Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonideasetylaasi (HDAC) estäjät pidättää syöpäsolujen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin alhainen myrkyllisyys siten muodostaa lupaava hoitoa syöpään. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet antituumorivaikutuksen keuhkosyövän solujen uuden syklisen amidin, joissa hydroksaamihappo- perustuu HDAC-inhibiittorit SL142 ja SL325. A549 ja H441 keuhkosyövän soluja sekä SL142 ja SL325 aiheuttama lisää solujen kasvun esto ja solukuolema kuin hydroksaamihappo–pohjainen HDAC estäjä suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA). Lisäksi yhdistelmä hoitoon käytetään retinoidi huumeita ATRA tai

9-cis

RA yhdessä SL142 tai SL325 merkittävästi indusoi enemmän apoptoosin ja tukahdutetaan pesäkkeiden muodostumista kuin kertakäyttöinen kummankaan. Ilmaus retinoiinihapporeseptoreihin RARa, RARβ, RXRa ja RXRβ pysyivät muuttumattomina hoidon kanssa. Kuitenkin lusiferaasireport- konstruktio (pGL4. RARE 7x), joka sisältää seitsemän tandem retinoidihappoa vastaava elementti (RARE) synnyttivät merkittäviä transkriptionaalinen aktiivisuus yhdistämisen jälkeen hoidossa retinoiinihapon hapot ja SL142 tai SL325 in H441 keuhkosyövän soluja. Lisäksi apoptoosin edistämisessä Bax ilmaisun ja kaspaasi-3-aktiivisuus lisääntyi yhdistämisen jälkeen hoidon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoidon SL142 tai SL325 kanssa retinoiinihapon happojen kykenee merkittävää tuumorin vastaista aktiivisuutta ja se on lupaava terapeuttinen ehdokas hoitoon ihmisen keuhkosyöpä.

Citation: Han S, Fukazawa T, Yamatsuji T, Matsuoka J, Miyachi H, Maeda Y, et ai. (2010) antituumorivaikutus in Human Lung Cancer yhdistelmä hoito Novel histonideasetylaasin estäjät: SL142 tai SL325 ja Retinoic Hapot. PLoS ONE 5 (11): e13834. doi: 10,1371 /journal.pone.0013834

Editor: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Saksa

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 11 lokakuu 2010; Julkaistu 4 marraskuuta 2010

Copyright: © 2010 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki : Opetusministeriö, tiede- ja kulttuuri, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

histonideasetylaasi (HDAC) ja histoni liasetyylitransferaasi (HAT) osallistuvat yhteistyössä sääntely chromatin remontin ja toiminnallisen geenien transkription säätelystä [1]. HDAC säädellä erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [2]. On olemassa useita raportteja, jotka muuttuneessa HAT tai HDAC liittyy erilaisiin syöpiin [3], [4], [5], [6]. Useita pienimolekyylisiä HDAC-inhibiittoreita on kehitetty syöpälääkkeet. Itse asiassa, HDAC-inhibiittorit osoitettiin indusoivan solusyklin pysähtymiseen, erilaistumista ja apoptoosia erilaisia ​​pahanlaatuisia soluja. HDAC-inhibiittorit lisäävät asetylointi histonien ja transkriptiotekijöiden, joka voi kääntää geenien mikä helpottaa geenin ilmentymistä [7]. Nämä vaikutukset välittyvät osittain valikoiva muutoksen geenin ilmentymisen, kuten induktio p21waf ilmaisun [8]. Kuitenkin, etteivät kaikki geenejä säädellään ylöspäin käsittelemällä HDAC-inhibiittorit, ja suhde ajan säänneltyjen alas geenien on todettu olevan lähellä 01:01 [9].

Keuhkosyöpä on johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti [7]. Kaksi tärkeintä keuhkosyöpään ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). Hoitotuloksia kehittynyt NSCLC käyttämällä kemoterapia-aineiden ovat tuottaneet pettymyksen. On selvää, lisätutkimuksia tarvitaan kiireellisesti hoitoon kehittynyt NSCLC. Uusia hoitomuotoja, uudet vaikutusmekanismit, mukaan lukien aineet, jotka kohdistuvat angiogeneesiä ja säätelyyn geenin ilmentymisen retinoiinihapon hapot on tutkittu [10], [11], [12], [13]. Ilman ligandia, retinoiinihapon hapot reseptorit toimivat transkriptiorepresso- johtuen sitoutumisen corepressor komplekseja, jotka sisältävät histonideasetylaaseja (HDAC). Ligandin sitoutuminen vapauttaa näiden samanaikaisesti repressors ja rekrytoi koaktivaattoria komplekseja, joka voisi tuottaa histoni acetylase toimintaa [13], [14]. On raportoitu, että yhdistelmät all-trans-retinoiinihappo ja HDAC-inhibiittoreilla on antitumoraalinen vaikutus [15], [16]. Yhdistelmä all

trans

retinoiinihappo (ATRA), ja joitakin HDAC-inhibiittorit osoitti kasvainten vastaisen vaikutuksen neuroblastooma [15], [16]. Yhdistelmähoito on retinoiinihapon hapot HDAC-inhibiittorit voivat parantaa tehokkuutta ja vähentää sivuvaikutuksia tarkoituksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on kehittää uusi strategia hoitoon keuhkosyöpään. Olemme sen vuoksi analysoineet vaikutus käyttämällä yhdistelmä uusien, luokan selektiivinen syklinen amidi-, joissa hydroksaamihappo- perustuu HDAC-inhibiittorit SL142 tai SL325 [17] yhdistettiin retinoiinihapon happojen testata tehokkuuden hoidettaessa keuhkosyöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

SL-142 ((E) -3- (2- (4-pyridin-4-yyli) bentsyyli-1-oksoisoindolin-6-yyli) -N- hydroxyacrylamide) ja SL-325 ((E) -3- (2- (4-kinolin-3-yyli) bentsyyli-1-oksoisoindolin-6-yyli) -N-hydroksi-akryyliamidi) ovat uusia isoindolinoni-hydroksaamihappo perustuvat histoni deasetylaasi- (HDAC) estäjät johdettu meidän rakenteellista kehittämistä tutkimuksia monille lääkkeille mallia talidomidi luomiseksi rakenteellisesti uusia lääkkeitä (Fig. 1A) [18], [19].

. Kemiallinen rakenne SAHA, SL142 ja SL325. B. havaitseminen H4 asetylaatio immunoblot 24 tunnin kuluttua SAHA, SL142 tai SL325 hoitoa (0,5 tai 2,0 uM) in H441 keuhkosyövän soluja. β-aktiini on esitetty valvontaa. C. Vaikutus solujen elinkelpoisuuden aiheuttama SAHA, SL142 tai SL325. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

3 solua /kuoppa 24 tunnin ajan ennen käsittelyä SAHA, SL142 ja SL325 (0,1-10 uM). Solujen elinkyky arvioitiin 96 tunnin käsittelyn jälkeen, jonka WST1 määritys (Roche, Basel, Sveitsi) mukaan valmistajan protokollaa. **, Merkittävä ero solujen elävyys käsiteltiin 0,1 uM SAHA, SL142 tai SL325 (p 0,01).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän soluja A549, H441 ja H1299 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin Hamin F12 (A549-solut), RPMI 1640 (H1299-solut), jossa oli paljon glukoosia Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä -inactivated naudan sikiön seerumia. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 10% CO

2 37 ° C: ssa. Lysaatit aikuisen ihmisen keuhkokudoksen saatiin Novasin Biologicals (Littleton, CO).

immunoblot-analyysi

Solut hajotettiin jääkylmässä lyysipuskurissa [1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCL (pH 8,0), 137 mM NaCl, 10% glyserolia (v /v), 2 mM EDTA, 1 mM natriumortovanadaattia (v /v) 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia]. Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla (10 min, 15000 x g 4 ° C: ssa), ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen DC-proteiinin määritys (BioRad, Hercules, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE-geelissä. Geeli siirrettiin elektroforeettisesti Hybond PVDF siirto kalvolle (Amersham, Arlington Heights, IL). Kalvo inkuboitiin ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineet mukaan SuperSignal

R West Pico kemiluminesenssi-protokollaa (Pierce, Rockford, IL) havaitsemiseksi sekundaarisen vasta-aineen sitoutumisen. Spesifistä vasta-ainetta β-aktiini-vasta-aine saatiin Sigma (St. Louis, MO), ja vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen RARa ja RXRa saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti RARβ, RXRβ ja Histone H4 asetyyli-vasta saatiin Abcam (Cambridge, UK). Spesifistä vasta-ainetta ihmisen Bax, p21 ja p27 saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Toissijainen piparjuuriperoksidaasikonjugoitua vasta-aineet on saatu Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).

inhibitio ja mittaus kaspaasiaktiivisuus

kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin käyttämällä ApoAlert kaspaasi kolorimetristä määritystä sarjat saadaan Clontech (Mountain View, CA) valmistajan mukaan protokollan. Kansi lisäys aktiivisuus määritettiin vertaamalla kaspaasi aktiivisuuden käsiteltyjen solujen kanssa kontrollisoluissa (DMSO). Kaspaasi esto, soluja inkuboitiin 100 uM zVAD-fmk saatu BioVision (Mountain View, CA).

Virtaussytometrinen analyysi apoptoosin

Solut maljattiin 24-kuoppalevyille tiheys 0,5-1,0 x 10

5 solua per kuoppa 1 vrk ennen hoitoja. Jälkeen 72 tai 96 tunnin ajan, solut kerättiin talteen ja pestiin kerran PBS: llä. Solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,2% Triton X-100 ja 1 mg /ml RNaasi-5 min huoneenlämpötilassa ja sitten värjättiin propidiumjodidilla 50 ug /ml määrittää osa-G

0 /G

1 DNA sisältöä käyttämällä FACScan. Kaksoispiikki, solu roskat, ja kiinnitys esineitä saatiin erotettua ulos, ja osa-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus määritettiin käyttämällä Cell Quest Ver. 3,3-ohjelmisto.

klonogeeninen selviytymisen

H441-solut ensin maljattiin tiheydellä 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti kuuden-kuoppalevyillä 24 tunnin ajan ennen käsittelyä. Käsittelyn jälkeen HDAC-inhibiittorit (0,5 uM) ja /tai retinoiinihapon hapot (2,5 uM) 36 tunnin ajan, solut vapautettiin lautasen inkuboimalla trypsiini /EDTA: lla, laskettiin ja maljattiin kolmena kappaleena tiheydellä 2 x 10

3 solua 100 mm: n annoksia 16 päivää. Sitten solut kiinnitettiin 100% metanolia ja sen annettiin kuivua ilmassa. Solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Colonies (ryhmät aggregoitujen solujen numerointi vähintään 50) Sitten laskettiin. Keskimääräinen lukumäärä PBS-käsitellyt solut mielivaltaisesti asetettu 100%, ja kaikki muut luvut normalisoitiin vastaavasti.

Plasmidit ja Ohimenevä transfektio Reportteri määrityksissä

kaksijuosteinen DNA, joka sisältää seitsemän toistoa RARE sekvenssi [20], [21] syntetisoitiin ja liitettiin Nhel: llä ja Hindlll-kohtiin pGL.4.24 lusiferaasireportterigeenin konstrukti (pGL4. RARE 7x, Promega, Madison, WI). Lusiferaasireportteri konstrukti pGL4 Bax muodostettiin subkloonaamalla promoottorialueen Bax -1570 /+ 68 genomisesta DNA: sta käyttämällä PCR-alukkeita: 5′-tttctcgag

XhoIgaagtccaagagatcttcctgacaccctagtctga ja 5’tttaagctt

HindIII caccgccgctcccgccgccgcctctcgccgggtcc. PCR-tuotettu fragmentti digestoitiin XhoI ja HindIII: lla ja subkloonattiin suoraan pGL.4.24 – lusiferaasireportteri- konstrukti (Promega). Kaikki transfektiot tehtiin kuuden kuopan levyillä. H441 keuhkojen solut ympättiin 24 tuntia ennen transfektiota, jonka tiheys on 0,3 x 10

6 /kuoppa. Transfektiot suoritettiin Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. H441 keuhkojen solut ympättiin 24 tuntia ennen transfektiota, jonka tiheys on 0,3 x 106 /kuoppa. Transfektiot suoritettiin Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 4 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin HDAC-inhibiittorit ja /tai retinoiinihapon hapot. 24 tunnin kuluttua HDAC-inhibiittorit ja /tai retinoiinihapon hapot hoitoon, solut kerättiin. Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty kertainen induktio suhteellisten valoyksiköiden normalisoidaan P-galaktosidaasin aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan kontrollivektoreihin. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Virhe palkit ilmaisevat keskihajonta keskiarvosta kolmesta näytteestä yhdessä kokeessa.

Tilastollinen

Tilastollisesti merkittäviä eroja keinoja ja mediaanit tutkittu ryhmien arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä tai ei-parametrinen Mannin-Whitneyn U-testiä. Varianssin analyysiä (ANOVA) testiä, tarvittaessa, käytettiin tunnistamaan tilastollisesti merkitsevä monivertailuja. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p 0,05 (*, #), p 0,01 (**).

Tulokset

Vaikutukset SL142 ja SL325 on H4 asetylaatio

analysoida histonideasetylaasi- aktiivisuutta SL142 ja SL325, immunoblot-analyysi suoritettiin. Inkubointi H441 soluja 24 tuntia SAHA, SL142 ja SL325 aiheutti annoksesta riippuvaa kasvu histoni H4 asetylaatio. Sekä SL142 ja SL325 osoittivat vahvempaa H4 asetylaatio kuin SAHA pitoisuuksina 0,5 uM ja 2,0 uM. SL142 aiheutti paljon suurempi kasvu histoni H4 asetylaation kuin SL325 pitoisuutena 2,0 uM (Fig. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että sekä SL142 ja SL325 kasvu histoni H4 asetylaatio yli SAHA [22] ja H441 keuhkosyövän soluja.

SL142 ja SL325 suppressoi merkittävästi solujen elinkelpoisuutta H441 ja A549 keuhkosyövän soluja

jotta analysoida kasvaimen vastaisen vaikutuksen HDAC-inhibiittorit, mittasimme solujen elinkelpoisuuden MTS-määritys hoidon jälkeen SAHA, SL142 ja SL325 on H441, A549 ja H1299 keuhkosyövän soluja. Solujen elinkelpoisuuden määritys paljasti, että kaikki HDAC-inhibiittorit (SAHA, SL142 ja SL325) suppressoi voimakkaasti solujen elinkelpoisuuden H441, A549 ja H1299 keuhkosyövän soluja pitoisuutena 10 uM. Pieninä pitoisuuksina (0,5-5,0 uM), sekä SL142 ja SL325 suppressoi merkitsevästi solujen elinkelpoisuuden H441 ja A549 keuhkosyövän soluja (Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SL142 ja SL325 ovat tehokkaampia tukahduttamaan solujen elinkelpoisuuden H441 ja A549 keuhkosyövän soluja kuin SAHA ja pienemmillä pitoisuuksilla.

SL142 ja SL325 huomattavasti kaspaasi-3-aktiivisuus aiheutti apoptoosia H441 ja A549 keuhkosyöpäsoluissa

Analysoimme kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin H441, A549 ja H1299 keuhkosyöpäsoluissa hoidon jälkeen HDAC-inhibiittorit. SAHA, SL142 ja SL325 lisääntynyt kaspaasi-3 aktiivisuutta kaikissa solutyypeissä. Merkittävää on, SL142 ja SL325 indusoi korkeamman kaspaasi-3-aktiivisuus (2.25- 2,48-kertainen) kuin SAHA (1.42- 1,66 kertaisesti) H441 ja A549 keuhkosyövän soluja (Fig. 2A). Seuraavaksi tutkimme indusoiman apoptoosin HDAC-inhibiittorit keuhkojen syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, SL142 ja SL325 aiheuttama useampi osa-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus (51,36-55,81% ja 35,07-43,80% vastaavasti) kuin SAHA (10,47-12,12%) vuonna H441 ja A549 keuhkosyöpäsoluissa jälkeen 72 tunnin hoito. Kuitenkin nämä HDAC-inhibiittorit indusoi vähemmän apoptoosin H1299 keuhkosyövän soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SL142 ja SL325 tehokkaammin lisätä kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja houkuttele apoptoosin H441 ja A549 keuhkosyöpäsoluissa kuin SAHA.

. Analyysi kaspaasi-3 aktiivisuutta A549, H441 ja H1299 keuhkosyöpäsoluissa jälkeen SAHA, SL142 ja SL325 hoitoa. Soluja käsiteltiin SAHA, SL142 tai SL325, jonka pitoisuus on 2,5 uM 36 tuntia. Kolmena kappaleena kokeet suoritettiin; Tulokset edustavat keskiarvoa-kertainen ± S.E. Merkittävä ero käsiteltyjen solujen PBS: lla ja solujen käsitelty HDAC-estäjien osoitti osoitettiin (* p 0,05, ** 0,01). B. virtaussytometrinen analyysi indusoiman apoptoosin SAHA, SL142 ja SL325. Solut infektoitiin SAHA, SL142 tai SL325 pitoisuudella 2,5 uM 72 tuntia ja osa-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus mitattiin propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometrinen analyysi.

ATRA tai

9-cis

RA parannettu kaspaasi-3: n aktiivisuuden aiheuttama SL142 tai SL325 ja lisääntynyt apoptoosin H441 keuhkojen adenokarsinoomasolua

analysoimiseksi yhdistelmä vaikutuksen retinoiinihapon happojen kanssa SL142 tai SL325, selvitimme kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja osa-G

0 /G

1 DNA sisältöä käyttämällä propidiumjodidivärjäys virtaussytometrillä ja kaspaasi-3 toimintaa sen jälkeen yhden tai yhdistelmähoito. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, sekä ATRA ja

9-cis

RA ei aiheuttanut kaspaasi-3: n aktiivisuuden, kun taas yhden hoitoon SAHA, SL142 tai SL325 lisääntynyt merkittävästi kaspaasi-3: n aktiivisuuden (1.38- 2,13-kertaisesti) H441 keuhkojen adenokarsinoomasolua . Tärkeää on, retinoiinihappo parannettu kaspaasi-3-aktiivisuus indusoitiin SAHA, SL142 ja SL325 ja yhdistelmä ATRA tai

9-cis

RA, ja SL142 tai SL325 lisääntynyt kaspaasi-3-aktiivisuus (2.47- 2,91-kertainen) yli ATRA tai

9-cis

RA ja SAHA yksinään (1.90- 2,04-kertainen). 100 uM zVAD-fmk esti tehokkaasti kaspaasi-3: n aktiivisuuden kaikissa kokeissa. Seuraavaksi tutkimme määrä indusoiman apoptoosin HDAC-inhibiittorit keuhkojen syöpäsoluja. Sub-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus nostettiin 5,98%: sta 8,58% yhden hoidon jälkeen on retinoiinihapon hapot tai HDAC-inhibiittorit. Kuitenkin yhdistelmä hoito SAHA ja ATRA tai

9-cis

RA kasvoi Saharan G

0 /G

1 DNA-pitoisuus on 22,37% ja 23,36% vastaavasti. Lisäksi SL142 ja ATRA tai

9-cis

RA kasvoi Saharan G

0 /G

1 DNA-pitoisuus on 32,82% ja 56,92% ja SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA lisäsi sisällön 26.18% ja 49.33% vastaavasti (Fig. 3B). Sub-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus indusoi yhden tai yhdistelmähoito normaaleissa ihmisen keuhkojen fibroblastin (NHLF) oli alle H441-soluja (tietoja ei esitetty). Morfologinen analyysi osoitti, että enemmän solukuolemaa aiheutettiin yhdistämisen jälkeen hoidossa SL142 ja ATRA tai

9-cis

RA kuin kertakäyttöiset (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATRA tai

9-cis

RA lisäys kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja indusoiman apoptoosin SAHA, SL142 ja SL325.

. Analyysi kaspaasi-3-aktiivisuus indusoitiin ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) ja /tai SAHA, SL142 ja SL325 (0,5 uM) on H441 keuhkosyövän soluja. Soluja käsiteltiin SAHA, SL142 ja SL325 pitoisuudella 2,5 uM 36 tuntia. 36 tunnin kuluttua hoidon osa-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus mitattiin propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometrinen analyysi. Kolmena kappaleena kokeet suoritettiin; Tulokset edustavat keskiarvoa-kertainen ± S.E. *, Merkittävä ero ohjaus (solut ilman hoitoja) (p 0,05). B. virtaussytometrinen analyysi indusoiman apoptoosin ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) ja /tai SAHA, SL142 ja SL325 (0,5 uM) on H441 keuhkosyövän soluja. 96 tunnin kuluttua hoidon osa-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus mitattiin propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometrinen analyysi. C. morfologinen analyysi H441-solujen jälkeen ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) ja /tai SL142 (0,5 uM) hoitoon.

vaikutukset yhdistelmähoidon retinoiinihapon happojen ja SL142 tai SL325 on tukahduttamiseen pesäkkeen muodostumisen H441 keuhkosyöpäsoluissa

analysoimiseksi antituumorivaikutus yhdistelmähoidon ATRA tai

9-cis

RA ja SL142 tai SL325, eli klonogeeniset määritys esitettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja 4B, ATRA tai

9-cis

RA heikosti estää pesäkkeiden muodostumisen H441 keuhkosyövän soluja (69,1-78,0%), kun taas SAHA, SL142 tai SL325 voimakkaammin estää pesäkkeiden muodostumisen (40,2-69,4%). Merkittävää on, ATRA tai

9-cis

RA tehosti kasvaimen vastaisen vaikutuksen SAHA, SL142 tai SL325 varsinkin yhdistettynä SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA rajusti tukahdutetaan pesäkemuodostuksen (2,52-13,22%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä hoito SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA synergisesti estää pesäkkeiden muodostumista H441 keuhkosyöpäsoluissa.

. Pesäkkeiden muodostumista H441: lla käsiteltyjen solujen ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) ja /tai SAHA, SL142 ja SL325 (0,5 uM) 36 tuntia. Määritys käynnistettiin maljaamalla 2 x 10

3 solua 100 mm: n annoksia. Jälkeen 16 päivää, solut kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla. Edustavia kuvia kokeita suoritettiin kolminkertaisesti näkyvät. B. Mean pesäkemäärät olivat peräisin kvantitoimiseksi kolmena ruokia testi- ja prosenttiosuus-spesifisen sytotoksisuuden verrattuna pesäkkeiden muodostumiseen DMSO ryhmässä (kontrolli) laskettiin. *, P 0,05 versus yksittäisinä aineina.

yhdistelmä hoitoon SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA synergisesti kasvattaa transkriptionaalista aktiivisuutta harvinaisia, mutta ei muuta ilmaisua RAR ja RXR

analysoida transkription aktiivisuus retinoiinihapon reagoivan elementin (RARE) käsittelyn jälkeen SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA, me tuotti lusiferaasia konstrukti ohjaavat seitsemän tandem harvinainen elementin: pGL4. RARE 7x [20], [21]. pGL4. RARE 7x syntyy merkittävää promoottorin aktiivisuutta (5.26- ja 17.11-kertaiseksi) annon jälkeen 2,5 uM ATRA tai

9-cis

RA hoitoja H441 keuhkosyövän soluja. Kuitenkin konstrukti ilmeni vähän transkriptioaktiviteettia jälkeen 0,5 uM SAHA, SL142 tai SL325 hoito soluissa (1.26- ja 1.43- kertaisesti). Tärkeää on, SL142 ja SL325 lisää merkittävästi parannettu promoottorin aktiivisuutta RARE hoidon jälkeen ATRA tai

9-cis

RA. (29.94- ja 37.42-kertaiseksi, 55.58- ja 60.14-kertaiseksi) verrattuna SAHA (14.99- ja 24.65-kertaiseksi) (Kuva. 5A). Kuitenkin, kuten on esitetty kuviossa. 5B, immuno blot analyysi osoitti, että pieni muutos nähtiin ilmaus RARa RARβ, RXRa ja RXRβ ilmaisun jälkeen yhden tai yhdistelmän käyttöä H441 keuhkosyövän soluja.

. Ohimenevä transfektio toimittaja analyysit H441 solujen pGL4. tai pGL4.RARE 7x (2 ug), plus pCMV. β-galaktosidaasi (2 ug) jälkeen retinoiinihapon hapot (2,5 uM) ja /tai SL142 tai SL325 (0,5 uM) retinoiinihapon hapot hoitoon. Tulokset on esitetty kertainen induktio suhteellisten valoyksiköiden normalisoidaan P-galaktosidaasin aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan valvonta konstruktioita.

#, merkittävä ero promoottorin aktiivisuuden tuottamat pGL4.RARE 7x jälkeen ATRA ja SAHA hoitoa (p 0,05). *, Merkittävä ero promoottorin aktiivisuuden tuottamat pGL4.RARE 7x jälkeen

9-cis

RA ja SAHA käsiteltyjä soluja (p 0,05). B. immunoblottianalyysi RARa, RARβ, RXRa ja RXRβ ilmaisuja jälkeen retiini- happoja ja /tai SL142 tai SL325 hoitoa H441 keuhkosyövän soluja. Ihmisen keuhkosyöpä solut otettiin talteen 24 tunnin kuluttua hoidon ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) tai /ja SAHA, SL142 tai SL325 (0,5 uM). β-aktiini on esitetty ohjaus.

Yhdistelmä käsittely SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA lisää Bax ilmentyminen H441 keuhkosyöpäsoluissa

tutkiakseen mekanismi antituumorivaikutuksen aiheutuvaa yhdistelmähoitoon ATRA tai

9-cis

RA ja SL142 tai SL325, analysoimme ilmaisun p21, P27: n ja Bax in H441 keuhkosyövän soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, p21 ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt jälkeen SL142 hoidon (Fig. 6A, kaista 7-9). Kun 9-cisRA, SAHA: hoitoon tai yhdistelmänä hoidon SAHA ja retinoidien lisääntynyt p27 lauseke (Fig. 6A, kaista 1-6) ilmoittamat muut [16], mutta mitään merkittävää muutosta ei havaittu p27 ilmaisun jälkeen SL142 tai SL325 hoitoa tai yhdistelmä hoito SL142 tai SL325 ja retinoidien (Fig. 6A, kaista 7-12). Tärkeää on, Bax ekspressio lisääntyi 24 tunnin jälkeen, SL142 ja SL325 hoitoon (Fig. 6A, kaista 7, 10) ja ATRA tai

9-cis

RA parannettu ilmaisu (kaista 8, 9, 11,12) on H441-soluja. Yhdistelmä hoito

9-cis

RA ja SL325 kasvoi myös Bax lauseke (kaista 6). Seuraavaksi analysoimme Bax-promoottorin aktiivisuus yhdistämisen jälkeen hoidon avulla lusiferaarikonstrukti sisältävä Bax promoottorialueen: pGL4. Bax. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, aktivointi Bax-promoottorin pysyi (3.58- 6,07-kertaiseksi), yhden hoidon jälkeen HDAC-estäjillä tai retinoiinihappo happojen H441 keuhkosyövän soluja. Tärkeää on, SAHA tehostettu Bax-promoottorin aktiivisuutta indusoi ATRA tai

9-cis

RA (6.27- 8,74-kertainen) ja SL142 ja SL325 parannettu vielä enemmän (10.14- ja 18.44-kertaiseksi). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoidon SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA voi parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta Bax-promoottorin ja aiheuttaa Bax ilmentyminen H441 keuhkosyövän soluja.

. Immunoblottianalyysi RARa, RARβ, RXRa ja RXRβ ilmaisuja jälkeen retiini- happoja ja /tai SL142 tai SL325 hoitoa H441 keuhkosyövän soluja. Ihmisen keuhkosyöpä solut otettiin talteen 24 tunnin kuluttua hoidon ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) tai /ja SAHA, SL142 tai SL325 (0,5 uM). β-aktiini on esitetty valvontaa. B. Ohimenevä transfektio toimittaja analyysit H441 solujen pGL4. tai pGL4.Bax (2 ug), plus pCMV. β-galaktosidaasi (2 ug) jälkeen retinoiinihapon hapot (2,5 uM) ja /tai SL142 tai SL325 (0,5 uM) retinoiinihapon hapot hoitoon. Tulokset on esitetty, kuten kuviossa. 6A. *, Merkittävä ero promoottorin aktiivisuuden tuottamat pGL4.Bax jälkeen ATRA tai

9-cis

RA (2,5 uM) tai SAHA, SL142 tai SL325 (0,5 uM) (p 0,05).

keskustelu

Keuhkosyöpä on yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [23]. Keuhkosyövän hoidossa kemoterapiaan pidensi elinaikaa kuitenkin kliinistä hyötyä näiden aineiden kanssa on rajoitettu potilaille muuten hyvä terveys ja ne alkuvaiheessa. Mutta kaikki kemoterapia myös toivottuja sivuvaikutuksia potilaalle [24]. Äskettäin, pienet molekyylit, on kehitetty hoitamaan keuhkosyöpään potilailla, joissa on käytetty tällaisia ​​mutatoituja geenejä kuten EGFR ja EML4-ALK -fuusiogeenit. Nämä pienet molekyylit on suunniteltu kohdistamaan kinaasin domeenit mutatoituja geenejä ja estää niiden toimintaa [25], [26]. Kuitenkin, kuten pienimolekyylisiä hoito ei ole sopiva useimpiin keuhkosyöpä tapahtumia, mukaan lukien syövän aiheuttama mutatoitunut KRAS-geeni [27]. On selvää, lisätutkimuksia uudempi, siedetty aineet, uudet vaikutusmekanismit tarvitaan kiireesti parantamiseksi kestoa ja elämänlaatua suuren joukon potilaita.

epäselektiivisten estäjiä ihmisen histonideasetylaasien (HDAC) ovat raportoitu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta

in vivo

, ja useat niistä ovat alle kliinisissä kokeissa [9], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]. Ensimmäinen näistä, SAHA on hyväksytty hoitoon ihon T-solulymfooma, ja se on myös raportoitu, että SAHA on tuumorin vastaista vaikutusta vastaan ​​keuhkosyövän soluja [37], [38]. Aiemmin olemme kehittäneet uusia amidi-, joissa hydroksaamihappo- johdannaiset luokan selektiivisiä HDAC-inhibiittorit, jota kutsutaan nimellä SL142 ja SL325 (Fig. 1A) ja on raportoitu, että nämä pienet molekyylit osoittavat suurempia HDAC1, HDAC4 ja HDAC6 estoaktiivisuus ihmisen eturauhasen syöpäsolujen LNCaP kuin SAHA [17]. Puoli maksimaalinen estävä pitoisuudet (IC50) SL-142 vastaan ​​HDAC1, HDAC4 ja HDAC6 on 69 ± 5 nM, 53 ± 2 nM ja 260 ± 70 nM. IC50 SL-325 vastaan ​​HDAC1, HDAC4 ja HDAC6 ovat 120 ± 4 nM, 65 ± 4 nM, ja 310 ± 50 nM. Sitä vastoin IC50 on käytetty kliinisesti HDAC estäjä suberoylanilide hydroksaamihappo- ZolinzaTM vastaan ​​HDAC1 ja HDAC4 ovat paljon korkeammat 290 ± 50 nM, 340 ± 30 nM, ja verrattavissa HDAC6 200 ± 10 nM. Näin ollen, näillä yhdisteillä on voimakkaampi inhiboiva aktiivisuus HDAC1 ja HDAC4 ja vertailukelpoisia HDAC6 inhiboivaa aktiivisuutta verrattuna kliinisesti käytetty HDAC-inhibiittori suberoylanilide hydroksaamihappo (ZolinzaTM) [18], [19].

Esillä olevassa tutkimuksessa , SL142 ja SL325 osoittivat merkittävämpiä HADC estoaktiivisuus (HAT aktiivisuus) in H441 keuhkosyövän soluja (Fig. 1 B) ja esti tuumorin elinkelpoisuutta H441 ja A549 keuhkosyövän soluja kuin SAHA (Fig. 1 C), mikä osoittaa, että SL142 ja SL325 ovat tehokas HDAC-inhibiittorit kuin SAHA. Meidän edellisessä raportissa, SL142 ja SL325 osoitti merkittävää p21-promoottorin aktiivisuutta ja sytostaatit aktiivisuus eturauhasen syöpäsolujen LNCaP [17]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, nämä pienet molekyylit myös indusoi merkittäviä kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja subG

0 /G

1 väestöstä H441 ja A549 keuhkosyövän soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SL142 ja SL325 voivat aiheuttaa apoptoosin keuhkosyöpä.

Retinoic hapot moduloivat normaali, syöpää edeltäviin, ja pahanlaatuisten solujen fenotyyppejä muutokset geenin ilmenemisessä välittyvät sitoutumalla kahteen luokkaan nukleaarihormonireseptorit reseptorien RAR ja RXRs. ATRA sitoutuu RAR korkealla affiniteetilla, mutta ei sitoudu RXR, kun taas

9-cis

RA on ligandi, joka sitoo ja transaktivoi sekä RAR ja RXRs [39], [40]. Retinoiinihapon hapot säännellä erilaistumista hengitystie-epiteelissä ja tukahduttaa syövän syntymistä keuhkosyöpä ja pään ja kaulan alueen syöpä [41], [42], [43]. Tärkeää on, että on raportoitu, että yhdistelmähoito HDAC-inhibiittorit ja retinoiinihapon hapot kasvanut tuumorin vastainen vaikutus pahanlaatuisiin soluihin [44], [45], [46], [47]. Lisäksi Epping et ai. raportoitu, että retinoiinihapporeseptorin (RAR) reitti on suunnattu HDAC-inhibiittori, ja että antituumorivaikutusta HDAC-inhibiittori tuumorisoluissa on osittain kautta derepressiota retinoiinihapon [48]. Tutkimuksessamme yhdistelmä hoitoon SL142 tai SL325 näiden retinoiinihapon happojen synergisesti lisääntynyttä apoptoosia ja tukahdutettiin pesäkkeiden muodostumista soluissa (Fig. 3A, 3B, 4A ja 4B). Lisäksi transkriptionaalinen aktiivisuus syntyy RARE yhdistämisen jälkeen hoito oli paljon suurempi kuin yksi hoitokerta (Fig. 5A). RAR tiedetään muodostaa heterodimeerin RXR ja sitoutuu retinoiinihappo reagoivan elementin (RARE) [49], [50]. Kuitenkin näiden reseptoreiden ekspression ei kasvanut hoidon jälkeen H441 keuhkosyövän soluja (kuvio. 5B) [45], [51]. Sekä retinoiinihapon hapot ja HDAC-estäjien on raportoitu aktivoida solusyklin tai apoptoosin liittyvät geenit ja aiheuttaa solujen erilaistumisen tai apoptoosin syöpäsoluissa [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Kertomuksessamme ekspressio p21 oli selvästi lisätä, kun SL142 käsittely H441 keuhkosyövän soluja ja mikä vielä tärkeämpää, Bax ekspressio lisääntyi sen jälkeen, kun yhdistelmä hoidon HDAC-inhibiittorit ja retinoiinihapon hapot. Expression of P27 ei muuttunut jälkeen SL142 tai SL325 ja /tai retinoidi hoito [16]. Promoottori on p21-geeni sisältää toiminnallisen RARE [62] ja tämä on sopusoinnussa tuloksemme (Kuva. 5A). Kuitenkin p21 tunnistettiin alun perin molekyyliä, joka säätelee siirtymistä G1 vaiheeseen S vaiheen solusyklin ja yli-ilmentyminen p21 on osoitettu aiheuttavan erilaistumista eri soluissa pikemminkin kuin indusoivat kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja apoptoosin [63] , [64], [65], [66]. Toisaalta yli ilmentyminen Bax indusoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden, ja apoptoosin monenlaisia ​​soluihin [67], [68], [69]. Tässä tutkimuksessa yhdistelmähoidon SL325 ja retinoiinihapon hapot merkittävästi indusoi solukuoleman H441 keuhkosyövän soluja. Kuitenkin yhdistelmähoito tuskin lisääntynyt p21 lauseke (Fig. 6A). Kuten on esitetty kuviossa. 6A, p53 ilmentymistä ei muuttunut hoidon jälkeen ja H441 ei-pieni keuhkosyöpä solut kantavat p53. Nämä tulokset viittaavat siihen, että jopa sääntely Bax voi olla ratkaiseva rooli antituumorivaikutus yhdistelmän hoidossa SL142 tai SL325 ja ATRA tai

9-cis

RA H441 keuhkosyövän soluihin [54] ja Bax kasvoi säännelty p53 itsenäinen reittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, p53 ilmentymistä ei muuttunut hoidon jälkeen ja H441 ei-pieni keuhkosyöpä solut kantavat p53. Toisaalta, kuten on esitetty kuviossa. 1C ja kuvio.