Krooninen sairaus

tiivistelmä

aiemmin osoitettu, että koriongonadotropiinia β (hCGβ) aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasio ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Kuitenkin mukana molekyylitason mekanismit ovat epäselviä. Täällä, loimme vakaa eturauhassyöpäsolulinja yli-ilmentävät hCGβ ja testattu hCGβ laukaiseman signalointireitteihin aiheuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota. ELISA osoitti, että hCGβ määrä erittyy väliaineessa lisääntynyt kulttuuriin ajan kuluttua hCGβ-transfektoituja soluja inkuboitiin 3, 6, 9, 12 ja 24 h. Enemmän, hCGβ standardeja edistänyt MAPK (ERK1 /2) fosforylaation ja lisäsi MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden sekä annoksesta ja ajasta riippuvaa tapojansa hCGβ kuin transfektoiduissa soluissa. Lisäksi hCGβ edistänyt ERK1 /2 fosforylaation ja lisääntynyt MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden merkittävästi hCGβ transfektoiduissa DU145 soluja. Kun taas ERK1 /2 esto PD98059 (25 uM) merkittävästi vaimentua fosforyloitu ERK1 /2 ja MMP-2. Erityisesti hCGβ edistänyt solujen vaeltamiseen ja invaasio, silti PD98059 vähentynyt hCGβ aiheuttama soluliikkuvuus näissä olosuhteissa. Nämä tulokset osoittivat, että hCGβ indusoi solun liikkuvuus kautta edistää ERK1 /2 fosforylaation ja MMP-2 säätelyyn ylöspäin ihmisen eturauhassyövän DU145 soluja.

Citation: Li Z, Li C, Du L, Zhou Y, Wu W (2013 ) koriongonadotropiini β indusoi Migration and Invasion kautta aktivointi ERK1 /2 ja MMP-2 Human Eturauhassyöpä DU145 Cells. PLoS ONE 8 (2): e54592. doi: 10,1371 /journal.pone.0054592

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 14 joulukuu 2012; Julkaistu: 12 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Science ja kehittämissuunnitelma Beijing koulutusvaliokunta (lupanumeroon: KM200910025008) ja National Natural Science Foundation of China (lupanumeroon: 81272843). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpien ja kuudenneksi yleisin kuolinsyy miehillä maailmassa [1]. Tällä hetkellä tärkein menetelmiä eturauhassyövän hoitoon ovat eturauhasen, ulkoista sädehoitoa, brakyhoito, systeeminen androgeenien puute hoidon ja kemoterapian, jne. [2] – [6]. Mutta terapeuttinen teho on epätyydyttävä. Uusien hoito kuten molekyyli- hoito on tarpeen eturauhassyövän hoitamiseksi. Mutta luonnehdinta molekyylitason mekanismit aiheuttavat eturauhasen syöpä on perustana uuden hoidon. Jos toteamme terapeuttinen molekyyli tavoitteet, jotka osaltaan eturauhassyöpään ensin, niin voimme hoitaa potilaita kautta kohteena ovat ne kasvainmerkkiaineet estävän eturauhassyövän, edelleen parantaa ennustetta ja laske kuolleisuutta.

istukkagonadotropiinia gonadotropiinien (hCGs) ovat heterodimeerisiä glykoproteiineja erittävät trofoblastiset solujen normaalin raskauden. HCGs on muutama isoformeja sisältää koskemattomia hCG, hCGα, hCGβ, hyperglykosyloiduissa (hCGh), koloja (hCGn) ja ydin-fragmentti hCGβ (hCGβcf) [7]. HCGβ on molekyyli, jossa itsenäinen toiminta. On osoitettu, että vapaa hCGβ on mahdollinen tuumorimarkkeri tuotetaan erilaisia ​​kasvaimia [8] – [10]. Raportoimme aikaisemmin, että hCGβ väheni E-kadheriinin ilmentymisen johtavat maahanmuuttoon ja invaasion eturauhassyöpäsoluissa [11]. Kuitenkin mukana koko mekanismit eivät ole selviä.

Solunulkoisilla signaali-säännelty kinase1 /2 (ERK1 /2) aktivointi on liitetty syövän synnyn ja syövän etenemistä. Lisääntynyt ERK1 /2 aktiivisuus edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden erilaisissa syöpäsolulinjoissa [12] – [15]. ERK1 /2 estäjä, PD98059 vähensi solujen kasvun ja invasiivisuus eturauhassyövässä. MA-10 Leydigin solut, hCG laukeaa ohimenevä ERK1 /2 aktivaation kautta ylävirtaan proteiinikinaasi A (PKA) [12]. Lisäksi, hCG indusoi myös ERK1 /2-fosforylaation on PKA-riippumattomalla tavalla on kohdun limakalvon ja on mukana karsinogeneesissä [13], [14]. Lisäksi on näyttöä siitä, että matriisi (MMP) ilmentyminen säädeltiin ERK1 /2 in invasiivisia karsinoomia. Tutkimukset osoittivat, että aktivoitu ERK1 /2 säännelty aktiivisuutta MMP johtaa solunulkoi- matriisiin (ECM) hajoaminen ja soluliikkuvuus [13] – [15]. Monet MMP pidetään olennaisina proteaaseja ECM hajoaminen ja remontin [16]. Raportti osoitti, että hCG stimuloi eritystä MMP-2 ja MMP-9: n annoksesta riippuvalla tavalla cytotrophoblastic soluihin [17]. Lisäksi hCG upregulated MMP-2 aktiivisuutta ja edistetään soluliikkuvuus in SGHPL-5 solulinjat [18]. Ihmisen eturauhassyöpä, parannettu MMP-2 ja MMP-9 -aktiivisuuden osaltaan kasvaimen invaasion ja metastaasin [19] – [21]. Tutkimukset osoittivat, että D-vitamiinin ja D-vitamiinin analogi ZK191784 vaimentua MMP estävän invaasiota eturauhassyövässä [22] – [24]. Epäilemättä, MMP ovat tärkeitä anti-hyökkäys tavoitteita. Siksi ehdotamme, että hCGβ voisi lisätä ERK1 /2 fosforylaation ja edelleen upregulate MMP edistää solun liikkuvuus.

Näin ollen tässä tutkimme hCGβ laukaisema signalointireitteihin ja keskinäisiä yhteyksiä hCGβ ilmaisun ja solun liikkuvuus. Tämän tutkimuksen, toivomme, että löydämme uusia vihjeitä molekyyli terapiassa eturauhassyövän.

(A) kvantitatiivinen analyysi hCGβ mRNA ja β-aktiini-mRNA transkriptio DV ja DH solujen Reaaliaikainen PCR . DV: DU145 transfektoitu tyhjällä vektorilla; DH: DU145 transfektoitujen solujen hCGβ cDNA rakentaa. Huomaa, että hCGβ mRNA ilmentyy suuresti verrattuna kontrolli. (B) analyysi hCGβ proteiinin ilmentymisen Western blotilla. β-aktiini käytettiin yhtä suuri lastaus ja normalisointi. Tulokset osoittivat, että hCGβ oli hyvin ilmaistu DH soluissa. * Osoittaa

P 0,05

versus kontrolli DV soluja. Tiedot näytettiin keskiarvoina ± SEM kolmesta eri testeissä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

HCGβ standardit ostettiin Abcam (Hong Kong). Konstrukti pVSneo-hCGβ sisältävät hCGβ cDNA hankittiin Stratagene (La Jolla, CA). Restriktioentsyymeillä SalI, Xhol, EcoRI, BamHI, HindIII: lla ja T4-DNA-ligaasia, kompetentteja soluja ovat tuotteita Invitrogen (Carlsbad, CA). G418 ja kristalliviolettia hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Ihmisen eturauhassyöpä DU145 ja PC3 (on varmuuskopio) solut tuotteita American Tyypillinen Culture Collection (Rockville, MD). -Soluja viljeltiin DMEM-alustassa (Hyclone), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa, 95% ilmaa ja 5% CO

2. TranswellTM levyt sisä- insertit tai keinotekoisia tyvikalvoissa ostettiin BD Biosciences (Bedford, MA). Anti-hCGβ oli peräisin Biodesign International (Saco, ME); anti-ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 ja anti-MMP-2 hankittiin Cell Signaling Technology, Inc (Shanghai, Kiina).

Transfektio

Via transfektion, me vakaa solulinjasta yliekspressoivien hCGβ sisään DU145 soluissa. Kontrollivektorilla pVSneo-vektori tehtiin leikkaamalla hCGβ cDNA restriktioentsyymeillä ensin ja sitten autoligation kuten aiemmin on kuvattu [11]. Solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille DMEM kasvualustaa. Kun solut tulevat 90% konfluenssiin, konstruktit, jotka sisältävät pVSneo-hCGβ tai pVSneo-vektori transfektoitiin DU145-soluissa FuGene HD-transfektioreagenssia (Roche, USA) ja valmistajan ohjeita. Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan, solut hajotettiin trypsiinillä-EDTA: lla ja kasvatettiin valinta alustalla, joka sisälsi G418: aa (1,2 mg /ml). Lisäksi, soluja inkuboitiin vielä kaksi viikkoa. Solut ilman integrointia hCGβ geenin olivat kuolleet ja kelluvat keskipitkällä ja yksittäisiä pesäkkeitä, jotka stabiilisti ilmentävät hCGβ kerättiin. Seulotaan soluja viljeltiin selektioelatusaineessa (600 ug /ml G418: aa) ja kaksi viikkoa, kunnes ei ole kuolleita soluja ei löytynyt. Valitut solut pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 600 ug /ml G418: aa ja lisätestejä. Päätimme, vakaa solulinjojen edellisessä työssä [11]; tässä käytimme uuden transfektioreagenssi lisäämiseksi transfektion tehokkuutta.

Reaaliaikainen PCR

Soluja kasvatettiin kuten rutiinit kasvualustaan. Sitten kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA). HCGβ cDNA tehtiin käyttämällä käänteistranskriptaasia Kit (TaKaRa, Kiina) ja 1,5 ug kokonais-RNA noudattaen valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Stratagene Mx3000P väline. Reaaliaikaista lämpökäsittelyyn, kolmena eriä cDNA käytettiin reaktioseoksessa, joka sisältää 250 nM kutakin aluketta reaktiossa 25 ui, että PrimeScriptTM RT reagenssia Kit (TaKaRa, Kiina). PCR Sykliohjelma ajettiin ensimmäinen Esidenaturaatio vaihe 94 ° C: ssa 60 s, sitten 40 syklissä vaiheessa, 94 ° C: ssa 30 s, 57 ° C: ssa 30 s, 72 ° C: ssa 20 s. Alukkeet olivat seuraavat:

hCGβ (eteenpäin): 5′-TCTGTGCCGGCTACTGCCCC-3 ’;

hCGβ (reverse): 5′-TTGGGACCCCCGCAGTCAGT-3′;

β-aktiini (eteenpäin): 5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG -3 ’; β.

β-aktiini (käänteinen): 5′-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3 ’.

Tietoja kerättiin ja analysoitiin seuraten valmistajan käsikirjan ohjeen.

ELISA

HCGβ on erittyvä proteiini, joka saattaa olla vuorovaikutuksessa joidenkin reseptoreihin, kuten luteinisoivan hormonin reseptori, jne rooli käynnistää signalointireittien. Siksi meidän täytyy varmistaa, että ilmaistu hCGβ erittyi solumediumia. Sen jälkeen, kun stabiili DU145-soluja kasvatettiin 70% con fl uency on kasvualusta, solut pestiin kolme kertaa seerumittomalla DMEM-alustassa. Sitten soluja viljeltiin seerumittomassa DMEM-alustassa 3, 6, 9, 12 ja 24 h. Elatusaine kerättiin osoitettuina ajankohtina ja ELISA suoritettiin testata eritetään hCGβ kautta β-hCG ELISA-kitillä (DRG Diagnostics, New Jersey, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Edellisessä tutkimuksessa olemme onnistuneet havaitsemaan hCGβ erittymistä hCGβ transfektoiduissa soluissa kautta hCGβ havaitseminen Kit, F-hCGβ ccubind ELISA, mistä Monobind (Costa Mesa, CA) [11]. Jotta jäljentää ja nämä tulokset vahvistava käytimme β-hCG ELISA kit määrittää hCGβ eritystä.

Immunoblottausmääritys

Kun DU145 soluja viljeltiin vaaditun ajan, solut kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurilla (25 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksikolaattia ja proteaasi-inhibiittorit, Thermo Scientific, USA). Solulysaattia sentrifugoitiin 18000 g: ssä 20 min. Yhteensä proteiinikonsentraatiot testattiin BCA Protein Assay Kit (Invitrogen). Kahdeksankymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja kestää tarvitaan aikaa riippuen molekyylipaino, sitten siirrettiin nitroselluloosamembraaneille kautta puolikuiva siirto. Membraanit blokattiin 1,5% BSA TBS-T: puskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa varovasti ravistellen, sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla erikseen 4 ° C: ssa, yön yli. Kun oli pesty TBST: llä 3 x 10 min, kalvot koettimena fl uorescence-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) 1 h huoneen lämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen kalvot skannattiin vuonna 700 tai 800 kanavia käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, NB, USA). β-aktiini käytettiin yhtä suuri lastaus ja normalisointi. Vasta-aineet laimennettiin asianmukaisesti.

gelatiinitsymografialla

Kun ERK1 /2 esto PD98059 (25 pM) käytettiin hoitamaan DU145-soluja 2 tuntia, muutimme 10% naudan sikiön seerumia DMEM otetaan seerumia, ja viljeltiin 24 tunnin ajan. Medium erittyneen hCGβ kerättiin sama määrä soluja, ja sekoitettiin yhtä suuret määrät ei-vähentää näytepuskuria. Yhtäläisen tilavuus alustaa ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia, kuten proteaasin substraattina. Geeli pestiin 2,5% Triton X-100 liuosta huoneen lämpötilassa varovasti sekoittaen, ja liotettiin puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl

2 · 2 H

2O ja 0,02% Brij-35, pH 7,6) 37 ° C: ssa 42 tuntia. Inkuboinnin jälkeen geeli värjättiin 30 min värjäysliuoksen kanssa (0,5% Coomassie Brilliant Blue, 25% isopropanolia ja 10% etikkahappoa). Sitten värjätty geeli väri poistettiin sopivalla Coomassie R-250 värinpoistoliuos (50% metanolia, 10% etikkahappoa). Alueella, jossa matriisimetalloproteinaaseja, kirkas bändejä vasten tummansinistä taustaa näkyy. Osoittaakseen yhtäläinen lastaus, rinnakkainen SDS geeli ajettiin testaamaan MMP-2 ja β-aktiini Western blotilla.

soluliikkuvuus määritykset

Eturauhassyöpä solumigraatiota tehtiin 24-kuoppaisella levy sisäkammioon; kammion pohja on 8 um huokosia. Yhteensä 1 x 10

5-soluja siirrostettiin ylempään kammioon 500 ui seerumia, ja 1 ml DMEM-alustassa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan kammioon. Kun soluja kasvatettiin 6 tunnin ajan, solut ylemmässä kammiossa poistettiin pumpulipuikolla. Siirrettyjä soluja (tai valejalka) pohjalle kammioon kiinnitettiin 100% metanolissa 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa, sitten värjättiin 0,5% kristallivioletilla liuosta huoneen lämpötilassa 10 min. Muuton jälkeen pois kristalliviolettiliuoksella, solut huuhdeltiin tislatulla vedellä, kunnes ei irtoväriä katseltiin. Siirrettyjä soluja tai valejalka valokuvattiin ja laskettiin 5 satunnaisesti valitun alueilla; kuvat valokuvattiin kameraan Leica DM IRB mikroskoopilla × 200 suurennus. Invaasiomääritys suoritti Kasvaimen invaasio System (8 um huokoskoko, BD BioCoat). Alaosassa soluviljelyinsertissä päällystettiin keinotekoinen tyvikalvon päällystetty matrigeeliä. Kellarissa kalvo on ohut soluväliaineen taustalla epiteelisolujen. Matrigel on kaupallinen tuote, joka on uutettu hiiren sarkooma runsaasti soluväliaineen proteiineja. Pääkomponentti on laminiini, jonka jälkeen kollageeni IV ja hepariinisulfaattiproteoglykaanien. Toinen menettelyt ovat samat kuin migraatiokokeessa.

Tilastollinen analyysi

Data tehtiin varianssianalyysi kanssa posttests vertailun väestön erityisryhmissä. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SEM ja analysoitiin tilastollista merkittävyyttä käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA). Bonferroni korjaukset monimuuttujille vastaan ​​yhden ryhmän käytettiin.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Vähimmäismäärä toistuvia kokeita oli 3.

Tulokset

HCGβ Expression

Ensimmäinen rakensimme kontrollivektorille kuten aiemmin on kuvattu; Sitten DU145-solut transfektoitiin konstruktien kanssa tai ilman hCGβ cDNA. Sen jälkeen kun perustaminen stabiilien solulinjojen soluja ylläpidetään väliaineessa, joka sisälsi 600 ug /ml G418: aa lisätutkimuksia. Testata hCGβ ilmentymisen transfektoiduissa DU145-soluissa, sekä reaaliaikaisen PCR ja Western blot käytettiin määrittämään mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 24 tuntia, vastaavasti (Figure1A, Figure1B). Nämä tulokset osoittivat, että hCGβ oli hyvin ilmaistu sekä mRNA ja proteiini tasoilla verrattuna tyhjä vektori transfektoidaan DU145 (DV) soluja. Joko hCGβ mRNA tai proteiini määrä oli pieni kontrollisoluissa näissä koeolosuhteissa.

HCG eritys

ELISA osoitti, että hCGβ erittyi keskipitkällä huimasti 24 tuntia; määrä oli jopa 150 ng /ml (kuvio 2). Määrä hCGβ eritys lisääntyi inkubointiajan. Huomaa, että olemme perustaneet vakaa solulinjasta yli-ilmentävät hCGβ. HCGβ voisi olla tärkeä rooli välinen signalointi solunulkoisen ja solunsisäisen viestinnän.

Data osoitti, että oli hCGβ erittyä solumediumia. Lisäksi taso hCGβ erittyy elatusaineeseen lisääntyi ajan kuluessa sen jälkeen, kun hCGβ transfektoituja soluja inkuboitiin 3, 6, 9, 12 ja 24 h.

HCGβ Aktivoitu ERK1 /2

HCGβ standardit levitettiin hoitoon ei-transfektoitujen DU145-solujen annoksina 25, 50, 100 ja 200 ng /ml 24 tuntia, Western blot osoitti, että ERK1 /2 ekspressio lisääntyi sen jälkeen, annoksesta riippuvainen suuntaus, ja ERK1 /2 fosforylaation tuli huippu hoidoissa 200 ng /ml hCGβ (kuvio 3A). Näin ollen käsittelimme solut 0 (CON, ohjaus), 5, 15, 30 ja 60 min sen määrittämiseksi, ERK1 /2-fosforylaation. Tulokset osoittivat, että ERK1 /2-fosforylaation ja sen jälkeen ajasta riippuvalla tavalla, ja tuli piikki 30 min hoidon 200 ng /ml hCGβ (kuvio 3B). Lisäksi, ERK1 /2-fosforylaation havaittiin merkitsevästi suurempi hCGβ transfektoiduissa DU145 (DH) soluja kuin kontrollisoluissa. Kuitenkin PD98059 (25 uM), erityinen esto, esti ERK1 /2 fosforylaation merkittävästi verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 3C). Huomaa, että hCGβ aiheutti ERK1 /2 aktivointi seuraavia annoksesta ja ajasta riippuvia käytöstapoja.

(A) Olemme osoittaneet, että pitoisuus 200 ng /ml hCGβ standardien aiheuttamaa soluinvaasiota [11]. Näin ollen, tässä me käsiteltiin ei-transfektoitujen DU145-solujen eri annoksilla 0, 25, 50, 100, ja 200 ng /ml hCGβ 1 tunti. Western blot osoitti, että hCGβ standardit fosforyloituu ERK1 /2: n annoksesta riippuvainen suuntaus. Pitoisuudella 200 ng /ml, ERK1 /2 aktivointi saavuttanut huippunsa. (B) Ei-transfektoitujen DU145-solujen seerumia käsiteltiin 200 ng /ml hCGβ 0, 5, 15, 30 ja 60 min. Western blot osoitti, että hCGβ aktivoitu ERK1 /2 on ajasta riippuva tavalla. Tuolloin pisteen 30 min, ERK1 /2 fosforylaation saavuttanut huippunsa ja sitten laski. (C) Soluja esikäsiteltiin PD98059 (25 pM) 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin 24 tuntia seerumittomassa väliaineessa, Western blot osoitti, että hCGβ aktivoitu ERK1 /2, mutta PD98059 laski ERK1 /2 aktivointi. * Osoittaa

P 0,05

versus DV. Tietoja on esitetty keskiarvoina ± SEM kolmesta eri testeissä.

HCGβ aiheuttama MMP-2: n ilmentymisen kautta aktivointi ERK1 /2

MMP-2 osoitettiin olevan osallisena syöpäsolujen muuttoliike ja invaasio. Tässä tutkimme hCGβ indusoimaa MMP-2: n ilmentymisen on hCGβ ei-transfektoitujen DU145-soluissa. HCGβ standardit lisättiin seerumittomassa väliaineessa annoksina 0 (CON, kontrolli), 25, 50, 100 ja 200 ng /ml. Western blot osoitti, että hCGβ lisääntynyt MMP-2: n ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla, MMP-2: n ilmentymisen nostettiin huippuun, kun käsiteltiin 200 ng /ml hCGβ (kuvio 4A). Lisäksi käsittelimme solut PD98059 (25 pM), tulokset osoittivat, että MMP-2: n ilmentymisen DH-soluissa merkittävästi vaimentua (kuvio 4B), mikä osoittaa, että MMP-2 säätelyä johtui ERK1 /2-fosforylaation.

(A) Käsittelimme ei-transfektoitujen DU145-solujen kanssa 0, 25, 50, 100, ja 200 ng /ml hCGβ 1 h, Western blot osoitti, että hCGβ standardit voimistunut MMP-2: n annoksesta riippuvalla tavalla, pitoisuutena 200 ng /ml, MMP-2: n ilmentymisen saavuttanut huippunsa. (B) Käsittelimme DH ja DV-solujen kanssa tai ilman PD98059 (25 pM) 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin 24 h seerumittomassa elatusaineessa, Western blot osoitti, että hCGβ voimistunut MMP-2: n ilmentymisen ja PD98059 poistettu nämä lisäys. Koot varten pro-MMP-2 ja aktiivinen-MMP-2 ovat 72 Kd ja 64 Kd, vastaavasti. * Osoittaa

P 0,05

versus kontrolli. Tiedot näytettiin keskiarvoina ± SEM kolmesta eri testeissä.

HCGβ Lisääntynyt MMP-2 Activity kautta aktivointi ERK1 /2

gelatiinitsymografialla testi osoitti, että MMP-2 aktiivisuus vähennettiin by PD98059 (25 pM) (kuvio 5), mikä osoittaa, että hCGβ aktivoitu MMP-2 kautta, ERK1 /2-fosforylaation.

Keräsimme ehdollinen väliaineen edellä hoito oli geltin tsymografialla määrityksessä kuin menetelmät. Tulokset osoittivat, että hCGβ lisääntynyt MMP-2 aktiivisuus ja PD98059 vähensi näitä vaikutuksia. * Osoittaa

P 0,05

versus kontrolli. Tietoja on esitetty keskiarvoina ± SEM kolmesta eri testeissä. Alempi paneeli geelin kuvat osoittivat yhtä lastaus että rinnakkainen SDS geeli ajettiin testaamaan β-aktiini Western blotilla.

HCGβ Lisääntynyt soluliikkuvuus kautta ERK1 /2: n fosforylaatio

edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että hCGβ aiheuttama eturauhassyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen vahvistaneet miten hCGβ indusoi solujen vaeltavia ja invasiivisia käyttäytymistä. Tietää hCGβ aiheuttama soluliikkuvuus johtui ERK1 /2 fosforylaatio, migraation ja invaasion testit suoritettiin joko ilman PD98059 (25 uM). Tarkka menetelmät olivat, kuten on kuvattu menetelmät. Tulokset osoittivat, että hCGβ lisääntyi merkittävästi sekä solumigraatioon ja invaasiota; mutta PD98059 laski merkittävästi näitä vaikutuksia (kuva 6A, kuva 6B). Huomaa, että hCGβ täsmälleen nopeutettu solumigraatioon ja invaasion kautta ERK1 /2 fosforylaation.

(A) Jaoimme 1 x 10

5 solua 24-kuoppaisen levyn solun insertit, solut lisättiin /ilman PD98059 (25 pM) 6 h havaita solujen vaeltamiseen, tulokset osoittivat, että hCGβ edistää solujen muuttoliikkeen merkittävästi verrattuna kontrolli. (B) Samalla olosuhteissa olemme inkuboitiin solujen invaasio kammiossa keinotekoisilla tyvikalvon, solut lisättiin kanssa /ilman PD98059 (25 pM) 12 tuntia havaita solujen invaasiota, tulokset osoittivat, että hCGβ edistää solujen invaasiota merkittävästi. Kaikki menettelyt suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. * Osoittaa

P 0,05

versus kontrolli. Tiedot näytettiin keskiarvoina ± SEM kolmesta eri testeissä.

Keskustelu

Eturauhassyöpä osuus 29% kaikista syövistä miehillä [25]. Eturauhassyöpä soluilla on silmiinpistävä taipumus etäpesäkkeitä, ja etäpesäke on merkittävä kuolinsyy syöpäpotilaiden [26]. Sen vuoksi on tarpeen löytää ja luonnehtia kohdemolekyylit estää invaasiota ja etäpesäkkeiden kautta geenikohdennus.

HCGβ on merkittävä markkeri pahanlaatuisen muutoksen. Lähes jokainen ihmisen syövän tuottaa hCGβ jossain määrin [27]. Tutkimukset osoittivat, että hCGβ edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja voi myös edistää etäpesäke. Esimerkiksi Laurence Cole huomasi, että hCGβ voivat kilpailla TGFli sitoa TGF-reseptori, kuten TGFli reseptoriantagonismista valvoa apoptoosin ja invaasiota aktivoimalla metalloproteinaasien [28]. Myös toinen raportti osoitti, että hCGβ ja VEGF olla koordinoitu rooli kautta angiogeeninen ja invasiivisia ominaisuuksia kehittämisessä Barrettin adenokarsinoomien [29]. Kautta edellä tuloksista voidaan päätellä, että hCGβ voisi olla tärkeä rooli syövän edistäviä kautta useita signalointireittien. Näin ollen on välttämätöntä tutkia hCGβ laukaisema signaalireaktioteissä kasvain muuttoliikettä ja invaasiota.

Edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että hCGβ muuttunut syöpäsolujen morfologia, kiihtyvä solun liikkuvuus, vähen- tämisessä muuttoliike estävä proteiini E-kadheriinin, edistämään yksilön eturauhassyöpä muuttoliike ja invaasiota [11]. Kuitenkin edelleen mekanismeja aiheuttaa muuttoliikettä ja invaasion pitää tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että jotkut signaalinvälitysreittien liittyivät maahanmuuttoon ja hyökkäystä. Tässä osoitimme, että hCGβ voimistunut ERK1 /2 ja MMP-2 johtaa solun muuttoliikettä ja invaasiota. Käyttämällä ERK1 /2 fosforylaation esto PD98059, huomasimme, että MMP-2 säätelyä johtui ERK1 /2 fosforylaatio. ERK1 /2 on osoittautunut edistää kasvaimen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja etäpesäkkeiden, ja useat tutkimuksesta osoitti, että hCG edisti ERK1 /2 aktivointi joissakin solutyypeissä [30], [31]. On selvää, nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tuloksemme että hCG indusoi ERK1 /2 fosforylaation annoksesta ja ajasta riippuvaa käytöstapoja DU145 soluissa. ERK liittyvä reitti on yksi kriittisimmistä signalointireittejä kasvaimen esiintyminen, kehittäminen ja kloonilaajenemisen. Erityisesti, MMP-2 on keskeinen molekyyli kasvaimen invaasio. Havaintomme että hCGβ aktivoitu MMP-2 kautta ERK1 /2 fosforylaation DU145 solut ovat erittäin tärkeitä. Nämä tulokset paitsi paljasti suhdetta hCGβ ja syöpä, mutta totesi myös, että me löytäneet uuden keskeinen koulutusjakson estää syöpää. Ilmeisesti hCGβ /ERK1 /2 /MMP-2-reitti on elintärkeä kasvaimen invaasio, ainakin eturauhassyövässä. Toisin sanoen, olemme huomanneet, enemmän hyötyä lähestymistapoja estää kasvaimen invaasio, ja edelleen voimme kehittää molekyylitasolla huumausaineiden.

hCG koostuu kahdesta alayksiköstä, hCGα ja hCGβ. Nämä kaksi alayksiköstä tehdä monimutkainen, joka sitoutuu luteinisoivan hormonin reseptoriin ja laukaisee signalointireitteihin. Emme kuitenkaan tiedä, onko hCGβ sitoutuu myös luteinisoivan hormonin reseptoriin erikseen. Tämä tutkimus antoi meille uuden vihjeen ja työntää meidät luonnehtia hCGβ erityisiä reseptorin.

Lisäksi MMP pidettiin olevan etäpesäkkeitä edistävää molekyylejä monenlaisia ​​isoformeja. Niillä on mahdollisuuksia hajottamiseksi soluväliaineen ja tyvikalvon. MMP-2 on liitetty keskeiseksi jäsen MMP. Enemmän, ERK1 /2 voi siirtyvät tumaan ja aktivoi jonkin transkriptiotekijän AP-1 säädellä geenin transkriptiota [32]. AP-1 etsii ja MMP-2 promoottorialueen MMP-2-geenin, mikä, ERK1 /2 voi edistää MMP-2-transkription ja vapauttaa [33], [34]. Näin ollen, jotta voidaan tutkia roolia ERK1 /2 säätelemään solujen vaeltamiseen ja invaasiota, olemme menestyksekkäästi määritetty MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden. Huomasimme, että hCGβ huomattavasti MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden. Nämä vaikutukset olivat huomattavan tukahdutettu PD98059 vuonna hCGβ transfektoiduissa DU145 soluja. Nämä tulokset osoittivat ylikuulumisen ERK1 /2 ja MMP-2. Sattumalta, Huomasimme myös, että hCGβ edistetään ERK1 /2 fosforylaation ja MMP-2: n ilmentymisen jälkeen sama annos ja aikaa kuvioita. Nämä tulokset osoittivat, että hCGβ laukaisi ERK1 /2 aktivointi johti MMP-2 säätelyä ja lisäsi MMP-2: n aktiivisuuden. Niinpä hCGβ-aiheutti muuttoliikkeen ja invaasion johtui ERK1 /2 aktivointi. Kuitenkin, meillä ei ole riittävää näyttöä siitä hCGβ aiheuttamia MMP-2 säätelyä on merkittävä rooli maahanmuutto- ja hyökkäystä. Transfektio MMP-2 konstruktio ja tyrmätä MMP-2 tutkimus voisi auttaa vastaamaan näihin kysymyksiin. Lisäkarakterisointiin hCGβ signaloinnin auttaa meitä löytää lisää etäpesäkkeiden markkereita täyttämään terapeuttisen vaatimukset.

Itse asiassa, jotkut asiantuntijat ovat aloittaneet tutkimuksen hCGβ liittyviä vasta-aineita alalla syövän [35], [36]. Tässä me paljastui, että hCGβ fosforyloituu ERK1 /2 ja edelleen ilmen- tymisen lisääntymisen MMP-2 lisätä syövän motiliteetin eturauhassyöpäsoluissa. Tuloksemme saattavat antaa uusia oivalluksia molekyylitason mekanismeja hCGβ sääntelyn ja tarjota vahvemman pohjan hCGβ liittyvä tutkimus kasvaimia estävä aine.

Löysimme muutamia uusia molekyyli tavoitteita estävän invaasiota ja etäpesäkkeiden eturauhasen syöpä. Tehokas hoito eturauhasen syöpä on suuri merkitys. Estäminen hCGβ signalointi on potentiaalinen terapeuttinen strategia eturauhassyövän ja muiden syöpien. Lisätyötä on luonnehtia hCGβ reseptoriin; kehittäminen hCGβ signaloinnin esto tulee mahdollinen kenttä alentaa ja metastaasit.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Ameae Walker, University of California, Riverside ystävällisistä suuntaan alkuperäisen hankkeen suunnitteluun . Kiitämme myös tohtori Tao Jiang, Tiantan sairaala, Capital Medical University hänen apua kokeissa.