Krooninen sairaus

tiivistelmä

Etäpesäke on merkittävä kuolinsyy syöpäpotilailla. Invadopodia katsotaan olevan ratkaiseva rakenteita, jotka mahdollistavat syöpäsolut tunkeutuvat koko solunulkoisen matriisin (ECM) käyttämällä matriksin metalloproteinaasien (MMP: t). Aiemmin olemme eristäneet erittäin invasiivisia A431-III alalinja vanhempien A431-soluista Boyden kammion määrityksessä. A431-III soluilla korkeampi invasiivisia ja muuttavien kykyjä, kohonnut MMP-9 ja tehostettu epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että A431-III soluissa oli lisääntynyt mahdollista muodostaa invadopodia ja parantunut kyky hajota ECM verrattuna alkuperäiseen A431 soluja. Havaitsimme myös parannettu fosforylaation tasoja cortactin ja Src in A431-III-solut; Näiden fosforyloitu proteiineja on raportoitu olevan tärkein säätelijöitä invadopodia muodostumista. Flavonoidit, lähes kaikkialle jaetaan ruokaa kasveja ja kasvien ruokaa tuotteita, on dokumentoitu näytteille anti-kasvain ominaisuuksia. Siksi oli paljon kiinnostusta tutkia vaikutuksia flavonoidi antioksidantteja on metastaattinen aktiivisuus A431-III-soluja. Altistuminen A431-III solujen kaksi voimakas ravinnon flavonoidit, nimittäin luteolin (Lu) ja quercetin (Qu), aiheutti eston invadopodia muodostumisen ja vähenemä ECM hajoamista. Olemme päätellä, että Lu ja Qu vaimentavat fosforylaatiota cortactin ja Src in A431-III soluissa. Tämän seurauksena, on ensues häiriöitä invadopodia sukupolven ja tukahduttaminen MMP eritystä. Nämä muutokset, konsertti, aikaan vähenemiseen etäpesäkkeiden.

Citation: Lin Y-C, Tsai P-H, Lin C-Y, Cheng C-H, Lin T-H, Lee KPH, et al. (2013) vaikutus Flavonoidit Matrix Metalloproteinase eritys ja Invadopodia Formation erittäin invasiivinen A431-III syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (8): e71903. doi: 10,1371 /journal.pone.0071903

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 06 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 04 heinäkuu 2013; Julkaistu: 21 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Taiwan Academia Sinica teemahankkeen (AS-96-TP-B06 on MTL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Dr. Chithan C. Kandaswami työskentelee Castle Hills Health. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

etäpesäke, leviäminen syövän lähtöpaikkakunnan distaaliseen kudoksiin , katsotaan olevan pääasiallinen tekijä kuolleisuuden suurin osa syövistä [1]. Yli 90% syöpään liittyvien kuolemien ovat vuoksi etäpesäkkeitä ja vielä sääteleviä mekanismeja etäpesäkkeitä vielä selvennetään edelleen [2]. MMP: t ovat parhaiten dokumentoitu kriittinen proteolyyttisiä entsyymejä, jotka liittyvät kasvaimen etäpesäke [3]. Helpottaakseen etäpesäke, kasvainsolut riippuu toimintaa useamman kuin yhden MMP ja muiden yleisempiä hajottavia entsyymejä, jotta heidät ylittämään kudoksen esteitä he kohtaavat prosessin aikana hyökkäyksen. Uskotaan, että MMP: t hajottavat ECM, ja että tämä toiminta mahdollistaa kasvainsolujen siirtää, hyökätä ja levitä eri toissijainen sivustoja elin, jossa ne muodostavat etäpesäkkeitä. MMP säännellä kasvain microenvironment, ja niiden ilmaisun ja aktivointi lisätään lähes kaikissa ihmisen syövissä, kun verrattuna normaalissa kudoksessa vastaa syöpään [4]. Runsaasti äskettäin kertyneen tietojen mukaan MMP rekrytoidaan ainutlaatuinen pintarakenteiden, joita kutsutaan invadopodia, ja että he voivat sitten läpi erityksen [5], [6].

Invadopodia löydettiin ensin fibroblasteissa transformoitu v-src onkogeeni, joka koodaa konstitutiivisesti aktiivinen ei-reseptori-tyrosiinikinaasin v-src: [7], ja termi keksittiin vuonna 1989 [8]. Invadopodia erikoistuneet aktiini-kalvosuodattimia ulkonemia löytyy syöpäsoluja, jotka huonontavat ECM kautta lokalisoinnin proteaasien [9]. Niiden kyky välittää ECM hajoaminen ehdottaa ratkaiseva rooli invadopodia syövän eteneminen ja metastaasit. Invadopodia koostuvat monista aktiini säätelevien proteiinien, kuten cortactin, N-WASP, Arp2 /3 ja cofilin [10]. Vaikka nämä aktiini säätelyproteiineihin ovat myös yhdistettyinä muihin aktiini-kalvosuodattimia ulokkeita, matriisi hajottavaa kykyä erottuu suurena, olennaista ja ennakoitavissa indeksi invadopodia tunnistamisen. Kolme MMP MMP-2, MMP-9 ja MT1-MMP [11], on raportoitu palvelukseen invadopodia, jotta heidän alentavan kyvyn. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit, joilla MMP kuljetetaan ja kohdistettu invadopodia, ja edelleen erittyy edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

Viime vuosina useat molekyylien pelaajat toimintansa invadopodia on määritellyt mutaatiotutkimukset, RNA-interferenssi tutkimuksia tai jonka käyttöönoton estävää vasta-aineita. Näistä keskeinen rooli Src ei-reseptori tyrosiinikinaasin invadopodia asetus on päätellä; myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että Src on olennaisen tärkeää invadopodia muodostumista ja toimintaa [12], [13]. Todellakin tämä toiminta Src itsessään johti löytämisen invadopodia. Fosforylaatio sen komponentin proteiinien on kriittinen invadopodia sääntelyä ja tämä on lähinnä tyrosiinifosforylaatiota Src. Useita Src-substraattien, kuten cortactin, Tks5, dynamin2, AMAP1 /ASAP1 ja N-WASP, on paikallistettu invadopodia ja vaaditaan niiden olevan aktiivisia [10], [14], [15]. Kun Src aktivoidaan ylävirtaan integriinin signalointia tai kasvutekijän stimulaatio, nämä proteiinit läpikäyvät tyrosiinifosforylaatiota; Tämän jälkeen säätelee niiden toimimista sovittimia tai sallii heidän olla vuorovaikutuksessa toistensa kanssa kokoonpanon aikana aktiini verkkojen [12], [16]. Mutaatio tyrosiinifosforyloitumiskohdat seuraavilla proteiineihin estää invadopodia muodostumista ja toimintaa [15], [17], mikä edelleen tukee merkitys tyrosiinifosforylaation ja invadopodia muodostumiseen. Lisäksi tyrosiinifosforylaatiota Src, proteiinikinaasi C: n on myös raportoitu synergisesti Src ja osallistua sääntelyn invadopodia fosforyloimalla seriinin tai treoniinin [16].

Cortactin, aktiinia säätelyproteiini, joka toimii aikana sekä aktivoinnin ja vakauttamista vaiheet aktiini haarautumisen, on ollut viime aikoina piirustuksen näkyvästi huomiota, koska sen rooli invadopodia muodostumiseen [18]. Cortactin identifioitiin aluksi Src-tyrosiinikinaasin substraatti [19]. Se nimettiin cortactin koska se on lokalisoitu aivokuoren aktiini rakenteisiin. Ihmisen cortactin koodaa

CTTN

(ent

EMS1

) kromosomissa 11q13, joka on usein monistetaan erilaisiin syöpiin, kuten rinta-, pään ja kaulan [20]. Geenin monistuminen, joka johtaa yli-ilmentyminen cortactin on havaittu olevan yhteydessä korkeampi etäpesäkkeitä /invaasion ja huonoon ennusteeseen [21]. Yhdenmukainen sen aktiinin sitova kyky, cortactin on havaittu paikantuvan naapurisolujen rakenteita, kuten lamellipodioihin ja invadopodia. Viimeaikaiset tutkimukset, joiden tarkoituksena on tutkia molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät aktiini polymerointi ennen MMP rekrytointi ovat ehdottaneet, että cortactin fosforylaatio on ratkaiseva invadopodia muodostumisen ja kypsymisen [22] .Nämä havainnot viittaavat siihen, että Src-tyrosiinikinaasi ja sen alustan cortactin yhdessä pelata erittäin merkittävä rooli syövän invaasio ja muuttoliike [23].

Voit selvittää, miten solut ohjaavat invadopodia muodostumista, useat tutkijat ovat seulottu kokoelman farmakologisesti aktiivisia yhdisteitä, joiden tavoitteena on tunnistaa kemikaaleja, jotka pystyvät estämään prosessia. Kasvien flavonoideja on kirjattu jonkin aikaa omaavana anti-kasvain ja anti-erilaistumisen vaikutukset [24] – [27]. Aiemmin olemme määritelleet kaksi ravinnon flavonoidi aineosia, Lu, joka on flavone, ja Qu, flavonolia, kuten jotkut tehokkain tehtaan flavonoidit mitattuna niiden

in vitro

biologisia vaikutuksia. Niillä on erilaisia ​​syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, kuten vaimennus solujen kasvua ja kinaasin toiminnan, apoptoosin, arvonalentumisesta erilaistumista, tukahduttaminen MMP erityksen vähentäminen kasvaimen soluadheesiota, etäispesäkkeiden inhiboimiseksi ja lasku angiogeneesiä [28] – [31]. Vaikka nämä kaksi flavonoidit ovat potentiaalisesti tehokkaita anti-invasiivisia yhdisteitä, tähän mennessä ei Tutkimuksessa arvioitiin vaikutuksesta Lu ja Qu päälle invadopodia muodostumista ja toimintaa. Aiemmissa tutkimuksissa olemme dokumentoitu, että sekä Lu ja Qu pystyvät blunt tyrosiinikinaasin toimintaa ja suuresti alentaa eritystä MMP kasvainsoluissa [26]. Ymmärretään, mikä merkitys ja tärkeys eston kinaasin toimintaa ja MMP erityksen näistä flavonoidit on saanut meidät arvioimaan niiden vaikutusta sattuneet invadopodia muodostumista ja toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

A431 ihmisen orvaskeden syöpäsolulinjan hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Erittäin invasiiviset A431-III soluja eristettiin laboratoriossamme päässä vanhempien A431 tuumorisoluissa (A431-P) [32]. Naudan sikiön seerumia (FBS) ja RPMI-1640 saatiin GIBCO (Grand Island, NY). MMP-9 siRNA ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). PCR-alukkeet ostettiin Purigo Biotech (Taipei, Taiwan). Quercetin ostettiin Nacalai Tesque (Kioto, Japani). Luteolin saatiin Extrasynthese (Genay, Ranska). Anti-cortactin-vasta-aine saatiin Epitomic (Burlingame, CA). Anti-fosfo-cortactin (Y421) vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Src-vasta-aine hankittiin Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Anti-fosfo-Src (Y418) vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA). Anti-Tks5-vasta-aine ja GM6001 saatiin Millipore (Billarica, MA). Anti-MT1-MMP, TIMP1, TIMP2 vasta-aineet hankittiin Genetex (Irvine, CA).

valmistaminen solulysaateista

Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja sitten pestiin PBS: llä. Solut hajotettiin kultaa hajotuspuskuria kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Liukenematon materiaali kerättiin sentrifugoimalla 14000 x

g

20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus kvantifioitiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Hercules, CA). Sitten näytteet jaetaan 50 ul: n eriä ja säilytettiin -80 ° C: ssa jatkotutkimuksiin.

transfektio Pienet häiriöt RNA

A431-III-soluja (2,5 x 10

5) maljattiin 60 mm kulttuuriin ruokia ja annettiin kiinnittyä yön yli. 6 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen) lisättiin 300 ul: aan seerumia, sekoitetaan perusteellisesti ja inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Samanaikaisesti, 12 ui siRNA varastossa (10 uM) lisättiin erottamaan 300 ui seerumia, sekoitetaan perusteellisesti. Laimennetun siRNA ja Lipofectamine 2000 yhdistettiin sitten ja niitä inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi siRNA /Lipofectamine kompleksi lisättiin 60 mm: n astiaan, joka sisälsi 2,4 ml seerumittomalla väliaineella jolloin lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin 40 nM. 24 tunnin kuluttua väliaine, joka sisältää transfektion monimutkainen muutettiin ja tuoretta alustaa, joka sisälsi 10% FBS: ää, lisättiin; soluja inkuboitiin sitten vielä 24 tuntia. Kaikki määritykset suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä korkean Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Sveitsi), ja käänteiskopioitiin käyttämällä MMLV High Performance käänteistranskriptaasia kit (Epicentre, Madison, WI). Kvantifiointi transkriptipitoisuuksissa kohdegeenien suoritettiin LightCycler järjestelmä (Roche) käyttäen kaupallista SYBR Esiseos Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japani) ja erityiset alukeryhmiä.

Gene Expression Microarray Analysis

menettely geenien ilmentymisen mikrosiruanalyysi tarjosi valmistaja Welgene Biotech (Taipei, Taiwan). Lyhyesti, sekä A431-P ja A431-III-soluja (1 x 10

6) maljattiin 100 mm: n annoksia ja annettiin kasvaa täydelliseen alustaan. 24 tunnin kuluttua, kokonaismäärät RNA molempien soluja uutettiin 3 ml Trizol reagenssia. Geeniekspressiota mikrosiruanalyysi A431-P ja A431-III-soluja suoritettiin Welgene Biotech. Tiedot käsitellään tässä julkaisun on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE47996 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE47996) .

gelatiinitsymografialla

väliaine kerättiin ja erotettiin 8% SDS-PAGE, joka sisälsi 0,1% gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin 2,5% Triton X-100: ssa 20 min, kaksi kertaa, naturoitua gelatinaasien ja sitten inkuboitiin reaktiopuskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, joka sisälsi 5 mM CaCl

2, 0,02 % NaN

3) 37 ° C: ssa 24-48 tuntia. Sitten geeli värjättiin Coomassie Blue ja poistettiin väri kanssa värinpoistovaihe puskurilla kuten aikaisemmin on kuvattu [33]. Gelatinaasimäärityksellä aktiivisuus näkyi selvä vyöhykkeiksi geeli.

Western-blottaus

solulysaattinäytteet sekoitettiin 5 x näytepuskuria ja keitettiin 5 minuutin ajan, erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidi- geelit (PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosalle (Millipore). Kalvon blotit blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 5% BSA: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Kun oli pesty TBST: llä, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,8% (paino /tilavuus) NaCI: a ja 0,25% Tween-20, blotteja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Millipore). Sitten membraanit pestiin TBST: llä, ja immunologisesti vyöhykkeet havaittiin ECL-reagenssit ja alttiina Fujifilm.

In vitro Invasion määritys

suodatin 24-kuoppaisen Transwell yksikön päällystettiin 0,1 ml 0,6 mg /ml EHS Matrigel. Alempi osastossa oli RPMI-1640, jossa oli 10% FCS, kuten kemoattraktantti. Solut sijoitettiin ylempään osastoon (10

5 solua /0,5 ml RPMI-1640, joka sisälsi 0,1% BSA) 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen suodattimet fiksoitiin 3% glutaraldehydillä PBS: ssä ja värjättiin kristallivioletilla. Solujen yläpinnan suodatinta varovasti kaavittiin pois, ja ne, jotka lävistää Matrigel alapintaan suodattimen laskettiin mikroskoopilla (20 x).

Immunofluoresenssi

solut maljattiin 6-kuoppalevyllä, joka sisälsi 18 mm gelatiinipäällystetyille peitelaseja 18-24 tuntia, jotta kiinni. Sitten väliaine heitettiin pois ja solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min, pestiin PBS: llä, ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 10 min. PBS-pesun jälkeen, peitelasit blokattiin 1% BSA: lla PBS: ssa 30 min. Sitten soluja inkuboitiin anti-cortactin tai anti-Tks5 vasta-aineita, jotka oli laimennettu 1% BSA estopuskuria 1 tunti. Tätä seurasi inkubointi sopivan, sekundaarista vasta-ainetta konjugoituna Alexa Fluro 555 (Invitrogen) 1,5 tuntia. Sama solut värjättiin myös Alexa Fluro 488-konjugoidun phalloidin ja DAPI havaita F-aktiini ja solutumien, vastaavasti. Peitinlasit sitten asennettu 50% glyserolia PBS: ssä ja analysoitiin confocol kuvan mikroskoopilla.

Matrix hajoaminen Pitoisuus

matriisin hajoaminen määritys suoritettiin aikaisemmin kuvatun menetelmän [34], ja koko menettely matriisin hajoamisen määritys suoritettiin pimeässä. Lyhyesti, 18 mm peitinlasit ensin pinnoitettu 0,2 mg /ml Oregon Green® 488-konjugoidun gelatiinia (Molecular Probe). Peitinlasit oli 200 ui 0,5% jääkylmää glutaraldehydillä PBS: ssä lisätään päälle ne ja seoksia inkuboitiin sitten 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, peitelasit inkuboitiin tuoreen 5 mg /ml NaBH

4 PBS: ssä 3 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi peitelaseja pestiin PBS: llä ja steriloitu 70% etanolia. Sammuttamisen jälkeen seerumia ja 1 h, 1 x 10

5-solut ympättiin peitinlaseil- 5 h, ja kalvot prosessoitiin immunofluoresenssianalyysillä käyttäen phalloidin havaitsemiseksi F-aktiini ja DAPI havaita solutumien. Kuvat visualisoitiin konfokaalimikroskopialla. Määrällisesti invadopodia muodostumista ja toiminnon, invadopodia manuaalisesti kvantitoitiin laskemalla kokonaismäärä tuottavien solujen invadopodia vähintään viisi yksittäistä kentät ( 300-solut). Alueella matriisin ympäri soluihin, joita oli hajonnut mitattiin myös käyttäen identtinen signaali kynnys Oregon Green® 488-gelatiini fluoresenssin jokaisen kuvan. Huonontuneen mitattu ala oli alueella, jossa fluoresenssisignaali oli alle kynnyksen mitattuna ImageJ. Määrälliset alue oli sitten normalisoitu vastaan ​​solujen lukumäärä.

konfokaalimikroskopia

Fluoresenssikuvia otettiin käyttäen Zeiss LSM510 -konfokaalimikroskoopilla kanssa 63 × öljyssä linssi, NA 1,25 tavoite ja tappi reikä 0,1 ilmava yksikkö. Kuva-analyysi suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Tilastollinen analyysi

Quantitative tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen ilmaistaan ​​välineet (± SEM). Parittomia Studentin t-testejä käytettiin vertaamaan eroja ryhmien välillä.

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

A431-III solut muodostavat enemmän Invadopodia ja huonontaa ECM tehokkaasti

Olemme aiemmin osoittaneet, että A431-III soluilla enemmän invasiivisia ja muuttavien valmiuksia sekä kohonnut MMP-9 [32]. Tämä antaa meille luotettavan mallin tutkimiseen mekanismi etäpesäkkeiden /hyökkäystä vertaamalla A431-III solujen emosoluista (A431-P). Sen määrittämiseksi, onko A431-P ja A431-III-solut pystyvät muodostamaan invadopodia, ensin suoritetaan immunofluoresenssimenetelmällä havaita ja verrata muodostumista invadopodia by A431-P ja A431-III-soluja. A431-P ja A431-III solut maljattiin gelatiinilla päällystettyjä 6-kuoppaisille levyille 4 tuntia. Invadopodia voitiin havaita cortactin ja aktiini-positiivisia pisteitä sijaitsee ventral päällä soluja. Kuten kuviossa 1A, invadopodia oli helposti löydettävissä A431-III-soluja. Siellä oli vähän tai ei lainkaan havaittavissa invadopodia näy A431-P-soluissa. Seuraavaksi matriisi hajoaminen määritys suoritettiin arvioimiseksi ECM hajoamista kapasiteettia invadopodia in A431-P ja III soluja. A431-III solujen havaittiin olevan suurempi gelatiinia alentavaa kykyä verrattuna A431-P-soluissa (kuvio. 1A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että suurempi liivate halventava kyky todettu liittyvän A431-III solut rinnasteinen niiden suurempi kyky muodostaa invadopodia.

, Ylähavas: A431-P ja A431-III solut värjättiin cortactin ( punainen), F-aktiini (vihreä), ja DAPI (sininen). Arrowheads esimerkkejä invadopodia jotka tunnistetaan cortactin ja aktiini-positiivisia pisteitä. Kuvat ovat otettu molempien soluja. Alempi paneeli: Molemmat solut maljattiin Oregon Green® 488-konjugoidun liivate. Heikentynyt ECM tunnistettiin tumma alue liivate. B, Ylähavas: kvantifiointi solujen liittyy matriisin hajoamista. Alempi paneeli: kvantifiointi hajoamisen alueen normalisoitui vastaan ​​solujen määrä. C, Invasion määritykset suoritettiin. *

p

0,05. Virhejanat esittää standardin keskivirhe. Mittakaava on 22 um. P (A431-P); III (A431-III).

määrällisesti muodostumista invadopodia ja niiden kyky hajota ECM, laskimme prosenttiosuus solujen invadopodia puncta jotka liittyvät huonontuneen gelatiinia laastaria. Kuten kuviossa 1B, yli 35% A431-III solujen havaittiin muodostamaan invadopodia ja hajota gelatiinia. Tämä poikkeaa tulokset A431-P, jossa on vain 5% A431-P solujen havaittiin muodostamiseksi invadopodia. Olemme myös määrällisesti alueen huonontuneen laastarit ja normalisoitu tätä vastaan ​​solujen määrä. A431-III solut osoittivat 10 kertaa suurempi kyky hajota liivate kuin teki A431-P-soluissa. Tämä suurempi kyky invadopodia muodostumisen ja alentava toiminta vastasi hyökkääviä kyky näiden solujen (Fig. 1 C). Yhteenvetona, nämä havainnot viittaavat siihen, että, verrattuna A431-P-soluissa, erittäin invasiivinen A431-III-soluilla on paljon suurempi kyky muodostaa invadopodia, ja että tämä johtaa enemmän hajoamista ECM ja lisääntynyt invasiivisen kyvyn.

Cortactin fosforylaatiomääritys Edistää invadopodia Formation ja Matrix Hajoaminen

Viime aikoina useat raportit ovat hyväksyneet, että yli-ilmentyminen invadopodia sääntelyviranomaisten tai invadopodia komponentti proteiinit pystyvät parantamaan invadopodia muodostumista. Edelleen vahvistaa, onko nämä säätimiä säädellään ylöspäin A431-III soluja, suoritimme microarray ja qPCR analysoi valottaa tätä tapahtumaa. Yllätykseksemme ei ollut merkittävää nousua kaikista tunnetuista invadopodia säädin tai komponentti proteiinia (Fig. 2A 2B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ero A431-P ja A431-III suhteen invadopodia, on todennäköisesti olevan signaalitransduktion tasolla eikä niinkään ekspressiotaso.

, Expression of invadopodia sääntelyviranomaisten, ydinkomponentteihin ja MMP /TIMP in A431-P ja A431-III analysoitiin microarray. B, Expression of invadopodia sääntelyviranomaisten, komponentteja ja MMP /TIMP todensi qPCR. C, kokosoluliuotteista alistettiin varten immuuniblottausanalyysi. Aktiivinen tila Src ja fosforylaatiota cortactin määritettiin.

Src on keskeinen rooli säätelyssä invadopodia muodostumisen [12], [13]. Useat komponentti proteiinien tiedetään läpi tyrosiinifosforylaatiota aikana invadopodia genesis, mukaan lukien cortactin [9], [35]. Fosforylaatiota cortactin mukaan Src on keskeinen kytkin, jonka avulla remodeling aktiinisäikeiden ja aktivointi invadopodia muodostumista ja toimintaa [17], [22]. Voit testata roolin Src in invadopodia muodostumista ja toimintaa, tutkimme Src-kinaasiaktiivisuuden anti-fosforyloitu Src-vasta-aineen A431-P ja III soluja. Kuten kuviossa 2C, olemme huomanneet, että Src on merkittävästi aktivoitu A431-III-soluja, ja sen jälkeen lisääntyminen fosforylaation alavirran kohde, cortactin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Src-kinaasiaktiivisuutta, eikä transkription induktio Src tai minkä tahansa muun invadopodia säädin /komponentti, on todennäköisesti vastuussa lisääntyi invadopodia muodostusta A431-III soluja, yhdenmukaiset meidän päättely koskee microarray data.

varmistamiseksi edelleen roolia Src ja cortactin fosforylaation invadopodia muodostumista A431-III-solut, me sitten käsiteltiin soluja SU6656, selektiivinen Src-estäjällä. Tulos osoitti, että invadopodia muodostumista dramaattisesti tukahdutti käsittely SU6656 (Fig. 3A), kuten oli tunkeutuvat kyvyt havaitaan invaasio määritykset (Fig. 3d). Kvantifiointi prosenttiosuus invadopodia-positiivisten solujen ja suhteellinen hajoaminen alue on esitetty kuviossa 3B. Nämä havainnot osoittavat, että vähentäminen fosforylaatiota Src johtuu inhibitio Src-kinaasiaktiivisuuden SU6656, mutta liittyy myös alhaisempi cortactin fosforylaation (Fig. 3C). Tämä data viittaa siihen, että Src-kinaasiaktiivisuutta on tarpeen invadopodia muodostumista ja invasiivisia mahdollisia.

A, A431-III-solut maljattiin gelatiinilla tai Oregon Green® 488-konjugoidun gelatiinia ja käsiteltiin DMSO: ssa tai 5 uM SU6656 varten 5 h tutkia muodostumista invadopodia ja matriisin hajoamista. B, kvantifiointi solujen liittyy matriksin hajoamista (ylempi paneeli). Kvantifiointi hajoamisen alueen normalisoitui vastaan ​​solujen määrän (alempi kuva). C, yhteensä solulysaatteja valmistettiin immunoblottauksella analyysiä. Aktiivinen Src ja alavirran kohde cortactin (Y421) analysoitiin. D, Invasion määritykset suoritettiin. *

p

0,05. P-arvot verrataan kontrolli A431-III. Virhejanat esittää standardin keskivirhe. Mittakaava on 22 um.

MMP aktiivisuutta tarvitaan Invadopodia Formation ja Matrix Hajoaminen

etäispesäkkeitä, kasvainsolut luottaa invadopodia muodostumiseen ja MMP suorittaa ruoansulatusta ECM, mikä helpottaa solupenetraatio poikki ECM este. Osallistuminen MMP: iden invadopodia elämään on olennaisen tärkeää proteolyysi tapahtuisi. Määrittää korrelaation MMP ja invadopodia muodostumista A431-III, ensin mitataan kykyä A431-III-solujen muodostamiseksi invadopodia ja hajoavat ECM läsnä ollessa GM6001, laaja MMP-estäjä. Tutkimuksemme käytetään Tks5 markkerina havaita invadopodia muodostumista ja toimintaa. Hoitoon A431-III solujen 25pM GM6001 poistetaan kokonaan liivate hajoamista (Fig. 4A). Havaittavaa invadepodia pistemäisiä rakenteita A431-III-solujen havaittiin hoidon jälkeen GM6001. Tämä vaikutus saattaa johtua invadopodia jätti muodostamaan vakaan rakenteen, kun MMP-aktiivisuus estyy. Kvantifiointi prosenttiosuus invadopodia-positiivisten solujen ja suhteellisen hajoamisen alueet on esitetty kuvassa 4B. Vaikutukset GM6001 on MMP toimintaa ja TIMP mitattiin western blot ja zymografialla (Fig. 4C). Yhdessä meidän havainnot osoittavat kriittisen merkityksen MMP toimintaa halventava kyky A431-III soluja, ja miten MMP aktiivisuus vaikuttaa muodostumista invadopodia rakenne.

A, A431-III solut maljattiin gelatiinia tai Oregon Green® 488-konjugoidun liivate ja käsitellään DMSO tai 25 uM GM6001 5 h tarkkailla muodostumista invadopodia ja matriisin hajottavien kyky. Tks5, invadopodia osa proteiinia, käytettiin merkkiaineena. B, kvantifiointi solujen liittyy matriksin hajoamista (vasen paneeli). Olevat hajoamistuotteet alueen normalisoitui vastaan ​​solujen määrä (oikea paneeli). C, vaikutus GM6001 on MMP toimintaa ja TIMP ”ilmaisun mitattiin zymografian ja western blot. D, Soluja käsiteltiin 40 nM MMP-9 siRNA tai kontrolli-siRNA. Knockdown tehokkuutta mitattiin qPCR (vasemmalla) tai gelatiinitsymografialla (oikealla). E, A431-III soluja (ilmentävät ohjaus- tai MMP-9 Knockdown siRNA) maljattiin gelatiinia tai Oregon Green® 488-konjugoitu liivate tutkimaan muodostumista invadopodia ja matriisin hajottavien kyky. F, kvantifiointi solujen liittyy matriksin hajoamista (vasen paneeli) ja hajoaminen alue normalisoitu vastaan ​​solujen määrä (oikea paneeli). *

p

0,05. Virhejanat esittää standardin keskivirhe. Mittakaava on 22 um.

Kolme MMP, MT1-MMP (MMP14), MMP-2 ja MMP-9, on raportoitu liittyvän invadopodia toimiva erilaisissa solulinjoissa [13], [36], [37]. Olemme osoittaneet, että MMP-9 aktiivisuus on avain MMP mikä lisää merkittävästi in A431-III solut (Fig. 2A 2B) [32], ja että tämä proteiini on merkittävä rooli muuttoliikkeen, invaasion ja EMT [33]. Johtuen siitä, että MT1-MMP: n ja MMP-2 tehdään vähän tai ei lainkaan muutoksia A431-III-solut, se on näin ollen todennäköistä, että korkeus on MMP-9 tasolla on vähentämään merkittävästi suurenemisen invadopodia proteolyyttistä aktiivisuutta. Vahvistamaan, onko MMP-9 myötävaikuttaa invadopodia muodostumisen prosessi, saarto endogeenisen MMP-9: n aktiivisuutta A431-III soluihin toteutettiin siRNA knockdown. Pudotus MMP-9: A431-III-solujen vahvistettiin qPCR ja tsymografialla analyysit (Fig. 4D). Menetys MMP-9 johti epäonnistumiseen havaita invadopodia puncta A431-III-solut (Fig. 4E). Pudotus MMP-9: A431-III-soluissa oli riittävä heikentää invadopodia muodostumista noin 60%, ja aiheuttaa väheneminen 70% kokonaispinta-alaan hajottaa näiden solujen, kuten on esitetty kuviossa 4F. Yleensä pudotus MMP-9: A431-III-solut oli samanlainen tulos kuin altistuminen GM6001. Molemmissa tapauksissa oli joko vika voidaan havaita invadopodia tai merkittävä väheneminen määrän invadopodia pistemäisiä rakenteita. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että MMP-9: llä on tärkeä rooli induktion invadopodia sukupolven ja myöhemmin hajoaminen ECM.

Luteolin ja kversetiini Inhibioitu Src-kinaasiaktiivisuutta ja Vaikuttavat alavirran Target Cortactin

Aiemmissa tutkimuksissa tunnistimme kaksi voimakkaimmista tunnetuista flavonoideja, eli Lu ja Qu. Nämä flavonoidit näytteille erilaisia ​​syöpälääkkeen vaikutuksia, kuten solujen kasvun esto ja kinaasiaktiivisuutta, tukahduttaminen MMP ilmaisun ja erittymisen, lasku muuttoliike /hyökkäyksen, ja käänteinen EMT [26], [29], [38], [39]. Vaikka nämä kaksi flavonoidit ovat potentiaalisesti tehokkaita anti-invasiivisia yhdisteitä, tähän mennessä ei Tutkimuksessa arvioitiin vaikutuksesta Lu ja Qu päälle invadopodia muodostumista ja toimintaa. Perustuen niiden vaikutukset kinaasiaktiivisuutta ja MMP [26], me olettaisi, että Lu ja Qu saattaa olla kyky häiritä muodostumista ja toimintaa invadopodia. Ehdotuksia on tehty, että Src, kun aktivoitu, pystyy välittää signaaleja loppupään tavoitteita, sitten moduloida solun kasvua, selviytymistä, muuttoliike ja invaasio [40]. Nämä havainnot sai meidät tutkimaan, onko hoito joko Lu tai Qu olisi välitön estävä vaikutus Src tyrosiinikinaasiaktiivisuutta, ja arvonalentumiset cortactin fosforylaation seurauksena.

Hoito joko Lu tai Qu havaittiin vähenevän src fosforylaatio on cortactin (Fig. 5A). Sen lisäksi, että inhiboiva vaikutus Src ja cortactin fosforylaation, tutkimme myös vaikutuksia näiden kahden flavonoideja on MMP toimintaa. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, Lu tai Qu tukahdutti eritystä MMP-2 ja MMP-9 toimintaa, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta MT1-MMP, TIMP1 ja TIMP2.

Soluja käsiteltiin 20 uM Lu tai Qu seerumivapaassa väline 24 h. A, kokosoluliuotteista alistettiin varten immuuniblottausanalyysi. Aktiivinen Src ja alavirrassa oleva kohde cortactin (Y421) määritettiin. B, väliaine ja solulysaattia analysoitiin MMP toimintaa ja TIMP ”ilmaisun käyttämällä gelatiinitsymografialla ja western blot. C, Kuvat ovat A431-III käsitelty Lu tai Qu. Vasen paneeli: Solut värjättiin cortactin (punainen) ja F-aktiini (vihreä). Oikea paneeli: A431-III solut maljattiin Oregon Green® 488-konjugoidun gelatiini tutkimaan matriisin alentavan kyvyn. D, kvantifiointi solujen liittyy matriksin hajoamista (vasen paneeli). Olevat hajoamistuotteet alueen normalisoitui vastaan ​​solujen määrä (oikea paneeli). E, Invasion määritykset suoritettiin. *

p

0,05. P-arvot verrataan kontrolli A431-III. Virhejanat esittää standardin keskivirhe. Mitta-asteikko on 22 um.

tutkimiseksi edelleen vaikutusta Lu ja Qu kohtelu invadopodia muodostumista prosessissa, arvioimme kyky A431-III-solujen muodostamiseksi invadopodia ja hajoavat gelatiinia läsnä ollessa lu tai Qu.