Krooninen sairaus

tiivistelmä

Curcumin aktiivinen komponentti kurkuma, on osoitettu suojaavan syövän synnyn ja estää kasvainten kehittymiseen. Kuitenkin vähän tiedetään sen anti-kasvain mekanismi pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että curcumin voi estää SCLC soluproliferaatiota, solusyklin, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi kautta tukahduttaminen STAT3. SCLC-soluja käsiteltiin curcumin (15 mikromol /l), ja tulokset osoittivat, että curcumin oli tehokas estämään STST3 fosforylaation downregulate on joukko STAT3 loppupään tavoitteita, mikä osaltaan solujen proliferaatio, menetys pesäkkeen muodostumisen, masennus solun muuttoliike ja invaasio. Curcumin myös tukahdutti ilmentymisen proliferatiivisen proteiinien (surviviinia Bcl-X

L ja sykliini B1), ja invasiivisia proteiinit (VEGF, MMP-2, MMP-7 ja ICAM-1) .Knockdown of STAT3 ilmentymisen siRNA kykeni indusoimaan anti-invasiivisen vaikutuksia in vitro. Sen sijaan aktivoituminen STAT3 ylävirtaan interleukiini 6 (IL-6) johtaa lisääntynyt

solun

lisääntymistä,

solujen

eloonjäämisessä, angiogeneesissä, invaasio, muuttoliike ja kasvaimen kasvua. Meidän havainnot kuvaavat biologinen merkitys IL-6 /JAK /STST3 signalointi SCLC etenemiseen ja providenovel näyttöä siitä, että polku voi olla uusi potentiaalinen kohde terapiassa SCLC. Katsottiin, että curcumin on voimakas agentti eston STAT3 suotuisa farmakologinen aktiivisuus, ja curcumin voi olla translaation potentiaalia tehokkaana syövän terapeuttiseen tai ehkäisevä aine SCLC.

Citation: Yang CL, Liu YY, Ma YG, Xue YX, Liu DG, Ren Y. et al. (2012) Curcumin Blocks pienisoluinen keuhkosyöpä Cells Migration, Invasion, Angiogeneesi, Cell Cycle ja neoplasiaa kautta Janus-kinaasi-STAT3 merkinanto Pathway. PLoS ONE 7 (5): e37960. doi: 10,1371 /journal.pone.0037960

Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Intia

vastaanotettu: 01 helmikuu 2012; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 25, 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Foundation of maakunnan Key laboratorio ruokatorven syöpään, Liaoningin Ministry of Science and Technology, Kiinan kansantasavalta (nro [2011] 20), Liaoningin Department of Health, kansantasavalta Kiinan (nro 2010-079), Liaoningin Department of Human Resources ja sosiaaliturva, kansan Kiina (nro 2009-390). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Signal anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3) proteiini on perheen jäsen piilevä sytoplasmisen transkriptiotekijöiden signaalien lähettämiseksi solun pinnalta tumaan aktivoida sytokiinien ja kasvutekijöiden. Sidos solun pinnan reseptorien ligandien kanssa, kuten interleukiini-6 (IL-6) tai epidermaalisen kasvutekijän (EGFR), indusoi tyrosiinifosforylaation STAT3-proteiinin Janus-kinaasi ja kasvutekijän reseptorityrosiinikinaasit [1]. Aktivoitu dimeerimuodoksi fosfo- STAT3 siirtyy tumaan ja säätelee geenien ilmentymistä, jotka sisältävät STAT3-sitoutumiskohtia niiden promoottorien [2]. Aktivoituminen STAT3 proteiini on nopeaa ja ohimenevää normaaleissa soluissa. STAT3 säätelee biologisia perusprosesseja, myös solujen jakautumista, selviytyminen, ja kehitys. Äskettäin, varaamiseen näyttö osoittaa, että poikkeavuuksia Janus-kinaasi (JAK) /signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription (STAT) signalointireitin osallistuvat oncogenesis useiden syöpien [3].

Aktivoidut STAT3 (ydin- pSTAT3) ilmaistaan ​​noin 55% NSCLC kasvaimista, mitattuna immunohistokemiallisella analyysit [4] – [6]. STAT3 aktivointi on havaittu useimmissa NSCLC solulinjojen [7], [8]. Toisin kuin NSCLC, vahva pSTAT3 ilmentyminen osoitettiin 100% (10/10) SCLC kasvaimen testatuissa kudoksissa [9]. Kuitenkin mekanismi, jolla väärin säädellystä STAT3 signalointia edistää etenemistä ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) ei ole selvitetty. SCLC tiedetään aggressiivisemman biologian nopea kasvu ja varhainen levisi sekä yhteinen yhdessä paraneoplastic oireyhtymät [10]. Kaikista histologinen tyypit keuhkosyöpä, SCLC on herkin kemoterapiaa ja säteily, mutta ennuste on edelleen huono, ja sen kokonaispaksuus mediaanielossaolosta käsittelyn jälkeen 10 kuukauden ja 5 vuoden pysyvyys 5% [11]. Vanhukset keuhkosyöpäpotilaita ja ne, joilla on huono suorituskyky tila ei kemoterapiaa, koska korkea myrkyllisyys monilääke hoito. Löytö uusien aineiden, joilla on vähemmän vakavia haittavaikutuksia on suuri välttämättömyys. Kliinisissä syöpäpotilaiden hoidossa, monet reseptilääkkeiden ovat peräisin luonnon kasvilajeista [12].

Kurkumiinia johdettu kurkuma (

Curcuma longa

) ja on luonnollinen polyphenol. Kurkumiini on jo pitkään käytetty elintarvikkeena, väriainetta, ja perinteisen lääketieteen. Se on turvallinen ja myrkytöntä ja on osoitettavissa antitumor tulehduksenvastainen, apoptoottisten, ja antioksidanttisia ominaisuuksia [13]. Erityisesti sen antikarsinogeenisia omaisuus, silti on tehty paljon kiinnostusta. Yhä enemmän todisteita osoittivat, että kurkuma on syöpää ehkäisevistä vaikutuksista vastaan ​​erilaisia ​​ihmisen kasvainsoluissa, mukaan lukien munasarjasyöpä soluja, paksusuolen syövän solujen ja astroglioma soluihin [14], [15]. Tämä syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on curcumin tunnistettiin häiritsee solusyklin, aiheuttamaan apoptoosin, ja estämällä invasiivisia potentiaalia syöpiä. Kuitenkin mekanismit tämän syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on vielä tutkittavana, erityisesti sen anti-invasiivisen potentiaalia SCLC cancer.We ovat osoittaneet aikaisemmin, että curcumin estää SCLC solujen kasvua ja indusoi SCLC-solujen apoptoosin [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme molekyylitason mekanismeja, joiden kurkuma tukahduttaa muuttoliike ja hyökkäyksen SCLC soluissa. Tavoitteena oli selvittää rooli JAK /STAT signalointi SCLC etenemistä ja testata hypoteesia, jonka mukaan curcumin voisi toimia terapeuttisina kohteina.

Tulokset

Tavoitteemme tässä tutkimuksessa oli selvittää curcumin moduloi kasvu SCLC solulinjojen ja jos on, hahmotella erilaisia ​​mekanismeja, joilla se voi välittää sen vaikutuksia. Tutkimme vaikutukset kurkumiinista Jaks aktivointi, STAT3 aktivointi ja STAT3-säänneltyjä geenituotteiden ja solujen kasvua SCLC (NCI-H446 ja NCI-1688) soluja. Aikaisemmassa tutkimuksessa, tunnistimme korkeampaa p-STAT3 ilmentymistaso NCI-H446-solulinjoja verrattuna muihin ihmisen SCLC solulinjat. Valitsimme NCI-H446-soluissa tälle tutkimukselle.

IL-6 indusoi ihmisen SCLC-solujen, ja curcumin tai si STST3 estää sitä. Curcumin tai siSTAT3 estää leviämisen NCI-H446 ja NCI-1688-soluissa. Tutkia roolia STAT3 toiminnassa SCLC-solujen, STAT3 aktivaatio ja inhibitio indusoitiin IL-6 ja siSTAT3 tai kurkumiini, vastaavasti. Transfektion jälkeen STAT3 siRNA (siSTAT3) tai kontrolli-siRNA: (kaupallisesti negatiivinen kontrolli), ilmentyminen STAT3 arvioitiin käyttäen Western blot ja RT-PCR: llä. Olemme havainneet, että siSTAT3 merkittävästi vaimentua proteiini- ja mRNA-tasojen STAT3, verrattuna ohjaus siSTAT3 (Fig. 1).

Solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai STAT3 siRNA (si STAT3). Transfektion jälkeen ilmentymistä STAT3-proteiinin (A) ja mRNA: n (B) arvioitiin käyttämällä Western blot ja RT-PCR: llä ja verrattiin transfektoimattomiin NCI-H446 ja NCI-H1688-soluissa. Sarakkeet ”NCI-H446 ja NCI-H1688-solujen” vastaavat käsittelemättömiin soluihin vastaavasti. Pylväät ”siSTAT3” vastaavat transfektoitu STAT3 siRNA.The sarakkeet ”ohjaus” vastaavat transfektoitu ohjaus siRNA. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolli soluihin.

toistavat aiemmissa raporteissa [17], [18], että IL-6 indusoi syöpäsolujen, me serum- nälkään NCI-H446 ja NCI-1688-solujen 12 tunnin ajan ja sitten viljeltiin niitä puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina IL-6: ssa 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia. IL-6 indusoi NCI-H446 ja NCI-1688 annoksesta riippuvalla tavalla. Tulosten mukaan meidän alustavassa kokeessa, 25 ng /ml pitoisuuksia IL-6 edistänyt merkittävästi solujen proliferaatiota, verrattuna 12,5 ng /ml pitoisuuksia, kun taas ei ollut mitään merkitsevää eroa 25 ng /ml ja 50 ng /ml pitoisuuksia (kuvio . 2). Puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) arvo curcumin oli 15 uM SCLC soluissa aikaisemmista julkaistu paperi [16]. Sen vuoksi, 25 ng /ml konsentraatio IL-6 ja 15 uM curcumin käytettiin seuraavassa kokeessa. SiSTAT3 yksin tai 15 uM curcumin ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 3). Merkittäviä eroja havaittiin välillä kaikkina ajankohtina tutkittiin, mikä osoittaa lineaarinen kasvu leviämisen altistumisen lisääntyessä kertaa IL-6 (kaikki

p

0,05).

Soluja käsiteltiin IL- 6 (12,5, 25 tai 50 ng /ml) 24, 48 tai 72 h, ja solujen elinvoimaisuus arvioitiin käyttämällä BrdU-määritystä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna soluihin ei käsitelty IL-6.

Soluja käsiteltiin curcumin (15 uM ) 24, 48 tai 72 h, ja solujen elinvoimaisuus arvioitiin käyttämällä BrdU-määritystä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

#

p

0,05 tai

##

p

0,01 verrattuna transfektoitu ohjaus siRNA soluihin.

Curcumin estää SCLC-solujen muuttoliikettä ja invaasiota. Estoja NCI-H446 ja NCI-1688 solumigraatio by curcumin tutkittiin käyttämällä haavan paranemista määrityksissä ja siirtokuoppaan muuttoliikkeen malleja ja tulokset on esitetty kuvassa. 4 ja kuvio. 5A. Curcumin (15 umol /l) kykeni merkitsevästi estävän NCI-H446 ja NCI-1688 SCLC-solujen muuttoliikettä, ja tämä vaikutus oli yhdenmukainen sekä haavan paranemista ja transwell muuttoliikkeen malleja. Lisäksi haavan paranemista määrityksissä ja siirtokuoppaan muuttoliike -malli tutkimukset osoittivat, että siSTAT3 kykeni estävät solujen migration.IL-6 pystyi edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Matrigel-pohjainen siirtokuoppaan määritys osoitti, että curcumin tai siSTAT3was pystyvät merkittävästi estävät solujen invaasiota (Fig. 5B). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että curcumin on anti-muuttoliike ja anti-hyökkäyksen vaikutuksia vastaan ​​SCLC soluihin.

Yhtenäisiä yksikerroksiset solut arpinen, ja korjaus seurattiin mikroskooppisesti 24 tunnin kuluttua hoidon curcumin 15 uM tai IL-6 25 ng /ml. Edustaja valokuvat osoittivat samalla alueella ajanhetkellä nolla ja 24 tunnin kuluttua inkubaation kanssa tai ilman curcumin. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 tai **

p

0,01 verrattuna kontrolli soluihin.

Kun 8 tunnin inkuboinnin tai ilman ilmoitetun pitoisuuden kurkumiinin, solut, jotka vaeltavat alempaan kammioon kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin valomikroskoopilla tai flurescent mikroskopiaan perustuvia korkea pitoisuus seulonta järjestelmä, kuten kuvataan materiaalit ja menetelmät. Random kentät skannattiin (neljä kenttää kohti suodattimen kuoppa) läsnäolo solujen alemman membraanin. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolli soluihin.

#

p

0,05 verrattuna soluihin käsitelty IL-6 (25 ng /ml). B, vaikutus curcumin hoidon soluinvaasiota määritettiin käyttämällä matrigeelin Invasion -määrityssysteemiä. NCI-H446-solut seerumivapaassa väliaineessa tai ilman curcumin ympättiin ylempään kammioon järjestelmän. Pohja hyvin täytettiin täydelliseen alustaan. 16 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut, jotka olivat tunkeutuneet läpi Matrigel kalvon värjättiin 20% Giemsa-liuoksella ja laskettiin valomikroskoopilla (suurennus, x 200). Kokeet suoritettiin kolmesti kolmena kappaleena. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolli soluihin.

#

p

0,05 verrattuna soluihin käsitelty IL-6 (25 ng /ml).

tärkeys IL-6 /JAK /STST3 väylän kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Ankkuroinnista riippumattoman kasvun SCLC-solujen määritettiin pehmeällä agar-määritys [19]. NCI-H446-soluissa pystyivät rakentamaan suuria aggregaatteja pehmeässä agarissa 15 päivän aikana tarkkailujakson aikana. Sitä vastoin ei ollut proliferaatiota kun läsnä on siSTAT3 tai curcumin, mikä viittaa panoksen tämän reitin tässä prosessissa. Oli täydellinen edistää, jonka IL-6, mikä viittaa merkitys tämän väylän kiinnittymisestä riippumatonta kasvua (Fig. 6). Ensimmäisellä viikolla, solut näyttivät melko samanlainen mikroskoopilla, lukuun ottamatta sitä, että esti niitä ei lisääntyä. Kuitenkin, kun 7-14 päivää solut inhiboitui curcumin alkoivat muuttaa morfologia.

Pesäkkeenmuodostusta NCI-H446-soluissa ja ilmoitetusta vakaa alilinjat pehmeässä agarissa. -Solujen havaittiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (x 400) pehmeässä agarissa ja 15 päivää. Pylväät ”ohjaus” vastaavat transfektoitu ohjaus siRNA.

Curcumin aiheuttaa G

2 /M-vaiheen solusyklin pysähtymisen NCI-H446-soluissa. Sen määrittämiseksi, onko kurkumiini estää solusyklin etenemistä NCI-H446-soluja, soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin ja solusyklin jakautumisen analysoitiin virtaussytometrialla, kun 12- ja 24-tunnin altistuminen kurkumiini (15 uM). Havaittiin, että solujen prosenttiosuus G

2 /M vaiheeseen curcumin hoito oli 52,2%, kun 12 tunnin inkuboinnin ja laski 21,2% 24 tunnin kuluttua. Solujen prosenttiosuus Saharan G

0 /G

1 vaihe oli 3,5% ja 37,1%, kun 12 ja 24 tunnin inkuboinnin vastaavasti. Kontrollisoluissa prosenttiosuus solujen G

2 /M ja Sub-G

0 /G

1 vaihe oli 21,7% ja 1,1% (taulukko 1).

määrittämiseksi mahdollinen mekanismi, jolla curcumin vaikuttaa G

2 /M vaiheessa jakelun NCI-H446-soluissa, ilmentyminen sykliini B1 arvioitiin käyttäen RT-PCR: llä ja Western blot. Verrattuna kontrolli solut, curcumin merkittävästi vaimentua mRNA ja proteiini tasoilla sykliini B1, joka liittyy G

2 /M vaiheen etenemisen (Fig. 7). SiSTAT3 ollut merkittävää vaikutusta tasot sykliini B1 ilmaisua. Verrattuna kontrolli-solujen IL-6 merkittävästi voimistunut proteiini- ja mRNA-tasojen sykliini B1. Yhdessä tulokset edellä ilmeistä, että curcumin estää leviämisen SCLC syöpäsolun ja estää sen G

2 vaiheen kautta ilmentymisen estämiseksi sykliini B1.

NCI-H446-soluja käsiteltiin IL-6 ( 25 ng /ml) tai kurkumiini (15 uM) 24 tunnin ajan. Ilmentymistasojen näiden komponenttien arvioitiin käyttäen RT-PCR: ää (A) ja Western blot (B). Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrollisoluihin.

#

p

0,05 verrattuna soluihin käsitelty IL-6 (25 ng /ml).

Curcumin estää IL-6 indusoituvaa STAT3 fosforylaation annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Sen tutkimiseksi, mikäli kurkumiini, joka on suunniteltu valikoivasti tavoite STAT3 osoittaisi samanlaisia ​​estävä vaikutus STAT3 fosforylaatiota, NCI-H446-soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa yli yön ja sitten esi-käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin 1 tuntia tai 15 uM curcumin varten eri aikaan. Käsittelyn jälkeen koko proteiini uutettiin ja fosforyloidun STAT3 ja koko STAT3 analysoitiin western blot. Kuten kuviossa 8, curcumin esti STST3 fosforylaatio tyrosiini 705 annoksesta riippuva ja aika tavalla. Yhteensä STAT3 ei vaikuttanut hoitoon curcumin.

V: Tutkia annoksesta riippuvainen vaikutus NCI-H446cells käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin 1 h. B: tutkimiseksi aika-riippuvainen vaikutus, soluja käsiteltiin kurkumiini (15 uM) 30, 60 ja 120 min. C: tutkimiseksi vaikutus kurkumiinista IL-6-indusoidun p-STAT-3, soluja viljeltiin asdescribed edellä, paitsi että solut esikäsiteltiin IL-6 (25 ng /ml) 1 tunti ennen käsittelyä curcumin (15 uM) 1 tunti. Solut poistettiin osoitettuina aikoina ja hajotettiin valmistaa koko-solu-uutetta. Solut kerättiin ja 20 ug proteiinia koko-solu-uute ladattiin kuhunkin kaistaan. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrollisoluihin.

#

p

0,05 verrattuna soluihin käsitelty IL-6 (25 ng /ml).

Koska IL-6-indusoitujen signaalien välittyvät STAT3 fosforylaatio, on loogista sitten vaikutuksen tutkimiseksi IL-6 ja kurkumiinista STAT3 fosforylaation SCLC-soluja. Vaikka SCLC-solut ilmentävät korkeita tasoja Tyr705p-STAT3 (Fig. 8A ja B). Kuvio 8C esittää, että IL-6-indusoidun STAT3 fosforylaatiota SCLC-solujen väheni curcumin hoitoon. Altistuminen solujen curcumin 1 h merkittävästi tukahdutti IL-6-indusoidun STAT3 fosforylaatiota NCI-H446-soluissa.

Curcumin estää JAK fosforylaation SCLC-soluja. Fosforylaatio STAT riippuu aktivointi Jaks. Jäsenten JAK perheen Proteiinityrosiinikinaasien fosforyloivat fosforyloivat ja aktivoivat sytoplasman STAT-proteiinit. JAK-2 on tunnustettu aktivaattori STAT3 [20]. Me tutkimme, estovaikutukset kurkumiinista aktivoinnista STAT johtuivat tukahduttaminen JAK ilmaisun SCLC cells.Curcumin esti p-JAK-1, p-JAK-2 ja p-JAK-3 ilmentymistä NCI-H446-soluissa (Fig. 9). Expression koko JAK-1, JAK-2 ja JAK-3 ei muuttanut curcumin hoitoon.

NCI-H446-soluja käsiteltiin dfferent pitoisuus curcumin 30 min.These proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Yhtä suuret määrät solun kokonaisproteiinia (20 ug) erotettiin 10% -15% SDS-PAGE. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrollisoluihin.

Curcumin-inhiboi MMP-2, MMP-7, VEGF, surviviinia, Bcl-X

L ja ICAM-1 in SCLC soluissa. Tasot muuttoliikkeen, invaasio ja angiogeneesi liittyy proteiinien NCI-H446-solujen hoidon jälkeen curcumin määritettiin ja kvantifioitiin Western blottauksella. Tulokset on esitetty Figure10 osoittavat, että MMP-2, MMP-7, VEGF: n ja surviviinin (kuvio 10A). BCL-X

L ja ICAM-1 (Fig. 10B) olivat pienemmät kuin vastaavat kontrolliryhmään. Nämä proteiinit on tärkeä rooli solun muuttoliikkeen, invaasio ja angiogeneesi. Nämä vaikutukset saattavat ovat johtaneet esto muuttoliike, invaasion ja angiogeneesin NCI-H446-solujen altistuksen jälkeen curcumin 15 uM.

NCI-H446-soluja käsiteltiin 15 uM curcumin 24 tuntia. Nämä proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Yhtä suuret määrät solun kokonaisproteiinia (20 ug) erotettiin 10% -15% SDS-PAGE. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolli soluihin.

#

p

0,05 verrattuna soluihin käsitelty IL-6 (25 ng /ml).

Keskustelu

SCLC edustaa erittäin pahanlaatuisten ja erityisen aggressiivinen syöpä, varhaisen ja laajaa metastasesand huono ennuste. Tähän mennessä ei ole tietoja rajata vaikutukset kurkumiinista proteiinien säännellään STST3 signalointia SCLC. Useat tutkimukset käyttävät geneettiset ja farmakologisia menetelmiä moduloida konstitutiiviset signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3 (STST3) aktiivisuus ovat perusteltuja kriittisen roolin poikkeavien STST3 toiminnan pahanlaatuisiksi ja syövän etenemiseen ja siten tukemaan STAT3 uutena syöpälääkkeen kohde- [21] .

Curcumin (diferuloylmethane), anti-inflammatorinen aine, jota käytetään perinteisessä lääketieteessä, on osoitettu tukahduttaa solujen transformaatio, proliferaatio, invaasio, angiogeneesi, ja etäpesäkkeiden sellaisen mekanismin kautta, ei täysin ymmärretä. Koska useita geenejä, jotka välittävät näitä prosesseja säätelevät signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription olemme olettaisi, että curcumin välittää sen toimintaa moduloimalla STST3 aktivointia. Tässä tutkimuksessa selvitimme mekanismi, jonka kurkuma ilmenee sen vaikutus STST3 ja STAT3 säädelty alavirtaan geenin ilmentymistä. Osoitimme, että curcumin alassäädetty ilmentymistä STAT3-säänneltyjen geenituotteet osallistuvat solusyklin (sykliini B1), eloonjääminen (Bcl-X

L, surviviinia), angiogeneesin (verisuonten endoteelin kasvutekijä) ja etäpesäkkeiden (matriisi metalloproteinase- 2, matriksimetalloproteinaasi-7 ja solujen välinen adheesiomolekyyli-1). Perinteisesti solusyklin on erillisiä neljään vaiheeseen: DNA: n kahdentuminen tapahtuu S vaiheessa, ja kromosomi erottelu tapahtuu M vaiheessa. S ja M faasit erotetaan ns aukko vaiheet, G

1 (ennen DNA-replikaation) ja G

2 (ennen mitoosi). Tutkimuksemme osoitti, että curcumin esti NCI-H446-solujen lisääntymistä indusoimalla G

2 /M solusyklin pysähtymiseen johtavat apoptoottisen solukuoleman. Merkittäviä eroja ei havaittu koskien jakautuminen solujen G

0 /G

1 ja S vaiheissa. Tässä tutkimuksessa sekä proteiini- että mRNA-tasot sykliini B1 merkittävästi vaimentua, kun soluja käsiteltiin curcumin 24 tuntia. Sykliini B1, joka on yli-ilmentynyt useissa eri kasvaimissa, säätelee STAT3, jota tarvitaan solujen edetä G

2 vaiheesta M vaiheen solusyklin [22], [23]. Tämä havainto osoittaa ensimmäistä kertaa, että curcumin on pidätys vaikuttaa solusyklin etenemistä, joihin G

2 /M vaihe SCLC soluissa. Se voi myös selittää antiproliferatiivisia vaikutuksia curcumin. Meidän laboratorio on osoittanut aiemmin, että curcumin voi aiheuttaa SCLC-solujen apoptoosin. Sen lisäksi, että konstitutiivisen aktivaation STAT3 pystyimme osoittamaan, että stimulointi SCLC-solujen IL-6 lisäsi STST3 fosforylaatiota SCLC cells.Our tulokset vahvistavat potentiaalia curcumin kuin multitarget lääke syövän hoitoon.

löytää että curcumin esti SCLC soluinvaasiota kautta alas-säätely ilmentymisen STAT3 säänneltyjen geenituotteiden osallistuvat solujen invaasiota (esimerkiksi MMP-2 ja MMP-7). Alas-säätely VEGF kuten tässä voisi selittää haarapesäkkeiden toimintaa curcumin [24]. ICAM-1 on liitetty syöpää aiheuttavia prosesseja, ja sen yliekspressio pahanlaatuisia soluja on osoitettu parantavan solujen invaasio, indusoi angiogeneesiä, säännellä antiapoptoottisten solu puolustuksemme, ja kasvattaa immunologisia vastus kautta prostaglandiini E2 [25]. MMP-2 ja MMP-9 on ratkaiseva rooli tuumorin invaasio ja angiogeneesin välittäjänä hajoaminen soluväliaineen, ja inhibitio MMP aktiivisuuden on osoitettu tukahduttaa keuhkosyövän etäpesäkkeiden [26].

tutkimiseksi mekanismi curcumin aiheuttaman STAT3 estäviä vaikutuksia in SCLC soluissa analysoitiin proteiinit ylävirtaan STAT3. Roolit JAK ovat sekaantuneet STAT3 aktivointi. Kuten kuviossa 8C ja 9B, fosforylaatio JAK-1, JAK-2 ja JAK-3 tukahdutettiin käsittelemällä kurkumiini on SCLC-soluja. On todennäköistä, että inhibitio Tyr705 STAT3 johtuu eston JAK koska esto JAK fosforylaation tapahtui 30 minuutin käsittelyn jälkeen, kun taas STAT3 fosforylaatio inhiboitui 1 tunnin käsittelyn jälkeen. Tämä viittaa siihen, että curcumin voisi ilmentää sen vaikutus STAT3 aktivointi kautta estämällä Jaks. Aikaisemmassa tutkimuksessa, laboratoriossamme havaittu, että kurkuma estää selektiivisesti STAT3 tyrosiinifosforylaatiota, mutta ei vaikuta seriinifosforyloinnin STAT3 on SCLC-soluja. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa tutkimukset Saydmohammed et al [27]. He havaitsivat, että curcumin eivät estäneet fosforylaatiota STAT3 at Ser727 endometriumin ja munasarjojen syöpäsolujen. Kun IL-6 stimulaation, STST3 nopeasti fosforyloitiin Tyr705 ja kulkeutua tumaan. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että IL-6 välitteinen STAT3 Tyr705 fosforylaatio on lähinnä ydintapahtuman.

Monissa kasvaimissa ja syöpäsolut, konstitutiivinen aktivaatio STAT3 on IL-6 riippuvaisia ​​joko autokriinisella tai parakriinistä signalointia, joka näyttää olevan laajalti ilmaistaan ​​syöpäsolulinjoissa [28]. Joissakin tapauksissa, aktivointi STAT3 reitin korreloi reipas kasvaimeen tulehdussolujen infiltraatiota, mikä tarkoittaa, että STAT3 aktivointi voi tapahtua paracrine mekanismien [29]. Koska tässä tapauksessa estyminen STAT3 aiheutti vähentynyt IL-6.The aktivaatio STAT3 reitin on tutkittu potilaiden kasvain kudosnäytteitä. Tasot p-STAT3 ilmaisu korreloi eloonjäämisaste ja vakavuus kordooma [30]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös liittyvät aktivoinnin STAT3 väylän korkea histologinen ja pitkälle useissa syövissä [31]. Nämä tulokset viittaavat siihen, STST3 voi paitsi toimia ennustava merkki lääkeresistenssin, vaan myös prognoosimarkkerina kasvaimia [32].

Yhteenvetona ennen tämän raportin, ei ollut tietoja tilasta JAK /STAT3 signalointi proteiineja SCLC soluissa ja niiden sääntelyä curcumin. Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka on tutkittu yksityiskohtaisesti curcumin syöpälääkkeen mekanistinen rooli JAK /STAT3 signalointi SCLC kasvainten synnyssä ja etenemisessä. Tämän merkitys tutkimus on, että olemme tunnistaneet perturbance lukemattomien JAK /STAT signalointi proteiineja syöpäsoluissa. Siten STAT3 on merkittävä rooli SCLC onkogeneesiin ja voisi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde SCLC hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja vasta-

Curcumin (1,7 bis [4-hy-droxy-3-metoksifenyyli] -1,6-heptadieeni-3,5-dioni) ostettiin Sigma-Aldrich (St.. Louis, MO), liuotettuna DMSO: hon varastossa pitoisuutena 10 mM , ja laimennettiin osoitettu pitoisuus RPMI 1640-väliaine. Vasta-aineet Surviviinia, Bcl-X

L, sykliini-B1, P-JAK1, JAK1, P-JAK2, JAK2, P-JAK3, JAK3, Tyr

705-pSTAT3 ja STAT3 ostettiin Cell Signaling Technology ( Beverly, MA). Vasta-aineet VEGF: n, ICAM-1, MMP-2, MMP-7, ja GAPDH ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). siSTAT3 ja Lipofectamine 2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Muut kemikaalit hankittiin Sigma-Aldrich.

Cell Culture

NCI-H446 ja NCI-1688 (ihmisen SCLC) solulinjat aikaisemmista julkaistu paperi [15] viljeltiin RPMI-1640 täydennetty 10% HyClone naudan sikiön seerumia (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) atmosfäärissä 5% CO

2 37 ° C.Cells kasvatettiin 75 cm

2 viljelypulloihin ja korjattu trypsiinin liuos-EDTA: logaritmisen kasvun vaiheessa.

plasmidit ja siRNA

plasmidit pcDNA6.2-STAT3 ja kontrollivektoreihin (määräävän-negatiivinen mutantti STAT3) kuvattiin aiemmin [33]. siRNA-sekvenssejä kohdistaminen STAT3α olivat seuraavat: F, 5′-TGCTGAATGCAGGCAATCTGTTGCCGGTTTTGG CCACTGACTGACCGGCAACATTGCCTGCATT-3 ’ja R, 5′-CCTGAATGCAGG CAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCAACAGATTGCCTGCATTC-3’. Negatiivinen kontrolli: F, 5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTG GCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ’ja R, 5’-CCTGAAATGTA CTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTC-3.

Transient ja vakaa transfektio

transfektio plasmidit ja siRNA: iden pieniksi keuhkosyöpä solut tehtiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ohimeneviä transfektiosta solut transfektoitiin siRNA: lla tai plasmideja erilaisilla annoksilla kuten 48 tuntia ennen toiminnalliset analyysit suoritettiin. Stabiilisti transfeted solulinjoja eristettiin SCLC-soluja transfektoitiin pcDNA6.2-STAT3 plasmidista valinta Blasticidin (Invitrogen, 5 ug /ml).

proliferaatiomääritystä

proliferaatio SCLC-solujen oli määritetään analysoimalla 5′-bromi-2′-deoksiuridiinin (BrdU) sisällyttäminen juuri syntetisoidun DNA: ksi käyttäen soluproliferaation entsyymi immunosorbenttimääritys (Soluproliferaatio ELISA (BrdU), Roche, Mannhein, Saksa). Sillä BrdU, solut laskettiin ja ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (2 x 10

3 solua /kuoppa). BrdU (10 ul /kuoppa) lisättiin SCLC solut kiinnitettiin ja värjättiin 4 h mukaan valmistajan ohjeiden. Kolorimetrinen analyysi suoritettiin ELISA-levyn lukijaa (DTX880; Beckman, Miami, FL) 450 nm: ssä.

Cell Cycle Analysis virtaussytometrialla

hoidon jälkeen curcumin 24 tuntia, SCLC-solujen kerättiin ja pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 75% etanolissa 2 tuntia 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin kaksi kertaa 500 ml: lla kylmää PBS: ää. Sitten solut värjättiin 500 ml propidiumjodidia (PI) värjäysliuosta (50 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, 200 mg /ml DNaasi-vapaata RNaasi PBS: ssä) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Kymmenentuhatta tapahtumaa per näyte hankittiin käyttäen FACS-scan virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), ja prosenttiosuus solujen G

0 /G

1, S, G

2 /M ja Sub-G

2 /M vaiheiden solusyklin määritettiin käyttäen CellQuest- ohjelmistoa (Becton-Dickinson).

arpeutumisprosessit Pitoisuus

SCLC-solujen viljeltiin 24-kuoppaisille levyille ja niitä kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää lähes konfluentin yksisolukerroksen, sitten varovasti naarmuuntunut käyttäen muovista pipetin kärjen tehdä lineaarinen ”haava” on yksisolukerroksen kunkin kuopan. Yksikerroksista pestiin kahdesti PBS: llä poistaa roskat tai irrottaa soluja yksikerroksista, ja sitten kurkumiini lisättiin 15 uM; IL-6: a lisättiin 25 ng /ml; ohjaus hyvin lisättiin 0,1% DMSO: ta liuottimena ohjaus. Viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa ja photographedimmediately ja seurattiin Viivästys Carl Zeiss Axiovert Bio-asema järjestelmässä. Mikroskoopilla, solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat solun vapaa-alueelle, emäs linjalla lineaarisen ”haava” arvioitiin. Kokeet suoritettiin kolmesti kolmena kappaleena ja laskettiin kaksoissokkotutkimuksessa vähintään kaksi investigators.To tutkia solun liikkuvuus, yksikerroksiset SCLC-soluja valmistettiin ja haavoittui kuvatulla above.The haavoittuneita yksikerroksia inkuboitiin 37 ° C: ssa RPMI-1640, joka sisälsi 10