Krooninen sairaus

tiivistelmä

peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori gamma (PPARy) on tumareseptorin joka on olennainen rooli soluproliferaation apoptoosin, ja tulehdus. Se on yli-ilmentynyt useissa syöpätyyppien, kuten paksusuoli-, vatsa-, rinta-, ja keuhkosyöpä, mikä viittaa siihen, että sääntely PPAR saattavat vaikuttaa syövän synnyssä. Täällä käyttäen proteomic lähestymistapaa, tunnistamme PTB liittyvän silmukoinnin tekijä (PSF) uutena PPARy-vuorovaikutuksessa proteiini ja osoittaa, että polyesterikatkokuitujen on mukana useita tärkeitä sääntelyn vaiheet paksusuolensyöpä solujen lisääntymisen. Tutkimaan suhde polyesterikatkokuitujen ja PPARy paksusuolen syöpä, arvioimme vaikutuksia PSF ilmentymisen DLD-1 ja HT-29 koolonsyöpäsolulinjaa, jotka ilmentävät matalan ja korkean tason PPARy vastaavasti PSF vaikuttanut kykyyn PPARy on sitoa ja ilmaus PSF siRNA merkittävästi tukahdutti leviämisen koolonkarsinoomasoluissa. Lisäksi PSF knockdown aiheuttaman apoptoosin kautta kaspaasi-3. Mielenkiintoista on, että DLD-1-solut olivat alttiita PSF pudotus solukuolema kuin HT-29-soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että PSF on tärkeä säätelijä solukuoleman, joka toistaa kriittinen roolit selviytymisen ja kasvun koolonkarsinoomasoluissa. PSF-PPARy akseli voi olla rooli valvonnassa peräsuolen syövän synnyn. Yhdessä tämä tutkimus on ensimmäinen kuvata vaikutuksia PSF soluproliferaatioon, kasvaimen kasvua ja solujen signalointi liittyvät PPAR.

Citation: Tsukahara T, Haniu H, Matsuda Y (2013) PTB-Associated Jatkaminen Factor (PSF) Onko PPARy-sitova proteiini ja kasvu Regulator koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (3): e58749. doi: 10,1371 /journal.pone.0058749

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 04 joulukuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 13 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Tsukahara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) 22591482 (ja Tamotsu Tsukahara) päässä Japanin Society for Promotion of Science, ja avustukset-in-Aid Takeda Science Foundation (ja Tamotsu Tsukahara) ja Astellas pohjan tutkimukseen aineenvaihduntahäiriöihin (jotta Tamotsun Tsukahara). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma. Maailmanlaajuisesti noin 1 miljoonaa uutta tapausta paksusuolen syöpä diagnosoidaan vuosittain lähes 500000 kuolemia tähän tautiin vuosittain [1]. Useimmat näistä kuolemista tapahtuu seurauksena myöhäinen diagnosointi. Vaikka paksusuolen syöpä kehittyy paksusuolen ja peräsuolen kudoksiin, syöpäsolut voi levitä muihin kehon osiin, kuten maksa, luu, aivot, ja keuhkojen ja muodostavat uuden kasvaimen. Koska metastaattinen paksusuolen syöpä liittyy korkea kuolleisuus [2] – [3], etenemistä etäpesäkkeiden on kriittinen piste paksusuolensyöpä selviytymistä. Tällä hetkellä, kemoterapeuttiset aineet ovat tärkeimmät välineet hoitoon paksusuolen syövän. Kuitenkin useimmat näistä lääkkeistä ovat epäspesifinen tai heiketä kasvainsolujen hankkia monilääkeresistenssin. Siksi uudet hoitovaihtoehdot vähentämiseksi tarvitaan paksusuolensyöpä kuolleisuutta.

PPARy kuuluu ytimen reseptorin super-perhe, jonka jäsenet aktivoivat kohdegeenin transkription ligandista riippuvaisella tavalla [4] – [5] . Aktivointi PPARy mukaan tiatsolidiinidionien (TZD) johtaa muuttuneessa aineenvaihdunnan rasvakudoksessa, luuston lihassoluja ja maksa jotka yhdessä johtaa insuliinin herkistymistä [6]. PPARy ilmentyminen lisääntyy monissa syöpätyyppien, kuten paksusuoli-, keuhko-, rinta-, ja mahasyövän, mikä viittaa siihen, että sääntely PPAR saattavat vaikuttaa syövän synnyssä [7], [8]. Vaikka PPARy ilmentyy merkittäviä määriä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja kudosten [8], rooli PPAR aktivaation paksusuolen syöpä on edelleen kiistanalainen [9]. Lisäksi rooli PPAR aktivointi syövän yleensä jää epäselväksi. Useita korkean affiniteetin synteettisiä agonistit olemassa PPARy, kuten rosiglitatsonin ja troglitatsoni. On raportoitu, että nämä agonistit inhiboida erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja. Kuitenkin vaikutusmekanismi useimmissa tapauksissa osoittaa reseptorin riippumattomia vaikutuksia [10]. Useat tutkimukset kuvaavat kykyä PPARa /γ-agonisti, TZD18, aiheuttaa glioblastoomasolulinjan myrkyllisyydestä reseptori-riippumattomalla tavalla [11]. Tämä yhdiste indusoi apoptoosia solusyklin pysähtymiseen. Apoptoottiset tapahtumia välittämiä alas-säätely Bcl-2, säätely ylöspäin Bax, ja kaspaasi-3. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TZD: t voivat indusoida apoptoosia riippumaton PPARy aktivaation, ensisijaisesti aktivoimalla luontainen apoptoottisen reitin.

PTB liittyvän silmukoinnin tekijä (PSF) on monitoiminen proteiini, transkription säätelyyn, pre-mRNA: n prosessointi, ja DNA: n korjautumiseen [12]. Yksi runsas tumaproteiinit, se koostuu yhdestä polypeptidiketjun ca. 76 kDa (määritettynä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi [SDS-PAGE]) [13]. Aminopäässä on runsaasti proliinia ja glutamiinitähteet. PSF on useita sitovia toimintoja. Äskettäinen tutkimus paljasti, että PSF kuuluu perheeseen oletetun kasvaimeen vaimennin proteiineja, jotka sisältävät RNA: ta sitovan domeenin (RBD) ja DNA: ta sitovan domeenin (DBD) [14]. DBD sitoo ja tukahduttaa geenien transkriptiota, jotka ovat PSF-sitoutumiskohdan [14], [15]. Siten PSF on erittäin monimutkainen proteiini, joka voi olla tärkeä osa transkription tukahduttaminen monien erilaisten geenien liittyy erilaisia ​​mekanismeja. Äskettäin, Wang et ai. ilmoitti, että polyesterikatkokuitujen on keskeinen rooli palautuva asetuksessa nisäkkään soluproliferaation ja kasvaimen kehittymisen [16]. Muutos ilmaus polyesterikatkokuitujen ja sen sitovat kumppanit voivat olla potentiaalia terapeuttisena strategia syövän [17]. Kuitenkin miten eri toimintojen polyesterikatkokuitujen säännellään koolonkarsinoomasoluissa ei ole vielä selvä. Oletimme, että polyesterikatkokuitujen vuorovaikutuksessa PPARy. Siksi käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli ollut saada todisteita välillä on suora vuorovaikutus polyesterikatkokuitujen ja PPARy paksusuolen syövän synnyn. Tuloksemme osoittivat, että PPARy vaikuttaa suoraan PSF. Tutkia PPARy-riippuvia vaikutuksia polyesterisynteettikuitutyypin vertasimme myös HT-29-solulinja, jossa PPARy ilmentyy voimakkaasti, jossa DLD-1-solulinjassa, jossa PPARy on huonosti ilmaistu, alle PSF knockdown olosuhteissa. Ero proteomic kuviot kahdessa solulinjassa arvioitiin LC-MS /MS-analyysi. Taso PPARy paksusuolen kudoksessa on yhtä suuri tai suurempi kuin rasvakudoksessa [18]. Tämä havainto viittaa erityistä roolia PPARy paksusuolessa, mikä näkyy osittain solu- tai kudos-erityinen ilmaisu reseptorin [19]. Proteiinit säädellään eri tavalla kahdessa solulinjoissa meille parempi käsitys tapahtumista osallistuvien paksusuolensyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Hiiren monoklonaalinen anti-PSF vasta-ainetta (sc-271796), kanin polyklonaalinen anti-PPAR-ainetta (sc-7196), vuohen polyklonaalinen anti-VDAC2 vasta-ainetta (sc-32059), hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini vasta-ainetta (sc-47778), PSF siRNA (SC- 38304), ja ohjaus siRNA (sc-37007) hankittiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Sykliset fosfatidihappo (CPA) ja lysofosfatidihappo (LPA) hankittiin Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). Matti ™ /Flexi® Vector Nisäkkäiden kaksihybridisysteeminä hankittiin Promega (Madison, WI, USA).

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

Täyspitkä ihmisen PSF cDNA (GenBank ™, BC051192) hankittiin IMAGE Clone Consortium (IMAGE numero: 5262885). PCR-alukkeet suunniteltiin sisältämään koko avoimen lukukehyksen polyesterikatkokuitujen.

Kpn

I ja

Xho

I ulokkeita lisättiin mielessä ja antisensealukkeina, vastaavasti. Sekvenssin sense-aluke oli: 5′-GTAAGGTACCATGTCTCGGGATCGGTTCCGGAGTCGTG-3 ’(

Kpn

I on alleviivattu). Sekvenssin antisense-aluke oli: 5′-CACGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTTTGGGCCTTCG-3 ’(

Xho

I on alleviivattu). 2124-bp: n PCR-tuote monistettiin käyttäen Tks Gflex ™ DNA-polymeraasia (Takara, Shiga, Japani), puhdistetaan, digestoidaan

Kpnl

I /

Xho

I, ja insertoitiin pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Nisäkkään kaksi-hybridimäärityksessä, täyspitkä PSF ja PPARγ1 (

SGF

I /

Pme

I) tuotettiin PCR: llä ja kloonattiin pFN11A tai pFN10A vektori matti ™ /Flexi® Vector Nisäkkäiden Two-Hybrid System (Promega) on

SGF

I ja

Pme

I sivustoja. Sekvenssi PSF sense-aluke oli: 5′- CATAGCGATCGCCATGTCTCGGGATCGGTTCCGGAGTCGTG-3 ’(

SGF

I on alleviivattu). Sekvenssi PSF antisense-aluke oli: 5′- CGCGGTTTAAACCTAAAATCGGGGTTTTTT GTTTGGGCC-3 ’(

Pme

I on alleviivattu). Sekvenssi PPARy sense-aluke oli: 5′-CAGTGCGATCGCCATGACCATGGTTGACACAGAGATGCCATTC-3 ’(

SGF

I on alleviivattu). Sekvenssi PPARy antisense-aluke oli: 5′-GCGCGTTTAAACCTAGTACAAGTCCTTGTAGATCTCCTG-3 ’(

Pme

I on alleviivattu). PSF häviämämutantit (150-707, 290-707, 370-707, 450-707, ja 662-707) oli antelias lahja tri Xuesenin Dong (University of British Columbia, Department of Urologiset Sciences, British Columbia, Kanada) . Kaikki sekvenssit varmistettiin käyttämällä DNA-analysaattori (ABI malli 3730xl) ja BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Cell Culture

ihmisen paksusuolen syövän HT-29-solulinja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VS, USA). DLD-1 ihmisen adenokarsinoomasolua saatiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). Soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM; Nakarai Tesque, Kioto, Japani) tai RPMI 1640 väliaine (Nakarai Tesque), joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä, 10 ug /ml streptomysiiniä, ja 2,5 ug /ml Plasmocin ™ (Nakarai Tesuque) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

valmistaminen Subsellulaariset Fraktiot

neuvotte- PER Cell fraktiointi Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) käytettiin eristämään ydin- fraktio soluista, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kun solulimafraktio erotettiin, tumafraktios- saatettiin lyhyt sentrifugointi (1000 x

g

, 10 s), ja käyttöliittymä poistettiin vähentää sytoplasman saastumista.

Pull-down-määritys joiden Metal Affinity Resin

heksahistidiiniliite- (6 x His) hännitetty PPARy fuusioproteiineja tai tyhjän vektorin valvonta ilmennettiin BL-21 (DE3) solut. Transformoitiin BL-21-soluja indusoitiin 0,5 mM isopropyyli-1-β-D-galaktopyranosidi (IPTG) (Invitrogen), 12 tunnin ajan 25 ° C: ssa ja kerättiin sentrifugoimalla. Seuraavaksi 1 ml supernatanttia inkuboitiin 20 ui TALON metallin affiniteetti hartsia (Takara), 4 ° C: ssa 1 h hajotuspuskuria. Hartsi pestiin 5 kertaa pesupuskurilla (20 mM MES, pH 7,4, 150 mM NaCl), ja proteiinit eluoitiin 150 mM imidatsolia pesupuskurissa. Määrä PPAR kvantitoitiin käyttäen Protein kvantifiointi Kit-Rapid (Dojindo, Kumamoto, Japani). Jotta avattavasta analyysissä puhdistettuja 6 x His-PPARy (1 ug) sekoitettiin ydin- otteita HT-29 solua 50 ul: aan sitoutumispuskuria, joka sisälsi 20 mM MES pH 7,4 ja 150 mM NaCl; TALON hartsia lisättiin sitten. Kun oli inkuboitu 2 tuntia 4 ° C: ssa, hartsit pestiin 5 kertaa 500 ul: lla pesupuskuria, joka sisälsi 20 mM MES, pH 7,4, ja 100 mM NaCl.

In-gel Digestion ja proteiini tunnistaminen MALDI-TOF MS

geeli ruoansulatusta geelin bändejä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, proteiini paikkoja, jotka leikattiin irti geelistä, tehtiin de-värjättiin 100 mM ammoniumbikarbonaattia 50% asetonitriiliä. Geeli kappaleet kuivattiin ja pilkottiin sekvensointilaatuinen luokan modifioitu trypsiini (Promega). Peptidi liuos otettiin talteen, ja jäljellä peptidit uutettiin ravistellen 5% trifluorietikkahappoa (TFA) 50% asetonitriili. Yhdistetyt liuokset väkevöitiin käyttäen lyofilisaattoria. Trypsiinikartta peptidejä, jotka liuotettiin 0,1% TFA: ta, poistettiin suolat Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA, USA) valmistajan ohjeiden, sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden matriisin liuosta (10 mg /ml α-syaani -4-hydroksikanelihappoa 50% asetonitriili /0,1% TFA: ta), ja lisättiin kohdelevyä. MS /MS-analyysit suoritettiin käyttäen AB SCIEX TOF /TOF ™ 5800 System (AB SCIEX, Foster City, CA, USA). Proteiini tunnistaminen suoritettiin kautta ProteinPilot ™ -ohjelmiston (AB Sciex, Framingham, MA, USA) käyttäen UniProt tietokantaa.

samanaikainen immunosaostus ja Western Blot

HT-29-solujen ja DLD-1-soluissa suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 100 mM NaCl, 50 mM KCI, 0,05% Tween-20, 10% glyserolia, ja Halt Protease Inhibitor Cocktail (Takara). Sen jälkeen kun oli inkuboitu 15 minuuttia jäissä, solulysaatti sonikoitiin ja sentrifugoitiin 16000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin koko-solu-uutetta. Solulysaatti esipuhdistettiin lisäämällä 5 ui Protein A /G Plus-agaroosi (sc-2003, Santa Cruz Biotechnology), ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Hiiren monoklonaalinen anti-PSF-vasta-ainetta (200 ug /ml, sc-271796, Santa Cruz Biotechnology), ja solu-uutetta sekoitettiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 3 h. Sitten näyte sekoitettiin 5 ui IP-matriisin (ImmunoCruz ™ IP /WB Optima B-järjestelmä, sc-45039, Santa Cruz Biotechnology), ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Inkuboinnin jälkeen immunosaostetut pestiin 5 kertaa 0,5 ml: lla 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 0,5 M NaCl, 0,1 M KCI, ja 0,025% Tween-20, ja sitten eluoitiin SDS-PAGE- pelkistysnäytepuskuria. Näytteet erotettiin 5-20% SDS-PAGE ja western blot. Pesun jälkeen kaivoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-sidottu laji-spesifisten koko sekundaarinen vasta-aine (anti-kani tai -hiiri IgG, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten visualisoidaan Pierce ECL Plus Western blotting Alustan (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA) tai EzWestLumi plus (ATTO, Tokio, Japani).

Quantitative Reaaliaikainen PCR-analyysi

Yhteensä RNA valmistettiin HT-29 ja DLD-1-soluihin käyttämällä NucleoSpin® RNA II (Takara). Sitten 0,5 ug kokonais-RNA: ta käytettiin myöhempään cDNA: n synteesi käyttäen ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japani), kuten valmistajan suosittelemia. Kvantifiointi mRNA tasot mitattiin käyttämällä ECO Real-Time PCR-järjestelmä (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) ja SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- (Toyobo) seuraavin alukeparia sarjaa: PSF, 5′-TGCCATTCATGCTTCTATGCA-3 ’(F) ja 5′-GGCCTAGACACTCTCATGCTTTC-3′ (R); 18S rRNA, 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ’(F) ja 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’ (R). Kaikki PCR: t suoritettiin 10 ul: n tilavuudessa käyttäen 48-kuoppaista PCR-levyjä (Illumina). Pyöräily olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min (polymeraasi aktivointi), jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 55 ° C 15 sekuntia ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Sen määrittämiseksi, mikä taloudenhoito geenit olivat sopivin myöhemmin normalisoituminen tiedot, me aluksi valitaan 3 ehdokasta: GAPDH, β-aktiini ja 18S-rRNA, yleisesti käytetty sisäisen valvonnan nisäkässoluissa. Monistuksen jälkeen näytteet lämmitettiin hitaasti 55 ° C: sta 95 ° C: ssa jatkuvasti käsittelyssä fluoresenssin saamiseksi sulamiskäyrä. Suhteellinen mRNA määrän laskettiin käyttäen aritmeettista kaavan 2

-ΔΔCq, jossa ΔCq on ero kynnyksen aikana tietyn kohde-cDNA: n ja endogeenisen viite cDNA. Johdannaisia ​​kaavat ja validointitestejä on kuvattu Applied Biosystems User Bulletin nro 2.

Sirna

PSF ilmentyminen inhiboitui HT-29 ja DLD-1-solujen transfektio pieni häiritsevä RNA (siRNA) kohdistaminen PSF (Santa Cruz Biotechnology), käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Solut maljattiin 6-kuoppalevyille (Iwaki, Tokio, Japani) tiheydellä 5 x 10

4 solua per kuoppa DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut transfektoitiin 100 pmol /ml mRNA-spesifisten siRNA tai sekoitetun ohjaus siRNA. Pieneneminen PSF tasojen varmistettiin western blot-analyysi.

Measurement of Cell Proliferation

PSF pudotettiin HT-29 ja DLD-1-solut, jotka ympättiin 96-kulttuuri levyt (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani): 10 ui Cell Counting Kit-8 lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 2 tunnin ajan inkubaattorissa 5% CO

2; määrä oranssin formatsaanin väriaine tuotettu laskettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä mikrolevylukijalla (Awareness Technology, Inc., Palm City, FL, USA).

Detection of Sytoplasmiset vakuolisaation

DLD-1 ja HT-29-soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyille DMEM: ssä 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen PSF siRNA. Näinä ajankohtina, solut tutkittiin Olympus-fluoresenssimikroskoopilla. Kuvat analysoitiin laskemalla kokonaismäärä solujen määrä ja vakuoleja soluja.

PPARy aktivaatio määritettiin HT-29 tai DLD-1-solut transfektoitiin 125 ng: pGL3-pPre-asyyli-CoA-oksidaasin sivektorissa, 62,5 ng pcDNA3.1-PPARy-vektori, ja 12,5 ng pSV-β-galaktosidaasi (Promega) vektori, joka rakennettiin, kuten aiemmin on raportoitu [21], [22]. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin Opti-MEM (Invitrogen), joka sisälsi testattavaa yhdistettä liuotettuna DMSO: hon (jopa 0,1%) ja viljeltiin vielä 20 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ONE-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega) käyttäen LuMate mikrolevyn luminometrillä (Awareness Technology, Inc., Palm City, FL, USA).

Nisäkkäiden Kaksoishybridiseulonta Analyysit

CV-1-soluja maljattiin 96-kuoppalevylle (Iwaki) tiheydellä 1,5 x 10

4 solua per kuoppa DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin ohimenevästi 71 ng pGL4.31 [

luc2P /GAL4UAS /Hygro

] vektori, 14,3 ng pFN11A-PSF vektori, 14,3 ng pFN10A-PPARy vektori, ja 10 ng pSV-β-galaktosidaasi-vektoriin (Promega) käyttäen X-tremeGENE HP DNA-transfektioreagenssia (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). 48 h transfektion jälkeen solut analysoitiin ONE-Glo ™ Luciferase Assay System (Promega) käyttäen Power Scan 4 mikrolevylukijalla (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Näytteet ajettiin viitoset, ja keskiarvo ± SEM laskettiin. Tiedot edustavat vähintään 3 riippumatonta transfektioiden.

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastollisessa vertailussa. Eroja pidettiin merkittävinä, kun p-arvo oli alle 0,05.

Tulokset

Proteiini-proteiini vuorovaikutukset arvioimana Alasvetoköysi Kokeet

Pull-down kokeita His-leimattu fuusioproteiineja kiinnitetty metalli affiniteettihelmillä ovat seulontatekniikka tunnistamiseksi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia. Käyttäen 6 × His-PPARy syöttinä (Fig. 1A, oikea paneeli), onnistuneesti kiinni mahdollisen kohdeproteiinin (100 kDa) peräisin HT-29 tumaekstraktien (Fig. 1A). Perusteellisen pesemisen jälkeen sitoutuneet proteiinit ja jää proteiini leikattiin irti geelistä, trypsiini-pilkottu, ja analysoitiin peptidi massa sormenjälkien MALDI-MS: llä. Tandem-massaspektrometrialla (MS /MS) tiedot, joista polyesterikatkokuitujen proteiinin on esitetty kuvassa. 1A. Koska Polyesterikatkokuituja tumaproteiini, me sitten suorittaa solufraktioinnin, western blotting-analyysi, ja immunovärjäystä polyesterikatkokuitujen. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, HT-29 ja DLD-1 solulinjoissa, PSF lokalisoitu pääasiassa sisällä ydin- pelletti. Toisaalta, HT-29-solujen, PPARy sijaittava sytosolin ja ydinvoima jakeet. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vuorovaikutusta PPARy ja PSF, suoritimme samanaikainen immunosaostus (co-IP) käyttävien kokeiden tumaekstraktien. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, PSF havaittiin anti-PSF-vasta sen jälkeen, kun immunosaostus ydinvoiman otteita HT-29 ja DLD-1-soluissa anti-PPARy-aineella. Siten PSF ja PPARy vuorovaikutuksessa koolonkarsinoomasoluissa.

(A) Avattava affiniteettisitomismenetelmä määrityksessä puhdistetulla PPARy. Täyspitkä PPARy ilmaistaan ​​

E. coli

kuten 6 x His-fuusioproteiini eristettiin ja puhdistettiin käyttäen TALON hartsia (ylempi oikea paneeli). 6 × His-PPAR-proteiinia inkuboitiin tumaekstrakteilla eristetty HT-29-soluja. Kun oli pesty pesupuskurilla, hartsi kerättiin sentrifugoimalla, ja SDS-PAGE suoritettiin 5-20% (w /v) akryyliamidigeelissä. Erotettu Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin Coomassie Brilliant Blue. Proteiini kaistalla (a) leikattiin geelistä, digestoitiin trypsiinillä, ja tunnistetaan massa sormenjälkien. Määrä peptidejä, sekvenssi-kattavuutta, ja hakunumerolla proteiinin on esitetty taulukossa S1. (B) tarkastaminen lokalisoinnin PSF ydin- ja sytosolisessa otteita HT-29 ja DLD-1-soluissa. Soluliman tiivisteet ja tumauutteita valmistettiin soluista ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen vasta-ainetta ihmisen PSF. Immunofluoresenssivärjäyksen formaliinilla kiinnitettyjä HT-29 ja DLD-1-soluissa osoittaa ydinvoiman lokalisointi polyesterikatkokuitujen (oikea paneeli). (C) HT-29-soluja hajotettiin hajotuspuskuria ja sitten analysoitiin samanaikainen immunosaostus ja Western blotting anti-PSF vasta-aine. Pelkät kuulat ja normaalia kanin seerumia (IgG) käytettiin negatiivisina kontrolleina. Nuolet osoittavat asennon PSF (100 kDa).

vuorovaikutus pFN-PSF ja pFN-PPAR-fuusioproteiinien in CV-1 solut

tutkia mahdollisuuksia vuorovaikutusta polyesterikatkokuitujen ja PPARy, olemme analysoineet niiden vuorovaikutukseen nisäkkään kaksi-hybridi-määritystä, CV-1-soluissa. CV-1-soluja käytettiin, koska ne eivät ilmennä PPARy [21]. Kuten odotettua aikaisemmista kokeista, koekspressio PSF, on fuusioitu GAL4: n DNA: ta sitovan domeenin, ja PPARy, fuusioitu VP16 aktivaatiodomeenissa, indusoi GAL4-promoottori-driven lusiferaasin ilmentymistä (3,0-kertaiseksi, että tyhjiä vektoreita, Fig. 2A). Vaikutus rosiglitatsonin kykyyn PPARy-PSF aiheuttavan lusiferaasiekspressiota analysoitiin kuten kuvassa. 2B. PPARy aktivointi ei merkittävästi vaikuta PPARy-PSF -alueella. Seuraavaksi määritetään fyysinen sijainti vuorovaikutuksen sivustoja. PSF koostuu 707 aminohaposta (aa), on molekyylipaino 76 kDa, ja se koostuu 2 rakenteelliset ja toiminnalliset domeenit [23]. Sen tutkimiseksi, mitkä näistä verkkotunnuksia ovat ratkaisevia vuorovaikutusta PPARy rakensimme PSF häviämämutantteja. Vuorovaikutus Kimeerisen Gal4-PSF deleetiomutantit kanssa VP16-PPARy arvioitiin käyttäen nisäkkään kaksi-hybridi reportterigeenimäärityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, menetys aminohappoja 1-290 PSF ei ollut vaikutusta vuorovaikutukseen. Näin ollen N-pään domeeni ei ole välttämätön näiden proteiinien vuorovaikutus. Menetys aminohappojen 291-370 PSF häirinnyt vuorovaikutusta polyesterikatkokuitujen ja PPARy. Poistaminen aminohapot 371-450, 451-662, ja 452-707 polyesterikatkokuitujen myös häirinnyt vuorovaikutus PPARy. Yhdessä tuloksemme tunnistettu ensimmäisen nukleotidin sitova domeeni (aa 291-370) tärkeänä molekyyli- sivuston PPARy sitova.

(A) Kaaviokuva kahden hybridin määrityksessä käyttäen täyspitkän PSF ja PPARy . Nisäkkään kaksi-hybridi-määrityksessä, CV-1-solut ko-transfektoitiin GAL4-UAS-Luc yksin tai yhdessä pFN11A-PSF (BIND) ja pFN10A-PPARγ1 (VP16 transaktivaattoria). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut lyysattiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Tulokset on esitetty kertainen induktio verrattuna negatiiviseen kontrolliin (GAL4-UAS-Luc yksinään) ja edustavat keskiarvoa kolmena rinnakkaisena edustavasta kokeesta, jossa virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman. (B) CV-1-solut kotransfektoitiin GAL4-UAS-Luc, pFN11A-PSF, ja pFN10A-PPARγ1. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin rosiglitatsoni, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Rosiglitatsonihoitoon (0,1-10 uM) ei vaikuttanut PSF-PPARy vuorovaikutus. (C) Kaaviokuva PSF perustuu toimialueen ennustustyökalun SMRT; nukleotidi-sitova domeeni on merkitty. Verkkotunnukset sisällä PSF sisältää C-pään nukleotidin tunnustamista motiiveja (NRM1 ja NRM2) ja latautuneita verkkotunnus. N-päähän sisältää proliini-glutamiini-rikas aloilla ja arginiini-glysiini-rikas verkkotunnuksia. Vuorovaikutus PPARγ1 kanssa typistettyjä muotoja PSF analysoitiin käyttäen nisäkkään kaksi-hybridi-määrityksessä. CV-1-solut transfektoitiin plasmideilla, että ilmentyminen GAL4-UAS-Luc, pFN11A-PSF kimeerisen proteiinin, VP-16-PPARγ1 proteiineja, ja osoitetun deleetiomutanttien. Kannen induktio lusiferaasin aktiivisuus laskettiin suhteessa negatiiviseen kontrolliin. Virhe palkit edustavat keskihajonnan.

PPARy Aktivointi ei säädetä PSF Expression in HT-29 ja DLD-1 solut

määrittämiseksi PPARy: n säätelijänä PSF ilmaisua, tutkimme vaikutukseen PPAR-agonistin, rosiglitatsonia (10 uM), on polyesterikatkokuitujen ilmaisun DLD-1 ja HT-29-soluja. Kuten kuvioissa. 3A ja B, HT-29-solujen stimulaatio rosiglitatsonin ei estänyt PSF mRNA ja proteiinin ilmentyminen; Ilmaisulla tasot laskivat DLD-1-solut stimuloidaan rosiglitatsonin. Selektiivinen ja palautumaton PPARy-antagonisti GW9662 (10 uM) ei estänyt PSF ilmentymistä kummassakaan solulinjassa. Lisäksi lisäämällä GW9662 ja rosiglitatsonin ei muuttunut PSF mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PSF ilmaisu on PPARy-riippumaton ja osoittavat, että muita menetelmiä kuin PPARy stimulaatio säädellä PPARy-PSF akselilla.

(A) Reaaliaikainen PCR mittaus PSF mRNA ja proteiinin ilmentyminen in HT-29 ja DLD-1-soluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon (DMSO), rosiglitatsonin (Rosi), tai GW9662 (GW) 20 tuntia. PCR suoritettiin käyttäen alukkeina PSF. Suhteellinen PSF tasot normalisoitiin 18S- rRNA ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (

n =

3), ** P 0,01. Lisääminen GW9662 yhdessä Rosi ei muuttunut PSF mRNA ja proteiini ekspressiotasot. Proteiini tasot analysoitiin SDS-PAGE ja Western blot ja visualisoidaan tehostetun kemiluminesenssin reagenssilla. Kukin kaista ladattiin 50 ug kokosolu-lysaattia. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

knockdovvn PSF Estää Cell proliferaatiota ja indusoi vakuolisaatiota DLD-1 solut

vaikutusten arvioimiseksi polyesterikatkokuitujen leviämisen HT -29 ja DLD-1-solut, PSF ilmentyminen tippuu alas käyttämällä siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, knockdown polyesterikatkokuitujen ilmentymisen HT-29 ja DLD-1-soluissa käyttämällä siRNA oli tehokasta, mistä on osoituksena western blot-analyysi käyttäen anti-PSF vasta-aine. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti, että polyesterikatkokuitujen mRNA siRNA transfektoiduissa soluissa, joka pudotettiin 80-90% verrattuna ilmentymisen transfektoimattomissa (UT) kontrolli soluja. DLD-1-soluissa esiintyi tyhjiä, Lucent tiloja faasikontrastimikro- kuvia 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion (Fig. 4C). 48 ja 72 h transfektion jälkeen, noin 30 ja 40% kokonaismäärästä solujen, vastaavasti, osoittivat laajaa vakuolisaation sytoplasmaan. Vakuolisoituminen kasvoivat lukumäärältään ja kooltaan, miehittää yhä suurempia alueita sytoplasmaan ajasta riippuva tavalla. Seuraavaksi määritti PSF Knockdown soluproliferaatioon käyttäen kolorimetristä määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, PSF knockdown vakavasti esti soluproliferaation DLD-1-soluissa, joka on alhaisempi endogeenisen tason PPARy kuin HT-29-soluja. Mielenkiintoista, PSF knockdown heikosti inhiboi solujen lisääntymistä in HT-29 ja LOVO soluja verrattuna proliferaatioon DLD-1 ja Caco-2-soluihin. Täten HT-29-solujen näyttävät olevan vastustuskykyisempiä PSF Knockdown aiheuttama kasvun estäminen.

(A) ilmentyminen polyesterikatkokuitujen pudotettiin HT-29 ja DLD-1-soluissa. Yhteensä proteiini uutettiin transfektoimattomista (UT), ohjaus siRNA- tai PSF siRNA-transfektoiduissa soluissa. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, kokosolulysaateista tehtiin Western blot analyysi polyesterikatkokuitumarkkinat. Inkubointi anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin proteiini-loading ohjaus. (B) vaikutus siRNA mRNA ilmaisun HT-29 ja DLD-1-soluissa. Tehokkuus PSF Knockdown laskettiin olevan 80% reaaliaikaisella kvantitatiivinen RT-PCR. Data esitetään keskiarvoina ± SEM (

n =

3). (C) 24 h transfektion jälkeen, solut uudelleen maljattiin 96-kuoppalevyille (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 48 tuntia. Sytoplasmisen vakuolisaation näkyi DLD-1 soluja faasikontrastimikro- kuvien jälkeen siRNA transfektion (merkitty nuolilla). Vakuoleja solut analysoitiin ja laskettiin kuten kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Vähintään 3 aloilla solua näytettä kohden laskettiin ja taulukoitu. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (

n =

3), ** P 0,01. (D) aika-riippuvaisen solukasvun esto mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8: 24, 48, 72, 96, ja 120 h kuluttua siRNA transfektion. Sama määrä soluja (1 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboidaan sitten 24 tuntia 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2. Sitten 10 ui Cell Counting Kit-8 lisättiin keskipitkällä ja inkuboitiin 2 tunnin inkubaattorissa (5% CO

2). Määrä oranssi formatsaanin väriaineen tuotti laskettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä mikrolevylukijalla. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (

n =

4), ** P 0,01.

PPARy Expression taso on kriittinen Suojaus PSF Knockdown aiheuttama solukasvuneston

Kuten kuvioissa. 5A ja B, tutkimme PPARy ja PSF-mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä 4 ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HT-29, DLD-1, Caco-2, ja LOVO. Kokonais-RNA eristettiin käsittelemättömät solut. Reaaliaikainen PCR-analyysi paljasti, että suhteellinen taso PPAR mRNA näissä soluissa oli luokkaa HT-29 LOVO Caco-2 DLD-1. Vastaavasti edellisessä raportissa ehdotettiin, että PPARy proteiini taso on korkea HT-29 ja LOVO solut ja alhainen Caco-2 ja DLD-1-soluissa [19]. Tämä havainto on sopusoinnussa myös kertomuksen Kitamura et al. [24]. Seuraavaksi testata toiminnallisuuden PPARy, transfektoimme solulinjaa lusiferaasireportteriplasmidi. HT-29 ja LOVO solut reagoiva rosiglitatsoni kuin DLD-1 ja Caco-2-solut (Fig. 5C). Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.