäisestä rinnakkaisnäytettä kustakin.

y

akselilla näyttää ATM puutosta WT ilmaisun suhde,

x

akselilla näyttää keskimääräinen ilmaisua kunkin miRNA; molemmat akselit ovat logaritmisessa mittakaavassa. Ilmentyvät eri miRNA on

p

-arvo ≤0.05 ja vähintään 1,5 kertainen muutos ovat sinisiä. Edustavia merkittäviä miRNA on merkitty. Kukin näyte oli erikseen luotu sekvensointi kirjasto ja ajettiin yksittäisen sekvensointi kaistaa.

A) Luettelo 4 tunnettujen tuumorisuppressoreilla ja 8 oncomirs merkittäviä ilme muuttuu jälkeen ehtyminen ATM. B) Ilmentymistasoja, tunnisteet miljoonasosaa (TPM), neljä esimerkkiä vapautetuilla miRNA. Tummanharmaa pylväät edustavat villityypin ilmaisun ja vaaleanharmaa pylväät edustavat ilmentymistä ATM-vajaiden solujen. Virhepylväät ovat vakiona virheen ilmaisua 3 riippumatonta rinnakkaista kunkin genotyypin.

geenien ilmentymistä ennustetaan olevan miRNA tavoitteet

Käyttäen Agilent ihmisen koko genomin microarray, keräsimme geeni ekspressiotietojen samasta WT ja ATM-puutteellisia HME-CC näytteitä. Yhdistelmä

p

-arvo (≤0.05) ja taita muutos (≥1.5) cut-off, tunnistimme 1086 merkittävästi muuttunut antureista edustavat 988 geenien tai geneettisen alueilla (taulukko S4). Jotta voitaisiin tunnistaa geenejä mahdollisesti kohdennetut muutokset miRNA ilmaisun, käytimme TargetScan 5.2 ennustaa mRNA tavoitteisiin 259 huomattavasti säännelty miRNA. Olemme rajoittaneet ennustettu mRNA tavoitteet, ensimmäinen perustuu geeneihin merkittävästi säännelty meidän geeniekspressioanalyysissä ja toinen tavoitteista joko kokeellisesti tai erittäin ennusti TargetScan. Lisäksi perustuu siihen tietoon, että miRNA vallitsevasti säädellä geeniekspressiota kautta estämällä ilmaisun, me vain säilyttänyt miRNA-mRNA yhdistelmiä, jotka ne ovat käänteisesti verrannollisia, tunnustaen me voidaan ilman toiminnallisesti tärkeä sääntelyn vuorovaikutusta mRNA. Alkaa meidän 81 huomattavasti säännelty miRNA tunnistimme 40, joka oli erittäin ennustettu mRNA tavoitteita merkittäviä muutoksia liittyviä geenien ilmentyminen. Havaitsimme 202 merkittävästi säänneltyä mRNA tavoitteita, jotka korreloi käänteisesti miRNA ennustetaan kohdentaa (taulukko S5). Monet miRNA ennustetaan kohdistaa useisiin merkittävästi säädellä mRNA: t, ja monet mRNA potentiaalisesti kohdistettu useamman kuin yhden ATM-riippuvainen miRNA. Nämä ilmiöt saattavat ehdottaa toiminnallinen redundanssia miRNA sääntelyn kohdegeenien.

käyttäminen Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [41], määritimme geeniperheistä edustaa geenejä ennustettu, joihin kohdistetaan miRNA ATM -riippuvaista tavalla (kuvio 4A). Tämä lähestymistapa antaa toiminnallinen katsaus geenien listallamme käyttäen Molecular allekirjoitukset Database [41]. Gene perheet yhteisiä ominaisuuksia, kuten biokemiallinen aktiivisuus ja homologia. Kiinnostavaa kyllä, monet ennustivat kohdegeenien merkittävästi säänneltyjen miRNA ovat transkriptiotekijöitä (esitetty taulukossa S6), mikä viittaa siihen, että monet ATM-riippuvaisen miRNA voi ohjata suuren fenotyyppisen vasteen asetukseen perustuva transkriptiotekijän ilmaisua. Osallistuminen miRNA sääntelyn transkriptiotekijöiden on ennustettu ja mallinnettu useita eri syöpätyyppien [42], [43], [44]. Meidän tulokset osoittavat muutoksia miRNA sekä muuttaminen transkriptiotekijä ilmaisutapa, jota esiintyy jälkeen menetys ATM. Lisäksi meidän havainnot viittaavat tämä muuttaminen transkriptiotekijöiden voidaan tapahtuvat ennen soluista tulee pahanlaatuisia (taulukko S6). Esimerkiksi, lisääntynyt ilmentyminen onkogeenisten transkriptiotekijöiden, kuten MAF ja CEBPA osoittavat miRNA voivat säädellä suurten verkkojen liittyvien geenien syövän muodostumiseen. Lisäksi 6 onkogeenien ja yksi tunnettujen kasvaimia estävä, SOCS1, ennustetaan olevan miRNA tavoitteita. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien mukaan miRNA voi olla kriittinen rooli muodostumista ja etenemistä syöpään. Ymmärtäminen varhainen vaikutukset miRNA säätelyssä transkriptiotekijöiden ja syövän muodostumisen voi johtaa käsityksen prognoosi- ja ennaltaehkäisevää hoitoa.

A) Gene Families edustavat 202 merkittävästi geenien määritetään käyttämällä GSEA antaa toiminnallinen yleiskuva tyypit geenien muutokset vaikuttavat miRNA ilme. B) Top toiminnot analyysi ATM-riippuvaisen korreloivat miRNA ja mahdollinen mRNA tavoitteita IPA. Vain valitut merkittäviä toiminnallisia ryhmiä on kuvattu. Katkoviiva osoittaa

p

-arvo on 0,01.

Pathway /toiminnallinen analyysi Ennustettu Tavoitteiden

Jotta saataisiin lisänäyttöä biologisten toimintojen ja verkot sairastumatta ATM riippuvia muutoksia miRNA ilmaisun, käytimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) [45]. Toiminnalliset analyysiin ja verkon sukupolven analyysiin IPA avulla voimme tutkia kaikki mahdolliset roolit merkittävästi muuttunut miRNA ja arvioidun geenikohteet kaivos- IPA Knowledge Base tunnistaa yhteyden ja suhteet geenien ja miRNA kohteita. Viisi verkot vaikutti merkittävästi jälkeen ehtyminen ATM, mukaan lukien solun toiminnot morfologia, solusyklin, solujen kasvua ja lisääntymistä. Ainakin 76 suurta toimintojen ryhmät olivat merkitsevästi (p 0,01) vaikutti jälkeen ehtyminen ATM, useita syövän ja kasvaimen erityistehtäviä ollessa voimakkaasti vaikuttanut (kuvio 4B). Eniten vaikuttaa merkittävästi biologisen toiminnon oli syöpä (

p

1 x 1010), muiden vaikutti merkittävästi toimintoja, kuten kasvain morfologia, DNA-vaurioita ja korjaus, ja solukuolemaa. (Taulukko S7 esitetään edustavat geenejä useissa näistä toiminnallisia ryhmiä.) Vapautuminen Näiden biologisten tehtävien ei-syöpäsoluja viittaa menetys ATM, joihin liittyy muutoksia miRNA ekspressiotasot, saattaa altistaa tai ajaa alkuvaiheessa syövän muodostumisen.

keskustelu

kautta genominlaajuisten syvä sekvensointi olemme saaneet tietoa olennaisesti kaikki pienet RNA: iden läsnä sekä villin tyypin ja ATM-puutosta normaalin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen, eikä vain niitä, jotka ovat erittäin ilmaisi. Havaitsimme 259 voimakkaasti ilmaistu miRNA läsnä sekä villin tyypin ja ATM-puutosta normaalin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen. Vaikka ATM on osallisena biogeneesille miRNA jälkeen DNA-vaurioiden [46], täyden tutkinnan vaikutuksesta ATM ehtyminen HME-sertiä paljastaa, että ehtyminen ATM itsessään on sekä odotettu alas-säätely miRNA sekä huomattava määrä sääteli miRNA. Vain yksi kolmasosa merkittävästi säänneltyjen miRNA ovat vähentyneet ilmaisun jälkeen ehtyminen ATM. Perustuu läsnäolo sääteli miRNA seuraavat ATM ehtyminen, me spekuloida, että ATM: n roolia aikaan miRNA ilmentyminen ei rajoitu miRNA biogeneesiä ja voitiin esiintyvät kautta useita mekanismeja. Lisäksi menetys ATM on liittynyt tehostettuun oksidatiivisen stressin [47], [48]. Spekuloida korkeampi oksidatiivisen stressin aiheuttama konstitutiivisen menetys ATM voi olla vaikutusta ekspressiotasot monia miRNA. Ehtyminen, tai tappio, ATM voi ajaa muutoksia miRNA itseilmaisu kasvun oksidatiivista stressiä. Useat miRNA nähnyt muuttuneen ilmaisun jälkeen ehtyminen ATM on myös osoitettu säätelevän kohonnut oksidatiivisen stressin, kuten HSA-miR-200C [49]. Lisätutkimukset ovat tarpeen, onko reaktiivisia happiradikaaleja scavengers voi lieventää miRNA muutoksia tai ilmiasun muutoksia nähty ehtyminen tai tappio ATM.

Kun vertasimme miRNA ilmaisun välillä villityypin ja ATM-puutteellisia HME- sERTiä huomasimme, että miRNA dIS säädelty jälkeen ehtyminen ATM osoittavat epätavallisen korkea korrelaatio miRNA osallisina syövän. Niistä 81 huomattavasti säännelty miRNA, ehtyminen ATM ajoi tukahduttaminen 4 tunnettujen miRNA tuumorisuppressoreilla ja yli-ilmentyminen 7 tiedossa oncomirs. Tämä alustava havainto viittaa keinoja, joilla menetys ATM saattaa altistaa solut syövän tai lisätä syöpään alttiutta.

tutkimiseksi edelleen roolia miRNA ATM-vajaiden solujen, yhdistimme merkittävästi säänneltyjen miRNA ja geenien ilmentyminen tietojen ennustaa ja arvioida mahdollisia miRNA-mRNA tavoite yhdistelmiä. Noin puolet merkittävästi säänneltyjen miRNA oli ennustanut tavoitteita, jotka olivat myös säädellään eri tavalla, kuten nähdään meidän geeniekspressioanalyysissä. Kun me tutki tarkemmin näitä miRNA ja mahdolliset kohteet korostimme lisätodiste syöpää alttius profiilin ATM-puutosta ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen. Tämä sisältää lisääntyneen sääntelyn onkogeenien MAF ja CEPBA sekä vähentynyt sääntely tuumorisuppressorigeenin SOCS1.

Ymmärtäminen genomin laajuinen miRNA profiilit normaali ja ATM-puutteellisia ei-syöpä-nisäepiteelisoluissa voi auttaa meitä ymmärtää paremmin roolien ATM ja miRNA että kasvainten synnyssä rintasyövän ja siirtyminen ei-syöpä pahanlaatuiseen rintojen kudosta.

erityisen kiinnostavaa on mahdollisuus hyödyntää miRNA ekspressiotasoja ennustaa syöpäalttiutta tai muodostuminen, ennen kuin se voidaan havaita tavanomaisilla diagnostisten menetelmien. Solut tutkimuksessamme ovat normaaleja ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen, jotka eivät ole peräisin syöpäsoluja. Siksi lisääntynyt ilmentyminen oncomirs ja tukahduttaminen joidenkin tuumorisuppressorin miRNA ATM-vajaiden solujen viittaavat siihen, että saattaa olla mahdollista kehittää biomarkkereita rintasyövän alttiutta. Hyödyntämällä miRNA biomarkkereiden profiileja sopusoinnussa rintasyöpä alttius mahdollistaisi varhaisen tunnistamisen potilaita, jotka ovat vaarassa ja ehkä nopeuttavan seurantaa, havaitsemista ja hoitoa.

Johtopäätös

Yhteenvetona 81 miRNA kanssa ATM-riippuvaista ekspressiota on tunnistettu. Nämä miRNA sekä niiden otaksuttu mRNA tavoitteet ehdottaa ne voivat olla rooli alkuvaiheessa siirryttäessä normaalista syöpä- nisäepiteelisoluissa. Tutkimus tarjoaa alustavaa tietoa siitä, että yhdistäminen microRNA ja mRNA: n ilmentymisen voi olla hyötyä kehittää biomarkkereiden ennustamiseksi alttiutta sairastua rintasyöpään. Tunnistamalla solujen ja potilaat, lisääntynyt rintasyövän muodostumiseen, suositukset voidaan tehdä mukana seuranta ja varhainen puuttuminen.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Sequence laskea kaikille 939 selityksin miRNA. Tunnisteet miljoonasosaa (TPM) sekvenssi count kaikille 939 MikroRNA selityksineen vuonna hg19 WgRNA kirjaa UCSC Genome selaimen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s001

(PDF) B Taulukko S2.

Sequence lasketa 259 läsnä miRNA. Sequence count varten 259 miRNA katsotaan läsnä (yli 10 TPM) joko 2 ulos 3 villityypin jäljittelee tai 2 ulos 3 ATM-puutosta toistojen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s002

( PDF)

Taulukko S3.

81 ATM-riippuvainen miRNA. 81 MikroRNA määritettiin olevan merkittävän muutoksen ilmentymistä ATM-vajaiden solujen verrattuna villin tyypin kontrolleihin. T-testi

p

≤0.05; Kertainen Muutos +/- 1,5 tai suurempi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s003

(PDF) B Taulukko S4.

1086 ATM-riippuvainen mRNA: t. 1086 mRNA koettimet määritettiin merkittäviä ilmentymisen muutoksia ATM-vajaiden solujen verrattuna villin tyypin kontrolli soluissa. T-testi

p

≤0.05; Kertainen Muutos +/- 1,5 tai suurempi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s004

(PDF) B Taulukko S5.

40 miRNA ja 202 mRNA tavoitteita. Luettelo 40 merkittävästi säänneltyjen miRNA kanssa korreloivat negatiivisesti ennustettu mRNA tavoitteet ja 202 mRNA ennustettu tavoitteita merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen. Muutoksen suuntaa (lisäys tai vähennys) ATM-vajaiden solujen verrattuna WT solut on tarkoitettu sekä miRNA (sarake 2) ja geeni (mRNA) tavoitteet (sarake 4).

Doi: 10,1371 /journal .pone.0064779.s005

(PDF) B Taulukko S6.

Mahdolliset kohde-transkriptiotekijöitä. Transkriptiotekijät tunnistettu mahdollisia kohteita on huomattavasti säännelty miRNA käyttäen Molecular allekirjoitukset Tietokanta GSEA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s006

(PDF) B Taulukko S7.

Edustavia geenien erityinen toiminnallinen ryhmiin. Esimerkkejä kohdegeenien osallisena solusykliä asetusta ja DNA Replication, rekombinaatio ja korjaus perustuu Ingenuity Pathway Analysis.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064779.s007

(PDF) B

Kiitokset

Tekijät haluavat antaa tunnustusta NIEHS Microarray Core ja NIH Intramural Sequencing Core heidän työstään tämän käsikirjoituksen. Lisäksi kirjoittajat haluaisi kiittää drakmaa. Paul Wade ja Douglas Bell heidän hyödyllisiä ehdotuksia ja kriittistä arviointia käsikirjoituksen.