Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

Vaikka geenin muutos T-solujen ilmaista kasvaimeen liittyvien antigeenispesifisten T-solureseptorin (TCR) tai kimeerisen antigeenin reseptori (CAR) on kliinisesti todistettu lupaus on vielä parantamisen varaa kliiniseen tehoon uudelleen suunnatun T-solu- pohjainen antitumor adoptiivinen hoito. Saavuttaakseen lisää tavoitteen kliininen vaste käyttämällä ex vivo-laajennettu kasvaimeen reagoivien T-solujen, haudutetun T-solut täytyy näyttää riittävän lokalisoitu tunkeutuminen kasvaimeen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Human keuhkosyövän solut vaihtelevasti ilmentävät tuumoriantigeenin, Wilmsin kasvain geenin tuotteen 1 (WT1), ja tulehduksellinen kemokiini, CCL2. Kuitenkin, CCR2, asiaa reseptori CCL2: n, on harvoin ekspressoidaan aktivoiduissa T-lymfosyyteissä. HLA-A2402

+ ihmisen keuhkosyövän solulinjassa, LK79, joka ilmentää suuria määriä sekä

CCL2

ja

WT1

mRNA, työskenteli kohteena. Normaali CD8

+ T-solut olivat retroviruksella-geenin muunnettu ilmentämään sekä CCR2 ja HLA-A * 2402-rajoitettu ja WT1

235-243 nonapeptidi-spesifisten TCR efektorina. Anti-kasvain toimintoja välittävät nämä efektorisolujen vastaan ​​LK79 solut arvioitiin sekä in vitro että in vivo. Lopulta vaikutus CCL2 on WT1 epitooppi reagoivien TCR signalointi välittyy efektorisolujen tutkittiin. Käyttöön CCR2 oli funktionaalisesti validoitu käyttämällä geeniä-modifioitua Jurkat-solut ja ihmisen CD3

+ T-solut sekä in vitro että in vivo. Double geeni-modifioitu CD3

+ T-solut menestyksekkäästi osoittanut sekä CCL2-trooppisten kasvain ihmiskaupan ja sytosidaalisia reaktiivisuus vastaan ​​LK79 solujen kasvua in vitro ja in vivo. CCL2 täydensi WT1 epitooppi reagoivien TCR signaloinnin osoittama asiaa lusiferaasin tuotantoa kaksinkertainen geenien muunnettuja Jurkat /MA solujen ilmaista lusiferaasi ja WT1-spesifisiä TCR, ja CCL2 myös annoksesta riippuen lisätyn WT1 epitooppi reagoivaa IFN-γ tuotantoa ja CD107a ilmaisun välittämä nämä double geeni-modifiedCD3

+ T-soluja.

Päätelmä /merkitys

käyttöönotto CCL2 /CCR2 akseli menestyksekkäästi tehostua vivo anti-keuhkosyöpä reaktiivisuus välittyy CD8

+ T-solujen kaksinkertainen geeni-muunnettu ilmentämään WT1-spesifisten TCR ja CCR2 paitsi kautta CCL2-tropic kasvain ihmiskauppaa, mutta myös CCL2-parannettu WT1-reagointikykyä.

Citation: Asai H, Fujiwara H, An J , Ochi T, Miyazaki Y, Nagai K, et ai. (2013) Co-Otettiin Toiminnallinen CCR2 Voimistaa In vivo Anti-Lung Cancer Toiminnallisuus välittävät T-solut Double Gene-muunnettu ilmentämään WT1-Specific T-Cell Receptor. PLoS ONE 8 (2): e56820. doi: 10,1371 /journal.pone.0056820

Editor: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 18 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Asai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia Japanin HF ja MINUN, ja Grant-in-Aid for Cancer Research terveysministeriön, Labour and Welfare MY. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat paitsi SO, JM ja HS ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole. SO ja JM ovat työntekijä Takara Bio, Inc .. HS on varustettu tutkimusrahoitusta Takara Bio, Inc .. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

huolimatta viimeaikaisista terapeuttista edistystä, eloonjäämisaste joilla on pitkälle edennyt keuhkosyöpä on edelleen huono [1], ja siksi etsintä uusien hoitomuotojen edelleen toivottava tavoite. Tulokset kliinisistä tutkimuksista kasvainten vastaisten otto- terapia ex vivo-laajennettu kasvaimeen reagoivien T-solujen, pääasiassa kasvaimeen infiltroituneen T-lymfosyyttien (TIL), hoitoon kehittynyt melanooman ovat osoittaneet vaikuttava kliinistä reagointia. Toisaalta, on olemassa tiettyjä haittoja, kuten menettelyjen monimutkaisuudesta ja vaikeuksia ylläpitää terapeuttisen laadun pitkäaikaisia-viljellyt T-solut [2]. Viimeaikaiset tekniset edistysaskeleet, joissa geenin muutokset käyttöön kasvaimeen reagoivien reseptorien terapeuttisiksi T-soluja – kuten kasvaimen antigeeni-spesifisten T-solureseptorin (TCR) ja kimeerisen antigeenin reseptori (CAR) – on suurelta osin ratkaisemaan nämä ongelmat [3] – [5 ]. Koska alueella sopivasti reagoivat kasvainten on vielä vähäistä, olemme ehdottaneet joitakin uusia vaihtoehtoja, kuten HLA-A * 2402-rajoitettu WT1-spesifisten TCR [6] ja HLA-A * 0201-rajoitettu Aurorakinaasi A (AURKA) erityisiä TCR [7], hoitoon ihmisen leukemiat. Toinen tekninen edistysaskel ehdotimme on uusi TCR vektorin järjestelmä, joka samanaikaisesti tuottaa shRNAs endogeenisen TCR α /β-geenejä (siTCR vektori) [8], mikä vähentää muodostumista mispaired TCR, mahdollinen riski tappavan akuutin GVHD [9].

WT1 on tunnettu kasvain antigeeni ilmaistu eriasteisina ihmisen keuhko- syöpäsoluja [10], ja WT1 ilme on osoitettu kliinisesti olevan ennusteen arvioinnissa keuhkosyöpäpotilaiden [11]. Käyttäen ksenosiirretty hiirimallissa, olemme aiemmin tutkineet anti-keuhkosyöpä terapeuttista potentiaalia ex vivo-laajeni klonaalinen sytotoksinen T-solulinja (CTL) [12], TAK-1, joka tunnistaa spesifisesti WT1

235-243 nonameeri epitoopin yhteydessä HLA-A * 2402 [13].

Toisaalta, riittämätön tunkeutuminen terapeuttisen T solujen lokalisoitu tuumorikohdat on rajoite onnistuneen hoidon [14]. Jotta lisätä kasvaimen kaupan aktiivisuus infuusiona terapeuttisen T-solujen, kykyä vastata asianmukaisen kemokiinien tuottaman kasvainsoluja tai kasvaimeen tunkeutunut immuunisolujen tarvitaan. Ensin Kershaw et al. [15], sarja prekliinisissä tutkimuksissa perustuu tähän käsitteeseen on tehty [16] – [19]. Kuitenkin pääasiallinen kysymys josta kemokiinin kemokiinireseptorin parin tulisi valita kliiniseen käyttöön on vielä ratkaistava. Esillä olevassa tutkimuksessa, jotta voidaan tutkia mahdollisia etuja yhteistyössä käyttöön kemokiinin kemokiinireseptorin akseli syövänvastaisen omaksutun immunoterapiaa, käytimme mallina geneettisesti ohjataan T-solut kohdistuvat WT1 hoitoon ihmisen keuhkosyöpää.

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CC-kemokiini 2 (CCL2) tuotettiin muuttujaan asteeseen ihmisen keuhkosyövän solulinjoja, ja että LK79, HLA-A * 2402

+ pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solulinja yli-ilmentävät

WT1

mRNA, valmistettu erittäin suuria määriä CCL2. LK79 tappoi CD8

+ T-solujen geenien modifioitu ilmentämään WT1-spesifinen TCR peräisin TAK-1. Toisaalta, CCR2, erityisen reseptorin CCL2: n, tuskin ilmenny näillä transfektantit. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että jotta voidaan osoittaa meidän proof-of-concept, se olisi järkevää palkata CCR2-CCL2 akselin asettamista ohjataan T-solujen kohdistaminen WT1 ja keuhkosyöpää. Koska hoito SCLC edelleen haastava [20], katsoimme, että käyttö LK79, joka on SCLC solulinja, koska tavoite saattaisi avata uusi väylä terapian SCLC.

Tässä tutkimuksessa olemme tarkasteli yksityiskohtaisesti vastaisen keuhkosyöpä toiminnot välittyvät tupla-transfektoitujen CD8

+ T-solut ilmaista WT1-spesifisten TCR ja CCR2 vastaan ​​LK79 soluja, sekä in vitro että in vivo. Perustuen havaintojemme keskustelimme kliininen toteutettavuus tämän strategian adoptiiviseen immunoterapiaa ihmisen keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

1. Etiikka lausunto

hyväksyntä tätä tutkimusta varten saatiin Institutional Review Board of Ehime University Hospital. Kirjallinen suostumus antoivat kaikki terveitä vapaaehtoisia mukaisesti Helsingin julistuksen. Kaikki in vivo hiiren Kokeet hyväksynyt Ehime yliopiston eläinten hoito komitea.

2. Solut

Jurkat-soluja (ATCC) ja ihmisen keuhkosyövän solulinjoja positiivisia joko HLA-A * 2402

+, WT1 mRNA tai molemmat käyttää. Jälkimmäinen sisältyy LC99A (suuri karsinooma alkuperä) [21], LK79 (pienisoluinen karsinooma) [21], rerf-LC-A1 (okasolukarsinooma) [21] ja LC11-18 (adenokarsinooma) [22]. PC-9 (adenokarsinooma) [21] oli positiivinen HLA-A * 2402

+ mutta negatiivisia WT1 mRNA, Sq-1 (levyepiteelikarsinooma) [21], LC65A (pienisoluinen karsinooma) [21], QG56 (levyepiteelikarsinooma) [21], LK87 (adenokarsinooma) [21], ja 1-87 (adenokarsinooma) [21] olivat negatiivisia HLA-A * 2402. Kaikki nämä aiemmin julkaistu keuhkosyövän solulinjat toimitti ystävällisesti Dr. Akio hiraki (Okayama University Graduate School, Okayama, Japani), ja viljeltiin, kuten on raportoitu aiemmin [12]. Jurkat /MA solulinja (ystävällisesti professori Erik Hooijberg, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam, Alankomaat) on Jurkat solu jatkokloonin aiemmin vahvistettu professori Erik Hooijberg ja työtovereiden jolta puuttuu endogeeninen TCR ilmaisun ja vakaasti ilmentää sekä ihmisillä CD8a geeni (

hCD8α

) ja

NFAT-lusiferaasi

geenikonstruktilla havaitsemiseksi signaloinnin kautta äskettäin käyttöön TCRiä [23].

HLA-A * 2402

geeni-transdusoitujen C1R-solulinja (C1R-A24) oli myös viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 0,5 mg /ml hygromysiini B (Invitrogen). B-lymfoblastoidisolulinjat (B-LCL) vahvistettiin transformaatio perifeerisen veren B-lymfosyyttejä Epstein-Barr-virus. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) terveistä vapaaehtoisista eristettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä käyttöön asti.

3. Hiiret

Kuusi viikkoa vanhoja NOD /SCID /yc

null (NOG) naarashiiriä ostettiin Keski Institute for Experimental Animals [24] ja ylläpidetään institutionaalisten eläimen laitokseen Ehime University.

4. Virtaussytometria

Surface markkereita transfektanttien tai ei-geenin modifioidun T-solut leimattiin anti-CD8, anti-CD4, anti-CD3 ja anti-CD45-mAb: t (BD Biosciences), anti-CD25 ja anti- CD69-mAb: t (BioLegend), anti-Vβ5.1 mAb (Beckman Coulter), anti-CCR2-mAb (R myöhemmin, GaLV-pseudotyypitettyä retrovirusvektoreiden saatiin peräkkäinen transfektio näiden svektori PG13 solulinjaan (Takara Bio).

6. Transduktio

TCR

ja

CCR2

geenien

Jurkat /MA solut ja terveitä luovuttaja-T-solut geeni-muunnettu ilmentämään WT1-spesifisten TCR ja CCR2 kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],6]. Lyhyesti, päivänä 1, 1 x 10

6 T-soluja kuoppaa kohti GT-T503 (Takara Bio) ja 5% ihmisen seerumia, 0,2% ihmisen albumiinia, 50 U /ml rekombinanttia ihmisen IL-2 (R Microtec).

8. WT1-reagoiva lusiferaasituotannon välittämä tupla-transfektoitujen Jurkat /MA solujen

mitata CCL2 ligaation yhteistyössä käyttöön CCR2 on WT1 epitooppi reagoivien TCR signalointia Jurkat /MA solulinja, joka on vailla endogeenisen TCR, ja vakaasti ilmentää

hCD8α

ja

NFAT-lusiferaasi

reportterigeeni (Jurkat /MA /CD8a /luc) käytettiin. Lyhyesti, WT1-si

TCR

ja

CCR2

geenejä transdusoitiin retroviraalisesti osaksi Jurkat /MA /CD8a /luc-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Double geeni-modifioitu Jurkat /MA /CD8a /luc soluja, kaksinkertainen positiivisia Vβ5.1 ja CCR2, eristettiin, laajennettiin ja alistettiin toiminnallinen analyysi. Kaksi miljoonaa double-transfektoitujen Jurkat /MA /CD8a /luc soluja co-inkuboitiin 1 x 10

6 MMC-käsiteltyjen C1R-A24-solujen kanssa tai ilman ladattu WT1-peptidin (20 uM) stimuloijaksi eri pitoisuuksien kanssa ihmisen rekombinantti CCL2 (Peprotech) 12 tuntia klo effector:target suhteessa 02:01. Single-transfektoitujen Jurkat /MA /CD8a /luc soluja pelkästään ilmentävät WT1-spesifisiä TCR käytettiin kontrollina. Sen jälkeen nämä solut hajotettiin ja niille lusiferaasianalyysissä käyttäen PicaGene-Dual-SeaPansy Kit (Toyo Inki). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Lumicounter 700 (Microtec Nition).

9.

51Cr-release assay

määrittämiseksi sytotoksisen aktiivisuuden välittämä

WT1-siTCR

geeni transduktoitu- CD8

+ T-solut, vakio

51Cr-release määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, 10

4 unpulsed tai peptidilisätyt kohdesolua leimattiin

51Cr (Na

2CrO

4: MP Bio Japani) ja inkuboitiin erilaisissa suhteissa efektorisolujen kanssa 200 ui viljelyalustaa 96-kuoppaisilla pyöreäpohjainen levyille. Eston määrityksessä, soluja viljeltiin, kun läsnä oli joko anti-HLA-luokan I yhteydessä mAb (W6 /32, ATCC) tai kontrollina anti-HLA-DR-mAb (L243, ATCC). 5 tunnin inkubaation efektorisolujen, 100 ui supernatanttia kustakin kuopasta. Prosenttiosuus spesifinen lyysi laskettiin: (kokeellinen vapautuminen cpm-spontaani vapautuminen cpm) /(maksimaalinen vapautuminen cpm-spontaani vapautuminen cpm) x 100 (%).

10. IFN-γ erityksen määritys

Viisisataatuhatta double-transfektoitujen normaali reuna CD8

+ T-solut ilmensivät sekä WT1-spesifisten TCR ja CCR2 oli inkuboitu yhdessä 1 x 10

5 WT1 peptidilisätyt (1 uM) tai unpulsed C1R-A24-soluissa 24 tuntia erilaisten pitoisuuksien CCL2. IFN-γ viljelmän supernatantissa mitattiin samoin ELISA-kittiä (R erot

p

0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

1. Tuotannon eri määriä CCL2 ihmisen keuhkosyövän solulinjat, ja harvinaisia ​​ilmentyminen vastaavan reseptorin CCR2 T-solujen pinnalla aktivoidaan OKT-3 ja IL-2

ilmentymisen profiilit 12 valitun kemokiini-mRNA: iden tuottaman kunkin ihmisen keuhkosyövän solulinjoja arvioitiin qRT-PCR: llä on esitetty taulukossa 2. Kuten on esitetty kuviossa 1A, eri määriä CCL2 proteiinia tuotettiin kaikissa keuhkosyövän solulinjat arvioida, joista LK79, eli SCLC solulinja tuotettu erityisesti suuria määriä CCL2. Vastaava reseptori, CCR2, harvoin ilmaistuna pinnalla sekä lepäävien T-solujen tai jotka aktivoidaan OKT-3 /IL-2 (n = 5). Aktivoidut T-solut aidatulla CD69 positiivisuutta. Edustava esimerkki joukossa 5 tapauksessa on esitetty kuviossa 1B. Ekspressiotasoja lepäämiseen ja aktivoitu soluja: CD8, 0,83 ± 0,72% ja 0,75 ± 0,51%, ja CD4, 0,66 ± 0,45% ja 0,5 ± 0,26% (keskiarvo ± SD), tässä järjestyksessä. Lisäksi, qRT-PCR osoitti, että ekspressiotasot

CCR2

mRNA: n päälle ja lepäävien T-solujen (n = 5) ei eroa joko CD4

+ tai CD8

+ T-soluja (tuloksia ei näytetty). Toisaalta, efek- CD8

+ T-solujen kaksinkertainen transfektoitujen ilmaista HLA-A * 2402-rajoitettu ja WT1

235-243-specific-TCR onnistuneesti tappoi ehdokas ihmisen keuhkosyövän solulinjoja käytettäessä HLA-A * 2402-rajoittuneesti (Fig. 1 C ja 1 D). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että valinta CCR2-CCL2 akselilla ja liitettiin CTL: ien käsittää efektorisolujen-geenin muunnettu ilmentämään WT1-spesifisten TCR LK79 kohdesoluja, jotka olivat herkkiä sytosidinen aktiivisuuden välittämien transfektoitu CTL oli kohtuullisen sopivia osoittaa proof-of-concept tämän tutkimuksen. Niinpä nämä double-transfektoitujen efektori CD8

+ T-solujen pariksi tavoite LK79 soluja käytettiin myöhemmissä kokeissa.

(A) ELISA-määritys paljasti, että 10 ihmisen keuhkosyövän solulinjat tutkitut tuotettu eri määriä CCL2 viljelmän supernatantissa. Virhe palkit kuvaavat SDS. (B) Kuten transduktio WT1-spesifisten

TCR

geenin, CD69-positiivisia CD8

+ ja CD4

+ T-solut aktivoidaan IL-2 ja OKT-3 Harvoin solun pinnan CCR2. Tyypillinen esimerkki 5 tapauksessa on esitetty. (C) CD8

+ T-solujen geenien muunnettu ilmentämään HLA-A * 2402-rajoitettu ja WT1

235-243 nonameeri erityisiä TCR onnistuneesti näkyvissä sytosidaalisia tehoaa keuhkosyövän solulinjaa soluja HLA-A * 2402-rajoitettu tavalla, määritettynä standardin

51Cr release määrityksessä. Virhe palkit kuvaavat SDS. Rahalaitosten osoittaa fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti, ei määr osoittaa vähemmän kuin havaittavissa. (D) Tällaiset anti-keuhkosyöpä aktiivisuus (vs. LK79 ja LC99A) estyi anti-HLA-luokan I yhteydessä mAb (klooni W6 /32), mutta ei anti-HLA-DR-mAb (klooni L243), jälleen osoittavat, että viety WT1-spesifisten TCR-välitteisen kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta oli HLA-luokan I-rajoitettu. Virhe palkit kuvaavat SDS. (E) tetrameeriä määritys osoitti, että efektorisolujen käytettiin näissä kokeissa oli positiivinen WT1 /HLA-A * 2402-tetrameerin. HIV /HLA-A * 2402-tetrameerin käytettiin negatiivisena kontrollina.

2. Toiminnallinen validointi käyttöön CCR2

Ensinnäkin, toiminnallinen validointi käyttöön CCR2 suoritettiin käyttäen

CCR2

-transfected Jurkat-soluja (Jurkat /CCR2) in Transvvell- kokeissa. Jurkat /CCR2, mutta ei vanhempien Jurkat-soluja, onnistuneesti näytetään CCL2-välitteisen muuttoliike aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Kuvio 2 esittää numerot liikkuvien solujen suhteessa, että aikana, CCL2 pitoisuutena 12,5 ng /ml. Jurkat /CCR2 soluja samalla näy maahanmuuton aktiivisuus LK79, LK87, LC11-18, LC65A ja LC99A soluja kylvetään pohjaan kuoppiin mukaan tason CCL2 tuottaman kunkin solulinjan (Fig. 1A). Lopuksi tämä kemotaksis välittyy Jurkat /CCR2 kohti LK79 inhiboitui täysin anti-CCR2-mAb (Fig. 2B). Seuraavaksi käyttäen ksenosiirretty NOG hiirimallissa, kasvaimen antigeeni-riippumaton in vivo kasvaimen kaupan välittämä

CCR2

ja

lusiferaasia

double-transfektoitujen normaali CD3

+ T-soluja tutkittiin käyttämällä bioluminescence kuvantamisen . Yhden päivän kuluttua laskimoinfuusion, nämä lusiferaasi-leimattua CCR2 ilmentävien CD3

+ T-solut alkoivat kerääntyvät rokotettujen LK79 solujen vatsaontelon etuseinämään, kun taas lusiferaasi-leimattu CD3

+ T-solut puuttuvat CCR2 olivat hajallaan koko kehon tarkkailujakson aikana (Fig. 2C). Seuraavaksi validointi toiminto kaksinkertaisen transfektoitujen normaali CD8

+ T-solut ilmaista sekä WT1-spesifisiä TCR ja CCR2 toteutettiin. Ensin arvioi yhteistyössä käyttöön CCR2 heikentynyt WT1-spesifinen sytosidisia tehoaa keuhkosyöpä solut välittävät tupla-transfektoitujen efektori CD8

+ T-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B, WT1-peptidi-reagoiva sytosidisia aktiivisuuden ja anti-keuhkosyöpä aktiivisuutta HLA-A * 2402

+ LK79 soluja (mutta ei HLA-A * 2402

– LK87 solujen negatiivisena ohjaus) välittämä nämä efektorisolujen, kaksinkertaisena-positiivisia Vβ5.1 ja CCR2 (Fig. 3C), ei vaarantunut suhteessa, että välittämä WT1-spesifisten

TCR

single-transfektoitujen CD8

+ T-solut (Fig. 1 C). Seuraavaksi yhdistetyt antituumori- toimintoja vastaan ​​LK79 solujen välittämä double-transfektoitujen CD8

+ T-solut, jotka käsittävät sekä lisääntynyt kasvaimen kaupan aktiivisuus ja WT1-spesifinen sytosidisia aktiivisuus, tutkittiin käyttämällä modifioitua transwell kokeessa. Näiden kaksois-transfektoitujen CD8

+ T-solujen (n = 3), mutta ei WT1-si

TCR

yhden transfektoitiin CD8

+ T-solujen (n = 3), ylä- ja tehokkaasti siirtynyt pohjaan ja jossa LK79 solut oli ympätty ja esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan. Sekä kaksi- ja WT1-si

TCR

single-transfektoitujen efektorisolujen ladataan ylempään kaivot olivat yhtä 90-92% positiivisia Vβ5.1, ja 70-72% kaksinkertaisen transfektantit ilmaisi CCR2 (data ei näytetty). Näin ollen merkittävästi (

p

0,05) enemmän LK79 solut tuhottiin siirretty double-transfektoitujen CD8

+ T-solut kuin WT1-si

TCR

single-transfektantit, jota edustavat kohonnut LDH viljelmien supernatanteissa (Fig. 4A). Lopussa näiden transwell kokeissa, virtaussytometria-analyysi osoitti, että 3,4 kertaa enemmän Vβ5.1-positiivisia efektorisolujen jäi pohjalle hyvin käsiteltiin kaksinkertaisen transfektoitiin CD8

+ T-solujen 7,91 ± 0,51 (x 10

4 ) kaksinkertainen-transfektantit, ja 2,35 ± 0,13 (x 10

4) yhden-transfektantit, vastaavasti), joka tukee tulokset LDH-määritystä. Mikroskooppinen tutkimus vahvisti suurempaan tuhoaminen LK79 solujen pohjalle hyvin käsittelyn jälkeen kaksinkertaisen transfektoitujen efektorisolujen, kuin yhden transfektoiduissa soluissa. Lisäksi konfokaali mikroskooppinen tutkimus osoitti punaisen leimattu siirretyn CCR2 ilmentäviä efektorisolujen pohjaan hyvin vasta hoidon kaksinkertainen geenin modifioidun efektorisolujen. Edustava esimerkki joukossa kolme koetta, on esitetty kuviossa 4B.

(A)

CCR2

-transduced Jurkat-soluja, mutta ei vanhempien Jurkat-soluja, näytetään annoksesta riippuvainen transwell CCL2-kemotaksista. Numerot liikkuvien solujen on esitetty suhteessa, että aikana, CCL2 pitoisuutena 12,5 ng /ml. Virhe palkit kuvaavat SDS. (B) Samalla numerot vaeltavia

CCR2

-transduced Jurkat-solut kullekin tasyöpäsolulinja näkyvät. Migraatio

CCR2

-transduced Jurkat-solut ilmeisesti inhiboi anti-CCR2 mAb, mikä viittaa siihen, että määrä vaeltavia solujen riippui tasosta CCL2 tuottaman kunkin solulinjan (kuvassa. 1A) ja välittämä jonka käyttöön CCR2 Jurkat-soluissa. Virhe palkit kuvaavat SDS. (C) CCL2-pohjainen Kohdeantigeenispesifiset riippumaton in vivo kasvaimen kaupan kohti ympätty LK79 solujen välittämiä

CCR2

-transfected CD3

+ T-solujen osoitettiin onnistuneesti vuonna ksenosiirretty hiirimallissa. Suonensisäisesti infuusiona lusiferaasi-leimatun CD3

+ T-solut ilmentävät CCR2 (CD3 /CCR2 /luc) (alempi), mutta ei niitä ole CCR2 (CD3 /luc) (ylempi), alkoivat siirtyä kohti LK79 solut heti 1. päivänä, kun infuusio, ja niiden kohdennetuilla maahanmuutto- säilyi koko tarkkailujakson aikana.

(A) käyttäen vakio

51Cr release assay, nämä kaksinkertainen transfektoidut efektorisolujen riittävän hajotettiin 1 uM WT1-peptidi-ladattu, mutta purkamattoman C1R-A24-solut, jotka ilmensivät HLA-A * 2402. E /T-suhde osoittaa effector:target suhde. Virhepalkin osoittaa SDS. (B) Nämä double-transfektoitujen efektorisolujen myös riittävän hajotettiin HLA-A * 2402

+ LK79 soluja, mutta ei LK87 soluja, joista puuttuu HLA-A * 2402-molekyyli käytettiin negatiivisena kontrollina. (C) Double-transfektoidut CD8

+ T-solut onnistuneesti ilmaistu sekä solun pinnan CCR2 ja Vβ5.1, alkio-linjan komponentti WT1-spesifisten TCR β-ketjun. [15].