Krooninen sairaus

tiivistelmä

sisplatiini, yleisesti käytetty kemoterapeuttinen, liittyy ototoksisuutta, munuaistoksisuutta ja neurotoksisuutta, mikä tunnistaa keino lisätä terapeuttista indeksiä Sisplatiinin voi mahdollistaa parannetun tuloksia. SNP (rs4343077) sisällä

eps8

, löysi kautta genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa sisplatiinin aiheuttaman sytotoksisuuden ja apoptoosin lymfoblastisolulinjoissa (LCL), edellyttäen sysäyksen edelleen tutkia tätä geeniä. Tämän työn tavoitteena oli arvioida rooli

EPS8

solujen herkkyys sisplatiiniin syöpä- ja ei-syöpäsolujen. Käytimme

EPS8

RNA-interferenssiä määrittää vaikutus laski

EPS8

ilmentymisen LCL ja A549 keuhkosyöpäsolua herkkyyttä sisplatiinia.

EPS8

Knockdown in LCL johti 7,9%: n nousu sisplatiinin aiheuttama eloonjäämisen (

P

= 1,98 x 10

-7) ja 8,7% lasku apoptoosin (

P

= 0,004) verrattuna kontrolliin. Sen sijaan vähensi

EPS8

ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa johti 20,6%: n lasku sisplatiinin aiheuttama eloonjäämisen (

P

= 5,08 x 10

-5). Sitten tutkimiseen, on

eps8

estäjä, mitramysiini A mahdollisena lisäävän aineen terapeuttista indeksiä sisplatiinin. Mitramysiiniä on käytetty pienempää

EPS8

ilmentyminen LCL mikä laski solujen herkkyys sisplatiinia osoituksena alemman kaspaasi 3/7 aktivointia seuraavaa sisplatiinihoitoon (42,7% ± 6,8% suhteessa kontrolliin

P

= 0,0002 ). 5 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat, mitramysiini myös alensivat

EPS8

ilmaisua. Lisäämällä mitramysiiniä 4 NSCLC solulinjojen ja virtsarakon syövän solulinja, johti lisääntynyt herkkyys sisplatiinia, joka oli merkitsevästi selvempi tuumorisolulinjoissa kuin LCL riviä (p 0,0001). EGFR mutantti NSCLC solulinja (H1975) ei ollut merkittävää muutosta herkkyys sisplatiiniin lisäämällä mitramysiiniä hoidon. Siksi estäjä

eps8

, kuten mitramysiini A, voisi parantaa sisplatiinihoitoon lisäämällä herkkyyttä kasvaimen suhteessa normaaleihin soluihin.

Citation: Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im HK, Dolan ME (2013)

ePS8

esto Lisäykset Sisplatiini Herkkyys Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10,1371 /journal.pone.0082220

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 24 lokakuu 2013; Julkaistu: 19 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Gorsic et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ovat kiitollisia National Institute of Health, National Institute of General Medical Sciences UO1GM61393 (MED), National Institute of Health Clinical and Translational tiedepalkinto TL1 RR25001 (ALS), National Institute of Health syöpäbiologian Training Grant T32CA009594 (HEW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sisplatiini on platinaa, jota käytetään hoitoon pään ja kaulan, munasarjan, kohdunkaulan, kiveksen, ja keuhkojen syövät; kuitenkin vaikea toksisuudet ja luontainen /hankitun resistenssin häiritse sen tehokkuus [1]. Ymmärtäminen geneettiset ja molekyylitason mekanismeja, joilla tämä kemoterapeuttisen aineen aiheuttaa myrkyllisiä sivuvaikutuksia olisi suurta hyötyä potilaille. Erityisesti tunnistamista geenejä, joiden ilmentyminen myötävaikuttaa myrkyllisyyttä mahdollistaisi kehittämiseen kemoterapiaa kiertää myrkyllisiä vaikutuksia.

lab on kehittänyt prekliinisessä farmakogenomiset mallia hyödyntäen lymfoblastisolulinjoissa (LCL) tunnistaa geneettisiä variantteja liittyvä alttius kemoterapeuttisia täydentää ja parantaa kliinistä farmakogenomiset tutkimuksissa [2] – [5]. Tärkeää on, variantit tunnistettu solussa perustuvan lähestymistavan on osoitettu liittyvän vasteen munasarjasyöpä [6], keuhkosyöpä [7], pään ja kaulan alueen syöpä [8], ja paklitakseli aiheuttama perifeeristä neuropatiaa syöpäpotilaista [ ,,,0],9], joka tarjoaa luottamus soluun perustuva malli tunnistaa kliinisesti merkittäviä variantteja.

useimmissa LCL tutkimuksissa lääkkeen aiheuttama solujen kasvun esto farmakologisen fenotyyppi mitattu, mutta tämä on laaja fenotyyppi, joka sisältää solun prosessit mikä kuolion, solukuoleman kautta apoptoottisten ja ei-apoptoottisia reittejä, solusyklin pysähtymiseen, ja vaurioituneiden solujen käynnissä DNA korjaukseen [10]. Apoptoosi, tarkempi fenotyyppiin, saattaa valaista asiaa yhden emäksen monimuotoisuus (SNP: t), joka liittyy sisplatiinin vaste potilailla, koska sisplatiini tiedetään aiheuttavan solukuolemaa läpi apoptoottisen reitin [11]. Siksi aikaisemmassa tutkimuksessa käsiteltiin HapMap LCL sisplatiinin ja mitataan kaspaasi 3/7 aktivointi sekä solujen kasvun estäminen [12]. GWAS paljasti 2449 SNP ja 1629 SNP suggestiivisesti liittyy sisplatiinin indusoiman apoptoosin ja sytotoksisuuden (

P

0,001), tässä järjestyksessä, 19 päällekkäisiä SNP [12]. Yksi yhteinen SNP, rs4343077, jossa alaikäinen alleeli oli alhaisemmat sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin (

P

= 0,0007) ja korkeampi eloonjäänti (

P

= 0,0007) on myös ilmaus polygeeninen ominaisuus (eQTL), joka liittyy perustason geenin ekspressiotasoja 28 geenien

P

≤10

-4 [12]. Tämä SNP on intronin epidermaalisen kasvutekijän reseptorin reaktiotien alustan 8 (

EPS8

).

Mielenkiintoista,

EPS8

on erityisesti yhdistetty sisplatiinipohjaisen ja paklitakselin aiheuttama lääkevaste, jossa kohdunkaulan syöpäsolut tuli herkempiä lääkehoidon seuraaviin

ePS8

knockdown [13]. Äskettäin

EPS8

havaittiin myös yliekspressoituvan ihmisen pahanlaatuinen gliooma ja edistettävä niiden solujen kasvua [14]. Tutkimukset ovat raportoineet lisääntyneen ilmentymisen

EPS8

muissa erilaisissa ihmisen kasvaimissa kuten munasarja-, peräsuolen, keuhko-, aivolisäkkeen ja suusyöpä [15]. Tämän seurauksena

EPS8

vaimennus on osoitettu vaikuttavan solujen vaeltamiseen ja soluproliferaatiota syöpäsoluissa [15].

Koska on tärkeää

EPS8

vastauksena sisplatiini kasvainsoluissa [13] ja meidän tunnistaminen SNP sisällä

ePS8

(rs4343077) liittyvät sekä sisplatiinin sytotoksisuus ja apoptoosin [12], me arvioidaan edelleen merkitystä

ePS8

herkkyydessä sisplatiinia. Tätä varten käytimme siRNA vastaan ​​

EPS8

ja tunnetun

EPS8

estäjä, mitramysiini. Downregulation käyttämällä siRNA ja /tai esto

EPS8

mukaan mitramysiiniä alensivat enemmän solujen kasvun estäminen in non-EGFR mutantti keuhko- syöpäsoluja ja virtsarakon solulinja seuraavat sisplatiinihoitoon. Tutkimuksemme tunnistaa merkitys

EPS8

in sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Yhdeksän LCL (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) johdettu yksilöiden Pohjois- ja Länsi-Euroopan syntyperä (HapMap CEU) ylläpidettiin RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 15% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, Utah, USA) ja 20 mM L-glutamiinia. Solulinjoja laimennettiin 3 kertaa viikossa pitoisuuteen 350000 solua /ml. A549, NCI-H1437, NCI-H1563 ja NCI-H1975 (ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat) ylläpidettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. NCI-H2126 (ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja) pidettiin DMEM: F12, joka sisälsi 0,005 mg /ml insuliinia, 0,01 mg /ml transferriiniä, 30 nM natriumseleniitti, 10 nM hydrokortisoni, 10 nM beta-estradiolia, extra 2 mM L-glutamiinia ja 5% naudan sikiön seerumia (medium ehdotti ATCC). HTB9 (virtsarakon luokka II karsinoomasolulinja) pidettiin RPMI 1640 ja 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki solulinjat säilytettiin 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2. Syöpäsolut, keskipitkän ja komponentit ostettiin ATCC (Manassas, Virginia, USA), Cellgro (Herndon, Virginia, USA) tai Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).

Drugs

sisplatiini ja mitramysiini A: ta ostettiin Sigma-Aldrich Co. dimetyylisulfoksidi käytettiin laimentamaan sisplatiinin 20 mM: n varastoliuos, kun taas mitramysiini laimennettiin varastossa pitoisuus 0,06 uM käyttäen fosfaattipuskuroitua suolaliuosta.

välinen korrelaatio

ePS8

ja fenotyyppien

genominlaajuiset geenien ilmentyminen tietoja kertyi meidän lab kanssa Affymetrix GeneChip- Human eksoni array 1.0 ST array [16] ja kaikki raaka eksonin array tiedot ovat olleet talletetaan Gene Expression Omnibus (tulonumero. GSE7761).

EPS8

geenin ilmentymisen tasot korreloivat 5 uM sisplatiinin indusoimaa sytotoksisuutta ja apoptoosin [12] CEU LCL (n = 77). Lineaarinen regressio analysoidaan välillä

EPS8

tasoilla ja kunkin fenotyypin suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 4.

RNA-interferenssi

pudotus kokeet suoritettiin sen osoittamiseksi, vaikutuksia alemman

EPS8

tasoilla sisplatiinin aiheuttamaa sytotoksisuutta ja apoptoosin. Käyttäen Lonza Cell Line 96-Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Basel, Sveitsi), LCL ja A549 oli nucleofected 24 tuntia sen jälkeen, kun oli ympätty 5,5 x 10

5 solua /ml ja 4,0 x 10

5 solua /ml, vastaavasti. Soluja sentrifugoitiin 90 x g: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa ja suspendoitiin uudelleen pitoisuuteen 1 x 10

6 solua /20 ul SF /täydennys liuosta ja 2 uM lopullinen konsentraatio AllStars negatiivinen kontrolli-siRNA merkitty AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) tai altaan Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) FlexiTube siRNA (Qiagen). Ohjelma DN-100 käytettiin LCL nucleofection ja CM-130 A549. Solut annetaan 10 minuutin lepo ennen lisäämistä RPMI-elatusaineeseen, sitten päällystetty sytotoksisuuden tai apoptoosin ja inkuboitiin yön yli.

Sytotoksisuus seuraavat siRNA tai hoidon mitramysiini

alamarBlue solukasvun inhibitiotesti jolla mitataan sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinin ja mitramysiini [17]. Sillä

EPS8

siRNA kokeissa LCL (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 ja GM12239) käsiteltiin 5 uM sisplatiinin 5 tuntia lähettää nucleofection, kun taas A549 käsiteltiin 5 uM sisplatiinin 24 tunnin kuluttua nucleofection. Seuraavat lääkehoidon soluja inkuboitiin 24 tuntia. AlamarBlue Sitten lisättiin ja levyjä inkuboitiin vielä 24 tuntia ennen kuin se luetaan aallonpituuksilla 570 ja 600 nm: ssä käyttämällä Synergy HT (Biotek, Winooski, VT) ja eloonjäämisprosentteina laskettiin [12]. Tarkkailla sytotoksisen vasteen

EPS8

pudotus läpi mitramysiini, soluja (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, A549, H1437, H1563, H1975, H2126 ja HTB9) maljattiin ja käsiteltiin joko mitramysiiniä yksinään (0 ja 0,01 uM), sisplatiini yksin (0, 1, 2,5, 5, 10 20, 25 ja 50 uM) tai sisplatiinin eri konsentraatioissa yhdessä 0,01 uM mitramysiiniä. Mitramysiiniä hoito ilmenee heti pinnoituksen. Sitten solut sisplatiinia 6 tuntia post mitramy- lisäksi ja 10% koko hyvin tilavuus alamarBlue lisättiin 24 tunnin kuluttua sisplatiinihoitoon. Jälkeen vielä 24 tunnin inkuboinnin ajaksi, levyt luettiin kuten edellä on todettu. Kaikki kokeilut eloonjäämisprosentteina mittauksia maljattiin kolmena kappaleena, jossa on vähintään kaksi erillistä koetta.

apoptoosimäärityksessä

sisplatiiniannoksen ja mitramysiini indusoiman apoptoosin mitattiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 reagenssia Promega Corporation (Madison, WI), kuten aiemmin on kuvattu [12]. Sillä

EPS8

siRNA kokeissa päällystetty soluja käsiteltiin 5 uM sisplatiinin 5 tuntia post nucleofection ja kaspaasi 3/7 mitattiin 24 tunnin kuluttua sisplatiinihoitoon. Arvioida

EPS8

geenin ilmentymisen jälkeen, mitramysiini altistuksen, solut maljattiin ja välittömästi käsiteltiin mitramysiini (0 tai 0,01 uM), sitten sitä käsiteltiin 5 uM sisplatiinin 20 tunnin kuluttua mitramysiiniä lisäksi. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua sisplatiinin ja laskettiin suhteessa kontrolliin (ei lääkettä lisäys). Tulokset apoptoosin mittauksen edustavat kokeita päällystetty kolmena kappaleena vähintään kahden itsenäisen toistuu.

Määritellään knockdovvn

EPS8

Solut pelletoitiin 5, 29, ja 53 tuntia jälkeen nucleofection kanssa

ePS8

siRNA ja salatun ohjaus sekä 6 ja 20 tunnin seuraava mitramysiiniä hoitoa. RNA uutettiin käyttäen RNeasy Plus Mini Kit ja QIAcube (Qiagen) seuraten valmistajan protokollaa. mRNA käänteistranskriptoitiin sitten cDNA: ksi, jolloin saatiin lopulliset pitoisuudet 25 tai 50 ng /ul käyttäen High Capacity Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY). CDNA käytetään suorittamaan qRT-PCR vahvistaa pudotus on

EPS8

[18]. Applied Biosystem TaqMan aluketta käytettiin määrittämään mRNA ilmaus

EPS8

(Hs00610286_m1).

Mixed vaikutuksia mallin

vaikutus

EPS8

knockdown sisplatiinilla indusoimaan apoptoosin ja kasvun esto mallinnettiin seuraavia sekoitettu vaikutukset malli:

Experiment ja solulinjat olivat satunnaisia ​​vaikutuksia mahdollistaa kokeilun erityisiä ja solulinjassa erityisiä siepataan ja knockdown tila pidettiin kiinteä vaikutus. Y apoptoosin tai kasvun estäminen. P-arvot Knockdown vaikutus laskettiin uskottavuusosamäärä malleihin sopivat REML asettaa false. Hyvyyttä mallien arvioitiin tarkastelemalla jäännösten ”jakaumat. R Tilastollinen ohjelmisto (R Development Core Team https://www.R-project.org/) ja

lme4

paketti (R paketin versio ,999375-42 https://CRAN.R-project.org/paketti = lme4) käytettiin analyysiin.

vuorovaikutus mitramysiiniä ± sisplatiinin

testaamiseksi vuorovaikutuksen vaikutusta solutyypin (kasvain vs LCL) ja mitramysiini kohtelu sisplatiinin annosvastekäyrältä sovimme sekoitettu vaikutuksia. Lopullinen malli oli: missä luonnollinen logaritmi eloonjäämisprosentteina oli lopputulos ja kasvaimen (tila vs LCL tila) ja mitramysiini hoito (TRT) kiinteään vaikutuksia vuorovaikutus aikavälillä; exp osoitti toinen biologinen rinnakkaisnäytteiden ja varustettiin satunnaisina vaikutus; sisplatiinin annosta ja sen neliö käytettiin mallintamaan annosvastekäyrältä jonka avulla on mahdollista olla erilainen kasvain ja LCL linjat; solulinja id lisättiin satunnainen vaikutus tilille sisällä solulinjan korrelaatio. Kun sopiva malli tulosten nolla pitoisuutena molempien lääkkeiden (rivit jossa selviytyminen tulos = 1 sillä tavalla eloonjäämisprosentteina laskettiin) jätettiin pois. Log transformaatio käytettiin parantamaan malliin sopivaksi. Kerroin vuorovaikutuksen termi tumor:trt voidaan tulkita keskimääräinen siirtymä annosvastekäyrältä kun mithrmycin lisättiin tuumorilinjoja suhteessa LCL linjat.

Tulokset

Onnistunut knockdovvn

ePS8

kautta RNA-interferenssi

Viisi CEU LCL ja A549 keuhkosyövän solulinjaa käytettiin tutkimuksiin, joissa

eps8

knockdown. Solut nucleofected joko salattu ohjaus tai siRNA on

EPS8

. Vertaamalla salattu ohjaus,

EPS8

pudotus on osoitettu olevan menestyksekästä kaikissa 6 solulinjoissa (Fig. 1A). Prosenttiosuudet

EPS8

kaikissa LCL klo 5, 29, ja 53 h ajankohtina oli 17,2 (± 7,5), 19,0 (± 4,3), ja 40,6% (± 7,3), tässä järjestyksessä. A549 saavutti

EPS8

Knockdown 7,4% ja 10,5% verrattuna salattu valvontaa 29 ja 53 tuntia.

Arvot kuuluu 2 itsenäistä kokeita qRT-PCR ajettiin kahtena kappaleena. Solulinja muutokset eloonjäämisprosentteina (

P

= 1,98 x 10

-7) ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus (

P

= 0.004) kaikkien LCL ja A549 (

P

= 5,08 x 10

-5) 5 uM sisplatiinia takia

ePS8

knockdown näytetään keskivirheen keskiarvon käyttäen 6 jäljittelee 2 itsenäisestä kokeesta (B).

Fenotyyppiset muuttuu

ePS8

siRNA

kun olet vahvistanut knockdovvn

eps8

, arvioimme muutosten herkkyyttä sisplatiinia mitattuna eloonjäämisprosentteina ja kaspaasi 3/7 aktivointi. Korrelaatio

EPS8

ilmaisun ja sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden osoitti alhaisempi

EPS8

ilmaus korreloi merkittävästi suurempi eloonjäämisprosentteina 5 uM sisplatiinin (

P

= 0,047); kuitenkin sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin ei saavuttanut merkitystä (

P

= 0,499) (Kuva. S1). Käyttäen sekoitettua vaikutusten malli jossa yhdistyvät kaikki solulinjat,

EPS8

RNA-interferenssi osoittivat elonjäämisetua sisplatiinia saaneilla LCL keskimäärin 7,9% (

P

= 1,98 x 10

– 7) ja väheni apoptoosin keskimäärin 8,7% (

P

= 0,004) (Kuva. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että alhaisempi

EPS8

vuonna LCL vähentää solujen herkkyyttä sisplatiinia osoituksena lisääntynyt solujen eloonjäämistä ja vähensi apoptoottista aktiivisuutta, kun sisplatiinia. Siten vähentynyt

EPS8

vuonna LCL antaa vastustuskyvyn sisplatiinin myrkyllisyyttä. Sen sijaan

EPS8

downregulation A549 aiheuttanut herkemmäksi sisplatiinin kanssa 20,6%: n lasku eloonjäämisprosentteina (

P

= 5,08 x 10

-5) (Fig. 1 B).

mitramysiini vähentää ilmentymistä

ePS8

syövän linjojen ja LCL

tasot

ePS8

ilmentyminen mitattiin 6 ja 20 tunnin hoidon jälkeen mitramysiiniä (0,01 uM). Tasot

EPS8

ilmaisu laski kaikissa 4 LCL testattu, ja keskimäärin 74,4% (± 3,4) 6 tuntia ja 29,8% (± 3,7) 20 tuntia vertailuryhmään nähden seuraavat mitramysiiniä altistuksen (Fig. 2A ). Mitramysiiniä myös vähentynyt

EPS8

ilmentymisen tasoa 5 NSCLC solulinjoissa ja virtsarakon syövän solulinja keskimäärin 95,7% (± 3,4) 6 tuntia ja 59,9% (± 14,7) 20 tuntia altistumisen verrattuna no lääkehoidon ohjaus (Fig. 2B). Nämä mittaukset vahvistavat, että hoito mitramysiini (0,01 uM) pienentävät ilmentymisen

EPS8

syöpäsoluissa keuhkojen ja virtsarakon soluja sekä noncancerous LCL.

Prosenttia arvot ovat kahden itsenäisen kokeen jossa qRT-PCR ajettiin kahtena kutakin koetta standardin keskivirhe.

mitramysiini vähentää herkkyyttä LCL sisplatiiniin

sitten määritti mitramysiiniä siitä herkkyydestä LCL sisplatiinin aiheuttama kaspaasi 3/7 aktivointia. Keskimääräinen apoptoosin tasoilla koko 4 LCL seuraavat sisplatiinia yksinään oli 5,94 (± 0,9) kontrolliin verrattuna, verrattuna sisplatiinin plus mitramysiiniä mikä laski keskimääräistä kaspaasi 3/7 tasoilla 3,38 (± 0,5) (Fig. 3). Kaspaasi 3/7 toimintaa sen jälkeen mitramysiiniä yksin (0,01 uM) johti keskimäärin 3,41 (± 0,4) yli 4 LCL. Vaikka mitramy- ja sisplatiinin erikseen apoptoosin, oli keskimääräinen lasku 42,7% (± 6,8

P

= 0,0002) in kaspaasi 3/7 aktivaation yhdistämällä mitramysiiniä sisplatiiniin verrattuna pelkkää sisplatiinia, mikä viittaa suojaava vaikutus of mitramysiiniä kannalta apoptoosin. Keuhko- ja virtsarakon syövän solut testattiin myös apoptoosin sisplatiiniin (5 uM) läsnä ollessa ja puuttuessa mitramysiini; kuitenkin kaspaasi 3/7 aktivointitasoa näiden solujen eivät olleet yli lähtötason.

Jokaisessa LCL kokenut alempi sisplatiinin aiheuttamaa apoptoottista aktiivisuutta jossa lisätty mitramysiiniä suhteessa ei lääkehoitoa valvontaa. Mitramysiini käsitelty 10859, 11830, 11840 ja 12156 johti 47,1, 40,8, 48,9, ja 34,0% laskua sisplatiinia yksin, vastaavasti. Data edustaa kaksi erillistä koetta, jokainen tehdään kolmena kappaleena standardin keskivirhe.

mitramysiini lisää herkkyyttä kasvainsolujen sisplatiini

Lisäksi testaus apoptoosin tasoa sisplatiinin ja mitramysiiniä in LCL ja syöpäsolujen, myös mitattuna solujen kasvun esto. Viisi NSCLC solulinjoja monipuolisia mutaatio statukset valittiin tutkimuksessa; vaikutus mitramysiini yksin vaihtelee näiden syöpäsolulinjoissa vaihtelevat 59,7-92,9% solujen kasvun esto (taulukko 1). Herkkyys sisplatiinia havaittiin lisääntyvän mitramysiiniä hoitoa 4 molecularly erillistä NSCLC-solut (Fig. 4). H1975 kanssa EGFR-mutaatio, ei havaittu merkittäviä muutoksia. Koska sisplatiinia käytetään myös hoitoon virtsarakon syöpä, Päätimme myös mitata sisplatiinin ja mitramysiini vaikutuksia virtsarakon kasvain linjan, onko vaikutus olisi jäljitellä NSCLC tuloksia; havaitsimme 59,6% selviytymisen mitramysiiniä hoito yksinään (Fig. 4).

Square muoto edustaa sisplatiinia pitoisuudet yksin, kun taas kolmion edustaa sisplatiini lisäämällä mitramysiiniä (0,01 uM). Käyrät edustavat kaksi erillistä koetta tehdään kolmena kappaleena standardin keskivirhe.

Kuitenkin tutkittaessa vaikutusta mitramysiiniä siitä herkkyydestä LCL sisplatiinia, emme tarkkailla samantasoista tehostettu solukasvuneston. Mitramysiiniä yksin yli 4 LCL aiheutti keskimäärin solukasvuneston 63,1% (± 12,8) 0.01 uM (kuva. S2). Annosvastekuvaaja varten LCL siirtyi alaspäin keskimäärin noin 17%, kun mitramysiiniä lisättiin. Sillä tuumorilinjoja annosvastekäyrästä siirtynyt alaspäin noin 26% keskimäärin. P-arvo vuorovaikutuksen termi oli

P

0,0001. Tämä, yhdessä apoptoosin tuloksia, tukee käsitystä, että alennettu ilmentyminen

EPS8

kautta mitramysiiniä ei ole yhtä haitallista LCL selviytyminen, koska se on syöpäsolu linjat. Mitramysiiniä aiheuttaa suurempaa herkkyyttä NSCLC soluja ilman EGFR-mutaatio ja mahdollisesti muiden syövän kudostyyppeihin näkemää tuloksemme virtsarakon tuumorisolulinja, HTB9.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioimme

ePS8

mahdollisena kohteena yhdistelmähoitoa sisplatiinin kanssa.

EPS8

valittiin perustuu aikaisempien prekliinisissä GWAS tuloksia käyttämällä useita cellular fenotyypit: sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden ja sisplatiinin aiheuttama apoptoosin mitattuna kaspaasi 3/7 aktivointi. SNP (introni on

eps8

), rs4343077, liittyi sisplatiinin aiheuttamaa sytotoksisuutta ja apoptoosin sekä perustason ilmentymistä 28 kohdegeenien. Kun knockdovvn

EPS8

ilmaisun 5 LCL, havaitsimme merkittävän laskun solujen herkkyyden sisplatiinia mitattuna solukasvuneston ja kaspaasi 3/7 aktivointi (

P

= 1,98 x 10

-7 ja

P

= 0,004, tässä järjestyksessä) poikki LCL. Kirjallisuus näyttö viittasi siihen,

EPS8

pudotus kasvainsolulinjoissa lisääntynyt solujen herkkyys sisplatiinin [13], [15]. Tuloksemme samaa mieltä näistä havainnoista, jotka osoittavat, että

EPS8

downregulation herkistää A549 keuhkosyöpään solujen sisplatiinihoitoon. Olemme laajentaneet tutkimukset muille molekyylitasolla määritellään keuhkojen solu- linjat ja virtsarakon solulinjan sekä LCL.

EPS8

Knockdown in LCL seuraavissa mitramysiiniä hoito johti vähenemiseen apoptoottista aktiivisuutta mitramysiiniä yhdistettiin sisplatiinia verrattuna pelkkää sisplatiinia. Vaikka solujen sytotoksisuus mittaukset osoittivat pientä herkkyyden lisääntyminen LCL sisplatiiniin seuraavat mitramysiini altistuksen, herkkyys syöpäsolujen linjojen oli merkitsevästi enemmän mitramysiiniä lisäksi verrattuna LCL. Poikkeuksena oli NSCLC solulinja H1975 kanssa EGFR-mutaatio. Tämä merkitsee sitä, pudotus on

EPS8

joko siRNA tai estäjän käyttö, kuten mitramysiini voi olla strategia, jolla lisätään tuumorin herkkyyttä sisplatiinia.

EPS8 on onkoproteiini edistää pahanlaatuisiin kasvainsoluihin [12], [19]. Se on substraatti epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja osallistuu EGFR signalointi kautta Rac, ja kaupan kautta Rab5 [20]. Sen tri-kompleksin suhteet

SOS1

ja

ABI1

on havaittu olevan olennainen osa lysofosfatidihappo stimuloiman solujen vaeltamiseen ja Rac aktivointia, jonka on todettu olevan tärkeä rooli munasarjasyöpä etäpesäkkeiden [21]. Tasot

EPS8

on myös toteutettu ennustetyövälineenä potilaille aikana alkuvaiheessa kohdunkaulan syövän [13]. Potilaat, joilla on korkeampi ilmentyminen

EPS8

taipumus kokea parametrial hyökkäystä, imusolmuke etäpesäke ja lasku eloonjääneitä.

Aluksi Yang et al. (2010), tutki mitramysiini, antibiootti päässä

Streptomyces

lajeja, mahdollisena estäjänä

EPS8

. Niin päätettiin mitramysiiniä vähentää mRNA ja proteiini tasoilla

EPS8

ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman epiteelisolujen linja ja ihmisen keuhkosyöpä epiteelisolujen linja. Lisäksi

eps8

downregulation kautta mitramysiini hoito, aiheuttaa merkittävän laskun syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike kyky [22].

mitramysiini on hyväksytty kliininen syöpälääkettä vuodesta 1970 [23] ja käytetään Yhdysvalloissa kliiniseen Pagetin tauti, kivesten karsinooma, ja hyperkalsemiaa, jos potilaalla pahanlaatuisuuteen liittyvää luuleesioita [24] – [28]. Kuitenkin sen käyttö terapiassa on vähentynyt vuosien saatossa, koska sen haittavaikutuksia ja kapea terapeuttinen indeksi [29]. Potilaita hoidettiin mitramysiini, näihin sairauksiin, on nähty kokea ruuansulatuskanavan, maksan, munuaisten ja luuytimen toksisuutta, jolloin pahoinvointi, oksentelu, ja verenvuoto [30]. Huolimatta vakavia sivuvaikutuksia, on ollut uutta kiinnostusta mitramysiiniä nyt, että ymmärrys sen vuorovaikutuksia molekyylitasolla kehittyy [29].

mitramysiini on todettu vuorovaikutuksessa GC-rikas DNA-alueet sijaitsevat pienessä urassa DNA [29], [31] – [33], joka on tällä hetkellä uskotaan estävän transkriptiotekijän spesifisyys proteiini 1 (SP1) sitoutumasta eri promoottorit proto-onkogeenien. Kuitenkin Sp1 sitoutumiskohtia, jotka eivät liity osajoukko esikasvaintekijöiden näyttävät säilyvät ennallaan, kuten promoottori p21

CIP1 /waf1 [29]. Siksi mitramy- välttämättä ole erityisiä SP1 esto ja saattaisi kohdistaa onkogeenin ylävirtaan SP1 vuorovaikutusta. Aiemmin on havaittu, että mitramysiini myös vähentää ilmentymistä

c-myc

,

c-myb

,

c-src

,

c-met

, ja FOXM1 [22], [34]; kuitenkin, mitramysiini lisää tasoja FOXO3A [34], joka on transkriptiotekijä, joka säätelee DNA-vaurioita vasteen. Voi olla mahdollista, että nämä geenit ovat yhteydessä toisiinsa in polun alavirtaan mitramysiini tavoite.

Esimerkiksi

EPS8

on myös todettu upregulate FOXM1 [35], joka on tärkeä tekijä kehittymistä ja etenemistä tiettyjen syöpien [36], jonka tiedetään suoraan sitoutua SP1 [37], [38]. SP1 FOXM1 on osoitettu transaktivoimaan edistäjille

c-myc

synergistisesti [38]. Lisäksi

EPS8

vaimennus on todettu vähentävän tasoa

Src

,

Shc

ja

FAK

(tunnetaan myös nimellä

PTK2

), solunsisäinen tyrosiinikinaasin osallistuvien solujen tarttumisen ja liikkuvuus [39]. FOXO3A voidaan myös säädellä läsnäolo tai puuttuminen

EPS8

läpi eri reittejä, joko PI3K /AKT /mTOR signalointi [40] kautta tai Ras-Raf-MEK-ERK-reitin [41]. Shiota et ai. (2010) tutkivat sisplatiinia kestävyys ja todennut, että sisplatiini resistenttien solujen tuli herkistyneet hoidon indusoimalla FOXO3A mukaan mitramysiiniä [34]. Väheneminen AKT signalointi aktivoi FOXO3A ja indusoi apoptoosin [36]; Näin ollen, on mahdollista, että vähentäminen

EPS8

tasoilla vähentää AKT, liipaisu fosforylaatiota FOXO3A ja syöpäsolujen apoptoosin sijaan jatkuvan leviämisen.

Kun yhteinen tarkastella kirjallisuudessa ja meidän tulokset näyttää mielenkiintoista, että keuhkosyövän solulinjaa, joka ei lisääntyä solukuolemaa kanssa mitramysiiniä (H1975) on EGFR-mutaatio. Keuhkotuumorisolulinjoissa linja H1975 on pistemutaatio aktivointi silmukka aiheuttaen muutoksen leusiinista arginiini (L858R) eksonissa 21 sekä toissijainen pistemutaatio, T790M, muuttamalla normaali EGFR toimintaa [42]. EGFR tyrosiinikinaasin estäjät käytetään tyypillisesti herkistää EGFR mutatoitu kasvaintyypeissä platinaa aineita, mutta EGFR villityypin kasvaimia harvoin vastauksena nämä inhibiittorit [43]. Mahdollisesti lisäämällä mitramysiiniä hoito voi olla hyötyä potilaille, joilla on villityypin EGFR tulla herkistyneet platina hoitoon estämällä

EPS8

ja loppupään tavoitteita, jotka olla suuri merkitys kasvaimen solujen lisääntymisen, tarttuvuus ja liikkuvuus . Mitramysiiniä annos riittävän suuri estämään tiettyjen onkogeenien mutta riittävän alhainen aiheuta ylimääräisiä haittavaikutuksia, antaisi kemoterapeuttisen aineen tehokkaammin aiheuttaa solujen kuoleman syöpäsoluja.

Yhteenvetona tuloksemme vahvistaa

ePS8

osallistuminen soluvastetta sisplatiinihoitoon. Vaikka testasimme mitramysiini, voi olla enemmän spesifisiä inhibiittoreita

EPS8

, että tuloksena on suurempi ero syöpäsoluja ja normaaleja soluja. Mitramysiiniä kyky pienentää tasoa

EPS8

aiheutti vähemmän apoptoottista aktiivisuutta LCL kuin sisplatiinin hoito yksinään. Alennettu ilmentyminen

EPS8

käsittelemällä mitramysiini on vähemmän haitallinen normaaleille soluille (mitattuna LCL) verrattuna syöpäsoluja. Yhdessä meidän data tarjoaa lisävahvistusta roolia ja merkitystä

EPS8

in sisplatiinin aiheuttamaa toksisuutta ja lupaavana tavoitteen määrittely sisplatiiniterapiaa.

tukeminen Information

Kuva S1.

välinen korrelaatio

EPS8

ekspressiotasot ja CEU LCL log muuttaneet eloonjäämisprosentteina (

P

= 0,047, r

2 = 0,05, ylhäällä) ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus (

P

= 0,499, r

2 = 0,006, alhaalla).

doi: 10,1371 /journal.pone.0082220.s001

(TIFF) B Kuva S2.

LCL on esitetty eri sisplatiinin kanssa läsnäollessa ja ilman mitramysiini. Neliön muotoinen edustaa sisplatiinia pitoisuudet, kun taas kolmion edustaa sisplatiini lisäämällä mitramysiini (0,01 uM). Käyrät edustavat kaksi erillistä koetta tehdään kolmena kappaleena standardin keskivirhe.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0082220.s002

(TIFF) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiitollisia Pharmacogenomics syöpälääkkeiden Cell Line Core yliopistossa Chicago apua tilaus- ja vastaanottaa näistä solulinjoista.