Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehitys Geneettisesti merkitty eläimen tuumoriksenografteja on alue meneillään oleva tutkimus mahdollistaa helpommin ja luotettavammin testaus syöpähoitojen. Geneettisesti merkittyjä kasvain malleissa on useita etuja perinteisiin kasvainmuodosta, mukaan lukien helppo pituus- seuranta hoitojen ja alennetun tarvittavien eläinten määrää kokeisiin. Useita erilaisia ​​menetelmiä on käytetty aiemmissa tutkimuksissa merkitä kasvaimia geneettisesti, mutta kaikilla on rajoituksia, kuten genotoksisuus ja muita esineitä, jotka liittyvät käyttö integroida virusvektoreita. Viime aikoina olemme tuotti episomaalisesti ylläpidetään-DNA (pDNA) lauseke, joka perustuu Telineiden /Matrix Attachment Region (S /MAR), joka sallii pitkän aikavälin lusiferaasin ilmentymistä hiiren maksassa. Tässä kuvaamme tarkemmin käyttö tämän pDNA vektorin ihmisen Ubiquitin C promoottori luomaan stabiilisti transfektoitu ihmisen hepatooma (Huh7) ja ihmisen haimakarsinooma- (MIA-PaCa2) solulinjat, jotka on annettu osaksi ”immuuni puutteellinen” hiirillä ja seurataan pitkittäin yli aika käyttämällä bioluminometer. Molemmat solulinjat paljasti kestävää episomaaliset pitkäaikainen lusiferaasiekspressio ja kasvaimen muodostumista osoittaa patologinen ominaisuudet maksasolusyövän (HCC) ja haiman karsinooma (PaCa), tässä järjestyksessä. Tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että pDNA vektori voi antaa jatkuvaa episomaalista lusiferaasin ilmentymistä eri hiiren kasvain malleja ja voidaan siten helposti käyttää seurata kasvaimen muodostumisen häiritsemättä solun genomiin.

Citation: Argyros O, Wong SP, Gowersin K, Harbottle RP (2012) geenimuunteluun syöpäsolut käyttäminen Non-Viral, episomaalista S /MAR Vektorit

In vivo

Kasvain Modelling. PLoS ONE 7 (10): e47920. doi: 10,1371 /journal.pone.0047920

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 20 syyskuu 2012; Julkaistu: 26 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Argyros et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitti Myrovlytis Trust. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi suurimmista terveysriskeistä kaikkialla maailmassa. Näin ollen on kasvava tarve kehittää uusia hoito- ja uusia edistysaskeleita eläinten kasvain mallintamiseen. Vaikka paljon edistystä tällä alalla, kehittäminen kliinisesti merkittäviä eläinmalleissa, jotka mahdollistavat nopean ja herkkä seuranta varhaisen kasvaimen kasvua ja myöhemmin etäpesäkkeiden edelleen käynnissä haaste [1].

Monet tavanomaiset eläin kasvainmuodoista käytetyt kehittämisessä syöpähoitoihin liittyy injektio ihmisen kasvainsoluja immuunipuolustus hiiriin [2], [3] sen jälkeen standardin calliper mittaukset arvioida kasvaimen koko, yleensä päätepiste mittaus, kun eläin on uhrattu. Nämä mallit ovat pieniä ja tutkimus on ollut käynnissä kehittää geneettisesti selvästi kasvain, joka mahdollistaisi ei-invasiivisia seuranta kasvain parametrien

in vivo

kuvantaminen perustuu valon emissiota lusiferaasi-ilmentävien solujen tai fluoresenssi mistä GFP-proteiinia ekspressoivien solujen [1]. Geneettisesti merkitty kasvainsolujen eläimen syövän mallissa on useita etuja. Ensisijaisesti se mahdollistaa yhden tehon seurantaan hoitointerventioiden kuten huumeiden, geeni tai soluterapian helpommin kuin perinteiset mallit. Se helpottaa seuranta kasvaimen parametrien, kuten koko ja kehitys sekä mahdollistaa erittäin herkkä visualisointi varhain etäpesäkkeitä ja arviointiin minimaalinen jäljellä taudin hoidon jälkeen [4]. Lisäksi se tekee mahdolliseksi käyttää peräkkäistä mittausta seurata kasvaimen koko hoidon aikana niin, että pitkittäistutkimuksissa voidaan suorittaa analysoida vaikutuksia hoitojen ajan antaa luotettavampaa tietoa ja vähentää koe-eläinten [5].

menneinä tutkimuksissa useita erilaisia ​​menetelmiä on käytetty antaa kasvainsoluja havaittavissa markkereita [1], [4], [6], [7], [8], [9]. Tehokkain tapa tuottaa geenejä soluihin on käyttää vektoreita, jotka ovat peräisin muokatut virukset [10]. Huolimatta eduista tämän geenin jakelujärjestelmä on myös merkittäviä rajoituksia, jotka liittyvät pääasiassa vektorin yhdentymisen soluun genomiin, mahdollinen immunogeenisuus virus koodaavat geenit sekä menetystä pitkäaikaisen ilmentymisen reportterigeenin. Olisi erittäin kiinnostava, siis kehittää ei-virusperäisen geenin jakelujärjestelmä, joka voi välittää pitkäaikainen reportterigeeniekspressiota eläimen kasvaimen malli. Tehokas tapa saavuttaa tämä tavoite on käyttää plasmidi-DNA (pDNA) lauseke, joka voidaan ylläpitää toiminnallisena, episomaalisena kokonaisuus kun se on toimitettu tuumoriverisuonien malli ja antaa heille hyvän havaittavia määriä markkerigeenin ilmentymisen koko niiden eliniän [11].

Edellinen

in vivo

tutkimuksia pDNA vektoreita ovat osoittaneet, että viruksen promoottorit, kuten sytomegalovirus (CMV) promoottori pystyy tarjoamaan korkeimman transgeeniekspression aluksi [12], [13], mutta on seurannut myöhemmin lasku ilmaisun kahden kuukauden kuluessa [14]. Tämä lasku ilmaisu on promoottori riippuvia ja todennäköisesti seurausta transkription hiljentäminen promoottorin [15]. Todellakin, CpG metylaatio CMV-promoottorin eri plasmidivektoreissa on todettu olevan kielteinen vaikutus ilmentymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

[11], [16], [ ,,,0],17].

Äskettäin me ja muut ovat osoittaneet, että pDNA vektori, joka käsittää yhdistelmän nisäkkään kudosspesifisiä promoottori, jossa on ydin- Telineiden /matriisikiinnitysalueet alue (S /MAR) elementti voi edistää pitkän aikavälin episomaalista ilme

in vitro

ja

in vivo

[11], [18], [19], [20], [21]. S /MAR elementti tarjoaa erityisen yhdistys vektorin kanssa ydin- matriisin kautta telinekiinnitysalueet tekijä-A (SAF-A), kiinniottamiseksi vektorin kromosomin telineen mitoosin aikana ja tuo plasmidi läheiseen kosketukseen solun replikointi koneet, siksi luodaan mitoosi vakautta ja ylläpitää plasmidia epigeneettisestä kokonaisuutena satoja solunjakautumisten [22], [23], [24], [25], [26]. S /MAR elementti on osoitettu olevan suojaava vaikutus metylaatioherkät sivustoja α1-antitrypsiini (AAT) maksa-promoottori [11], mutta ei ole sellaista vaikutusta CMV-promoottorin, korostaen, että nisäkkään sijaan viruksen promoottori soveltuu paremmin pitkän aikavälin ilmentymistä vektorin kanssa.

S /MAR-sisälsi plasmidin on kehitetty hakemuksen maksassa käyttö maksan-promoottori, AAT, ja on osoitettu säilyvän ja ilmaista Lusiferaasisiirtogeenin episomaalisesti yli 6 kuukautta hepatosyyteissä [11]. Kun pitkän aikavälin ilmentymistä näiden episomaalisesti ylläpitää plasmideja, S /MAR pohjaisen vektorin yhdessä nisäkkään promoottori näyttäisi olevan ihanteellinen käytettäväksi geneettinen merkki kasvainsoluja.

Plasmidit, jotka sisältävät S /MAR-sekvenssin ja CMV-promoottorin on aiemmin onnistuneesti transfektoida CHO [18], [23], [25], HaCat [23], HeLa [27], K562 leukemia-solut, U251 gliooma [20] ja primaarifibroblastin [28] ja on osoitettu jäljitellä ja säilytettäisiin kromosomin episomit.

tässä kuvattuihin näyttää, ensimmäistä kertaa, että käytetään episomaalisesti yllä, pUbC-S /MAR plasmidi, välittävät pysyviä lusiferaasin ilmentymistä tuottaa geneettisesti leimatun kasvainsolulinjojen jotka aiheuttavat erilaisia ​​syöpiä sovellettuna

in vivo

. Käytetyt solulinjat ovat ihmisen maksasyövän cell-line Huh7, joka on peräisin potilaasta, jolla maksasyövän ja ihmisen haimakarsinooma cell-line, MIA-PaCa2.

Tulokset

Generation stabiilisti transfektoitujen Kasvaimen Cell Lines käyttäen pUbC-S /MAR Plasmidi

aiempien

in vitro

-tutkimukset S /MAR vektoreita, pyrittiin soveltamaan tätä kokemusta luoda useita eri vakaasti kasvainsolulinjoja varten sukupolven eri kasvainmuodossa, jossa voidaan seurata

in vivo

bioluminesenssin kuvantamismenetelmiä. Plasmidi, joka sisältää S /MAR-elementin yhdessä nisäkkään UbC promoottori (pUbC-S /MAR), ajo Lusiferaasisiirtogeenin käytettiin tässä tutkimuksessa (kuvio 1A). Kaikkialla läsnä oleva UbC promoottori on sovellettu siten, että samassa vektorissa voidaan käyttää ohjaamaan Lusiferaasisiirtogeenin eri solulinjoissa.

EN) pUbC-S /MAR plasmidia käytetään tässä tutkimuksessa, jossa lusife- ekspressiota ohjaa ihmisen UbC promoottori. B) Huh7, ja MIA-PaCa2 solut transfektoitiin pUbC-S /MAR ja kasvatettu valinta G418 noin kaksi viikkoa. Kolme yksittäistä pesäkettä eristettiin ja laajennettiin ulos valinnan säännöllisesti kuvantamisen avulla Xenogen bioimager. C) Southern blot kokonais-DNA eristettiin kolmesta yksittäisistä pesäkkeistä kullekin solulinjan 45 vuorokautta transfektion. Kaistat 1-3: Huh7 eristetty pesäkkeitä; Kaistat 4-6 MIA-PaCa2 eristetyt pesäkkeet; (+): Positiivinen kontrolli, 10 ng bakteeri-pUbC-S /MAR plasmidi. D) lusiferaasin bioluminisenssimääritys (kahtena kappaleena) on yhä enemmän Huh7 ja MIA-PaCa2 soluja, jotka osoittavat rajat signaali (lusiferaasi) havaitseminen,

in vitro

. E-F) Plasmidi pelastuskokeiden kolmesta

E.coli

pesäkkeitä Huh7 (kaistat 1-3) ja neljä pesäkkeitä varten MIA-PaCa2 solulinjoissa (kaistat 4-7), joka osoittaa identtinen restriktioreaktio puhtaalla pUbC -S /MAR plasmidi (+), seuraavat pilkkomisesta

Spel

I entsyymi. (-) Negatiivinen kontrolli (ei DNA: ta); M: 1 kbp: n tikkaat (Hyperladder I, Bioline).

MIA-PaCa2 ja Huh7-solut transfektoitiin pUbC-S /MAR vektorin ja kasvatettiin kaksi viikkoa, kun läsnä oli G418: aa ( 1 mg /ml). Tämän jälkeen solut muodostivat erillisiä pesäkkeitä ja lusiferaasiekspressio varmistettiin Bioluminoivan Imager (kuvio 1 B, yläpaneeli). Kolme yksittäistä siirtogeenin ilmentävien pesäkkeiden kunkin solulinjojen (Huh7 ja MIA-PaCa2) eristettiin, ja sen jälkeen viljeltiin ilman antibioottiselektiota (kuvio 1 B, keskimmäinen ruutu). Lusiferaasi siirtogeenin osoitettiin molemmissa solulinjoissa osoittaa onnistuneen stabiili transfektio pUbC-S /MAR plasmidi. Soluja viljeltiin edelleen ilman selektiopainetta toisen kuukauden (kuvio 1B alapaneeli). Tällä 45 päivää transfektion jälkeen genominen DNA uutettiin kaikista kolmesta pesäkkeitä kustakin solulinjasta vahvistaa episomaaliseen ylläpitoon pDNA. Southern blot suoritettiin (kuvio 1C), joka joka tapauksessa esiintyi yksi vyöhyke tarkkaa kokoa pUbC-S /MAR (8198 bps) kunkin pesäkkeet molemmissa solulinjoissa. Lopuksi suoritettiin lusiferaasin bioluminenssina määrityksiä kasvavia määriä soluja, jotta suora kvantitatiivisia tuloksia geenien ilmentymisen vertailuun. Tulokset on esitetty kuviossa 1D, jossa raja-signaalin havaitseminen oli välillä 500-5000 solua Huh7-soluja ja välillä 250-2500 solua MIA-PaCa2.

Muita todisteita episomaalista huoltoa saatiin plasmidi pelastus pUbC-S /MAR alkaen kanamysiiniresistentte

E. coli

bakteerien transformaation jälkeen kokonais-DNA kustakin pesäkkeitä kahdessa solulinjassa. Tässä tapauksessa vain ehjä free-plasmidi-DNA: n tuottamiseksi bakteeri- pesäkkeet maljoilla, jotka sisälsivät kanamysiiniä, että on resistenssimarkkeri läsnä pUbC-S /MAR plasmidi. Rajoitus kuviot pDNA valittujen pesäkkeiden olivat yhtäpitäviä muunneltua integroitumattomia plasmidikonstrukteja sekä Huh7 ja MIA-PaCa2 solulinjoissa (kuvio 1E ja 1F).

pysyvästi transfektoitu Huh7 ja MIA-PaCa2 Cell linjat muodostavat Kasvaimet

in vivo

säilyttämään samalla korkeatasoinen transgeeniekspression 35 päivää injektion jälkeen

Solut kummastakin syntyy stabiilisti transfektoituja solulinjoja (MIA-PaCa2 ja Huh7) on erikseen hallinnoi vatsaonteloon ryhmille hiiriä (n = 4). Hiiret kuvattiin 24 tuntia injektion jälkeen ja lusiferaasin ilmentyminen havaittiin molemmissa ryhmissä injektoitiin hiiriin (kuvio 2A). Huomasimme, että kaikki neljä hiirtä injektoitiin MIA-PaCa2 solut ilmensivät lusiferaasin koko seurannan ajan ja muodostunut kasvaimia, kun taas kolme neljästä hiiriä ruiskutettiin Huh7 solut ilmensivät lusiferaasi ja yksi hiiri ei ollut alkuperäisen lusiferaasiekspressio, johtunee kyvyttömyys solut sijoittautua uuteen ympäristöön, vaikka tämä jää epäselväksi. Kuitenkin lusiferaasiekspression seurattiin molemmissa ryhmissä hiirten ssa yhteensä 35 päivän viikoittain kuvantamiseen. Bioluminescent kuvantaminen kuvia edustavan hiiren aika kunkin solulinjan on esitetty kuviossa 2A. Ilmentymisen taso nousi jyrkästi 21 päivää solujen toimitus (kuvio 2C). Ei lusiferaasin ekspressiota havaittiin ohjaus verrokkeihin (tuloksia ei esitetty), jossa taustan taso valoemission oli 5 x 10

5 fotoneja /sec /cm

2 /sr.

A) ryhmä neljä hiirtä kutakin solulinjaa injektoitiin intraperitoneaalisesti 3 x 10

6 Huh7 tai MIA-PaCa2 pysyvästi transfektoitujen solujen pUbC-S /MAR ja visualisoida ajan (päivästä lähtien injektion jälkeen) ja bioluminenssina käyttäen Xenogen bioimager, seuraavat injektiot 15 mg /ml D-lusiferiini, yksi minuutti hankinta-aikaa. Yksi edustaja hiiri kutakin solulinjaa on esitetty päivinä 7, 21 ja 35. B) 35 päivän kuluttua injektion Huh7 ja MIA-PaCa2 pistetään hiiret tapettiin ja leikattiin etsimään todisteita kasvaimen kasvua. Ei kasvua oli selvää ulkoisilta eläimen tutkimus, mutta se avataan massa havaittiin vatsaonteloon (Huh7 käsitelty hiiri esitetty esimerkkinä). Eläin kuvattiin varten bioluminenssina ennen ja jälkeen kasvaimen poiston. Intensiteetti lusiferaasiekspression näkyy hiiren: punainen edustaa voimakas ilmentyminen, violetti edustaa heikkoa ilmentymistä. Väripalkkia havainnollistaa suhteellista signaalin voimakkuutta. (C) graafinen esitys pitkän aikavälin lusiferaasin ilmentyminen NOD-SCID-hiiriä, joihin injektoitiin joko Huh7 tai MIA-PaCa2 stabiileja solulinjoja (n = 3 Huh7 ja n = 4 MIA-PaCa2). Luciferase määritysrajan ilmaistaan, kun fotonit /sec /cm

2 /sr ja piirrettiin (+/- SD). Taustataso valon emission ei-käsiteltyjen eläinten on 5 x 10

5 fotoneja /sec /cm

2 /sr.

Koska kasvu lusiferaasin ilmentymistä 35 vuorokautta -administration soluista, olimme vakuuttuneita siitä, että kasvain on peräisin injektoitu soluja oli muodostunut. Hiiret siis uhrattiin 35 päivää ja leikeltiin etsimään todisteita kasvaimen muodostumisen. Kun ulkoisesti ei ollut havaittavissa kasvua, suuri massa havaittiin vatsaonteloon, kun eläin leikellään. Edustaja kuva kasvaimen massan hoidetun eläimen Huh7-soluissa on esitetty kuviossa 2B. Kuvantaminen hiiret ennen ja poistamisen jälkeen kasvaimen vahvisti, että lusiferaasin ilmentymistä paikallistettiin kasvaimen massa (kuvio 2B).

histologinen analyysi Muodostuu Kasvaimet

hematoksyliini ja eosiini värjättiin kudosleikkeet suoritettiin tunnistaa kasvainhistologiaa peräisin kustakin solulinjasta. Kuvio 3 esittää histologisia osat kasvainten muodostettu Huh7-soluja. Histologia vahvistaa, että kasvain on maksasolusyövän (HCC) vaihtelevalla erilaistumisen (Kuva 3A-D). Kasvain muodostuu monikulmion solujen jaetaan irralliset arkit ja pseudoglandular kuvioita. Ytimet olivat kohtalaisen pleomorphic, vesicular ja sisältävät nucleolus. Muutamia yksittäisiä mitoosi lukuja myös merkille. Solulima oli eosinofiilinen ja solun rajojen olivat hyvin määritelty, kun strooman oli niukka. Solun sisäinen ja ulkoinen sapen pisarat ei havaittu kasvain eikä myöskään tuumorinekroosi. Piirteet kasvain varmistettiin riippumaton histopathologist olevan yhdenmukainen Grade II HCC (muokattu Edmonson ja Steinerin pisteytysjärjestelmä).

Osiot eri puolilla kaksi kasvaimia leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histologista analyysiä kasvaimia. A-D) Palasia Huh7 ruiskutetaan hiiriin. Osiot on amorfinen rakenne ja tunnistettiin maksasolusyövän (HCC) eriasteisia erilaistumista: (A) Kohtuullisen eriytetty HCC, suurennus × 10 (B-C) §: ssä analysoitiin immunohistokemiallisesti näyttää jakeluun lusiferaasiekspression. Ruskea värjäys osoittaa lusiferaasin positiivisia soluja. (B) Positiivisesti värjätään, Suurennus × 40 (C) Positiivisesti värjätään, Suurennus x 10 (D) Negatiivinen kontrolli: ei ensisijainen vasta-ainetta lisätään, suurennus × 10 E-H) Palasia MIA-PaCa2 injektoidaan hiiriin. Osiot on amorfinen rakenne ja tunnistettiin Haiman karsinooma (PaCa) eriasteisia erilaistumista. (E) Kohtuullisen eriytetty PaCa, suurennus × 10 (F-G) Osiot analysoitiin immunohistokemiallisesti näyttää jakeluun lusiferaasiekspression. Ruskea värjäys osoittaa lusiferaasin positiivisia soluja. (F) Positiivisesti värjätään, suurennus × 40 (G) Positiivisesti värjätään, Suurennus x 10 (H) Negatiivinen kontrolli: ei ensisijainen vasta-ainetta lisätään, suurennus x 10.

Lisäksi lusiferaasin immunohistokemiallinen analyysi tuumorisektioiden (kuvio 3B ja 3C) osoitti kaikki maksasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat peräisin ruiskutetaan solujen ilmentävät lusiferaasia. Unstained alueet uskotaan olevan joko nekroottista kudosta tai soluja rekrytoidaan kasvain, joka ei ole vielä vahvistettu kokeellisesti ja on tällä hetkellä tutkittavana.

Samoin hemotoksyliini- ja eosiini värjätään kudosleikkeiden saatiin kasvaimet muodostunut hiirillä injektion jälkeen MIA-PaCa2 soluissa (kuvio 3E-H). Tässä tapauksessa, histologinen ilmeni, että muodostettu kasvainsolut oli tunkeutunut välillä normaalin haiman rauhasrakkuloissa kehällä kasvain. Kasvain solut kuvattiin jaettavien kiinteässä arkkia mitään todisteita rauhas eriyttäminen ja on kohtalainen määrä solulimassa kanssa hyvin määritelty solun reunoja. Ytimet olivat epätyypillisiä ja hyperchromatic samalla nucleoli oli huomaamaton. Mitoosi luvut olivat harvinaisia. Suurin osa kasvainsolujen sisälsi vaalean intrasytoplasmista rakkula työntää tumasta kehän aikuiselämään sinettisormus ulkonäkö. Solunulkoisen liman ja strooman fibroosia ei havaittu. Riippumaton histopathologist vahvisti kaikki ominaisuudet kasvain oli sopusoinnussa sinettisormus syöpä haima.

Euroopan pUbC-S /MAR Plasmidi on episomaalisesti huollettu ja ilmaistaan ​​Tuloksena kasvainten kudoksia

tarjoavat fyysisiä todisteita molekyyli- luonteesta pUbC-S /MAR plasmidin HCC ja haiman kasvaimet, suoritimme Southern blot-analyysi kokonais-DNA eristettiin kahdesta eri sivustoja saman kasvaimen 35 päivän kuluttua toimituksen joko Huh7 tai MIA-PaCa2 solulinjassa.

edustava blot on esitetty kuviossa 4A, missä yksittäinen bändi odotetun koon havaittiin kaikissa kaistoilla. Tämä osoittaa, että pUbC-S /MAR pDNA jäädä episomaaliseksi 35 päivän kuluttua toimituksen. Lisätodisteita episomaalista ylläpitoa saatiin myös plasmidi pelastaminen pUbC-S /MAR plasmidi eristettiin kanamysiiniresistenteistä

E. coli

transformaation jälkeen koko DNA: n kasvain peräisin Huh7 tai MIA-PaCa2 hoidetuissa hiirissä. Tässä tapauksessa ainoastaan ​​ehjät vapaa pDNA eristetyistä kasvaimen näyte tuottaisi bakteeripesäkkeet maljoilla, jotka sisälsivät kanamysiiniä, vastus merkki läsnä plasmidissa. Rajoittaminen kuviot pUbC-S /MAR plasmidi olivat yhdenmukaisia ​​modifioimattoman ei-integroitu plasmidikonstrukteja (esitetty kuviossa 4E).

(A) Southern blot-analyysi pDNA eristetty kahdesta eri alueiden tuumorikudosta NOD /SCID-hiiriin, 35 päivää post-toimitus Huh7 ja MIA-PaCa2 stabiileja solulinjoja, suoritettiin kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä. Edustava hybridisaatio mallia pDNA eristetty eläimestä kustakin kasvain on esitetty. Detection of indikaattorin plasmidista M: 1 kbp tikkaat (Hyperladder I, Bioline); kaista 1: pUbC-S /MAR eristetty kasvainkudoksen jälkeen muodostunut Huh7 injektion NOD /SCID-hiiriin 35 päivää injektion jälkeen; kaista 2: pUbC-S /MAR eristettiin eri alueella kasvainkudoksen jälkeen muodostettu Huh7 toimittamisen NOD /SCID-hiiriin 35 päivää injektion; kaista 3 pUbC-S /MAR eristetty kasvainkudoksen jälkeen muodostettu MIA-PaCa2 injektion NOD /SCID-hiiriin 35 päivää injektion jälkeen; kaista 4: pUbC-S /MAR eristettiin eri alueella kasvainkudoksen jälkeen muodostettu MIA-PaCa2 toimittamisen NOD /SCID-hiiriin 35 päivää injektion; (+) Positiivinen kontrolli: 25 ng: n kanssa linearisoitua pUbC-S /MAR plasmidi. (B) Replication-riippuvainen määritys pUbC-S /MAR plasmidi-DNA eristettiin kasvaimia hiirissä 35 päivää annon jälkeen. kaistat 1-3: Southern blot koko kasvaimen DNA eristettiin NOD /SCID-hiiriin 35 päivän kuluttua toimitusta Huh7 vakaan solulinjan ja kaksinkertainen pilkottiin

Spe

I-

Mbo

I ( kaista 1),

Spe

I-

Dpn

I (kaista 2) tai

Spe

I-

BFU

CI (kaista 3) entsyymit; kaistat 7-9: Southern koko kasvaimen DNA eristettiin NOD /SCID-hiiriin 35 päivän kuluttua toimitusta MIA-PaCa2 vakaa solulinjasta ja kaksinkertainen pilkottiin

Spe

I-

Mbo

I (kaista 4),

Spe

I-

Dpn

I (kaista 5) tai

Spe

I-

BFU

CI (kaista 6) entsyymit; M: 1 kbp tikkaat (Hyperladder I, Bioline UK Ltd., London, UK). (C) Kvantitatiivinen PCR suoritettiin kasvaimen DNA saatu päivänä 35 injektion jälkeen Huh7 ja MIA-PaCa2 solulinjoissa. DNA uutettiin kahdessa eri kunkin kasvaimen lopussa kokeen ja määrä pUbC-S /MAR vektorin genomeja per diploidinen genomi on esitetty, sen jälkeen, kun normalisoinnin GAPDH-geenin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. (D) PCR-analyysi DNA eristettiin

in vitro

päässä Huh7 (kaista 1) ja MIA-PaCa2 (kaista 4) soluja ennen injektointia NOD /SCID-hiiriin, ja

in vivo myynnissä maassa kaksi eri alueilla kasvain kunkin solulinjan (kaistat 2,3 varten Huh7 ja kaistat 5,6 varten MIA-PaCa2 solulinjoilla). Odotettu PCR-tuotteen koko: 1091 bp. 100 emäsparin DNA-ladder (kaista M), (+) positiivinen kontrolli: pUbC-S /MAR; (-) Negatiivinen kontrolli: PCR-seos ilman DNA: ta. (E) Plasmid pelastuskokeiden neljä

E.coli

pesäkkeitä Huh7 (kaistat 1-4) ja kolme pesäkkeitä varten MIA-PaCa2 solulinjoissa (kaistat 5-7), joka osoittaa identtinen restriktioreaktio puhtaalla pUbC- S /MAR plasmidi (+), seuraavat pilkkomisesta

Spel

I entsyymi. M: 1 kbp tikkaat (Hyperladder I, Bioline).

Lisäksi teimme replikointi riippuvainen rajoitus määritys näyttämään pDNA lisääntymään. Yhteensä kasvaimen DNA kahta eri joko HCC tai PaCa kasvain, eristettiin eläinryhmät käsiteltiin pUbC-S /MAR plasmidi lopussa on 35 päivää kokeen ja pilkottiin

Spe

I, yksi leikkuri, linearisoida plasmidi, ennen edelleen pilkkomalla yön yli metylaatioherkkien entsyymien

Dpn

I,

Mbo

I tai

BFU

CI. Kaikki kolme entsyymit tunnistavat samassa järjestyksessä (GATC).

Dpn

I edellyttää metylaatio kohde-DNA bakteerien solujen hajotus, kun taas

Mbo

I rajoitus on riippuvainen nisäkkään DNA: n metylaation ja

BFU

Cl leikkauksia riippumatta metylaatiostatuksen ja ei eroteta lähde metylaation.

restriktiodigestiolla fragmentit erotettiin 0,8% agaroosigeelillä, sitten blotattiin ja koettimena 408 bp: n fragmentti kanamysiiniresistenssigeenillä. Southern blot-analyysi (kuva 4B) palvelee verrata ruoansulatusta mallia pUbC-S /MAR kasvaimen DNA eristetään Huh7 hoidetusta eläimestä ryhmässä (kuva 4B kaistat 1-3) että siitä MIA-PaCa2 ryhmä (kuva 4B kaistat 4-6).

tappio bakteeri metylaatio pUbC-S /MAR plasmidi löytyy DNA eristetty sekä kasvaimia kun niitä pilkotaan

Spel

I /

Mbo

I tai

Spel

I /

Dpn

I, vastaavasti (kaistat 1,2,4,5). Onnistunut ruoansulatus

Mbo

I osoittaa konversion lineaarisen

Spel

I yhtyeen pilkkoutumisfragmentteihin (kaista 1 Huh7 ja kaista 4 MIA-PaCa2), ja puute ruoansulatus

Dpn

I lähtee single

Spel

linearisoitu bändi ehjänä (kaista 2 Huh7 ja kaista 5 MIA-PaCa2). Kuten

Mbo

en vain leikkaa nisäkkäistä peräisin DNA, kun taas

Dpn

I edellyttää bakteeri- metylaatio ruoansulatukseen, tämä osoittaa, että pUbC-S /MAR plasmidi on toistettu kasvainsoluissa sekä HCC ja PaCa. Lopuksi digestio

Spe

I-

BFU

CI ei estänyt minkäänlaista metylaation ja toimii positiivisena kontrollina plasmidi ruoansulatus (kaistat 3 ja 6). Nämä tiedot osoittavat, että S /MAR-plasmidin pUbC-S /MAR kykenee replikoitumaan

in vivo

toimituksen jälkeen stabiilisti transfektoitujen solulinjojen, samanlainen tutkimukset

in vitro

jossa S /MAR-omistetun pDNA kykenee saavuttamaan mitoottisiin vakauden ja replikointi [26]. Oikeaa kokoa restriktiodigestiota bändejä ehdottaa mitoosi vakautta ilman merkittävää uudelleenjärjestelyjä replikoituvan plasmidin.

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin päättymisen kokeen (35 vuorokauden kuluttua toimituksen) vertaamaan suhteellisen kopioluvun plasmidin molekyylien Huh7 ja MIA-PaCa2 käsitellyissä ryhmissä. Tulokset on esitetty kuviossa 4C, jossa molemmissa tapauksissa plasmidin kopioluku on laskettu olevan noin yhdestä vektorifontteja kopiota /solu, aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä osoittaa suhteellisen alhaisen kopioluvun S /MAR vektori on vähemmän kuin 10 kopiota /solu [18], [25], [29].

lisäksi ylläpito siirtogeenisten markkerigeenin näkyi myös PCR-analyysillä DNA eristetään ”viljellyt” ​​MIA-PaCa2 ja Huh7 soluja (kuvio 4D , kaistat 1 ja 4) ja kahdesta eri sivustoja kasvainkudoksen 35 päivää synnytyksen jälkeen (kuvio 4D, kaistat 2,3 ja Huh7 ja kaistat 5,6 MIA-PaCa2). PCR-tuote on odotettu koko, 1091 bps, muodostettiin DNA: sta kaikista lähteistä joka ilmaisee, että pUbC-S /MAR plasmidi säilytetään sekä Huh7 ja MIA-PaCa2 solujen ja kasvaimen koko peräisin näistä soluista sen jälkeen, kun ruiskutus NOD -SCID-hiirissä. Tämä vahvistaa läsnäolo pUbC-S /MAR plasmidin molemmat

in vitro

ja

in vivo.

Keskustelu

Tämä työ edustaa kehitystä kasvainten hiirimallissa peräisin kahdesta eri solulinjoista. On merkittävää, tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa perustamisen geneettisesti merkitty hiiren malleja haiman ja hepatosellulaarikarsinoomien käyttämällä ei-virus- episomaalisessa plasmidivektori. Sekä HCC ja PaCa on korkea ilmaantuvuus; HCC on viides yleisin syöpä maailmassa ja muodostaa 80-90% ensisijainen maksasyövän [30], kun on noin 42470 yksilöitä haimasyöpä vuosittain Yhdysvalloissa alle 20% yksi- vuoden pysyvyys [31].

Koska esiintyvyys näiden sairauksien, on tärkeää, että tehokas tapa kehittää parantaa taudin havaitsemista ja ennusteen. Sukupolvi tehokkaan geneettisesti merkitty hiiren kasvain malli HCC ja PaCa on tärkeä askel tässä prosessissa, sillä se mahdollistaa vaikutuksia mahdollisten terapeuttisten olla helposti ja tarkasti seurataan ja antaa näin ollen luotettavampia tietoja kehitettäessä uusia syöpälääkkeiden.

Yritykset tuottaa geneettisesti merkitty kasvaimia aiemmin ollut rajoituksia, kuten riski integrointi virusvektoreita ja mahdollisten insertiomutageneesiin. Lisäksi genotoksisuuden virusvektoreita voi merkittävästi muuttaa ominaisuuksia sen vastaanottajan solujen ja myöhemmin tytär soluja. Kun luodaan tuumoriksenografteja, sitä vähemmän muutoksia, jotka alkuperäiseen kasvainsoluihin parempi edustus syöpä mallin. Siksi kehittäminen ei-virusvektoreita syöpätutkimuksessa minimoida nämä haittavaikutukset ovat ratkaisevia. Meidän edellinen työ on osoittanut jatkuvaa vahvaa episomaalista lusiferaasiekspressio

in vivo

, mistä pDNA ilmaus, joka käsittää S /MAR elementti ja nisäkkään promoottori hiiren maksassa [11], [20], [21]. Seuranta on Lusiferaasisiirtogeenin ajan yksittäisessä eläimessä ilman lopettamalla eläimet osoittaa hyödyllisyyttä tämän vektorin geneettisesti selvästi kasvainsolujen seurata kehitystä kasvaimen mallin yksinkertaisesti

in vivo

kuvantamiseen. Kuten kuvassa, S /MAR vektori mahdollistaa vakaan transfektio syöpäsolujen ja myöhemmän kehityksen HCC ja PaCa tuumoriksenografteissa. Tässä asiakirjassa kuvataan ensimmäinen osoitus toiminnallisen käytön S /MAR vektori pysyvästi transfektoida syöpäsolujen geneettisesti merkitä kasvaimet

in vivo

.

Aikaisemmat tutkimukset

in vitro

ovat osoittaneet, että S /MAR vektorit voivat replikoitua episomaalisesti riippumatta käytetty promoottori. Vahvistamme ja laajentaa tämän havainnon käyttäen pUbC-S /MAR vektorin Huh7 ja MIA-PaCa2 solulinjoissa. Olemme saaneet samanlaisia ​​tuloksia käyttämällä PEPI-Luc vektori – S /MAR-plasmidi, jossa lusiferaasin ilmentymistä ohjaa ihmisen CMV-promoottorin (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin aikaisemmassa tutkimuksessa merkitä kasvainsolujen geneettisesti kanssa lusiferaasin siirtogeenin, jota ohjaa CMV-promoottori [4] on osoittanut, että rajoitukset tämän promoottorin pitkän aikavälin ilmentymistä, koska CMV-promoottorin on helposti inaktivoi useita isäntä mekanismeja, kuten CpG-metylaation [11], [14], [15], [16], [17]. Tämä rajoitus on voitettu meidän tutkimuksessa, mikä osoittaa kestävää ilmentyminen nisäkkään UbC promoottori yhdistettynä S /MAR elementti. Differential perustaminen solut voivat selittää erot lusiferaasiekspressio välillä nähdään kunkin ryhmän eläinten antamisen jälkeen.

histopatologia analyysi kasvaimia osoitti tyypillinen kudosmorfologia odotetaan PaCa ja HCC (kuva 3) ja immunohistokemiallinen analyysi osoitti kaikki kasvainsolut, jotka ovat peräisin niitä ruiskutetaan hiiren olla lusiferaasi positiivinen (kuvio 3). Kun otetaan huomioon tämä ja pitkän aikavälin ilmentymistä saavutettiin 35 päivää injektion jossa kasvaa jyrkästi ilmentymistä havaitaan 21 päivän jälkeen (kuvio 2C), tämän S /MAR vektori näyttää erinomaisesti käytettäväksi syövän solulinjoissa tuottaa geneettisesti merkitty hiirimallissa tätä tautia.