Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä länsimaissa, ja uusia lähestymistapoja eturauhassyövän syöpäriski vähentäminen tarvitaan. Kasviperäiset fenoliyhdisteitä vaimentaa eturauhassyövän kasvua kokeellisissa malleissa useilla mekanismeilla, mikä on linjassa epidemiologista näyttöä viittaa siihen, että kulutus kasvipohjaisen ruokavalioita liittyy vähäinen riski eturauhassyövän. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida vaikutuksia uusi lignaanipitoista stilbenoid seoksen PC-3M-luc2 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

ja potilaalle tehdä ksenografteissa. Lignan ja stilbenoid rikas uute saatiin männyn (

Pinus sylvestris

) solmua. Pine solmu uutetta sekä stilbenoideja (metyyli pinosylvin ja pinosylvin), ja lignaanit (matairesinolin ja nortrachelogenin) läsnä mänty solmu uute osoitti antiproliferatiivisia ja proapoptoottiset tehokkuusyhdistelmän ≥40 uM

in vitro

. Lisäksi mänty solmu uutetta johdettu stilbenoideja parannettu tuumorinekroositekijä liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) aiheuttaman apoptoosin jo ≥10 uM pitoisuuksina. In potilaalle tehdä PC-3M-luc2 ksenograftissa laakeri immuunivasteeltaan hiiriä, kolmen viikon peroraalisen altistuminen männyn solmu uute (52 mg lignaaneja ja stilbenoideja kohti painokilo) oli hyvin siedetty ja osoitti antituumorigeenistä tehon osoitettiin monimuuttujamenetelmin yhdistämällä olennaista merkkiaineiden kasvaimen kasvua (eli kasvaimen tilavuus, verisuonten muodostumista ja solujen lisääntymistä). Metyyli pinosylvin, pinosylvin, matairesinoli, nortrachelogenin, sekä resveratrol, metaboliitti pinosylvin, havaittiin seerumin kokonaispitoisuus 7-73 uM, vahvistaa hyötyosuus männyn solmu saadun uutteen lignaaneja ja stilbenoidien. Yhteenvetona tietomme osoittavat, että mänty solmu ote on uusi ja kustannustehokas lähde resveratrol, metyyli pinosylvin ja muut bioaktiiviset lignaaneja ja stilbenoidien. Pine solmu ote näkyy antikarsinogeenisia tehoa prekliinisissä eturauhassyövän malli, ja meidän

in vitro

tiedot viittaavat siihen, että yhdisteet, jotka on saatu uute voi olla potentiaalia uusina Kemiallisia herkistimiä että TRAIL. Nämä havainnot edistämään lisätutkimuksia terveyteen liittyvissä sovelluksissa puun biokemikaalien.

Citation: Yatkin E, Polari L, Laajala TD, Smeds A, Eckerman C, Holmbom B, et al. (2014) Novel Lignan ja Stilbenoid Seos Näyttää antikarsinogeenisia Teho Prekliiniset PC-3M-luc2 Eturauhassyöpä Model. PLoS ONE 9 (4): e93764. doi: 10,1371 /journal.pone.0093764

Editor: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 tammikuu 2014; Hyväksytty: 08 maaliskuu 2014; Julkaistu: 03 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Yatkin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat FIBIC Suomi Bioeconomy Cluster, BioRefine ohjelman Suomen Tekes teknologian ja innovaatioiden sekä Suomen Akatemia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä miehillä Pohjois-Amerikassa, Länsi-Eurooppa, Itä-Eurooppa, ja Skandinaviassa. Pitkä luonnollinen historia Eturauhassyövän esittelee suhteellisen laajan aikaikkunan ravinnon tai lääkinnällisiin toimenpiteisiin, jotka voivat ilmetä esiintymistiheyden alenemista, toistuminen, sairastuvuuden tai sairauden etenemistä [1]. Ehdotettu muunneltavissa riskitekijöitä PCA jotka tarjoavat potentiaalisia ehkäisyyn kuuluvat tulehdus, steroidihormonien ja niiden reseptorien, liikalihavuus, hyperkolesterolemia ja ruokavaliotekijät [2]. Luonnollinen fenoliset yhdisteet, joilla antikarsinogeenisia ominaisuuksia, voi tarjota mielenkiintoisia mahdollisuuksia vähentämiseksi syövän taakkaa [3], [4]. Kuitenkin enemmän tietoa niiden tehokkuudesta ja vaikutusmekanismeja tarvitaan asianomaisten prekliinisissä, jotta voidaan valita optimaalinen yhdisteitä tai seoksia kliinisiin kokeisiin ja tuotekehitystä.

Puut ovat runsas lähde fenoliyhdisteitä, rakenteellisesti samoja tai samankaltaisia ​​kuin syötävien kasvien [5]. Nämä yhdisteet voidaan helposti eristettiin puusta hydrofiilinen uuttamalla poistamisen jälkeen lipofiilisen uuteaineiden heksaanilla uuttamalla [6]. Puuperäisten otteet ovat siis kustannustehokas lähde luonnon fenoliyhdisteitä, ja houkutteleva vaihtoehto kehittää uusia terveyttä edistäviä tuotteita.

kasvifenolit, kuten lignaaneja ja stilbenoideja, moduloivat useita tärkeitä biologisia prosesseja nisäkässoluissa [7], [8], ja näyttää antikarsinogeenisia ominaisuudet prekliinisissä PCa malleissa. Rye tai pellavansiemenet sisältäviä ruokavalioita, joilla on korkea lignaanista pitoisuus sekä ruokavalio täydentää puusta saatu kasvi lignaanista, 7-hydroxymataresinol (HMR), estää kasvun PCA

in vivo

[ ,,,0],9], [10], [11], [12]. Samoin kasviperäinen stilbenoideja, resveratroli (RV) ja pterostilbene on raportoitu tukahduttaa kasvun Eturauhassyövän

in vivo

[13]. Useita mahdollisia mekanismeja, jolla lignaaneja ja stilbenoideja niillä voi olla antikarsinogeenisia toimet PCA on tunnistettu, mukaan lukien solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosin induktion [14], [15], soluproliferaation inhibointi [16], [17], kasvaimen verisuonten muodostumista [18], modulaatio sytokiiniprofiilin [19], ja herkistymistä syöpäsolujen ohjelmoitua solukuolemaa [20], [21], [22].

tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL ) -välitteisen apoptoosin on hiljattain tunnistettu mielenkiintoinen kohde lignaaneja ja stilbenoidien. TRAIL on proteiini, joka toimii ligandi, joka aktivoi ja syöttämällä-signalointireitin, erityisesti syöpäsolujen, minimaalisella myrkyllisyys normaaleille kudoksille [23]. Kestävyys TRAIL on yleinen PCA, ja yhdisteitä, jotka herkistää PCa TRAILiin parhaillaan aktiivisia tutkimuksen. Mielenkiintoista on, että lignaanit, kuten matairesinoli (MR), ja nortrachelogenin (NTG), sekä RV parantaa antituumorivaikutuksen TRAIL PCa soluihin [21], [22], tai ksenograftien [18].

Experimental tutkimukset viittaavat siten siihen, että luonnolliset lignaaneja ja stilbenoideja vaimentaa PCa kasvun kautta lukuisia vaikutusmekanismeja. Sen vuoksi on todennäköistä, ehdottaa, että näiden kahden ryhmän fenoliyhdisteiden voivat tarjota muita etuja käyttöön yksittäisiä yhdisteitä. Kuitenkin ei ole julkaistua tietoa olemassa yhdessä vaikutukset lignaaneja ja stilbenoideja valvotuissa koeasetelmia. Tässä tutkimuksessa osoitimme kasvua estäviä vaikutuksia männyn knotwood uute (PKE), runsaasti lignaaneja ja stilbenoideja, PC-3M-luc2 ihmisen PCa solujen

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi olemme vahvistaneet hyötyosuuden PKE johdettujen fenolit, ja tunnistetut yhdisteet todennäköisesti selittää antikarsinogeenisia vaikutuksia PKE.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Animal hoidon ja käytön tehtiin mukaisesti Suomen eläinsuojelulain Kokeilut ja EU: n lakeja, ohjeita ja suosituksia. Kaikki tutkimukset hyväksyi kansallisen eläinten Experiment Board Suomessa (Lisenssi numero 1993 /04.10.03 /2011).

valmistelu ja kemiallinen karakterisointi PKE

männyn solmua saatiin teollisesta sellutehtaan prosessiin (niin kutsuttu kiviloukku) (UPM Tervasaari, Valkeakoski, Suomi). Solmut olivat kentällä, seulotaan ( 2 mm), kylmäkuivattu, ja uutettiin peräkkäin

n

heksaani 90 ° C: ssa (3 x 5 min) ja etanoli-vesi (95:5 tilavuusosina .) 100 ° C: ssa (3 x 5 min) käyttäen nopeutettua liuotinuutolla. PKE kemiallisesti tunnusomaista GC-liekki ionisaatiodetektio (FID), GC-MS ja korkean suorituskyvyn kokoeksk- kanssa haihtuvia-valonsironta tunnistus (HPSEC-ELSD). GC-FID, GC-MS, ja HPSEC-ELSD analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. GC-FID käytettiin kvantifiointiin komponenttien uutteen joka eluoitui kaasukromatografikolonnin. Kvantifiointia perustui kolmena analyysit samaa uutetta. Heneicosanoic happoa käytettiin sisäisenä standardina, jossa vastetekijät 1.00. Yksittäisten yhdisteiden havaittiin GC-FID tunnistettiin GC-MS, käyttäen kaupallisia ja laboratorion omaa spektrin kirjastot. Moolimassa jakautuminen PKE komponenttien määritettiin HPSEC-ELSD: llä.

Pääyhdiste ryhmät PKE olivat: lignaanit (16%), stilbenoidien (17%), hapetettu hartsihappoja (20%), hartsihappoja (24%), ja suurempi-molaarinen-massa yhdisteiden (550-4000 Da, 18%). Pitoisuudet (p-% kuiva-ainetta) tärkeimmistä GC-havaittavissa phenolics että PKE olivat pinosylvin monometyylieetteri (MEPS, 10,2%), NTG (7,0%), pinosylvin (PS, 4,0%), MR (1,5%) , abietiinihappo (1,5%), ja pinostilbene (0,4%). GC-havaittavissa hartsihappojen osuus 21,8% kuiva-painosta PKE. Vähäisiä määriä (alle 0,1-0,5%) lignaaneja HMR, conidendric happo, secoisolariciresinoli ja todolactol A: ta löytyi.

Reference ja Testiyhdisteet

valmistelu ja puhtauksia lignaaneja HMR, MR NTG, secoisolarici-, larici-, cyclolarici-, 7-oxomatai-, pino-, ja medioresinol, α-konidendriini, enterolaktoni, 7-hydroxyenterolactone, MR-

d

6, ja enterolactone-

d

6 on kuvattu aiemmin [25], [26]. Stilbeenit PS ja parlamentin jäsenet ja hartsihappopitoisuus dehydroabietiinihappoon (puhtaudet 95%) valmistettiin laboratoriossa puu- ja paperikemia Åbo Akademin eristämällä puusta ja puhdistaminen flashkromatografisesti (Biotage Flash 40i) kanssa silikakolonneissa. RV ja enterodiolin olivat Sigma-Aldrich Co., pinostilbene alkaen TCL Pharma Chem., Inc (Vaughan, ON, Kanada) ja

O

-methylpodocarpic happo, neoabietiini- happo ja abietiinihappoa alkaen Helix Biotech Corp. (CanSyn Chem Corp., Toronto, Kanada).

jotta tutkia yhdessä vaikutukset puhdasta PKE johdettujen lignaaneja ja stilbenoideja

in vitro

, valmistimme lignan-stilbeenijohdannaiset seosta (LS seos), joka sisältää neljä runsain PKE peräisin olevat yhdisteet moolisuhteissa samanlainen PKE (taulukko 1).

Soluviljely ja leviämisen, Apoptosis and Cell Cycle määritykset

PC-3M-luc2 solujen (Paksuus Life Sciences, Hopkinton, MA) viljeltiin Dulbeccon fenolipunaista olevaa muunnettua Eagle väliaineessa, jota oli täydennetty 50 IU /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia ( Invitrogen, Paisley, UK). Soluja pidettiin kostutetussa 5% CO

2 /ilmakehässä 37 ° C: ssa.

soluproleferaatiomäärityksessä, PC-3M-luc2 solut ympättiin 96-kuoppalevylle (1500-soluissa kuoppaa kohti). Dimetyylisulfoksidi kantaliuokset PKE (1-100 mg /l), puhdistettua yhdisteet (1-100 uM) tai dimetyylisulfoksidissa valvonnan valmistetaan elatusaineessa, lisättiin kuoppiin (kuusi toistoa). 48 tunnin jälkeen, solujen proliferaatiota mitattiin Cell Proliferation Elisa BrdU immunomääritys kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

apoptoosimäärityksessä, PC-3M-luc2 solut ympättiin 96- kuoppaiset levy. Kun 60-80% konfluentteja puolet väliaine poistettiin ja korvattiin väliaineella, joka sisältää puusta peräisin olevat yhdisteet (lopulliset pitoisuudet 1-40 mg /l). 48 tunnin kuluttua solut irrotettiin trypsiinillä, ja hajotettiin 0,4 M sitraattipuskuria PBS, joka sisälsi 0,3% Triton-X (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO). Tumat ja ydin- fragmentit leimattiin propidiumjodidilla (Sigma). Voit selvittää osa Saharan G0 /G1 tapahtumia, näytteet analysoitiin virtaussytometrillä (BD LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Arvioimiseksi TRAIL herkkyys, soluja käsiteltiin yhdistelmä puuta johdettujen yhdisteiden (kuten edellä) ja ihmisen TRAIL /Apo2L (cat. No. C-63600, Promokine, Heidelberg, Saksa) pitoisuuksina 3, 25, 50, ja 100 ng /ml.

Orthotopic PC-3M-luc2 ksenoqraftit kateenkorvattomissa hiirissä

Hsd: Kateenkorvattomiin Nude – Foxn1

nu uroshiirillä (5-6 viikon ikäisiä) hankittiin Harlan Laboratories (Horst, Hollanti) pidettiin aseptisissa olosuhteissa Keski Animal laboratorio Turun yliopiston. Hiiriä sopeutettiin kahden viikon ajan; varustettu soija-vapaa luonnollinen ainesosa ruokavalio (RM3, SDS, Essex, UK) ja vesijohtovettä

halun

.

PC-3M-luc2 käytettävät solut potilaalle tehdä ksenografti- kokeessa viljeltiin RPMI 1640 ilman fenolipunaista, jota oli täydennetty 50 IU /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. Soluja pidettiin kosteutetussa 5% CO

2 /ilmakehässä 37 ° C: ssa. PC-3M-luc2 soluja (1 x 10

6 solua 20 ul: ssa tavallista RPMI 1640-väliaine) siirrostettiin dorsolateral eturauhasen läpi vatsan viillon isofluraanianestesiassa. Kivunlievitykseen, hiirille annettiin buprenorfiinia (Temgesic, 0,05-0,1 mg /kg

sc

.) Ja carpofen (Rimadyl, 5 mg /kg

sc

.) Ennen ja jälkeen operaation, vastaavasti. Kasvaimen kasvu seurasi bioluminenssina kuvantamisen IVIS lumina II, joissa XGI-8 Gas Anesthesia System (Caliper Life Sciences, Runcorn, Yhdistynyt kuningaskunta). Hiiret nukutettiin isofluraanilla, pistetään

ip

150 mg /kg D-lusiferiini (Xenogen kissa. No. XR-1001, Oregon, USA) 10 min ennen kuvausta, ja bioluminesenssi kvantitoitiin käyttäen LivingImage 4.09A Carbon ohjelmistot (Xenogen).

viikon kuluttua inokulaation kasvaimettomina eläimet tunnistettiin bioluminenssina kuvantaminen ja poistettiin tutkimuksesta. Kasvain kantavia hiiriä kohdennettu kantajaa (kontrolli), matalan annoksen (32 mg /kg) tai suuren annoksen (160 mg /kg) PKE ryhmiä. Matala ja korkea annos sisälsi noin 5,0 ja 5,4, sekä 25 ja 27 mg lignaaneja ja stilbenoidit, vastaavasti. PKE liuotettiin vehikkeliin, joka sisälsi 10% (v /v), absoluuttista etanolia ja 90% (v /v), maissiöljy. Sekä ajoneuvon ja PKE olivat letkulla

p.o..

Päivittäin. Hiiret punnittiin viikoittain, ja bioluminesenssi kuvantaminen suoritettiin kahdesti viikossa.

Kolmannen viikon aikana hoidon 24 tunnin virtsa kerättiin metaboliahäkkeihin (5-6 hiirtä häkkiä). Virtsa kerättiin purkit, joka sisälsi 0,15 M natriumatsidia ja 0,56 M askorbiinihappoa säilöntäaineena. Virtsanäytteet sentrifugoitiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa analysointiin asti.

Kolmen viikon hoidon jälkeen hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen sen jälkeen taittamalla niskasta. Veri kerättiin sydänpunktiolla, sentrifugoitiin, ja seerumi erotettiin ja pidettiin -70 ° C: ssa analysointiin saakka. Kasvaimet leikeltiin ja punnittiin, ja kasvaimen koko mitattiin paksuus kolmessa ulottuvuudessa. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: tilavuus (mm

3) = (pituus x leveys x korkeus) x π /6. Kasvaimet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja käsiteltiin parafiiniupotusta ja käyttää immunohistokemiallista analyysejä.

Analyysi lignaanit ja stilbenoideja hiiren seerumia ja Virtsa

Serum (50 ui) ja virtsaan ( 300 ui) näytteet hydrolysoitiin ja kiinteän faasi uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu joitakin muutoksia [25], [27]. Hydrolyysille, joka on juuri valmistettu β-glukuronidaasi /-sulphatase 10 mM natriumasetaattia (pH 5,0) lisättiin seerumia ja virtsanäytteet ja inkuboitiin 19 h 37 ° C: ssa. Hydrolyysin jälkeen sisäiset standardit lisättiin näytteet: MR-

d

6 kasvien lignaanit ja stilbeenit, EL-

d

6 enterolignans (lopulliset pitoisuudet ~ 1 ug /ml), ja

O

-methylpodocarpic hapon hartsihapot (lopullinen konsentraatio ~ 3 ug /ml). Kiinteä-faasi uutettiin ja haihdutettiin, seerumin ja virtsanäytteet [25] liuotettiin uudelleen 150 ui ja 500 ui metanolia /0,1% etikkahappoa 20:80 (v /v), vastaavasti. PKE komponentit ja niiden aineenvaihduntatuotteiden kvantitoitiin käyttäen HPLC-MS /MS useita ionin seurantaa negatiivisten ionien tilassa kuten aiemmin on kuvattu [24]. Optimoitu useita ionimonitorointi siirtymät olivat deprotonoidusta molekyyli-ioni ja seuraavat fragmentit MS

2 (

m /z

); PS 169 18; MEPS 182 20; RV 143, 22; pinostilbene 225. hartsihapoista muodostunut mitään fragmentteja MS

2. Käytetty kartio jännitteet olivat 40 V varten stilbeenien ja 48 V Hartsihappoja. Törmäys energiat olivat noin 20 eV: n stilbeenien ja 5,0 eV: n hartsihapot. MS parametrit analysoitiin lignaanit on kuvattu aikaisemmin [26]. Kvantitatiivinen suoritettiin käyttäen standardiliuosta, joka sisältää sisäiset standardit ja kuusi pitoisuustasot analyyttejä, kuten aiemmin on kuvattu [26].

Immunohistokemia ja Detection apoptoottisten solujen Tuumorinäytteissä

von Willebrand tekijä (vWF, laimennus: 1:4000, ab6994-100, Abcam, Cambridge, UK) ja fosfo-histoni H3 (pH-H3, laimennus: 1:200, Ser10, Soluviestintä) immunohistokemian kudosleike poistettiin parafiini, uudelleen hydratoituja ja niitä inkuboitiin 10 mM Tris-EDTA pH 9 (vWF värjäys) tai 10 mM natriumsitraattia, pH 6 (pH-H3 värjäys) puskuri, mikroaaltouunissa antigeenin haku. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% H

2O

2. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, leikkeitä inkuboitiin 3% naudan seerumin albumiinia (BSA) 10 minuutin ajan, ja leimattu vWF tai pH-H3-vasta-aineita 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT) tai yli yön + 4 ° C: ssa, vastaavasti. Piparjuuriperoksidaasi leimattu polymeeri anti-kani (DAKO kuvitella järjestelmä, Dako) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Diaminobenzidine (Dako) levitettiin osiin seuraa Mayerin hematoksyliinillä ja asennus.

Päätelaite deoksinukleotidyylitransferaasilla biotiini-dUTP nick end merkinnät (TUNEL) menetelmää käytettiin määrittämään apoptoottisten solujen tuumorisektioiden. Analyysi suoritettiin käyttäen ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon International, Hampshire, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Osat poistettiin parafiini, vedettömät ja käsiteltiin 10 mM natriumsitraattipuskuria mikroaaltouunissa antigeenin haku. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% H

2O

2. Positiivisena kontrollina, yksi osa inkuboitiin DNaasi I (Invitrogen) 30 min + 37 ° C: ssa. Sillä TUNEL, leikkeitä inkuboitiin 0,8 U /ul TdT reaktioseoksessa: TdT- puskuri, 4 U /ul transferaasi, 25 mM CoCl

2 (Terminal transferaasi, Roche, Mannheim, Saksa), biotiini-16-dUTP (Roche ) ja MilliQ veteen; ja negatiivinen kontrolli, yksi osa inkuboitiin TUNEL reaktioseosta ilman transferaasi yhden tunnin ajan + 37 ° C: ssa. TUNEL Reaktio pysäytettiin 300 mM NaCl, 30 mM natriumsitraattia dH

2O (15 min huoneenlämpötilassa). Epäspesifinen tukittiin 3% BSA /PBS: llä 30 min RT: ssa. ExtrAvidine®-Peroxidase 1:500 (Sigma) levitettiin 1% BSA /PBS: llä 30 minuutin ajan + 37 ° C: ssa, minkä jälkeen diaminobentsidiinillä on sovellettu, ja leikkeet värjättiin Mayerin hematoksyliinillä ja kiinnitettiin.

kvantifiointi Solujen lisääntymisen ja Apoptosis Indeksit, ja verisuonitiheyttä ja pituus

Mosaiikki kohdat skannattiin virtuaalinen mikroskoopilla (Digital Virtual mikroskooppi, Soft Imaging System, Olympus, Saksa). Määrä ja kesto vWF-positiivisten suonten kvantitoitiin kolmessa tai neljässä valittujen alueiden mittaus- väline dotSlide ohjelman (Soft Imaging System). Kvantifiointia pH-H3 ja TUNEL-positiivinen solu tuumorisektioiden suoritettiin mukautettuja toimintoja kehitetään kudoksen kuva-analyysin mukaan Quva Oy (Tampere, Suomi). Ensinnäkin kuvia saatu skannatut diat normalisoitiin intensiteetin ja värivaihtoehtoa. Käsittelyä jatkettiin kuvan kynnystämällä, joka tunnistaa alueet sopivat värit pidettävä positiivisesti värjättyä kohdesoluja. Lopuksi vieraat havainnot olivat suodattanut koko ja muoto tiedon, ja tuloksena solut saatiin näkyviin punaisina yli alkuperäisen kuvan.

TILASTOANALYYSI

univariate analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism versio 4.00 Windowsille (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Vuonna normaalisti jakautunut tiedot, yksisuuntaisen varianssianalyysin ja Tukeyn post-hoc testissä käytettiin; muuten, Kruskal-Wallis tai ei-parametrinen t-testiä käytettiin. Kaikki tiedot esitetään ryhmän keskiarvona ± SEM. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

0,05.

pareittain monimuuttujavertailut ryhmän avulla (esim μ1 ja μ2) testattiin Mahalanobiksen etäisyys (MD) 🙁 1)

Mahalanobiksen etäisyys on tunnettu monimuuttuja tilastotieto, joka sisältää lineaarisia korrelaatioita covariates kautta kovarianssimatriisin-varianssi matriisi

S

, jossa mitta määrää covariates [28]. Keräämällä täydentäviä tietoja toisiinsa tekijöitä ja ottaa herkkyys kuvioita poikkeavia pääsuuntaukset [29], MD on kätevä tilastotieto testaamiseen hienovaraisempaa hoitoon vaikutuksia mahdollisesti huomaamatta yksiulotteista testeissä. Erityistapauksissa, MD vähentää standardoituun Euclidean etäisyyttä, jos

S

on diagonaalinen matriisi, ja tavallisille Euclidean etäisyyttä, jos

S

on yksikkö matriisi, ja siten linkkejä läheisesti tavanomainen

t

tilastollinen testaus riippumattomien kasvaimen kasvua markkereita. Tilastollisesti merkittävä etäisyyden

D

arvioitiin satunnainen permutaatio luokan tarroja kahden otoksen testeissä (Vehicle vs. Matala annos tai auto vs. korkea annos) [30]. Null jakaumat saatiin ajamalla 100,000 simulaatioita tällaisen satunnaisesti matkoja ja empiirinen

p

-arvot määritettiin osuus satunnainen etäisyyksien suurempi tai yhtä suuri kuin havaitun etäisyyden

D

.

tulokset

PKE ja sen komponentit esto PC-3M-luc2 Cell Proliferation ja apoptoosin

in vitro

PKE merkittävästi heikennettyjä PC-3M-luc2 solujakautumisessa ≥40 mg /l (Fig. 1A), osoittaa vähentynyt sisällyttämällä BrdU. Tämän mukaisesti, tärkeimmät ainesosat PKE, stilbenoidien (MEPS ja PS), sekä lignaanit (MR ja NTG) kukin esti merkitsevästi solujen uudiskasvua 40-100 uM (Fig. 1 B). Lisäksi näiden yhdistelmä neljä yhdistettä (MEPS, PS, MR, ja NTG), samassa suhteessa kuin läsnä PKE (lignaanista-stilbeenijohdannaiset, LS, seos), vähensi BrdU samalla tavalla kuin alkuperäisen uutteen (Fig. 1C). PKE (40 mg /l) ja LS seosta (40 uM), sekä lisääntynyt apoptoosi nopeudella, osoittaa virtaussytometrianalyysillä (Fig. 2A). PKE indusoiman solusyklin pysähtymisen, eli lisätä osa ei-apoptoottisten solujen G0 /G1 (Fig. 2B), ja, vastaavasti, vähentynyt osa solujen S ja G2 /M-vaiheessa. Lisäksi PKE (10 ja 40 mg /ml) valoherkkä PC-3M-luc2 solujen TRAIL-indusoidun apoptoosin (Fig. 3A). LS seokseen ja kaikki testatut PKE peräisin olevat yhdisteet (MEPS, NTG, PS, MR, ja RV), paitsi abietiinihappo, merkittävästi parannettu TRAIL-välitteisen apoptoosin (Fig. 3B), PS, MEPS, ja MR osoittaa selvin vaikutuksia .

A) Soluja käsiteltiin PKE tai seos sen tärkeimmistä lignaaneja ja stilbenoidit (LS seos) 48 tuntia. B) Soluja käsiteltiin yksittäisten PKE johdettujen yhdisteiden 48 tuntia. Solujen lisääntymisen määrä ilmaistuna prosentteina vertailusta mitattiin BrdU-määritystä. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritettiin epäparametrinen t-testiä kunkin hoitoon verrattuna vastaavaan ajoneuvoon hoitoon (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Apoptosis hinnat ja solujen määrä G0 /G1 vaihe on ilmaistu suhteessa ajoneuvon ohjaus (Ctrl = 1). Soluja käsiteltiin testiyhdisteiden kanssa 48 tuntia ja apoptoosi korko ja solukierron vaiheessa määritettiin virtaussytometrillä. LS, sekoitus pää- PKE lignaaneja ja stilbeenien; MEPS, pinosylvin monometyylieetteri; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinoli; Ab, abietiinihappo; RV, resveratrol. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritettiin epäparametrinen t-testiä kunkin hoitoon verrattuna vastaaviin Ctrl. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

A) Soluja käsiteltiin PKE yhdessä kasvavien pitoisuuksien kanssa ihmisen TRAIL (0-100 ng /ml), arvot ovat prosentteja ydinaseiden pirstoutumista. B) Soluja käsiteltiin PKE, LS seos tai yksittäisten PKE yhdisteitä yhdessä ihmisen TRAIL (25 ng /ml), arvot ovat suhteessa apoptoosin hinnat (Ctrl = 1). Soluja käsiteltiin testiyhdisteiden kanssa 48 tuntia ja ydin- fragmentoituminen määritettiin virtaussytometrillä. LS, sekoitus pää- PKE lignaaneja ja stilbeenien; MEPS, pinosylvin monometyylieetteri; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinoli; Ab, abietiinihappo; RV, resveratrol. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritettiin epäparametrinen t-testiä kunkin hoitoon verrattuna vastaavaan ajoneuvoon hoitoon (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

vaikutus PKE on Orthotopic PC-3M-luc2 Vieraslajisiirteen Volume, Cell Proliferation ja Angiogeneesi

kolmen viikon päivittäisen nauttimisen PKE oli hyvin siedetty, eikä merkkejä haittavaikutuksia havaittiin tahansa vaiheessa. PKE vähensi leviämisen indeksi (Fig. 4A) ja pituus verisuonten (ts kehä) PC-3M-luc2 kasvaimia (Fig. 4B). Suuntaus vähentää bioluminesenssin ja PCa kasvaimen havaittiin korkeampi PKE annos (160 mg /kg) ryhmä (Fig. 4C ja D). Ei merkittäviä muutoksia nähtiin apoptoosin indeksin, jonka suuruus alkaen TUNEL-värjätty tuumorisektioiden (tuloksia ei ole esitetty). Monimuuttuja vertailu leikattiin tuumorin tilavuuden, log-transformoituja kasvaimen bioluminesenssi, apoptoosin ja leviämisen indeksit, ja verisuonten tiheyden ja pituus suoritettiin käyttäen MD tilastollinen (yhtälö. 1). Kun vaste testattiin kannalta yhdistetty vaikutus näiden 6 kovariantteja (Fig. S1), oli merkittävä ero ajoneuvon ja suuren annoksen PKE ryhmissä (p = 0,0051, Fig. 5A), kun ajoneuvo ja pieniannoksisen PKE ryhmät olivat samankaltaisia ​​(p = 0,4195, Fig. 5B). Mielenkiintoista, yhdistetty arviointi covariates ja niiden vuorovaikutukset selvästi erillään ajoneuvon ja suuren annoksen PKE ryhmät (Fig. 5C, jossa 3 tärkeimmät ominaisuudet visualisoitu). Voida päätellä tästä yhdistetty analyysi oli täysin erilaisia ​​riippumattoman muuttujan analyysit (Fig. 4); Esimerkiksi monimuuttujakalibrointiin lähestymistapa havainneet, että jotkut kasvaimet oli alentunut vaskularisaation (

aluksen pituus

), kun taas toiset olivat pienikokoista (

kasvaimen tilavuuden

), ja siten antoi moniulotteinen näkymä hoidon vaikutusten . Alkuperäinen kasvain mitat esitetään oheismateriaali kuten bivariate (Fig. S1) ja yhden muuttujan tontteja (Fig. S2). Laskennallinen varianssi-kovarianssi rakenne

S,

skaalauksen jälkeen on korrelaatio, on esitetty kuviossa. S3. Kuten odotettua, liittyvät tekijät, kuten kasvaimen tilavuus ja tuumorin bioluminesenssi tai aluksen tiheys ja aluksen pituus, korreloivat voimakkaasti, ja niiden etäisyydet tehokkaasti ryhmitelty MD analyysi (Fig. S3).

A) PKE vähenee solujen lisääntymisen indeksi. Edustavat kuvat pH-H3-immunovärjäyksin näkyvät. B) PKE pienenee verisuonen pituus. Edustavat kuvat vWF-immunovärjäyksin näkyvät. C) Bioluminesenssi kasvainten, määrällisesti toinen viikko by

in vivo

kuvantamiseen. D) Tuumoritilavuudet lopetuksen. Hiiriä käsiteltiin päivittäin vehikkelillä (n = 11), PKE 32 mg /kg kehonpainoa (n = 10) tai PKE 160 mg /kg kehonpainoa (n = 11) kolmen viikon ajan. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä ja Tukeyn post-hoc-testi. * P 0,05. Mittaviivat 100 pm.

C) Tuumorin tilavuus, aluksen pituus ja leviämisen indeksin havaittiin tärkeimmiksi tekijät eroja monimuuttuja analyysit. Hypertaso osoittaa, että kaksi ryhmistä (ajoneuvon musta ja suuren annoksen vihreällä) oli lineaarisesti erotettavissa, kun kolmen tekijän katsottiin yhdessä (hypertaso: 100,55 = 0,104 × Kasvaimen tilavuus + 0,895 × leviämisen indeksi + 21,1 × Aluksen pituus).

jotta voitaisiin arvioida niitä tekijöitä, jotka olivat olennaisin erottamaan suurimman annoksen PKE ryhmä kontrolliryhmän, tyhjentävä testaus MD eri yhdistelmiä 6 kovariaatit suoritettiin. Näkyvin vaikutus havaittiin yhdistelmänä tuumorin tilavuus, leviämisen indeksi ja aluksen pituus. Tutkiminen vuorovaikutus näiden kolmen markkereita osoitti, että vaikka yksittäiset kovariaatit yksinään eivät informatiivinen riitä erottamaan kaksi ryhmää, kun tarkastellaan yhdessä, ajoneuvon ja suuren annoksen PKE ryhmät olivat lineaarisesti erotettavissa kanssa hypertaso (Fig. 5C). Lisäksi vaikkakin ajoneuvon ja pienen annoksen ryhmässä ero ei ollut tilastollisesti merkittävä, yleinen suuntaus poikki kolmeen ryhmään ehdotti lisääntynyt antituumorivaikutus kasvavalla annoksella (katsottuna järjestyksessä musta, punainen ja vihreä pilvet kuvassa. 5C).

pitoisuudet fenolisten yhdisteiden seerumissa että virtsassa kasvaimen omaavien Hiiret

mikromolaarinen pitoisuuksia NTG, ja MEPS havaittiin seerumissa eläinten alttiina suuremman annoksen PKE ( Taulukko 2). Hartsihappoja, jotka olivat läsnä PKE ei havaittu seerumissa tai virtsanäytteestä. Mielenkiintoista on, että merkittäviä RV, joka on monohydroksyloitu metaboliitti PS, sekä pinostilbene, metaboliitti MEPS, havaittiin seerumissa ja virtsassa hiiristä, joille oli syötetty PKE (taulukko 2). Lisäksi pitoisuudet MR ja HMR ja niiden aineenvaihduntatuotteiden enterolaktoniksi, enterodiolin, ja 7-hydroxyenterolactone sekä pitoisuudet MEPS, PS, NTG, ja pinostilbene merkittävästi suurempi verrattuna (taulukko 2). Stilbeenijohdannaisten ja lignaanista aineenvaihduntatuotteet olivat läsnä seerumin 15 min-3 h viimeisen antamisen jälkeen (tuloksia ei esitetty), ja korkeimmat pitoisuudet mitattiin 2 h (taulukko 2). Metaboliitin profiili virtsaan (24 tunnin keräys) oli hyvin samankaltainen kuin seerumin (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Epidemiologiset ja prekliinisissä tutkimukset viittaavat käänteinen suhde kulutuksen polyfenolien runsaasti elintarvikkeita ja esiintyvyys krooniset sairaudet, kuten syöpä [3], [7], [31]. Erityisesti lignaaneja ja stilbeenit, ja niiden aineenvaihduntatuotteiden, ovat houkuttelevia ehdokkaita PCA riskien vähentämiseksi. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet antikarsinogeenisia vaikutukset männyn solmu uute (PKE), seoksessa runsaasti lignaaneja ja stilbenoideja,

in vitro

ja

in vivo

käytettäessä potilaalle tehdä PCa ksenograftimallissa