Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nikotiiniasetyylikoliinireseptorin reseptorialayksiköitä (nAChR) liittyvät eri näkökohtia tupakointikäyttäytymiseen sekä tupakointiin liittyvät häiriöt. Useat näistä alayksiköistä on havaittu voimistuvan tupakoitsijoilla tai ilmentyy differentiaalisesti keuhkojen kasvainsoluissa. Taustalla olevia mekanismeja Näiden havaintojen ei tiedetä, mutta oletetaan olevan pääosin transkription jälkeisen. Monet posttranskriptionaalisen mekanismit aloitetaan toiminnallisesti asiaa jaksoryhmittymät sisällä transloimattomat geenialueisiin, kuten alkupään avointa lukukehystä (uORFs). Suoritimme järjestelmällinen haku kaikissa tupakointi liittyvät hermosolujen nAChR alayksiköt ja tunnistaa toiminnallisesti asiaankuuluvat uORFs in

CHRNA4

ja

CHRNA5

. Lusiferaasi kokeet osoittivat, että nämä uORFs pystyvät merkittävästi vähentää proteiinin ilmentymisen. Meidän kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) tuloksia viittaavat vahvasti siihen, että havaitut vaikutukset alkunsa käännöksen mieluummin kuin transkriptio tasolla. Mielenkiintoista on, että

CHRNA4

uORF oli vain toiminnallisesti tärkeää silloin, kun on ilmaistu lyhyemmän isoformin tämän geenin. Siksi tiedot esitetään tässä tutkimuksessa viittaa vahvasti kohti tärkeä rooli uORFs sisällä 5’UTR

CHRNA4

-isoform 1 ja

CHRNA5

säätelijöinä proteiinin translaation. Lisäksi yhteinen uORF on

CHRNA4

-isoform 1 /isoformia 2 on ensimmäinen esimerkki sekvenssin kontekstisidonnaisia ​​uORF.

Citation: Eggert M, Aichinger E, Pfaffl MW, Steinlein OK , Pfob M (2013) nikotiiniasetyylikoliini reseptorialayksiköitä α4 ja α5 tupakointiin liittyvien Käyttäytyminen ja keuhkosyövän säätelee Upstream avointa lukukehystä. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10,1371 /journal.pone.0066157

Editor: Huibert D. Mansvelder, Neuroscience Campus Amsterdamissa, VU University, Alankomaat

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 02 toukokuu 2013; Julkaistu: 02 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Eggert et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] ja Friedrich-Baur-Stiftung [Ei 57/12]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tupakointi tunnetaan merkittävä riskitekijä sydän- ja verisuonitautien ja tupakointiin liittyvät maligniteetit kuten keuhkosyövän [1]. Silti noin joka kolmas aikuinen maailmanlaajuisesti tupakoi ja määrä kasvaa [2]. Siksi ei ole yllättävää, että suuria ponnisteluja tehdään paljastaa syitä nikotiiniriippuvuuden sekä kehittää uusia ehkäisy- ja hoito. Nikotiini toimii asetyylikoliinin agonisti, joka kykenee sitoutumaan hermosolun nikotiiniasetyylikoliinireseptorien (nAChR). NAChR muodostavat heterogeenisiä ja homogeenisiä pentameerisen ionikanavia monipuolisen ekspressiota hermosolujen ja ei-hermosolukudoksista [3]. Niinpä monet geenit koodaavat nAChR alayksiköiden epäillään avainasemassa koskien nikotiiniriippuvuutta. Useat nAChR alayksikkögeenit on jo yhdistetty tupakointi ja tupakointiin liittyviin sairauksiin. Esimerkiksi

CHRNA7

, geeni koodaus α7 nAChR alayksikköä tukahduttaa hengitysteiden tyvisolusyöpä lisääntymistä ja uudistaa keuhkojen epiteelin. Lisäksi hypoteesi ilmi, että säädeltyyn α7 ilmentyminen aiheuttaa preneoplastiset muunnokset [4], [5]. Geneettisiä variantteja sisällä koodaavan alueen, mutta myös promoottorialueen

CHRNA4

liittyvät sekä subjektiivinen vastauksia tupakoinnin ja tupakoinnin lopettamiseen tulokset [6] – [10]. Useimmat tutkimukset, jotka on julkaistu aiheesta kolinergisiin reseptoreihin ja nikotiiniriippuvuuden /tupakointi liittyviin sairauksiin osoittavat kohti nAChR geeni klusterin kromosomissa 15. Polymorfiat tällä alueella, jotka ovat eniten johdonmukaisesti raportoitu liittyvän tupakointiin määrä, nikotiiniriippuvuutta , keuhkosyöpä ja perifeerinen valtimotauti sijaitsevat joko

CHRNA5

tai

CHRNA3

geeni [11] – [16]. Lisäksi assosiaatioita

CHRNB3

polymorfismien ja vastauksena ensimmäisen kerran tupakan käyttöä kuvattiin [17].

mekanismia, joilla nAChR liittyviä geenejä nikotiiniriippuvuuden säädellään ei tunneta yksityiskohtaisesti toistaiseksi . Yleisesti geeniekspressiota voidaan muokata joko ennen tai jälkeen kopiointia. Jälkimmäinen mekanismit ovat usein välittyvät cis-vaikuttavan jaksoryhmittymät sijaittava transloimattomat alueet (UTR), jotka ovat läsnä alku- ja loppupään useimpien eukaryoottisen geenin koodaavat alueet. Useat motiiveja 5’UTR- vastaavat translaation asetus on tunnistettu eukaryoottigeeneissä kuten sisäinen ribosomin sivustoja, rauta- reagoiva elementit ja vastavirtaan avointa lukukehystä (uORFs). Jälkimmäinen elementit voi olla ratkaiseva rooli geenin ilmentymisen säätelyyn. Yhä useammat todisteet osoittavat, että uORFs pystyvät vaikuttamaan proteiinin translaation eri tavoin. Skannaus ribosomit kääntämisen uORF ei ehkä pysty aloittaa uudelleen edelleen alavirtaan koodausalueen ATG, tai ehkä jumittuu uORF, estämällä muita ribosomien (ribosomaalinen esto). Vaihtoehtoisesti lopetuskodonista uORF voisi olla väärässä kuin nonsense-mutaatio, liipaisu nonsense välittämä rappeutuminen. [18], [19]. Lisäksi uORF proteiinia itseään voi moduloida käännös, kuten mutageneesillä kokeita käyttöön missense-mutaatio uORF sekvenssit [20]. Kaikki nämä mekanismit todennäköisesti lisäävät toiminnallista vaihtelua geenien sisällä populaatioissa. Toiminnallinen merkitys uORFs korostuu entisestään havainto, että mutaatiot ne pystyvät aiheuttamaan ihmisten sairauksien kuten perinnöllinen trombosytemia tai Marie Unna perinnöllinen hiustenlähtö [21], [22].

Tässä tutkimuksessa suoritetaan järjestelmällinen etsiä toiminnallisesti asiaan uORFs in nAChR alayksiköissä, joiden epäillään olevan osallisena nikotiiniriippuvuuden ja tupakointiin liittyviin sairauksiin. Meidän kokeissa kävi ilmi, että jotkut uORFs edistävät säätelyyn nAChR proteiinin ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

In silico

analyysi otaksutun uORFs 5’UTR α3, α4, α5, α7, ja SS3 nAChR alayksikköjen

5’UTRs on

CHRNA3, CHRNA4

isoformia 1 ja 2,

CHRNA5, CHRNA7

ja

CHRNB3

(koodaavat nAChR alayksikköjen α3, α4, α5, α7 ja SS3) seulottiin lukukehyksessä aloitus- ja stop-kodonit ylävirtaan tärkeimmät aloituskodonin kanssa StarORF Finder (https://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNP validoitu SNP geeni otetaan NCBI ja sijaitsevat uORF sekvenssi tai luomalla /poistaminen uORF katsottiin tutkittavaksi (Fig. 1).

’UTR nikotiiniriippuvuuden liittyvien nAChR alayksikkögeenit kanssa otaksuttu uORFs. BP sijoitetaan kunkin uORF (start /stop) on kuvattu aloittaen tärkeimmistä aloituskodonista 5’- suuntaan.

CHRNA4

isoformia 1 ja isoformia 2 eroavat koodaavan alueen, jossa vielä alavirtaan translaation aloituksen isoformin 2, että elongates sen 5’UTR-.

CHRNA4

isoformia 2 julkaistiin vasta 2012 ja ei ole toiminnallisesti analysoitu ennen. Ruudut, uORFs; nuolet, SNP

plasmidikonstruktion

Firefly sivektorissa pGL4.10 (AY738222.1) ja Renilla sivektorissa pGL4.74 (AY738230.1) ostettiin Promega (Mannheim, Saksa). TK-promoottorisekvenssi leikattiin pois pGL4.74 Kpnl: llä ja XhoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa) jälkeen generoidaan Xhol-restriktiokohdan asemassa bp 783 käyttäen geneart kohdennetun mutageneesin järjestelmä (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa ). Sen jälkeen Kpnl ja Xhol digestion pGL4.10, TK-promoottori-sekvenssi ligoitiin monikloonauskohtaan pGL4.10 ylävirtaan tulikärpäsen lusiferaasi koodaavan sekvenssin. 5’UTR insertit nAChR alayksikköjen α4 isoformia 1 ja 2, α5 ja SS3 syntetisoitiin (MWG Eurofinsille, Ebersberg, Saksa) ja kloonattiin pGL4.10 Xhol ja Ncol: llä (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa) suoraan välillä TK-promoottori ja tulikärpäsen lusiferaasi koodaavan sekvenssin. Kloonauksen jälkeen insertit varmistettiin sekvensoimalla. Luoda konstruktien puuttuu tietty uORF, ATG ja uORF mutatoitiin TTG. Samoin SNP alleelien esiintymistiheys uORFs vaihdettiin by mutageneesillä. Sillä

CHRNA4

isoformin 1 (NM_000744.6), kätkeminen yksi oletetun uORF kaksi konstruktioita luotiin: yksi villityypin mRNA: ta (

CHRNA4

-iso1-1) ja yksi mutatoitu uORF aloituskodoni (

CHRNA4

-iso1-2). Myöhempää testi (katso tulokset), kaksi konstruktioita luotiin: sellainen, jossa lopetuskodonista uORF mutatoitiin (TAG TAC), mutta tulikärpäsen aloituskodoni jäi ehjä (

CHRNA4

-iso1- 3), ja josta puuttuu sekä lopetuskodonista uORF ja tulikärpäsen aloituskodoni (ATG TTG) (

CHRNA4-

iso1-4).

CHRNA4

isoformin 2 (NM_001256573.1), jolla on viisi oletetun uORFs, kuusi konstruktit luotiin: yksi villityypin mRNA: ta (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5) ja viisi konstrukteja, joissa kussakin on yksi viidestä uORFs on kytketty pois päältä, on numeroitu vastaavasti, aloittaen eniten 5 ’sijaitsee uORF (

CHRNA4

-iso2-uORF1;

CHRNA4

-iso2-uORF2;

CHRNA4

-iso2 -uORF3;

CHRNA4

-iso2-uORF4;

CHRNA4

-iso2-uORF5).

CHRNA5

(NM_000745.3), kätkeminen yksi oletetun uORF sisältävät yhden SNP-kohdan, neljä rakennetta luotiin: yksi alleeli guaniinin ja ehjä /kytkeä pois uORF (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2) ja yksi alleeli adeniinin ja ehjä /sammutuksen uORF (

CHRNA5

-3;

CHRNA5

-4). Myöhempää testi (katso tulokset), kaksi konstruktioita luotiin: sellainen, jossa lopetuskodonista uORF mutatoitiin (TAG TAC), mutta Firefly aloituskodonista jäi koskemattomana (

CHRNA5

-5) , ja josta puuttuu sekä lopetuskodonista uORF ja tulikärpäsen aloituskodoni (ATG TTG) (

CHRNA

56).

CHRNB3

(NM_000749.3 ), kätkeminen oletetun uORF ja SNP kanssa pääalleelille adeniini luoda uORF aloituskodonin, kolme konstrukteja käytettiin: yksi ehjä uORF aloituskodoni tuottama SNP-alleelin adeniini (

CHRNB3

-1); jolla on pieni SNP-alleelin guaniinin poistamalla ensimmäinen uORF aloituskodonista (

CHRNB3

-2), mikä johtaa katkaistun uORF ja kolmasosa konstrukti SNP-alleelin guaniinin, jossa aloituskodoni katkaistun uORF on kytketty off (

CHRNB3

-3). Yleiskatsauksen konstrukteja käytetään kokeissa on esitetty taulukossa 1.

Soluviljely

Ihmisen alkion munuaissolut (HEK) 293 hankittiin Solulinjat palvelun (CLS, Eppelheim, Saksa). Solujen viljely suoritettiin T75-pulloissa yksikerroksisessa DMEM (Sigma-Aldrich, Hampuri, Saksa), joka sisälsi 4,5 g glukoosia, 10% FBS, 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiini (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

HEK 293-solut kotransfektoitiin reportteriplasmidilla pGl4.10 + TK, joka sisältää 5’UTR α4 isoformia 1 ja 2, α5 ja SS3, vastaavasti, ja ohjaus plasmidi pGL4.74 suhteessa 20:1 käyttäen TransIT ®-LT1 Transfection Reagent (Mobitec, Göttingen, Saksa), 24 h transfektion ennen lusiferaasi-määritystä ja qPCR, vastaavasti .

lusiferaasianalyysissä

HEK293-solut ympättiin 24 h ennen transfektiota 3 x 10

5-soluja 24-kuoppalevyillä (Greiner bio-one, Frickenhausen, Saksa). Tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin kanssa TriStar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa) Dual-Glow® lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Suhde tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasin aktiivisuus määritettiin ja normalisoitiin pGL4.10 + TK. Eri 5’UTR- konstrukteja ilmaistaan ​​kertainen muutos pGL4.10 + TK.

Kaikki kokeet toistettiin itsenäisesti kolme kertaa kolmena kappaleena näytteitä. Kahden-tailed t-testiä käytettiin vertaamaan arvot koenäytteiden ja kontrollinäytteestä.

p

arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​kertaluokkamuutos ja keskiarvona ± SEM.

qPCR

Quantitative reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin jos lusiferaasianalyysissä osoitti merkittäviä tuloksia. Kotransfektion eri konstruktien suoritettiin kuten edellä on kuvattu. RNA uutettiin käyttäen Qiagen RNAeasy kit, mukaan lukien DNaasikäsittely 10 min, mukaan valmistajan protokollan (Qiagen, Hilden, Saksa). Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin transfektiosta lähtöaineena (iScript ™ cDNA-synteesin kit, Bio-Rad, Munchen, Saksa). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kohdistaminen tulikärpäsen lusiferaasi (kohde) ja renilla lusiferaasi (kontrolli) koodaava sekvenssi käyttämällä seuraavia alukkeita tulikärpäsen-fwd 5’TGCAACACCCCAACATCTTC-3 ’ja tulikärpäsen-rev 5’CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3’; Renillaa-fwd 5’AATGGCTCATATCGCCTCCT-3 ’ja renilla-rev 5′-CACGACACTCTCAGCATGGA-3’. Monistustehokkuudessa ja testi lineaarisuuden (korrelaatiokerroin R

2) arvioitiin kullekin alukeparia (Fig. S1). Reaktiot suoritettiin 20 ul määriä, joka sisälsi 10 ui SsoFast

TM EvaGreen

® Supermix (Bio-Rad, Munchen, Saksa), 125 nM kutakin aluketta, 7 ui molekyylibiologian puhdistettua vettä ja 1 ui kutakin mallin jälkeen cDNA-synteesi. Lämpökäsittelyyn koostuivat denaturoinnista (98 ° C 5 s), hehkutus ja laajennus (60 ° C renilla; 62 ° C: ssa firefly 5 s), suoritettiin 50 syklin vaiheet Mini Opticon CFD-3120 PCR-laitteessa (Bio- Rad, Munich, Saksa). Sulamiskäyräanalyysillä vaihteli 65 ° C: sta 95 ° C: ssa 0,5 ° C: n välein. Kaikki kokeet toistettiin itsenäisesti kolme kertaa kolmena kappaleena teknisiä näytteitä. Kahden-tailed t-testiä käytettiin vertaamaan arvot kohdeotoksista ja kontrollinäytteestä.

p

arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CHRNA3

ja

CHRNA7

In silico

analyysi osoitti, ettei 5’UTR

CHRNA3

isoformin 1 (NM_000743.4) ja isoformin 2 (NM_ 001.166.694,1) eikä

CHRNA7

isoformin 1 (NM_000746.5) ja isoformin 2 (NM_001190455.2) sisältävät otaksuttu uORFs (Fig. 1). Siksi nämä kaksi alatyyppiä geenit eivät olleet mukana tutkimuksessa.

CHRNA4

isoformin 1 5’UTR satamiin toiminnallisen uORF

Kaksi erilaista

CHRNA4

mRNA muunnoksia on olemassa. Isoformi 1 (NM_000744.6) osoittaa 5’UTR pituus 231 nt taas isoformin 2 (NM_001256573.1) on tunnusomaista pidempi 5’UTR (690 nt) johtuen koodaavan alueen eroja, jotka johtavat edelleen alavirtaan translaation aloituksen. 5’UTR

CHRNA4

isoformin 1 yhden oletetun uORF 60 nt: n pituus voi sijaita

in silico

(Fig. 1). Sen aloituskodoni on sisältyvistä riittävä Kozak-konsensussekvenssin (koska guaniinin asemassa -3). Konstruktit

CHRNA4

-iso1-1 ja

CHRNA4

-iso1-2 testattiin lusiferaasin määrityksellä (taulukko 1 ja S1). Tulokset paljastivat, että katkaisemalla uORF merkittävästi lisääntynyt

CHRNA4

-iso1-1 proteiinin ilmentymistä 4,8-kertaiseksi (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

CHRNA4

– iso1-2 2,9 ± 0,43;

p

= 0,013) (Kuva. 2A).

V: lusiferaasianalyysissä on

CHRNA4

isoformin 1 5’UTR- johti merkittävään kasvuun proteiiniekspressiossa kun katkaisemalla uORF. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, kuvataan kolmen eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso1-1; 3,

CHRNA4

-iso1-2. B: Tällä uORF ATG on

CHRNA4

-iso1 pystyy aloittamaan käännöksen, jolloin pitkänomainen Firefly proteiinia. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan viiden eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGl4.10; 3,

CHRNA4

-iso1-2; 4,

CHRNA4

-iso1-3; 5,

CHRNA4

-iso1-4. C: Suhteellinen qPCR varten

CHRNA4-ISO1

5’UTR- ei osoittanut merkittäviä eroja mRNA määrä verrattaessa eheitä poistettu uORF. Kertainen muutos Firefly mRNA normalisoida pGl4.10 + TK, kuvataan kolmen eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso1-1; 3,

CHRNA4

-iso1-2. D: Mikään viidestä uORFs on

CHRNA4

-iso2 5’UTR- osoitti merkittäviä tuloksia. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan seitsemän eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso2-uORF1-5; 3,

CHRNA4

-iso2-uORF1; 4,

CHRNA4

-iso2-uORF2; 5,

CHRNA4

-iso2-uORF3; 6,

CHRNA4

-iso2-uORF4; 7,

CHRNA4

-iso2-uORF5. Virhe pylväät edustavat ± SEM 3 biologisten rinnakkaista. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja (

p

0,05).

Jotkut, mutta ei kaikkia uORFs muunnetaan proteiiniin. Seuraavassa vaiheessa emme siis tutkittava, ATG aloituskodonista

CHRNA4-

iso1-1 uORF pystyy aloittamaan proteiinia käännös, mikä olisi edellytyksenä käännös uORF itse. Käännetty uORF kanssa mutatoitunut lopetuskodonin, kloonattu samaan lukukehykseen tulikärpäsen ORF pitäisi johtaa synteesiin pitkänomainen Firefly proteiinia. Kaksi rakennetta,

CHRNA4-

iso1-3 ja

CHRNA4-

iso1-4 verrattiin

CHRNA4

-iso1-2. UORF asetettiin kehyksessä tulikärpäsen ORF kaikkien 3 konstruktioita. Tulokset osoittivat ole merkittävää eroa proteiinin ilmentyminen muuttuu välillä

CHRNA4

-iso1-2 ja

CHRNA4-

iso1-3 välillä eikä

CHRNA4

-iso1-2 ja

CHRNA4-

iso1-4 (

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

CHRNA4

-iso1-3 0,94 ± 0,25;

p

= 0,542

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26;

p

= 0,471). Vertailu

CHRNA4

-iso1-4 kontrollivektorilla pGL4.10 paljasti lisääntyminen proteiinin ilmentyminen, joka ei saavuttanut merkitsevyyttä (

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26; pGL4.10 0,03 ± 0,01;

p

= 0,067) (Kuva. 2B).

analysointiin tulokset lusiferaasimääritystä johtuivat transkription tai translaation vaikutus, suoritimme määrälliseen real -Aika PCR (qPCR). Kun verrataan mRNA: n määrä soluissa, jotka on transfektoitu konstruktit

CHRNA4

-iso1-1 ja

CHRNA4

-iso1-2 mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu ehjä ja poistetaan uORF (

CHRNA4

-iso1-1 1,23 ± 0,29;

CHRNA4

-iso1-2 1,05 ± 0,22;

p

= 0,702) (Kuva. 2C).

5 ”UTR

CHRNA4

isoformia 2 sisältää viisi otaksutun uORFs vaihtelevat 18-60 nt (Fig. 1). Konstrukti vain ehjä uORFs verrattiin konstrukteja, joissa kussakin on yksi viidestä uORFs on kytketty pois päältä (taulukko 1 ja S1). Tulokset osoittivat merkittäviä eroja koskevia ehjä versus kytketty pois uORF. Tämä pätee erityisesti korkeintaan 5 ’uORF, joka on läsnä sekä

CHRNA4

isoformeja. Tämä uORF näytti olevan toiminnallinen isoformin kanssa lyhyempi 5’UTR- (katso edellä) mutta ei aiheuttanut muutoksia proteiiniekspressiossa jälkilämpöön vuonna isoformin kanssa pidemmän 5’UTR- (Fig. 2D). (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02;

p

= 0,644;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03;

p

= 0,607;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02;

p

= 0,427;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03;

p

= 0,514;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02

p

= 0,926).

verrattaessa kahden villityyppisen isoformia

CHRNA4

-iso1-1 ja

CHRNA4

-iso2-uORF1-5, tulokset osoittivat, että proteiini ilmentymisen jälkimmäinen oli merkittävästi vähentynyt (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

p

= 0,014).

CHRNA5

5’UTR sisältää transkription jälkeen toiminnallinen uORF

CHRNA5

5’UTR- (NM_000745. 3) havaittiin satamaan yhden oletetun uORF 30 nt: pituus (Fig. 1). Tässä uORF SNP rs56182392 kanssa esi alleeli guaniinin (alleelifrekvensseiltään 99,4%) ja harvinainen alleeli adeniini johtaa aminohapon vaihto alaniinista treoniiniksi käännettynä.

analysoimiseksi

CHRNA5

uORF ja sen SNP proteiini tasolla testasimme konstrukteja Lusiferaasimäärityksiä (taulukko 1 ja S1). Konstruktit

CHRNA5

-2 ja

CHRNA5

-4 johti proteiinin kasvua 50%: lla 65%, verrattuna

CHRNA5

-1, vastaavasti

CHRNA5

-3 (

CHRNA5

-1 0,76 ± 0,03;

CHRNA5

-2 1,15 ± 0,06;

p

= 0,009;

CHRNA5

-3 0,63 ± 0,08;

CHRNA5

-4 1,04 ± 0,03;

p

= 0,006). Näin ollen molemmissa tapauksissa konstruktit, joilta puuttuu uORF merkitsevästi enemmän proteiinia kuin vastaavat konstruktit ehjä uORFs. Verrattaessa kahta alleelin rs56182392 (konstruktioita

CHRNA5

-1 ja

CHRNA5

-3) rekisteröityä proteiini muutokset eivät ole olleet merkittäviä (Fig. 3A).

’UTR satamiin toiminnallinen uORF;

CHRNB3

uORFs eivät osallistu translaatiota ohjaavia. V: lusiferaasianalyysissä on

CHRNA5

5’UTR- johti merkittävään kasvuun proteiiniekspressiossa kun katkaisemalla uORF. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan viiden eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. B: Tällä uORF aloituskodoni

CHRNA5

ei aloittanut käännöstä yhtä tehokkaasti kuin tulikärpäsen aloituskodoni. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan viiden eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGL4.10; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-5; 5,

CHRNA5

-6. C: Suhteellinen qPCR varten

CHRNA5

5’UTR- ei osoittanut merkittäviä eroja mRNA määrä verrattaessa eheitä poistettu uORF. Kuitenkin merkittäviä eroja arvioitiin transkription kaksi SNP-alleeli variantteja. Kertainen muutos Firefly mRNA normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan viiden eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. D: lusiferaasianalyysissä on

CHRNB3

5’UTR- määrässä ole merkittäviä tuloksia. Kertainen muutos Firefly toiminnan normalisoida pGl4.10 + TK, havainnollistetaan neljän eri konstruktioita; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNB3

-1; 3,

CHRNB3

-2; 4,

CHRNB3

-3. Virhe pylväät edustavat ± SEM 3 biologisten rinnakkaista. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja (

p

0,05).

Jälleen, voidaan arvioida, ATG-aloituskodonin

CHRNA5

uORF pystyy aloittamaan proteiinin käännös, molemmat konstruktioita

CHRNA5

-5 ja

CHRNA5

-6 verrattiin

CHRNA5

-2. UORF asetettiin kehyksessä tulikärpäsen ORF kaikkien 3 konstruktioita. Tulokset paljastivat, että niin kauan kuin tulikärpäsen aloituskodoni oli ehjä lusiferaasi-proteiini ilmentyy voimakkaasti (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-5 1,55 ± 0,46;

p

= 0,736). Kuitenkin proteiinin ilmentyminen laski yli 90%, kun ainoastaan ​​ATG on uORF oli läsnä (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01;

p

= 0,029). Vertailu

CHRNA5

-6 kontrollivektorilla pGL4.10 ei osoittanut merkittäviä eroja (

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01; pGL4.10 0,03 ± 0,01;

p

= 0,069) (Kuva. 3B).

Suoritimme sitten suhteessa qPCR sulkea pois vaikutusta RNA tasolla syynä meidän havainnot. Kun verrataan mRNA: n määrä soluissa, jotka oli transfektoitu vastaavan konstruktien (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2

CHRNA5

-3

CHRNA5

-4) suhteellinen qPCR mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu ehjä ja poistetaan uORF (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-2 0,97 ± 0,01;

p

= 0,369;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

CHRNA5

-4 1,10 ± 0,05;

p

= 0,459) (Kuva. 3C). Siten uORF ei määrällisesti muuttanut mRNA-tasolla. Muodosta

CHRNA5

-3 sisältävä harvinainen alleelin rs56182392 tuotti huomattavasti tulikärpäsen lusiferaasi selostukset kuin

CHRNA5

-1 (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

p

= 0,011). Siitä huolimatta ei ole merkittäviä eroja kahden alleelin nähtiin proteiinin tasolla ja siksi on epätodennäköistä, että rs56182392 on tärkeä vaikutus

CHRNA5

toiminto.

CHRNB3

uORF tekee ei vaikuta proteiinin ilmentyminen

5’UTR tämän alayksikön (NM_000749.3) sisältää yhden otaksuttu uORF. Se satamiin SNP (rs4950 adeniini /guaniini) ja pieniä alleeli guaniinin poistetaan ensimmäisen ATG-aloituskodonin oletetun uORF, luoda katkaistu, oletetun uORF (Fig. 1). N Näiden kolmen konstruktin (

CHRNB3

-1;

CHRNB3

-2

CHRNB3

-3) verrattiin toisiinsa lusiferaasianalyysissä (taulukko 1 ja S1). Merkittäviä eroja ei havaittu näiden kolmen eri variantteja (

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

p

= 0,495;

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

p

= 0,778;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

p

= 0,726). Siten meidän tulokset osoittavat, ettei enää uORF eikä katkaistu uORF version rooli säätelyssä proteiinin translaation (Fig. 3d).

Keskustelu

Tässä esitetyt tiedot viittaavat vahvasti siihen, että uORFs sisällä 5’UTR

CHRNA4

-iso1 ja

CHRNA5

ovat tärkeitä säätelijöitä proteiinin translaation. Lisäksi ne osoittavat, että kaksi tunnettua

CHRNA4

isoformit poikkeavat suhteessa niiden vaikutusta geenien ilmentymisen tasolla. Vaikutus

CHRNA4

-UTR geenien ilmentymisen myös aiemmin raportoitu Briggs et ai. He ilmaisivat fretti

CHRNA4

ja

CHRNB2

yhdessä /tai ilman niitä vastaavat UTR oosyyteissä. Mielenkiintoista, yksinomaan herkkä eikä matalan herkkyyden -reseptorityypin havaittu, kun UTR oli läsnä. Kuitenkin otaksuttu sääntely UTR tekijöitä ei analysoitu yksityiskohtaisesti tässä tutkimuksessa [23].

Verrattuna lyhyemmän isoformin, läsnäolo pitkä 5’UTR

CHRNA4

vähensi lusiferaasiekspressio . Mikään viidestä uORFs läsnä tässä isoformin osoittivat vaikutusta geenien ilmentymisen kun tippuu erikseen. Tämä tekee epätodennäköisenä, että he ovat vastuussa alennettua geeniekspressiotasot liittyvät kauemmin

CHRNA4

isoformin. Emme voi täysin sulkea pois mahdollisuutta, että samanaikaisesti knock out kaikkien viiden uORFs olisi ollut vaikutusta geenien ilmentyminen, mutta on muita tukahduttavia säätelysekvenssi motiiveja tai RNA kääntyvät tapahtumia, jotka joko epävakaaksi mRNA tai hidastaa käännös näyttää olevan vähintään yhtä todennäköistä selityksiä.

on kiinnostavaa, että uORF todettu toimivaksi

CHRNA4

isoformin kanssa lyhyempi 5’UTR- on läsnä myös pitkän 5’UTR–isoformi mutta ei näyttävät vähentää geenin ilmentymisen jälkimmäisessä sekvenssin yhteydessä. Tietääksemme tämä esittelee ensimmäisen esimerkki uORF kanssa isoentsyymiselektiivisiä erityinen toiminnallinen merkitys. Syyt tähän tarkkailu ovat toistaiseksi tuntemattomia. Meidän venymä kokeet viittaavat siihen, että ATG lyhyen isoformi voi aloittaa käännös uORF. Kuitenkin tämä vaikutus oli melko pieni, ja tulokset eivät olleet merkittäviä. Siksi käännös uORF proteiinin voitaisiin edistää, mutta ei todennäköisesti ole tärkein syy tälle havainnolle. On myös mahdollista, että riittävä Kozak-konsensussekvenssi [24] kattaa uORF aloituskodoni mahdollistaa riittävän ribosomin tunnustamista. Ribosomi pysähtyminen on siksi pidettävä vaihtoehtoisen mekanismin vaikutukset havaittiin proteiinin tasolla. Se voi vain arvailla, miksi sama uORF näytti olevan toimimattomia kun analysoidaan pitkällä 5’UTR-

CHRNA4

isoformin. Mahdollinen syy voi olla läsnä muita, toistaiseksi tuntematon sääntelyn motiiveja jotka ovat olemassa vain pitkällä 5’UTR-

CHRNA4

5’UTR- ja pystyvät estämään uORF toiminto. On jo osoitettu, että säätelevän roolin ainakin joidenkin uORFs voidaan läheisesti muihin 5’UTR- jaksoryhmittymät [25]. Kuitenkin uORF kuvattu tässä edellisen selonteon ainoa toimiva jos sääntelyyn motiiveja olivat läsnä.

CHRNA4

uORF käsitellään tässä vaatisi päinvastainen mekanismi, eli tukahduttamisen jaksoryhmittymät tuntematon.

Mitä yksittäinen uORF on

CHRNA5

, meidän kokeet osoittivat ole selviä viitteitä että uORF aloituskodoni pystyy aloittamaan translaation tulikärpäsen geeni kloonattiin alavirtaan siitä. Todennäköisin selitys tälle havainnolle olisi alhainen lujuus Kozak-sekvenssi, joka ympäröi uORF-ATG. Tämä heikko sekvenssimotiivissa on omiaan vähentämään todennäköisyyttä, että ribosomeja tunnistaa uORF-ATG ja aloittaa kääntäminen tällä sivustolla. Kuitenkin se, että emme voineet havaita merkittävää eroa ilmaisun tasojen ohjaus vektorin ja konstruktio, jossa uORF aloituskodonista toimi ainoana toimintaa translaation aloituskohdan (

CHRNA5

-6) tekee ei välttämättä sotkea että käännös uORF ei suljeta kokonaan pois mahdollisena mekanismi. Vielä, koska vaikuttava vaikutus proteiinien ilmentymiseen uORF osoitti, että läsnä on oma ehjä lopetuskodoni on epätodennäköistä, että tämä voimakas vaikutus johtui yksinomaan heikko käännös uORF proteiinia. Tämä viittaa siihen, että toisin kuin

CHRNA4

uORF edellä on kuvattu,

CHRNA5

uORF ei kuulu ryhmään sekvenssiriippuvaisia ​​uORFs joilla saavutetaan niiden vaikutuksia koodaamalla pieniä proteiineja, jotka pelata aktiivinen rooli translaation valvontamekanismit. Niinpä muita mekanismeja on otettava huomioon, mukaan lukien pysähtymisen ribosomien klo uORF tai vuotavat skannausta. Sakkauskohtaus- mekanismi tapahtuu, kun ribosomien pysähdyt aikana uORF käännös [26]. Kuitenkin aloituskodonin joka ei kykene saavuttamaan riittävää käännös on myös todennäköisesti aiheuta merkittävää ribosomien pysähtymisen. Vuotava skannaus näyttää olevan todennäköisempi selitys havaittuja vaikutuksia. Tämä mekanismi erityisesti ilmenee, jos aloituskodonin uORF on sisältyvistä huono aloituskodonin yhteydessä sekvenssin läsnä uORF on

CHRNA5

. Tämän seurauksena jotkut ribosomien tunnustaa aloituskodonista uORF ja aloittaa, toiset ohittaa sen ja aloittaa seuraavan aloituskodonin.