Krooninen sairaus

tiivistelmä

EGFR

mutaatioita korreloi paremman kliinisen tuloksen kun taas

KRAS

mutaatiot liittyvät vasteen puuttumisen tyrosiinikinaasiestäjiksi potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Endobronkiaalinen ultraääni (EBUS) -transbronchial punktiomenetelmällä (TBNA) yhä useammin hallintaan NSCLC. Co-vahvistus alemmilla denaturaatiolämpötilassa (COLD) polymeraasin toi- (PCR) (COLD-PCR) on herkkä määritys havaitsemiseksi geneettisten mutaatioiden kiinteitä kasvaimia. Tässä tutkimuksessa arvioitiin mahdollisuutta käyttää COLD-PCR seuloa

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita sytologia näytteistä saadaan EBUS-TBNA rutiini kliinisessä käytännössä. Näytteet saatu NSCLC potilailla, joille tehdään EBUS-TBNA arvioitiin mukaan meidän vakio kliinisiä protokollia. DNA: ta näistä näytteistä tehtiin COLD-PCR monistamiseen eksonit 18-21

EGFR

ja eksonit kaksi ja kolme

KRAS

seuraa suoralla sekvensoinnilla. Mutaatio analyysi tehtiin 131 132 (99,3%) pienisoluista keuhkosyöpää (70F /62M), jossa vahvistettiin imusolmukemetastaaseja (94/132 (71,2%) adenokarsinooma, 17/132 (12,8%) okasolusyöpä, 2/132 (0,15% ) suuri solu neuroendokriinisten, 1/132 (0,07%), suuret cell carcinoma, 18/132 (13,6%) NSCL-ei muuten määrittelemätön (NOS)). Molecular analyysi kaikista

EGFR

ja

KRAS

kohdesekvenssien saavutettiin 126 132 (95,5%) ja 130 132 (98,4%) tapauksista vastaavasti.

EGFR

mutaatioita tunnistettiin 13 (10,5%) on täysin arvioitu tapauksista (11 adenokarsinooma ja kaksi NSCLC-NOS) sisältäen kaksi uutta mutaatiota.

KRAS

mutaatioita tunnistettiin 23 (17,5%) on analysoitu potilaiden näytteistä (18 adenokarsinooma ja viisi NSCLC-NOS). Voimme päätellä, että EBUS-TBNA imusolmukkeiden soluttautunut NSCLC voi tuottaa riittävän kasvain materiaalia

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi useimmilla potilailla, ja että COLD-PCR ja sekvensointi on vankka seulonta määritys

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi tässä kliinisessä yhteydessä.

Citation: Santis G, Angell R, Nickless G, Quinn A, Herbert A Cane P, et ai. (2011) seulonta

EGFR

ja

KRAS

Mutaatiot endobronkiaalinen Ultraääni Johdetut Transbronchial Needle Aspiraatit Non-pienisoluinen keuhkosyöpä kylmällä-PCR. PLoS ONE 6 (9): e25191. doi: 10,1371 /journal.pone.0025191

Editor: Melanie Königshoff, Comprehensive Keuhkosairausoppi Center, Saksa

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 29 elokuu 2011; Julkaistu: 19 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Santis ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustuksia Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB /G006911 /1 GS), Department of Health kautta National Institutes of Health Research kattavan Biomedical Research Centre palkinnon Guy n ja St Thomas ’National Health Service Foundation Trust yhdessä Kingin College London (GS JS), ja siitä Experimental Cancer Medicine verkostoa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) on jäsen, ErbB-reseptoriperheen, joka on keskeinen säätelijä epiteelisolujen proliferaation [1]. EGFR koostuu solunulkoisen domeenin, transmembraanialueen ja sytoplasmisen katalyyttinen alue, joka sisältää tyrosiinikinaasidomeeniin [1]. Liiallinen EGFR signalointi järkyttää tasapainoa solun kasvun ja apoptoosin edistää tuumorigeneesiä monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2]. Tämä voi syntyä yliekspressio EGFR, sen signaloinnin kanssa, tai kaksi sen ligandien, EGF: n ja TGF-α [3], [4]. Konstitutiivisen aktivaation EGFR-tyrosiinikinaasi-aktiivisuutta voidaan saada aikaan somaattisia mutaatioita tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR [5], [6], [7]. Takautuva ja tulevaisuudentutkimuksista Aasian ja Euroopan potilasta NSCLC ovat osoittaneet, että läsnäolo

EGFR

mutaatiot eksoneissa 18-21 korreloi paremman kliinisen tuloksen EGFR tyrosiinikinaasin estäjät gefitanib ja erlotinibin [8], [9] , [10]. Useimmat NSCLC-spesifinen

EGFR

mutaatiot ovat joko yhden aminohapon substituutio kodonissa 858 (leusiini ja arginiinia, L858R), tai poistaminen mutaatiot eksonissa 19, jotka vaikuttavat konservoituneen LREA motiivin [11]. Nämä mutaatiot löytyvät pienellä osalla valkoihoisiin NSCLC mutta peräti 60% Itäaasialaiset adenokarsinooma [8], [12], [13], [14]. Erillinen ryhmä

EGFR

mutaatioita on yhdistetty korkeaan sekä hankittu resistenssi erlotinibille ja gefitinibin, ja nämä klusteri eksonissa 20

EGFR

geeni [15], [16].

Jotkut NSCLC myös satama mutaatioita Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeeni homologin

(KRAS) B koodaa GTPaasina myötävirtaan EGFR [17], [18], [19]. Nämä mutaatiot klusterin eksonissa kahdessa

KRAS

, esiintyy 15-30% Valikoitumattomien NSCLC [20], ja näyttävät olevan poissulkevia

EGFR

mutaatioita NSCLC [21]. On ehdotettu, että mutaatiot

KRAS

liittyy

de novo

vastustuskykyä gefitinibin ja erlotinibin [21]. Toisin kuin

EGFR

mutaatioita, jotka ovat myönteinen ennustetekijä,

KRAS

mutaatioita resektoitiin NSCLC liittyi lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on

EGFR

mutaatioita [17], [ ,,,0],18], [19]. Yhdessä nykyinen näyttö viittaa siihen, että

EGFR

ja

KRAS

mutaatiot määritellä erillisiä alaryhmiä NSCLC potilaiden, joilla on erilaiset vastaukset EGFR- kohdistettuja hoitomuotoja.

Useimmat potilaat NSCLC läsnä edennyt pitkälle ja patologinen diagnoosi tehdään usein pienistä kokoinen bronkoskooppiset, rintakehän ydin koepaloja tai sytologinen näytteitä. Useimmat geneettinen mutaatio analyysejä luottaa siihen, että polymeraasiketjureaktio (PCR) monistamista varten kohdesekvenssien. Toisin kuin tavallisissa PCR, co-vahvistus alhaisemmissa denaturaatiolämpötilassa-PCR (COLD-PCR) ensisijaisesti monistaa mutanttisekvensseistä ja siksi lisää herkkyyttä havaita geneettisten mutaatioiden [22]. Tämä on erityisen tärkeää analysoida läsnä geneettisten mutaatioiden kiinteän syövän kudoksissa, joissa kasvainsolut voidaan sekoittaa strooman ja muiden ei-pahanlaatuista kudosta. Koska se oli ensimmäinen kuvattu, COLD-PCR: n on osoitettu olevan ylivoimainen tavanomaisiin PCR useissa sovelluksissa suunniteltu havaitsemaan mutaatioita sekoitettu näytteissä [22], [23], [24], [25].

endobronkiaalinen ultraääni (EBUS) -transbronchial punktiomenetelmällä (TBNA) on viime aikoina kehitetty tekniikka, joka mahdollistaa ultraääni-ohjattu toive välikarsinan ja hilar imusolmukkeiden ja massoja. Lisääntyvä tieto tukee sen käyttöä keuhkosyövän diagnosointiin ja levähdyspaikat vaihtoehtona mediastinoscopy [26], [27], [28], [29], [30], mutta on huolissaan siitä, että nämä pienet Sytologisten näytteet ehkä riitä kasvain materiaalia molekyyli- diagnoosi, alueen merkitys kasvaa NSCLC hallintaan. Tämä näkyy äskettäin julkaistussa konsensuslausuman on

EGFR

mutaatio testaus jossa suositellaan kudosnäytteitä pitäisi käyttää mieluummin Sytologisten näytteitä mahdollisuuksien mukaan ennen lisätutkimuksia vahvistetaan luotettavuutta mutaatiostatuksesta saatujen tietojen sytologinen näytteistä [ ,,,0],31]. Täällä me käsittelemme tätä kysymystä seulomalla

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita 193 EBUS-TBNA peräisin sytologian näytteet metastaattinen imusolmukkeiden 132 potilasta NSCLC rutiini kliinisessä käytännössä yhdellä perustuva määritys periaatteisiin COLD-PCR ja suoralla sekvensoinnilla.

tulokset

EBUS-TBNA

132 potilasta diagnosoitu NSCLC käyttäen EBUS-TBNA touko 2009 ja helmikuu 2011 (125 valkoihoinen, neljä Aasian ja kolme brittiläistä musta) on mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki potilaat (n = 65) NSCLC riippumatta histologinen alatyyppi välillä toukokuu 2009 ja helmikuun 2010 on mukana tässä tutkimuksessa. Loput 67 potilasta (maaliskuu 2010-helmikuu 2011) edustavat peräkkäistä potilasta NSCLC, ei-levyepiteelikarsinooma alatyyppi. Potilaan kliinisiä piirteitä, ja taudin vaiheen on esitetty taulukossa 1. Yksikään potilaista ei ollut saanut hoitoa ennen toimenpidettä. Aspiraatit otettiin 193 imusolmukkeet asemien kahdesta 11 (lyhyt akseli halkaisija oli 1,2 +/- 0,5 cm) 132 potilasta (taulukko 1). Mediaani ajokertojen kohden imusolmuke asema oli 4,6 (vaihteluväli: 1-10); Tämä on samanlainen kuin mediaani ajokertojen kohden imusolmuke station (3,8) saatu 972 potilasta tutkittiin meidän keskustaan ​​EBUS-TBNA välillä helmikuussa 2008 helmikuu 2011 (julkaisemattomia havaintoja).

Morfologiset diagnoosi ja immunoprofile

Immunohistokemia onnistuneesti suoritettiin 131 132 potilasta. Riittämätön aine oli saatavissa yhdestä potilaasta. Histologinen tyyppi määritettiin yhdistämällä morfologia (Sytologisten dioja ja cellblock kohdat) ja immunohistokemiallinen profiilin. Kun kyseessä on adenokarsinooma, diagnoosi tukivat ilmentymistä TTF-1, CK7 tai BerEP4 ja negatiivisuus varten CK5 ja p63. Cytomorphology ja ilmaus CK5 ja p63 suosi okasolusyöpä diagnoosi, kun taas ilmaus neuroendocine markkereita (CD56, kromograniinilla ja synaptofysiini) ja asianmukaista morfologia perustettu diagnoosi suuri solu neuroendocrine syöpä. Eriyttämätön NSCLC morfologian että myös puuttui ilmentyminen erilaistumisen merkkiaineiden CK5, CK7, CD56, TTF-1, p63, BerEP4 johti diagnosoinnissa NSCLC ei ole mainittu (NSCLC-NOS). Näiden kriteerien perusteella, 94 132 potilasta (71,2%) oli diagnosoitu adenokarsinooma, 17 (12,8%) ja okasolusyöpä, kaksi suurta neuroendokriinisolun karsinooma (0,15%), yksi iso cell carcinoma (0,07%), ja 18 (13,6%) kanssa NSCLC-NOS (taulukko 1).

Mutaatioanalyysi

kylmä-PCR ja sekvensointi protokollaa optimoitiin monistaa ja pituudet eksonien 18 ja 21

EGFR

ja kodonien 12, 13 ja 61

KRAS

havaitsemiseksi

EGFR

ja

KRAS

mutaation herkkyys 5-10% (mutaatio taajuudet 10% havaittiin kaikissa COLD-PCR toimii, kun taas mutaatio taajuudet 5% havaittiin kaksi kolmesta ajoa) verrattuna mutaatio herkkyys 30% meidän vakio-PCR.

Yksi 132 näytteitä ei monistaa kohde-DNA: han ja siksi

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi suoritettiin vuonna 131 132 näytettä (99,3%). Potilas näyte joka epäonnistui DNA vahvistus sisälsi vain 100 solua /jakso [32]. Kylmä-PCR monistettiin onnistuneesti eksonien 18-21 126 131 potilasta (95,5%), joille DNA ollut saatavilla. Monistaminen eksonin 21 epäonnistunut kolmella potilaalla näytettä (kaksi adenokarsinomia ja yksi okasolusyöpä); yksi näistä näytteistä ei myöskään monistamisen eksonin 20. Kaksi muuta potilaan näytteitä ei ole vahvistusta eksonin 18. Sekvensointi oli onnistunut kaikissa monistettua sekvenssiä; Siksi täydellinen molekulaarinen analyysi kaikista neljästä

EGFR

tavoite eksonien oli saatavana 126 132 potilasta (95,4%) ja osittainen molekyylitason analyysi 131 132 potilasta mukana tässä tutkimuksessa (99%).

käyttäen COLD-PCR pystyimme havaitsemaan

EGFR

mutaatioiden 13 126 potilasta (10,3%), joille koko molekyylitason analyysi oli saatavilla (taulukko 2). Yksi potilas näyte sisälsi kaksi eksonia 21 mutaatiota (taulukko 3). Toistamalla COLD-PCR ja sekvensointi protokollan toisesta cellblock itsenäisesti vahvistanut kaikki mutaatiot. Mutaatiot olivat lähes yksinomaan löytyy adenokarsinoomaa alatyyppi (11 13, 85%; p 0,001). Yksi iso lukukehyksessä poisto eksonin 19 ja L858R mutaatio havaittiin kahdella potilaalla NSCLC-NOS. Ei

EGFR

mutaatioita havaittiin 17 okasolusyöpää välillä toukokuu 2009 ja helmikuun 2010 mutaatio-analyysi sen jälkeen suoritettiin vain potilailla diagnosoitu NSCLC kuin levy- histologia.

EGFR

mutaatioita tunnistettiin 11 89 (12,3%) adenokarsinoomia ja 13 110 (12%) ei-levy- histologia. L858R-mutaation osuus neljä 13 (31%). Havaitsimme vain yksi kehyksen poisto eksonissa 19 (Δ2481-2495) (taulukko 3). Havaitsimme myös kaksi uutta

EGFR

mutaatioita; molemmat olivat yhden aminohapon substituutioita, yksi eksonissa 19 (V760M) ja toinen eksonissa 20 (H805L). Oli yhden kompleksisen mutaatio (L833V + L858R). On olemassa mahdollisuus, että uusia mutaatioita havaittiin tässä tutkimuksessa ovat artefakteja; tämä on yhdistetty PCR formaliinilla upotettu kudokseen [33], [34]. Lisäksi COLD-PCR sekä vakio-PCR on altis polymeraasin aiheuttama virhe. Tutkimuksessamme AmpliTaq Gold käytettiin monistamaan kohdesekvenssejä, toisin hifi Taq-polymeraasia käytetään Li

et al.

[22], [23], [24] käyttäminen hifi Taq-polymeraasia voitaisiin välttää mahdollisuus PCR rikastuminen PCR virheitä. On kuitenkin epätodennäköistä, että uusia mutaatioita havaittu tutkimuksessamme johtuvat COLD-PCR-virheiden, kuten kaikki mutaatiot vahvistettiin erillisissä reaktioissa ja mutaatioita havaittiin villityypin DNA, jota käytettiin negatiivisena kontrollina kaikissa reaktioissa. Tämä viittaa myös siihen, että AmpliTaq Gold ei rikastuttaa amplikoneihin keinotekoisilla mutaatioita.

määriteltiin myös harvinaisempia

EGFR

mutaatioita G719A, P733S, L747P ja L861Q. Toinen harvinainen mutaatio (L833V) havaittiin yhdessä L858R mutaatio. MassArray (Sequenom Inc) ja Scorpion monistettiin tulenkestävä mutaatio järjestelmä (SARMS) (DSX

EGFR

PCR mutaation analyysi kit; QIAGEN) tekniikat eivät olisi havaittu mutaatioita P733S, L747P, V760M, H805L ja L833V.

KRAS

mutaatioiden analyysi menestyi 130 132 kasvaimia (98,4%). Yksi näyte, joka antoi epäinformatiivisia sekvenssi myöskään

EGFR

mutaatio analyysi johtuen vähäisyys kasvaimen materiaalia. Yhden aminohapposubstituutiot joissa kodonien 12, 13 ja 61

KRAS

tunnistettiin 23 130 NSCLC (17,7%) kokonais- (18 93 adenokarsinoomat (19%) ja viisi 18 NSCLC-NOS (27,7% )) (taulukko 3). Yhtäkään niistä ei ollut potilailla, joilla levyepiteelikasvain tai potilailla harboring

EGFR

mutaatioita.

Aikaisemmat tutkimukset ja omaa validointi kokeet ovat osoittaneet lisääntynyt herkkyys COLD-PCR verrattuna standardi PCR [22 ], [23], [24], [25], [35]. Täällä myös suorittaneet rajoitetun vertailun kykyä COLD-PCR havaitsemiseksi

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita 25 EBUS johdettuja adenokarsinooma Sytologisten aspirates kanssa standardin-PCR. Nämä näytteet analysoitiin myös rinnan COLD-PCR ja SARMS (dxs EGFR PCR Kit, QIAGEN) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Löysimme standardi-PCR ja myöhemmin sekvensointia havaita kaikki

EGFR

mutaatioita, jotka oli havainnut COLD-PCR (L858R, Δ2481-2495 ja H805L). Mutaatio huippu oli selvemmin seuraavista COLD-PCR-monistus, kuten on esitetty, että L858R-mutaation (kuvio 1A). Vakio-PCR ei havainnut

KRAS

G12C mutaatio (kuvio 1 B). Tämä ero mutaation havaitsemisen välillä COLD-PCR: n ja standardi-PCR ei ollut merkitsevä (p = 0,5). Käyttämällä SARMS löysimme mitään ylimääräisiä

EGFR

mutaatioista nämä EBUS johdettuja adenokarsinooma aspiraateilla. SARMS vahvisti myös L858R mutaatio, joka oli alun perin tunnistettiin COLD-PCR.

Sekvensointi electrogramme vertailevan analyysin COLD-PCR ja standardi-PCR-monistus

EGFR

eksonin 19 ja

KRAS

eksoni 2.: ylempään ja alempaan paneeliin ovat kylmiä ja standardi PCR-monistuksen eksonin 21

EGFR myynnissä maassa EBUS johdettuja aspiraateissa imusolmukkeista soluttautunut metastaattisen keuhkoadenokarsinooma vastaavasti. A esittää vaihdosta tymidiini (T), jonka sytosiini (C) eksonissa 21

EGFR

tuottaa L858R mutaatio, joka on ilmeistä COLD-PCR-monistusreaktio (nuoli) sekä standardi PCR-reaktiossa. Mutaatio huippu on selvästi nähtävissä COLD-PCR (ylempi paneeli) verrattuna standardi-PCR-reaktio (alempi kuva). B ylemmän ja alemman paneelit ovat COLD ja standardi PCR-monistuksen

KRAS

eksonin 2. ylempi paneeli esittää vaihdosta guaniini (C) tymidiiniä (T) tuottaa G12C mutaatio, joka havaittiin COLD-PCR-monistuksella ( nuoli). Mutaatio ei näkynyt standardin PCR-reaktion (alempi kuva).

Keskustelu

Kirjoittajat raportoivat mahdollisuutta käyttää COLD-PCR seuloa

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita 132 potilasta, jotka olivat näytteet EBUS-TBNA mukaan meidän vakio kliinisiä protokollia. Tämä on suurin kohortti tällaisten potilaiden raportoitu. Osoitamme täydellinen arviointi eksonien 18.-21 95,5% on

EGFR

ja eksonit kaksi ja kolme 98,4% ja

KRAS

keskuudessa EBUS-TBNA aspiraateilla. Tuloksemme ovat suurempia kuin kolme aiempien tutkimusten että seulotaan EBUS johdettuja aspirates varten

EGFR

mutaatioita. Garcia-Olive

et al

ja Nakajima

et al

onnistuneesti analysoidaan eksonit 19 ja 21

EGFR

72% (26/36) ja 93% (43/46 ) potilaan näytteitä vastaavasti [36], [37]. Schuurbier

et al

onnistuneesti analysoitiin 77% kaikista näytteistä tavanomaisilla PCR ja sekvensointi eksonien 18-21

EGFR

[38]. Me näytteet laajasti samankokoisiin imusolmukkeiden kuin arvioitiin kolmea muuta tutkimuksia ja suorittaa mediaani 4,5 kulkee per imusolmuke näytteitä; Tämän ajokertojen on samanlainen kuin kolmen ja neljän kulkee solmua kohden suositeltavaa vahvistaa diagnoosin maligniteetin [28], [30]. Tulokset tästä ja aiemmat tutkimukset ehdottavat näin ollen EBUS-TBNA voi tuottaa riittävän kasvain materiaalia

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä näin vältetään tarve enemmän invasiivisia kirurgisia näytteenotto näissä potilailla.

Tällä hetkellä on olemassa useita menetelmiä, jotka on kehitetty seulomiseksi

EGFR

mutaatioita NSCLC näytteille, joissa mutantti-DNA on vain murto-osa koko puhdistettu DNA [7]. Jotkut määritykset kuten SARMS ja MassArray näyttö spesifisten mutaatioiden kanssa herkkyydellä 1% ja 10% vastaavasti. Muita strategioita, jotka ovat riippuvaisia ​​tekniikoita, kuten korkean resoluution sulaminen ja denaturoivissa korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa tunnistaa useimmat mutaatiot ilman tarkkoja aminohapposubstituutio [7]. Joissakin tutkimuksissa mikrodissektion kasvaimen kudosnäytteiden DNA tehtiin ennen DNA: n monistuksen [39]. Tällä hetkellä ei ole yleisesti hyväksytty, mikä näistä on paras tapa mutaation analyysi NSCLC [31]. Kuitenkin strategioita, jotka perustuvat DNA: n monistuksen ja suoralla sekvensoinnilla ovat kattavimmat, koska ne voivat seuloa paitsi tunnettujen vaan myös uusia mutaatioita. On suositeltavaa, että vähintään 30% tuumorisolujen täytyy olla yli 10% mutantti-DNA tehokkaaseen mutaatio seulonta luottaa vakio PCR ja sekvensointi protokollat ​​[7].

Kylmä-PCR-määritys käyttää tässä tutkimuksessa havaittiin

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita esiintyy kasvaimen DNA sisältää niin vähän kuin 5-10% koko näytteen DNA: ta. On todennäköistä, että käyttämällä yhden COLD-PCR kriittinen denaturaatiolämpötilassa joidenkin amplikoneista testattu on huomattava rikastus (kuten Fig. 1 esittää), kun taas toiset on vain vähän tai ei lainkaan etua. Herkkyys niin määritellään meidän COLD-PCR-määritys olisi siis kehitetty edelleen havaita mutaatio taajuuksilla alle 5% oli kehitimme amplikoni-spesifinen määritys, jossa käytetään optimaalista heterodupleksi hehkutus ja denaturoivissa lämpötilat kunkin amplikonin. Herkkyys voidaan edelleen tehostaa käyttämällä herkempiä amplikoni-erityisiä COLD-PCR-määrityksissä, kuten on kuvannut Galbiati

et al

[40], tai Parannettu ja Complete rikastus-COLD-PCR (

jään

-Kylmä-PCR) perusta, jolla voidaan havaita mutaatio taajuuksilla niinkin alhainen kuin 0,1%, [41]. Olemme sitä mieltä kuitenkin, että käyttämällä amplikonin erityisiä määrityksiä ei todennäköisesti ole toteutettavissa rutiinidiagnoosimenetelmää käytettäväksi havaitsemiseen useita mutaatioita ja voidaan parhaiten käyttää, kun kasvainsolun pitoisuus on pienempi kuin 5-10% kynnysarvo nykyiseen määrityksen. Kiinnostavaa kyllä, olemme hiljattain löytänyt tämän olevan harvinainen kliininen skenaario [32]. Esimerkiksi, huomasimme, että mediaani kasvain solujen määrä in EBUS johdettuja imusolmuke aspirates on 2525 (vaihteluväli 65-39800) ja mediaani prosenttiosuus kasvain oli 70% (vaihteluväli 10-95%). Tämä oli verrattavissa tuottoa bronkoskooppiset koepaloja ja parempi saanto tietokonetomografiakuvantamisasemasta-ohjattu neulabiopsiat perifeerisen ensisijaisen keuhkokasvaimia. Itse asiassa osuus kasvaimen sisältö kaikilla näytteen tutkituissa oli 5% tai enemmän [32]. Kuten EBUS johdettu kliiniset näytteet voivat koostua vähemmän kuin 30% kasvainsoluja, standardi-PCR: llä ei ehkä ole riittävän herkkä havaitsemaan riittävän herkkä havaitsemaan mutaatioita näissä näytteissä. Tämän tueksi, rajoitetun vertailu COLD-PCR

vs

standardi-PCR osoitti, että standardi-PCR ei havainnut yksi neljästä mutaatiota tunnistettiin COLD-PCR, joka osoitti myös korkeampia mutaatio huippuja (Kuva 1A 0,01) kuin 36% taajuudet

EGFR

eksonin 19 poistot NSCLC primaarikasvaimen näytteet analysoitiin COLD-PCR ja suora sekvensointi eksonien 18-21 meidän laitos (julkaisematon). Tämä havainto herättää mahdollisuuden, että eksoni 19 poistoja voidaan aliedustettuina metastaattisessa imusolmukkeisiin verrattuna ensisijainen kasvaimia. Park

et al

raportoitu ristiriita välillä primaarikasvaimen ja imusolmukemetastaaseja NSCLC erityisesti mutaatiot eksonissa 19 [46]. Lisäksi Nakajima

et al

ilmoitetaan vain yksi eksoni 19 poisto keskuudessa 11 (9,9%)

EGFR

mutaatioita 43 EBUS-TBNA metastaattisen keuhkosyövän adenokarsinooman Itä-Aasian potilaista [37], kun taas ensisijainen keuhkojen adenokarsinooman eksonia 19 poistot osuus peräti 53% mutaatioiden Itä-Aasian potilailla [47]. Menetys

EGFR

mutaatioita metastaattisen keuhkosyövän adenokarsinooman verrattuna primaarikasvainten on myös raportoitu [48]. Suuremmat tulevaisuudentutkimuksista Matching analyysi primaarituumorin ja imusolmukemetastaaseja on määrä arvioida

EGFR

eksonin 19 deleetion tai muita mutaatioita, ovat aliedustettuina metastaattisessa imusolmukkeiden joko aikaan diagnoosin tai hoitovaste.

tässä tutkimuksessa arvioitiin myös EBUS johdettuja neula aspiraatteja varten

KRAS

mutaatioita käyttämällä COLD-PCR ja löysi nämä 19% keuhkojen adenokarsinooman ja 27,7% NSCLC-NOS. COLD-PCR on aiemmin osoitettu lisäävän

KRAS

mutaation havaitsemisen herkkyyttä verrattuna tavallisiin PCR, erilaisissa kliinisissä näytteissä [25]. Taajuus

KRAS

mutaatioita EBUS-TBNA analysoidut näytteet tässä tutkimuksessa on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten että raportoitu

KRAS

mutaatio taajuudella jopa 22%, pääasiassa adenokarsinoomat [20] Tärkeää on,

KRAS

mutaatiot liittyvät vasteen puuttumisen EGFR estäjähoidosta NSCLC [21]. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että yhdistämällä

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi NSCLC joilla on ei-levyepiteelikarsinooma, päätökset sopivuudesta EGFR-TKI hoito voidaan tehdä 27% potilaamme kohortti.

Olemme päätellä, että EBUS-TBNA of välikarsinan imusolmukkeiden soluttautunut NSCLC voi tuottaa riittävän kasvain materiaalia

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi valtaosassa potilaista ilman tarvetta turvautua invasiivisia kirurgisia mediastinoscopy tai mediastinotomy. Olemme myös päätellä, että COLD-PCR ja sekvensointi protokollien tulisi pitää potentiaalisena seulomismäärityksessä useita

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi tässä kliinisessä yhteydessä. Kyky tunnistaa uusia

EGFR

mutaatioita, kuten osoitimme tässä tutkimuksessa, voi osoittautua hyödylliseksi myös seulonnassa hankittu

EGFR

mutaatioita, kysymys syntymässä kliinistä merkitystä NSCLC. Serial näytteenotto ja arviointi kasvainkudoksen saatu samanaikaisesti ovat yhä useammin keskeisiksi kliinisessä käytössä EGFR-kohdistettuja hoitoja. EBUS-TBNA on turvallinen ja vähän invasiivisia tekniikkaa, joka on todennäköisesti erittäin hyvin sovellettavissa tässä yhteydessä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä oli havainnointitutkimuksessa suoritettu mukaan meidän vakio kliinisiä protokollia. Kaikki potilaat antoivat kirjallisen suostumuksensa läpi EBUS-TBNA ja tutkittavan analysoitavan materiaalin mukaan hyväksytyn kliinisen protokollia. EBUS-TBNA hyväksyttiin uutena tutkimuslääkkeiden menettelyn Guy St Thomas ’Hospital Clinical Governance Committee ja on osa tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on NSCLC. COLD-PCR on hyväksytty menetelmä

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi meidän laitokselle.

EGFR

ja

KRAS

mutaatio analyysi on osa tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on NSCLC meidän laitoksessa.

EBUS-TBNA

EBUS-TBNA suoritettiin kaksi konsulttien Respiratory Medicine käyttäen bronkoskoopin integroidulla lineaarinen ultraäänianturi (Olympus 260 ° F) ja C200 ultraääni prosessorin 128 potilasta ja alfa viiden ultraääni prosessorin neljässä. Menettely suoritettiin käyttäen perussedaatiossa. 22G neulaa käytettiin imemään jokaisessa solmussa. Yksi ilmakuivattu ja yksi alkoholi-kiinteä tavanomainen preparaatti valmistettiin kustakin syötön jonka biolääketieteilijä ja neula pesut huuhdeltiin tasapainotettuun suolaliuokseen: Aqsia ™ (Bausch Lomb, Kingston-Upon-Thames, UK). Ilmakuivattua tahroja värjättiin Hemacolor ™ (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, UK) välittömästi arviointi ja alkoholi-Kiinnitettyjä levyjä säilytetään myöhempää Papanicoloau värjäystä. Paikan päällä arviointi (ROSE) konsultin cytopathologist tarjotaan reaaliaikainen arvio imee mukaansa ja triage Solususpensioiden varten cellblocks, virtaussytometria tai mikrobiologian sanelee mikroskoopilla. Useita aspiraateissa yksittäiset solmut kultakin solmukohtien asemalta yhdistettiin lisäanalyysiä. Sama patologi tarkistetaan kaikki diat ja myöhemmät cellblock kohdat, antoi diagnoosi ja välitetään cellblocks molekyyli- patologian laboratorioon mutaation analyysi. Dioja ja kaikki cellblocks myös tarkistettava, mukaan paikallinen kliinisten ohjeiden, jonka paneeli rintakehä histopathologists ja cytopathologists. Lopullinen diagnoosi ja sairauden vaiheessa [49] jälkeen sovittiin keskusteltavaksi rintakehä Syövät monitieteistä kokouksessa. Kaikki peräkkäisen potilailla, joille tehdään EBUS-TBNA välillä toukokuu 2009 ja helmikuun 2010, joilla oli diagnosoitu NSCLC tai olivat järjestettyjä niiden tunnetun NSCLC olivat mukana tässä tutkimuksessa. Maaliskuun 2010 helmikuu 2011 kaikkia peräkkäisiä joilla on ei-levyepiteelikarsinooma NSCLC arvioitiin.

Mutaatioanalyysi

Näytteen käsittely ja selliosasto valmistautuminen DNA: n eristämiseksi.

kolme 10 mikronia osat näistä parafinoidut EBUS cellblocks poistettiin parafiini ja DNA eristettiin kudoksista käyttäen Qiagen DNA eristyspakkausta modifioidun protokollan. Lyhyesti, deparaffinised kudokset suspendoitiin 180 μ kudosta liuottavan puskuria ja 70 ui proteinaasi K entsyymiä ja inkuboitiin 56 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen, kun oli lisätty 200 ui DNA: ta sitovaa puskuria, seosta inkuboitiin 70 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 100 ui isopropanolia ja sentrifugoimalla nopeudella 16 kg: ssa 1 minuutin poistamiseksi kudosjäte. Laatu DNA ja sen soveltuvuutta PCR-monistus arvioitiin DNA-OK PCR kit, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.

COLD-PCR

COLD-PCR suoritettiin periaatteiden mukaisesti laatimia Li J

et al

[22] pienin muutoksin Multiple alukkeita (kahdeksan-kymmenen per amplikoni) suunniteltiin ja syntetisoitiin monistamiseen eksonit 18-21

EGFR

ja kodonien 12, 13 ja 61 on

KRAS

. Mutatoitu DNA kunkin kohde-amplikonien syntetisoitiin ja sarjalaimennettiin villityypin DNA maksimaalinen laimennus 5% (mutatoitu villityypin DNA). Vakio ja COLD-PCR-reaktiot suoritettiin sitten käyttäen erilaisia ​​hehkutus ja denaturoivissa lämpötilat jokaisen alukeparia. Heterodupleksia muodostuminen lämpötilan oli oltava huomattavasti suurempi kuin hehkutus lämpötila alukkeiden välttää ennenaikainen laajennus.