Krooninen sairaus

tiivistelmä

proangiogeeninen entsyymi Tymidiinifosforylaasi (TP) on lupaava kohde syöpähoitojen, mutta sen toimintaa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ei ole täysin ymmärretty. Selvittämiseksi sen rooli NSCLC kasvaimen kasvua, NCI-H292-keuhkosyöpä limakalvon epidermaalista solujen ja endoteelisolujen suunniteltu yliekspressoimaan TP virusvektorin transduktio. NSCLC solujen muuttunut ilmentyminen transkriptiotekijän Nrf2 tai sen kohdegeenin hemioksigenaasi-1 (HO-1) käytettiin tutkimaan sääntelyn TP ja havaintojen prekliininen malleja liittyvät geenien ilmentyminen Kliinisten NSCLC yksilöitä. Yli-ilmentyminen Nrf2 tai HO-1 aiheutti ylösajon TP NCI-H292-soluissa, vaikutusta matkia käsittelemällä antioksidantti N-asetyylikysteiini ja osa poistuu HO-1 knockdown. Yliekspressio TP heikennettyä solujen proliferaatio ja migraatio

in vitro

, mutta samanaikaisesti parantaa angiogeenisten potentiaalia syöpäsolujen täydennetty tymidiinillä. Jälkimmäinen havaittiin myös SK-MES-1 okasolusyöpä ja NCI-H460 suuri cell carcinoma soluja. TP-yli-ilmentävät NCI-H292 kasvaimet

in vivo

esillä parempi hapettumisen ja korkeammat IL-8, IL-1β: n ja IL-6. TP yli-ilmentyminen endoteelisoluissa täydennetty niiden angiogeeninen ominaisuuksia, jotka oli liitetty parannettu sukupolven HO-1: n ja VEGF. Korrelaatio TP ilmentymisen kanssa HO-1 ja tulehduksellisten sytokiinien vahvistettiin kliinisissä näytteissä NSCLC. Kaikkiaan lisääntynyt IL-1β ja IL-6 yhdessä proangiogeeninen vaikutuksia TP-ilmentävien NSCLC on endoteelin voi edistää kasvaimen kasvua, mikä TP kuin kohteena angiogeneesiä torjuvina NSCLC.

Citation: Tertil M , Skrzypek K, Florczyk U, Weglarczyk K, oli H, Collet G, et ai. (2014) asetus ja Novel toiminta tymidiinifosforylaasia Non-pienisoluinen keuhkosyöpä: Ylikuuluminen kanssa Nrf2 ja HO-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10,1371 /journal.pone.0097070

Editor: Soumitro Pal, lastensairaalassa Boston Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 12, 2014

Copyright: © 2014 Tertil et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana avustukset nro 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 ja N N301 314837 National Science Centre (NCN). Alicja Jozkowicz oli kansainvälinen vanhempi tutkija peräisin Wellcome Trust. M. Tertil ja K. Skrzypek tuettiin Conseil Regional du Centre, stipendi yhteistyössä opetusohjelma PhD thesis. Tiedekunnan biokemian, biofysiikan ja biotekniikan Jagiellonian yliopisto on edunsaaja rakennerahastojen Euroopan unionin ja Puolan tiede- ja Higher Education (myöntää nro: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 ja 01.01.02-00-069 /09). Tutkimus toteutettiin soveltamisalaan MiR-Tango International Associated Laboratory (LIA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkokasvaimia listalla top syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuinen, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin. NSCLC potilaat ovat usein diagnosoitu edenneen taudin, kun systeeminen kemoterapia on merkittävä terapeuttinen vaihtoehto. Koska kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ovat riippuvaisia ​​angiogeneesistä, mekanismit uusien verisuonten muodostumista on kohdennettu interventioon keuhkosyövän [1]. Kuitenkin lisäksi anti-VEGF-lääkeaineiden tavanomaisten kemoterapia aiheutti ainoastaan ​​lievää parannusta mediaanielinajassa [1], [2] kokeneiden potilaiden kasvaimen uusiutumisen vuoksi syntyminen lääkeresistenssin antiangiogeeniset aineet, korostaa pikaisesti uudet tavoitteet kombinatorisista hoitoja.

tymidiinifosforylaasia (TP, EC2.4.2.4) on pyrimidiini pelastaa synteesireitti entsyymi, joka on tunnettu myös proangiogeeninen ominaisuuksia. TP katalysoi palautuvia -fosforolyysireaktio tymidiiniä osaksi tymiinin ja 2-deoksi-D-riboosi-1-fosfaatin (DRP), joka on edelleen defosforyloitiin 2-deoksi-D-riboosi (dR). Entsyymi ja sen sokerialan tuotteiden stimuloida endoteelisolujen migraatiota ja putken muodostumiseen

in vitro

ja tehostaa angiogeneesiä eri malleja

in vivo

[3]. TP on usein yli-ilmentyy ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien NSCLC [3], [4] ja sen on osoitettu korreloivan suurempien mikroverisuonitiheys, kehittyneempiä kasvain vaiheessa, etäpesäke ja huono ennuste [3]. Proangiogeeninen toiminta TP kasvaimia, lukuun ottamatta suoraa toimintaa sen tuotteita endoteelisolujen, voi sisältyä myös stimulaation ilmentymisen muiden angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF, interleukiini-8 (IL-8) tai hemioksigenaasi-1 (HO- 1) [5], [6]. Niinpä kohdistaminen TP jossa pienimolekyylisiä estäjiä Tällä hetkellä tutkitaan uutena antiangiogeenisesti strategia [7]. Kuitenkin kehittämään tehokkaita kombinatorisista kemoterapeuttisten, säilyttäen entsyymiaktiivisuus TP voi olla tarpeen, koska se katalysoi tärkeä askel aktivointi fluoropyrimidiinipohjaisen aineet, kuten kapesitabiinin, joka on ehdotettu vaihtoehtoista hoitoa kehittyneen ei-pienisoluisen keuhkosyövän [8]. Tämä kaksitoiminen TP kasvaimen kasvua ja hoito edellyttää, että estämällä protumoral vaikutukset entsyymin voi vaatia kohdistaminen sen loppupään välittäjiä. Selvittämiseen mekanismit sääntelyn ja kasvaimen edistävät toimet, TP on siis erittäin tärkeää.

Nrf2 (ydin- tekijä (Erytroidispesifiset johdettu 2) -kuten 2) on transkriptiotekijä säätelevä solujen antioksidantti vasteita [9]. Usein on konstitutiivisesti aktiivinen kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä, ja voidaan edelleen indusoida syöpähoitoihin. Se ohjaa ekspressiota sytoprotektiivisen geenien johtaa resistenssin kehittyminen sytotoksisille aineille [10]. Yksi Nrf2 tavoitteista on HO-1, joka muuntaa hemin osaksi CO, rauta rautaa ja biliverdiini, ja joka on osoitettu välittävän Nrf2-odotuksiin vastus NSCLC solujen kemoterapia [11], [12]. Mielenkiintoista, molemmat proteiinit rooleja angiogeneesin edistäminen: toiminnan HO-1 tuotantoketjun angiogeenisen VEGF ja SDF1α on vakiintunut [13], ja osallistuminen Nrf2 on sääntelyn angiogeenisten IL-8 on osoitettu [14] – [16].

Tässä tutkimme biologisen roolin TP keskitytään angiogeneesiin ja vuorovaikutus Nrf2 ja HO-1 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja endoteelisolujen. Tuloksemme osoittavat vaikutuksia TP yli-ilmentymisen NSCLC soluissa

in vitro

ja

in vivo

ja korostavat proangiogeeninen toiminnan entsyymin.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit ja virusvektoreita

Plasmidi pBK-RSV-TP kätkeminen ihmisen TP cDNA ystävällisesti Dr. S. Liekens (Rega Institute for Medical Research, KU Leuven, Belgia). PEF (sininen) -Nrf2 sisältää ihmisen Nrf2 cDNA ystävällisesti lahjakas tri J.A. Johnson (osasto Pharmaceutical Sciences, University of Wisconsin-Madison, USA) [17]. Rakentaminen retrovirusvektoreita (RVS) RV-TP ja RV-Nrf2 suoritettiin kuvatulla Täydentävä Methods (File S1). Retrovirusplasmidiin pMSCV-Luc sisältävä lusiferaasin ilmentämiskasetin tuotantoon RV-Luc saatiin Addgene. Kaikki RVS lukien ohjaus RV-tyhjän vektorin (LNCX2) on tuotettu, kuten on kuvattu [18].

adenovirusvektoreilla (AdVs) kätkeminen TP cDNA (ADTP) kehitettiin, kuten on kuvattu täydentävä Methods (File S1) ja kontrollivektoreihin GFP (AdGFP) kuten on raportoitu aiemmin [16].

solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen NSCLC solulinjat: NCI-H292 (limakalvon epidermaalista, ostettu ATCC), A549 ( adenokarsinooma, saatu professori Jakub Golab, Warsaw Medical University, Varsova, Puola) ja NCI-H460 (suuri karsinooma, hankittiin ATCC) viljeltiin RPMI 1640 (PAA) ja SK-MES-1 (levyepiteelikarsinooma, ostetut ATCC) viljeltiin MEM (Gibco), kukin täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (PAA) ja penisilliiniä (100 U /ml) /streptomysiiniä (10 ug /ml) (Sigma) (pen /strep). Ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HMEC-1, saatu tri Francis Candal, Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) viljeltiin MCDB 131 täydennetty 10% FBS: ää, L-glutamiinia 2 mM, pen /strep, EGF 10 ng /ml ja hydrokortisonia 1 mg /ml. Ensisijainen ihmisen napalaskimon endoteelisolut (HUVEC) eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], ja viljeltiin M199: ssä (PAA), johon oli lisätty 20% FBS: ää, pen /strep ja endoteelisolujen kasvun täydentää EKG 30 mg /l (Millipore).

Kaikki solut ylläpidettiin vakiona viljelyolosuhteissa: 37 ° C, 5% CO

2, 95%: n kosteudessa. Tutkinnassa hapen niukkuuden vaikutuksilta Solut laitettiin 24 tai 48 tunnin ajan kammiossa (Biospherix USA) valvotuissa kaasun ilmakehässä 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2 asetettiin 37 ° C: ssa soluviljelmässä hautomo.

perustaminen solulinjoja NCI-H292-Luc-TP (NCI-TP) ja NCI-H292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) vakaasti yli-ilmentävät lusiferaasia ja vastaavat siirtogeenien ja valvonta NCI-H292-Luc-EV (NCI-EV) modifioitu tyhjän vektorin, solut transdusoitiin retrovirusvektoreilla. Ensimmäinen, infektio RV-siirtogeenin tai RV-tyhjän vektorin (RV-EV) suoritettiin ja stabiilisti transformoidut solut valittiin genetisiinillä (1 mg /ml), jota seurasi transduktiolla RV-Luc ja valinta hygromysiiniä (0,3 mg /ml). NCI-H292-Luc-HO-1 (NCI-HO1) solulinja kehitettiin ja validoitiin aiemmin laboratoriossamme [20]. Huolto transgeeniekspression solut rutiininomaisesti pidettiin vakiona väliaineessa lisäksi täydennetty genetisiinillä (0,5 mg /ml) ja hygromysiini (0,1 mg /ml). Kokeita varten soluja siirrostettiin väliaineessa ilman antibiootteja.

Transient TP yli-ilmentymisen ja stimulointi solujen NAC tai TP alustaan ​​

tymidiiniä (Thd) ja N-asetyylikysteiini (NAC) hankittiin Sigma Aldrich . Ohimeneviä TP yliekspressio EC: eissa, HMEC-1 ja HUVEC-solut transdusoitiin adenovirusvektoreiden ADTP tai valvontaa AdGFP MOI = 10 24 tunnin ajan ja stimuloitiin sitten Thd vielä 24 h täydellisessä elatusaineessa. Ohimeneviä TP yli-ilmentymisen NSCLC soluissa, SK-MES-1 ja NCI-H460 transdusoitiin MOI = 20 ja MOI = 40, vastaavasti, ja stimuloitiin 1 mM Thd väliaineessa täydennetty 2% FBS 48h transduktion jälkeen.

Reaaliaikainen RT-PCR

mRNA geenien määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR. RNA eristettiin joko Qiazol (Qiagen) tai käyttämällä RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1 ug RNA: ta käänteiskopioitu cDNA käyttäen oligo-dT-alukkeita RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen 30 ng näytteen QuantiTect SYBR Green (Qiagen, analysointi

in vitro

kokeissa) tai SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara, analysointi

in vivo

kokeiluja ) mukaan valmistajan ohjeita LightCyclerTM 480 II-järjestelmä (Roche). Geenien ilmentyminen laskettiin ACt tai ΔΔCt menetelmiä EF2 apuna geeni, jossa virhe baareja laskettu keskihajonnan keinot, jaettuna √ (N-1), jossa N on määrä itsenäisen kokeen. Virheenkasautumisanalyysillä ei ole otettu huomioon, mikä on jonkin verran rajoitus Tutkimuksemme.

Western blot-analyysi ja ELISA

Western blot HO-1 suoritettiin kuten [19]. Havaitsemiseksi ihmisen TP hiiren mAb P-GF.44C (Calbiochem) käytettiin. Tuotantoa ihmisen VEGF: n ja IL-8: elatusaineet ja ihmisen IL-8, IL-1β: n ja IL-6 kasvaimen lysaateissa kvantitoitiin käyttäen DuoSet ELISA Kit (R

d

on pienin mitta).

mittaus kasvaimen hapettuminen

Hapettamista kasvainkudoksen mitattiin OxyLite anturijärjestelmä perustuu rutenium fluoresenssisammutuksen O

2 (Oxford Optronix).

analyysi kliinisestä materiaalista

Ethics selvitys.

Ihmisen tutkimuksia hyväksynyt paikallinen eettinen komitea Collegium Medicum Jagiellonian yliopiston Krakovassa, Puolassa. Potilaat ovat ilmaisseet kirjallisen suostumuksensa tutkimukseen osallistumisesta.

Koepalat primaarikasvainten ja kasvainten etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin (jos olemassa) kerättiin leikkauksen aikana 24 kärsivien potilaiden NSCLC adenokarsinooma. Potilaita hoidettiin klo Clinic of Thoracic Surgery, Jagiellonian University Medical College, 31-202 Krakova, Puola.

Tilastollinen

Ellei toisin mainita, tulokset osoittavat keskiarvo ± SEM vähintään 3 riippumatonta kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Parittomia Studentin t-testejä käytettiin arvioimaan, onko kahdella ryhmää erosivat merkittävästi. Vertailun useiden ryhmien yksisuuntaista ANOVA kanssa Tukey testin jälkeen käytettiin. Erot joiden arvo on p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

TP ilmentyy differentiaalisesti NSCLC soluissa eritasoisia Nrf2 ja hemioksigenaasi-1

tutki TP ilmentyminen NSCLC solulinjoissa A549 ja NCI-H292 alkuperältään eri histologisia kasvaimia – adenokarsinooma ja limakalvon epidermaalista vastaavasti. Western blot-analyysi osoitti, että A549 adenokarsinooma näytöt korkea perusilmennystä TP, kun entsyymi on erittäin matala NCI-H292 (Fig. 1A). Koska kahden solulinjan tiedetään eroavat aktiivisuuden transkriptiotekijän Nrf2 ja sen kohdegeenin HO-1, molemmat ilmaistuna korkeammalla tasolla A549 kuin NCI-H292 ([22], Fig. 1A, B), tutkimme onko Nrf2 /HO-1 akseli voisi olla mukana säätelyssä TP. Todellakin, kun Nrf2 ja HO-1 oli itsenäisesti stabiilisti yli-ilmentynyt NCI-H292-solut (Fig. S1A, [20]), joka on pieni pohjapinta-Nrf2 ja HO-1 induktio TP havaittiin sekä NCI-Nrf2 ja NCI -HO1 solut (Fig. 1 C 0,05 NCI-H292

vs

A549 ). CD. Lisääntynyt TP mRNA ja proteiinin ilmentyminen NCI-H292-solulinjoja stabiilisti yli-ilmentämään Nrf2 tai HO-1 (n = 4, * p 0,05 ohjaus tyhjän vektorin (EV)

vs

siirtogeenin yli-ilmentyminen) E. TP mRNA (vasen ) ja proteiinin ilmentyminen (oikealla, densitometrisen analyysi WB alemmassa paneelissa)

in vivo

hallinnassa ja HO-1-yli-ilmentävät NCI-H292-ksenograftit (perustettu kuvatulla [20]) vahvistavat

vuonna vitro

data (n = 5, * p 0,05 NCI-HO1

vs

NCI-EV).

Nrf2-sitoutumiskohtien TP promoottori ei ole todettu (analyysi ei esitetty), mikä viittaa siihen, että asetus on epäsuora. Koska HO-1 on tunnettu tavoite Nrf2 ja oli merkittävästi voimistunut NCI-Nrf2-solut (Fig. S1B), seuraavan kerran haluttiin selvittää, onko vaikutus Nrf2 oli HO-1-riippuvainen. NCI-Nrf2-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​HO-1 (Fig. S2), joka johti osittain downregulation TP ilmentymisen sekä Nrf2-yli-ilmentävät solut ja ohjaus transdusoitujen solujen tyhjällä vektorilla (NCI-EV) (Fig. 2A) , mikä tarkoittaa, että HO-1 on rooli säätelyssä TP NSCLC, mutta sen osallistuminen vaikutus Nrf2 on vähäinen. Lisäksi hoito NCI-EV solujen antioksidantti N-asetyylikysteiini johti annoksesta riippuvaa säätelyä TP (Fig. 2B), matkien sääntely entsyymin Nrf2 /HO-1 yli-ilmentymisen. Koska stimulaatio ohjaus solujen HO-1 tuotteita ei toistaa säätelyä TP löytyy HO-1 yli-ilmentäviä soluja (kuvio. S3), vaikutus Nrf2 /HO-1 voitiin katsoa johtuvan vaimennuksen oksidatiivisen stressin, kuten ovat jo osoittaneet, että NCI-HO1 soluilla on alhaisempi reaktiivisten hapen lajien [20].

. HO-1 ja TP-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen NCI-H292-solujen kanssa HO-1 pudotus. NCI-Nrf2 ja NCI-EV-ohjaus-solut transfektoitiin 50 nM siRNA vastaan ​​HO-1 (siHO1) tai kontrolli salattu sekvenssi (siSCR) 72 tuntia johtaa downregulation TP ilmaisun jälkeen, HO-1 hiljentäminen. (N = 4, * p 0,05 NCI-Nrf2

vs

NCI-EV, # p 0,05 siHO1

vs

siSCR). B. Vaikutus antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC) TP ilme. NCI-EV soluja stimuloitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla NAC 24 h tuloksena annoksesta riippuvainen säätelyä TP. (N = 3, * p 0,05 ohjaus

vs

stimulaatio).

TP yli-ilmentymisen vaimentaa proliferaatio ja migraatio NCI-H292-soluissa, mutta kiihdyttää angiogeeninen potentiaali NSCLC solulinjojen

in vitro

Seuraavaksi pyrimme tutkimaan suorat vaikutukset TP itse proliferaatio ja migraatio NCI-H292-soluissa. Vakaa solulinja yli-ilmentävät sekä lusiferaasia ja TP (NCI-TP) perustettiin retroviruksen transduktion ja validoitu TP ilmentymisen (Fig. 3A). Yllättäen leviämisen NCI-TP-solujen estyi (3B). Scratch testi osoitti, että muuttavat potentiaalia NCI-TP-soluissa oli myös heikennetty (Fig. 3C, Tiedostojen S2 S3). Downregulation mRNA-tasojen matriksin metalloproteinaasien (MMP) MMP-1 ja MMP-2 havaittiin myös (Kuva. S4), jotka voivat vaikuttaa kielteisesti Tuumorigeenisuustutkimuksissa NCI-H292-soluissa

in vivo

.

. Mallin validointi – säätelyä TP mRNA ja proteiini tasoilla NCI-H292 solulinjan vakaasti yli-ilmentävät TP, perustettiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät (n = 3). B. Suhteellinen pohjapinta leviämisen hinnat NCI-EV ja TP-yliekspressoivia soluihin mitattiin sisällyttämällä bromideoksiuridiinin (BrdU) (n = 4). C. Basal siirtymänopeuksien NCI-EV ja NCI-TP-soluissa määritettiin tyhjästä määrityksessä (n = 4) (asteikko bar – 200 pm) * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV

koska merkittävä rooli TP kasvaimen kasvua ajatellaan liittyvän pikemmin sen proangiogeeninen ominaisuuksia [23], me seuraavaksi keskittyneet selvittämiseen roolista TP angiogeneesin modulointi meidän NCSLC mallissa. Standardiolosuhteissa mitään vaikutusta TP yliekspressio /TP tuotteita angiogeenisten potentiaalia syöpäsolujen voitiin havaita (Kuva. S5). Kuitenkin suuret laukaista angiogeenisten kytkimen

in vivo

on hapenpuutteen. Siksi paremmin jäljitellä ympäristöön kasvava kasvain, otimme punasolut hypoksia ja jos ne tymidiini, joka voidaan vapauttaa nekroottisen ytimen kasvain. Vaikka estäviä vaikutuksia TP ilmentymisen vaikutus proliferaatio ja migraatio NSCLC-soluja vaikuttanut joko hypoksia ja /tai tymidiiniä (Fig. S6), erilaisissa olosuhteissa paljasti parannettu angiogeeninen potentiaali NCI-TP-soluissa, mikä näkyy Matrigel putken muodostumiseen määrityksessä käsitellyllä media (Fig. 4A). Se liittyy säätelyä IL-8-proteiinin tuotantoa kasvainsolujen (Fig. 4B) ja induktio HO-1 (Fig. 4C), jotka voivat olla osoitus kohonnut oksidatiivista stressiä TP yli-ilmentäviä soluja, joka on yhdenmukainen havaintojen muissa elimissä [5]. Tärkeää on, TP-yli-ilmentävät solut osoittivat parannettuja angiogeeninen potentiaali läsnä tymidiinin myös mukaisesti happiolosuhteissa (Fig. S7).

. Lisääntynyt angiogeeninen potentiaali TP yliekspressoivien solujen hypoksia läsnäollessa tymidiiniä. NCI-H292-soluja stimuloitiin 1 mM Thd 48 tunnin ajan 1% happea, ja elatusaine levitettiin HMEC-1-solut ympättiin Matrigelillä. Määrä branchpoints muodostaman HMEC-1 käsiteltiin vakioitua elatusainetta joko tyhjiä vektori transduktoituja NCI-H292-soluissa (NCI-EV) tai TP Transdusoimattomia (NCI-TP) on laskettu (asteikko bar – 200 pm) (n = 3). B. Tuotanto angiogeenisten tekijöiden in TP-yliekspressoivia NCI-H292-soluissa hypoksiaolosuhteissa in 1 mM Thd 24 h kvantifioida ELISA havaitsemalla ylössäätely IL-8 NCI-TP solulinja (n = 4). C. Lisääntynyt HO-1-mRNA (vasemmalla) ja proteiini (oikealla) ilmentyminen TP-yliekspressoivia soluja 1 mM Thd hypoksia kuluttua 24 h (n = 3). * P 0,05 NCI-TP vs NCI-EV. D-I. Tehostettu angiogeeninen potentiaali keuhkojen okasolusyöpä SK-MES-1 ja iso karsinooma solujen NCI-H460 seuraavia ohimeneviä TP yli-ilmentymisen. SK-MES-1 (D-F, n = 3) ja NCI-H460 (G-I, n = 4), soluja transdusoitiin ADTP tai ohjaus AdGFP 48 tuntia, stimuloitiin 1 mM Thd lisää 48 tunnin ajan 1 % happea (D-E G-H) tai normoksia (F I). Elatusaine käytettiin Matrigel-määrityksessä HUVEC-soluja (D G), ja mittaus IL-8 tuotantoa (E H) ja HO-1-ekspressio määritettiin solulysaateista (F I). * P 0,05 ADTP vs AdGFP

tutkimme seuraavaksi, onko TP moduloi angiogeeninen potentiaali kasvainsolujen peräisin muista NSCLC histologisia tyyppejä, eli okasolusyöpä SK-MES-1-solulinjassa ja NCI-H460 suuri cell carcinoma. Esikäsitelty väliaine kerättiin hypoksisiin soluihin väliaikaisesti yli-ilmentävät TP seuraavat adenovirusvektori transduktion ja stimulaation Thd aiheutti parannettu haaroitus endoteelisolujen verrattuna ohjaamaan AdGFP-transdusoidut solut sekä solutyyppejä (Fig. 4D, G), joka oli liitetty lisääntynyt tuotanto IL-8: SK-MES-1-soluissa (kuvio. 4E). Induktio HO-1 TP havaittiin alle normoxic olosuhteissa (Fig. 4F, I).

TP moduloi ilmentymä tulehduksellisten sytokiinien

in vivo

määrittää, miten monimutkainen vaikutukset TP ilmentymisen vaikutus jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja angiogeeninen potentiaali NCI-H292-soluissa havaittiin

in vitro

vaikuttaisi kasvainten kehittymiseen

in vivo

, kasvainsolut istutettiin ihon alle nude-hiiriin ja kasvaimen kasvua tarkkailtiin 5 viikkoa. TP yli-ilmentyminen oli taipumus nopeuttaa kasvua NSCLC ksenograftien (Kuva. 5A) (p 0,1 NCI-TP

vs

NCI-EV 4 ja 5 viikkoa). Lisäksi NCI-TP kasvaimia osoitti merkityksetön suuntaus (p = 0,2) kohti tehostettu hyökkäys kasvaimeen tyhjennys imusolmukkeet (Fig. S8). Koska solujen proliferaatio ja migraatio on alentunut TP yli-ilmentymisen (Fig. 3B-C), me oletetaan erot angiogeenisten ominaisuuksia. Itse asiassa, mittaus kasvaimen hapettuminen suoritetaan loppuun koe osoitti, että NCI-TP kasvaimet olivat merkittävästi paremmat happipitoista kuin tuumorit, jotka ovat peräisin kontrolli-solut, jotka samaan aikaan lisääntynyt tuotanto hIL-8 entisen kasvaimia (kuvio. 5B, C) . Mikä tärkeintä, meidän aiempi tutkimus käyttäen NCI-H292 ksenografteissa olemme osoittaneet, että tehostettu kasvaimen hapettuminen saatiin vahvistus parantaa kasvaimen verisuonten muodostumista tässä mallissa [20]. Kuitenkin, vaikka TP yli-ilmentyminen vahvistettiin säilytetään ksenografteissa (Fig. 5D, E), ei eroista joko HO-1 tai muut angiogeenisten tekijöiden voitiin havaita vertailuryhmän kasvaimet (Fig. 5D, Fig. S9A D). Jotta ymmärtää paremmin mekanismia taustalla vaikutuksen TP ilmentymisen vaikutus NSCLC

in vivo

, määritimme ilmaus tulehduksellisten sytokiinien kasvaimissa. Ihmisen interleukiini-1β ja interleukiini-6 tasot olivat lisääntyneet huomattavasti NCI-TP kasvaimet (Fig. 5F G). Myös ilmaus TNFa oli yleensä suurempi TP-yliekspressoivia kasvaimia, mutta se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. S9E).

. Mittaus kasvaimen tilavuuden paksuus. NCI-EV ja NCI-TP-soluja ksenosiirrettyjä nude-hiiriin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. B. mittaus kasvaimen hapettuminen 5 viikkoa kasvaimen kasvua (n = 7 NCI-EV, n = 9 NCI-TP). C-G. mRNA (vasemmalla) ja proteiini (oikealla) ilmentyminen ihmisen IL-8 (C), HO-1 (D), TP (D, E) ja tulehduksellisten sytokiinien (F-G) ksenograftikasvaimissa osoittaa ylössäätely erityksen IL- 8, IL-1β: n ja IL-6 NCI-TP-ksenografteja (n = 5, * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV). H-J. mRNA ilmaus TP (H) ja tulehduksellisten sytokiinien (I-J) in koepalat ihmisen ensisijainen ja toissijainen keuhkojen adenokarsinooman.

vuorovaikutuksen TP, HO-1 ja tulehduksellisten sytokiinien kliinisissä NSCLC yksilöiden

Me tehdään alustava validointi havainnoistamme kliinisten materiaali primaarikasvainten ja kasvaimen tunkeutunut imusolmukkeiden kerätty leikkauksen aikana potilailta, jotka kärsivät keuhkojen adenokarsinooma. Vaikka ei ollut eroja kummassakaan TP, IL-1β tai IL-6 lauseke välillä ensisijainen ja toissijainen kasvain näytteet (Kuva5 HJ), on huomattava, että perusilmennystä TP oli korkea suhteessa konstitutiivisen geenin EF2 kasvainkudoksessa (keskiarvo TP /EF2 = 2,202), joka on verrattavissa TP /EF2 tasot saatu meidän TP-yliekspressoivia ksenografteissa (keskiarvo TP /EF2 = 1,027, kts. 5E). Suhteellinen geeni /EF2 suhteet ovat myös samanlaiset interleukiinit, mikä osoittaa ksenograftimallia lähes yhdenmukainen kliininen tilanne. Löysimme merkittävä korrelaatio HO-1 ja TP ilmauksia (Spearmanin, R = 0,556;

p

= 0,028). Mikä on enemmän, merkittävä korrelaatio TP IL-1β (R = 0,514,

p

= 0,001) ja IL-6 (R = 0,519,

p

= 0,002) havaittiin täten joka vahvistaa datan eläinmallissa osoittaa mahdollisia uusia vaikutus TP kiihdytyssäätely on keuhkon.

TP yli-ilmentyminen lisää angiogeeninen potentiaali endoteelisolujen

interleukiini-1β osoitettiin ilmentymisen indusoimiseksi TP primaarisissa makrovaskulaarisia ihmisen endoteelisoluissa HUVEC [24]. Me jäljentää tämä vaikutus ihmisen mikrovaskulaaristen endoteelisolulinjaa HMEC-1 (Fig. 6A), mikä viittaa asetusta oli tavallista eri endoteelisolujen tyyppejä. Tämä havainto esiin kysymyksen siitä, TP-riippuvaista säätelyä tulehduksellisten sytokiinien syöpäsoluissa voisi edistää modulaatio tuumoriangiogeneesin kautta modulaatio TP endoteelin. Siksi seuraava tutkimme vaikutuksia TP yli-ilmentymisen hankittua. Johdanto TP osaksi HUVEC parannettu kyvyt endoteelisolujen muodostamiseksi tubulussolujen kaltaisia ​​rakenteita Matrigel ja angiogeenisen itämistä vuonna kollageenigeelissä (Fig. 6B, C). Tämä liittyi induktion proangiogeeninen HO-1 (Fig. 6D, E), joka edelleen voimistaa HUVEC-soluissa, kun läsnä on ylimäärä TP alustan (Fig. 6E). In HMEC-1-malli, samanaikainen lisäys VEGF-tuotanto havaittiin seuraavat TP yli-ilmentymisen (Fig. 6F), kun taas mitään vaikutusta ei voitu havaita HUVECrlle (Fig. 6G), joka ei voi vapauttaa VEGF [25] – [27]. Nämä tulokset merkitsevät uutta proangiogeeninen toiminnan TP kuluessa hankittua, mahdollisesti induktion muiden angiogeenisten proteiinien. Mekanismi voi kuitenkin olla tiukasti endoteelisolujen solutyyppispesifisten.

. IL-1β TP ekspressiota HMEC-1-solut. Stimulaatio 0,3 ng /ml ihmisen rekombinanttia IL-1β 24 tuntia johti säätelyä TP endoteelisolujen (EC). (N = 3, * p 0,05 ohjaus

vs

IL-1β). B-C. EC transdusoitiin adenovirusvektoreiden kanssa ADTP tai valvontaa AdGFP MOI = 10 48 tunnin ajan, kun Matrigel määritys HUVEC: n läsnä VEGF (50 ng /ml), (B) ja pallomainen määritys HUVEC (VEGF 50 ng /ml) (C ) suoritettiin, mikä osoittaa tehostettu angiogeeninen potentiaali TP-yli-ilmentävät solut (n = 3, * p 0,05 ADTP

vs

AdGFP, # p 0,05 ohjaus

vs

VEGF) (asteikko bar – 100 um) D-G. 24 h jälkeinen transduktion AdV endoteelisolujen stimuloitiin 1 mM Thd seuraavan 24 tunnin ajan. Analyysi HO-1 ilmentymisen kvantitatiivinen PCR ja western blot in HMEC-1 (D) ja HUVEC (E) esittää induktio HO-1 in TP-yliekspressoivia hankittua, liittyy lisääntynyt VEGF ilmentymistä HMEC-1 (F), kun taas ei ole vaikutusta HUVEC (G). (N = 4, * p 0,05 ADTP

vs

AdGFP, $ p 0,05 ohjaus

vs

Thd).

Keskustelu

keskeisiä havainto tässä tutkimuksessa on osoitus siitä, että TP voidaan yläreguloituja NCI-H292-soluissa aktivoimalla Nrf2 /HO-1-reitin mahdollisesti parannus oksidatiivisen stressin.