Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ionisoiva säteily (IR) -enhanced kasvain invasiivisuus on nousemassa myötävaikuttamassa vähän hyötyä sädehoidon; kuitenkin, sen mekanismi on vielä epäselvä. Olemme aiemmin osoittaneet, että alakloonatun keuhkojen A549-solut (P-solut), joka selvisi 10 Gy IR (IR-solut), hankki korkea invasiivisuus

in vitro

. Täällä, yritimme tunnistaa mekanismia, jolla IR solut lisäävät invasiivisuus tarkastelemalla muuttunut geeniekspressiota ja signaalireaktioteissä IR-soluissa verrattuna P-soluissa. Simuloida microenvironment

in vivo

solut upotettu kolmiulotteinen (3D) I-tyyppisen kollageenin geeli, jossa IR-solut pitkänomainen, kun taas P-solut olivat pallomaisia. Integriinin ilmentyminen kuvio kartoitettiin ja ekspressiotasot integriini α2 ja β1 alayksiköt olivat merkittävästi koholla IR-soluissa. Knockdovvn α2 ilmaisun tai toiminnallisia saarto integriinin α2β1 johti kierroksen morfologia IR soluja, ja kumotaan niiden hyökkäyksen kollageenimatriksin, mikä viittaa molekyylin olennainen rooli solujen leviämisen ja invaasion 3D kollageenia. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) esitti myös lisääntynyt ilmentyminen ja aktivoinnin IR-soluissa. Hoito EGFR tyrosiinikinaasin estäjä, PD168393 laski suhde pitkänomainen solujen ja invasiivisuus. Molekyylejä, mukaan lukien ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi-1/2 (Erk1 /2) ja Akt, oli korkeampi aktivointi IR-soluissa. Inhibitio Akt aktivaation käsittelemällä fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) estäjä LY294002 laski IR soluinvaasiota, kun taas esto Erk1 /2 aktivaation mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi kinaasin (MEK) estäjä U0126 ei. Tuloksemme osoittavat, että integriinin α2β1 ja EGFR yhteistoiminnallisesti edistää korkeampi invasiivisuus IR-selviytyi keuhko- syöpäsoluja, välittämä osittain PI3K /Akt-signalointireitin, ja voisi toimia vaihtoehtona tavoitteita samanaikaisesti sädehoidon kanssa.

Citation: Li X, Ishihara S, Yasuda M, Nishioka T, Mizutani T, Ishikawa M, et al. (2013) Lung Syöpäsolut Hengissä Ionisoiva säteily Näytä Lisääntynyt integriini α2β1- ja EGFR-Dependent invasiivisuus. PLoS ONE 8 (8): e70905. doi: 10,1371 /journal.pone.0070905

Editor: Ferenc Gallyas, University of Pecs Medical School, Unkari

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 26 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 08 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Apurahat-in-tuki JSPS Fellows (11J06280) SI, Scientific Research (A) (21249065) HS ja H.H., tieteellisen tutkimuksen (B) (24390285) ja M.Y., T. N. ja H.H., tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (24106502) ja T. M., ja kartoittava tutkimus (23651099) ja K.K. alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology, Japani. Tämä tutkimus myös osittain tukevat Special aiheutuu menoja ”Reverse Translaatiotutkimuksen Advanced Medical Technology Advanced Life Science” ja M.I., H. S. ja H. H. rahoitetaan opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden kaikkialla maailmassa, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus useimmissa tapauksissa. Hoitovaihtoehtoja NSCLC kuuluvat leikkaus, kemoterapia, sädehoito, ja juokseva tai samanaikainen yhdistelmähoitoa [1]. Sädehoito on lääketieteellinen ionisoivan säteilyn (IR), ja sitä pidetään ei-invasiivisia paikalliseen hoitoon, jotka vaikuttavat pääasiassa soluja ja kudoksia, jotka sijaitsevat palkin sisällä IR. Epäilemättä se on osoittautunut niin olennainen työkalu taistelussa syöpää vastaan.

Kuitenkin yhä kokeellinen tiedot viittaavat siihen, olosuhteissa ei ole vielä ymmärretty, sädehoito primaarikasvaimen voisi suosia etäpesäke, joka voi miksi parempi paikallinen valvonta säteilyn ei kääntää pidempään elinaika, vapaa kaukaisten etäpesäkkeitä [2]. Siksi lisäksi huomattavia ponnisteluja parantaa radioherkkyyttä [3] – [6], tunnistaminen molekyylien ja mekanismeista IR aiheuttama metastaattinen etenemisen tarvitaan määrä tehostaa sädehoidon ja potilaiden eloonjäämisaste. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että säteilytys voi edistää invaasion ja /tai etäpesäkkeiden säätelemällä geenien ilmentymistä, ja aktivointi signalointireittien, jotka ovat mukana metastaattisen prosessin. Niistä, solun pinnan reseptorit, kuten integriinit ja kasvutekijäreseptorit, usein muuttunut IR ja kykenevät aktivoimaan useita eri signalointireittejä, jossa on useita soluvasteita. Esimerkiksi ekspressiotasot integriini a vp3 glioomasoluihin [7] ja α5β1 haimasyövän [8] voimistuvan IR, helpottaa sekä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Integriini α3β1 yli-ilmennetään jälkeen IR, edistämällä migraatio meningeooma solujen kautta polttovälin tarttuvuus kinaasi (FAK) ja ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) [9]. Ryhmämme [10] ja muut [11] osoitti keskeistä roolia integriini β1 IR aiheuttama invasiivisuus keuhkosyövän ja medulloblastoma, vastaavasti. IR voi myös parantaa hyökkäyksen aktivaation kautta epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptori 1 (IGFR1) [12], [13], ja eritys hepatosyyttien kasvutekijän (HGF) [14].

Tässä pyrimme paremmin ymmärtämään taustalla oleva mekanismi lisääntynyt invasiivisuus keuhkosyövän soluista, jotka selvisivät IR. Olemme osoittaneet, että integriinin α2β1 ilmentymistä selektiivi- sesti IR-soluissa, ja tarvitaan aggressiivista fenotyyppi ja invaasion IR solujen kolmiulotteisen (3D) kollageeni geeli. EGFR oli ilmentynyt ja aktiivisempia IR-soluissa, edistää IR invasiivisuus samoin. Tutkiminen useita tärkeitä signalointimolekyylien ilmeni aktivoitumista ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi-1/2 (Erk1 /2) ja Akt IR-soluissa, mutta ainoastaan ​​fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) /Akt välitti invasiivisia signaalitransduktioreittiin päässä integriinin α2β1 ja EGFR . Ymmärtäminen IR edistää hyökkäys syöpäsolujen voi antaa käsityksen etäpesäke ja potentiaalisia terapeuttisten kohteiden toistumisen ehkäisemiseksi toissijaisten kasvainten sädehoidon jälkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen keuhkoadenokarsinooma A549 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). P-solut ja IR-solut tuotettiin, kuten aiemmin on julkaistu [10]. Molemmat solulinjat pidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Equitech-Bio, Kerrville, TX) ja 1% antibiootti seosta penisilliiniä /streptomysiiniä (Sigma ). Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Reagenssit

EGFR-kinaasi-inhibiittori PD168393 (Calbiochem, Merck KGaA, Damstadt), PI3K-inhibiittori LY294002 ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi kinaasin (MEK) estäjä U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) käytettiin ilmoitetun pitoisuuden DMSO: ssa. Funktio-estävää vasta-ainetta vastaan ​​integriiniä α2β1 (BHA2.1) hankittiin Millipore (Billerica, MA). Western blotting spesifisiä vasta-aineita integriini α2 ja β1 alayksiköitä hankittiin BD BioScience (San Jose, CA). P-EGFR-vasta-aine (Tyr1068) hankittiin Signalway Antibody (College Park, Maryland). Spesifisiä vasta-aineita EGFR, Akt, p-Akt (Ser473), p44 /42 Raf-mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi MAPK (Erk1 /2), p-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 3 (Stat3), p-Stat3 (Ser727), p38 MAPK, ja p-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182) ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). GAPDH vasta-aine hankittiin Ambion (Austin, TX). MFP488 phalloidin ostettiin Mo Bi Tec (Molecular Biologische Technologie, Göttingen).

3D Kollageeni Culture

1,6 mg /ml kollageenia liuos valmistettiin sekoittamalla 3 mg /ml sian kollageenia tyyppi IP liuosta (Nitta Gelatin, Osaka), 2,6 x DMEM-elatusainetta (Sigma), ja puskuri (Nitta Gelatin) suhteessa 07:05: 1 jäällä. 30 mm: n malja ensin päällystetään 150 ui kollageenin liuosta ja annettiin polymeroitua 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, sitten huuhdeltiin välineellä. Sitten 10 ui 2 x 10

5-solujen suspensiota sekoitetaan huolellisesti 150 ui kollageenin liuosta ja maljattiin alemman kerroksen kollageenigeelistä. Kollageenin jälkeen polymerointi 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, solu-kollageenin seos peitettiin 2 ml: lla FBS: ää sisältävää väliainetta ja niitä viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 tarkempaa analysointia varten. Sillä morfologia analyysi ja time-lapse havainto, lasiastiassa korvattiin muovinen astia. Helpompi havainnointi solun liikkeen samassa tasossa, geeli-hiekka viljelmää käytettiin. Ensin soluja maljattiin ja annettiin kiinnittyä alempaan geeli, ja sen jälkeen 16 h, ylempi geelin päälle ja polymeroitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Soluja ylläpidettiin 2 ml FBS sisältävää väliainetta 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Solumorfologia Analyysi

Solun morfologia analysoitiin sen jälkeen, kun on 3D-kollageenigeeli 24 h. Milloin on osoitettu, inhibiittorit tai vasta-aineita lisättiin alustaan. Vaihekontrasti Kuvat on otettu satunnaisesti 4 kenttää per näyte, ja prosenttiosuus pitkänomainen soluja määritettiin vähintään 3 itsenäisen kokeen mukaan lukien yli 100 yksittäisiä soluja. Solu pidettiin pitkänomainen, kun sen suurin mitta oli kaksinkertainen lyhin mitta, ja kun se näytti ainakin yksi uloke, kuten aiemmin raportoitu [15].

Aikaväli Microscopy ja kvantifiointi Speed ​​of Cell Invasion

2 x 10

4 solut viljeltiin 3D geeli-hiekka määritys 24 tuntia, ja havaittiin kammioon 37 ° C: seen faasikontrastimikroskoopissa (TE300, Nikon Instech, Tokio). Kuvia satunnaisesti valitut solut otettiin joka 5 min 6 tuntia. Eston kokeet, inhibiittorit tai vasta-aineet lisättiin elatusaineeseen jälkeen geeli-overlay, kun ilmoitettu. Kvantifioimiseksi nopeus solujen, me seurataan liikkeitä yksittäisten solujen Image-Pro -ohjelmisto (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD). Solu invaasio nopeus laskettiin etäisyyden (pm) minuutissa vähintään 3 itsenäisen kokeen lukien 50 yksittäisiä soluja.

3D Sferoidiviljelmiä invaasiomääritys

Pallot tuotettiin käyttäen Gravity Plus -järjestelmä (InSphero , Zurich, Sveitsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 40 ui solususpensiota, joka sisälsi 10

3-soluja ympättiin kuhunkin levyn kuoppaan 4 d, ja pallosia siirrettiin kollageenigeelin ja päälle pian sen jälkeen. Oltuaan liivatteen 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, väliaine, jossa FBS lisättiin, ja soluja viljeltiin 24 tuntia. Milloin on osoitettu, inhibiittorit tai vasta-aineet lisättiin viljelyn aikana. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä, permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssa, ja värjättiin MFP488 phalloidin. Fluoresenssikuvat saatiin CLSM (C1 konfokaali kuvantamisjärjestelmä, Nikon Instech., Tokio). Kehä ja ala sferoidi- määritettiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), kuten aiemmin raportoitu [16]. Lyhyesti, vaihtaa kuvan 8-bittinen tyyppi, ja käytä kynnyksen toiminto muuntaa kiinnostavia asioita tyydyttyneiden mustia alueita yhdenmukaisesti olla binary (black valkoinen) kuva. Sitten pois kaikki hiukkaset alle 3 pikseliä ja poistaa esineitä vertaamalla binary kuvan fluoresenssi kuvaa. Käytä set mittaukset valintaikkuna määrittää alueen ja ympärysmitan. Käytä analysoida hiukkanen valintaikkuna mitata kaikki hiukkaset ja luoda ”hiukkanen raportti” jokaisen kuvan, jossa alueen ja ympärysmitan yksittäisten hiukkasten ja alueen summa yksittäisten hiukkasten dokumentoidaan. Kuvasuhteen laskettiin kehä

2 /[4π (alue)]. Suurempi kuvasuhde merkitsee enemmän epäsäännöllinen, soluttautuminen pallomainen rakenne. Tulokset määritettiin 3 erilliselle kokeelle suoritettiin kolmena kappaleena.

Western-blottaus

Solut 3D kollageenia kulttuuri kiinnitettiin 500 ui jääkylmää trikloorietikkahappoa (TCA) 3 min, ja pilkottu 200 ui 0,1% kollagenaasia 37 ° C: ssa 1 h. Solupelletit kerättiin sentrifugoimalla 14000 rpm: ssä 2 minuutin ajan, suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan Laemmli-puskuria, ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ennen lysaatit on sonikoidaan 30 sekuntia ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Suorittaa western blotting, solulysaatit erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore, Bedford, MA). Membraani blokattiin 5% saatettua rasvatonta maitojauhetta TBST-liuoksessa (10 mM Tris-HCI, joka sisältää 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20, pH 7,5). Blotteja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettu TBST tai Can Get Signal Immunokemiallisen Enhancer Ratkaisu 1 (Toyobo, Osaka) 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen TBST: llä, piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet laimennettiin TBST: ssä tai voi Get Signal Immunokemiallisen Enhancer Ratkaisu 2 käytettiin, ja blotit kehitettiin Enhanced Chemiluminescence Detection System (Perkin Elmer, Waltham, MA). Tasot GAPDH immunokompleksien käytettiin sisäisenä standardina samanarvoisesta lastaus. Kvantifiointi signaalin intensiteettiä suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmiston ja normalisoitiin vertailuarvosta.

RT-PCR

Solut lyysattiin Tripure (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ja RNA: n uutto, ja Käänteiskopiointireaktio suoritettiin ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). Soluille viljeltiin 3D kollageenin geeli, uuttaminen suoritettiin kahdesti. PCR suoritettiin Taq Polymerase in THERMOPOL Buffer (NEB, Ipswich, MA). Alukkeet olivat seuraavat: integriini α1:5′-GCCTCCTTTCTTGCTGTGTC-3 ’(eteenpäin), 5′-TGGGTGCTTATTGGTTCTCC-3′ (taaksepäin); integriini α2:5’-GAGCACCAGCAACAAAGTGA-3 ’(eteenpäin), 5′-CGGGTGTGTGTTCTGACATC-3′ (taaksepäin); integriini α4:5’-GAGATTTTCCCCTTGCATGA-3 ’(eteenpäin), 5′-GAGTGCAATGCAGACCTTGA-3′ (taaksepäin); integriini α5:5’-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 ’(eteenpäin), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (taaksepäin); integriini β1:5’-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3 ’(eteenpäin), 5′-CCTCGTTGTTCCCATTCACT-3′ (taaksepäin); ja GAPDH: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’(eteenpäin), 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (peruutus).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

qRT-PCR suoritettiin PikoReal (Thermo Scientific, Waltham, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, kokonais-RNA (1 ug), tehtiin käänteistranskriptio käyttäen spesifisiä alukkeita seuraavasti: integriini α2:5′-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 ’(eteenpäin), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (taaksepäin); integriini β1:5’-GACGCCGCGCGGAAAAGATG-3 ’(eteenpäin), 5′-GCACCACCCACAATTTGGCCC-3′ (taaksepäin); EGFR: 5’-CGCAGATAGTCGCCCAAAG-3 ’(eteenpäin), 5′-CCATCAGGGCACGGTAGAA-3′ (taaksepäin); ja β-aktiini: 5’-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3 ’(eteenpäin), 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGTCG-3’ (taaksepäin), jota käytettiin viite-geenin normalisointi.

Sirna (siRNA) Transfektio

transfektoitiin siRNA vastaan ​​integriini α2 kohdesekvenssin 5′-AACCAAAGAAGAAATGATTGTAG-3 ’(sense-sekvenssin, siα2-1) tai 5′-AACAAGAATGCTCAGATAATTCT-3′ (sense-sekvenssin, siα2-2) käyttäen Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). SiRNA vastaan ​​Azami Green kohdesekvenssin 5’-AGCAGATATTCAGGACTATTTCA-3 ’(sense-sekvenssin) käytettiin negatiivisena kontrollina.

proliferaatiotestillä

2 x 10

4-soluja viljeltiin 3D kollageenigeelissä 24-kuoppalevylle, ja käsiteltiin estäjillä tai vasta-aineita, kun ilmoitettu kasvatuksen aikana. Medium kanssa tai ilman inhibiittorit tai vasta-aineet vaihdettiin joka toinen päivä. Solut 3D kollageenia kulttuuri kiinnitettiin 200 ui jääkylmää TCA 3 minuutin ajan, ja hajotettiin 200 ul 0,1% kollagenaasia 37 ° C: ssa 1 h, pipetoitiin huolellisesti ja edelleen sulavaa vielä 1 tunnin. Solupelletit otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen PBS: llä. Solutiheys määritettiin hemosytometrillä. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 itsenäisestä kokeesta.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koeolosuhteissa toistettiin vähintään 3 kertaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi, ja P-arvo ≤0.05 katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

IR Solut Present Korkeampi Invasive Kyky

tutkia IR voi edistää syöpäsolujen invaasiota, solufenotyypin ensin verrattiin P ja IR-soluissa. Toisin samanlainen morfologia 2D jäykkä alustalle, solu morfologit eroavat merkittävästi, jos ne perustuvat 3D kollageenin geeli, missä P-solut ovat pallomaisia; IR-solut ovat pitkänomaisia ​​ulkonemia [10].

kvantifiointi hyökkäyksen nopeus yksittäisten solujen osoittivat, että IR-solut siirretään nopeammin noin kaksinkertaisesti kuin P solut kollageenigeelissä (Fig. 1A). Lisäksi liikeradat IR soluista oli pidempi ja ohjannut kuin P solut, joissa soluilla on usein kääntää ympäri (Kuva. 1 B). Lisääntynyt invasiivisuus IR-solujen vahvistettiin lisäksi 3D pallomainen invaasiomääritys matkia ominaisuus kasvainten

in vivo

(Fig. 1 C). Tulokset osoittavat, että kun upotettu kollageenigeelissä 24 tuntia, sekä P ja IR pallosia määrän kasvaessa noin 20-40% (Kuva. 1 D), kun taas IR pallosia laajennettu massiivinen ulokkeita, joitakin soluja, joilla on jo karannut kehosta , ja esitetään korkeampi kuvasuhde kuin P-soluissa (kuvio. 1 E), mikä viittaa suuremman invasiivisuus IR solujen microtissues.

(A) kvantifiointi hyökkäyksen nopeus P ja IR-soluissa esitetään keskiarvona arvot ± SD, *** p 0,001. (B) kaaviot edustavat hyökkäyksen lentoradat 4 edustavien solujen P ja IR solujen 3D kollageenigeelissä-hiekka kattaa 6 tuntia. Solun alkuperää asetettiin (0,0), ja mittakaava yksikkö on pm. (C) konfokaali kuvia edustavien MFP488 phalloidin-värjätään P ja IR rakeita kollageenigeelissä 0 h tai 24 h. Mittakaava, 200 um. (D) kvantifiointi alueen pallosia, jonka ImageJ ohjelmisto. (E) kuvasuhde pallosia laskettiin kehä

2 /[4π (alue)]. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle kolmena kappaleena.

integriini α2β1 yliekspressoituu IR Solut, ja tarvitaan Venymä ja invasiivisuus IR solut 3D Kollageeni

Integriinit ovat solun pintaan liima-reseptoreihin muodostama α ja alayksiköiden, jotka sitoutuvat soluväliaineen (ECM) proteiineja. Integriini-välitteistä tarttumista ECM laukaisee solunsisäisten signalointireitteihin moduloimiseksi solujen morfologia, muuttoliike, invaasio, proliferaatio, ja selviytyminen [17]. Dramaattinen elimellisen muutoksen IR solujen verrattuna P soluihin, kun ympärillä kollageenimatriisissa kannusti meitä tutkimaan integriini ilme kuvio. Edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että pudotus integriini β1 siRNA tai käsittelemällä sen inhiboivan vasta-aineen AIIB2 indusoi pallomainen morfologia IR solujen 3D kollageenigeeli, samanlainen kuin P-soluja [10]. Ottaen huomioon, että I-tyyppinen kollageeni ja fibronektiini (erottautuvat päässä FBS keskipitkällä ja erittämään soluista) ovat tärkeimmät ECM komponenttien meidän kollageenigeeli malli, ekspressiokuviota integriinien, kuten α1β1, α2β1, α4β1, ja α5β1, tutkittiin RT-PCR: llä. Joukossa, α1β1 ja α2β1 raportoidaan pääasiassa kollageeni-reseptoreihin, kun taas α4β1 ja α5β1 raportoidaan tärkein fibronektiinireseptoreita [18]. Tulokset RT-PCR osoittavat, että IR-soluissa, transkription tasot α2, ja β1 lisääntynyt taso α1 vähentynyt, ja ei ole selvää muutosta tason α4 ja α5 (Fig. 2A). Tulokset qRT-PCR vahvisti lisäksi, että transkriptio taso α2 tehostui 4,8-kertaisesti, ja että β1 tehostui 2,2-kertaisesti (kuvio. 2B). Lisäksi western blottaus suorittaa tunnistavat proteiinin tasot, ja samanlainen korkeus havaittiin (Fig. 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että integriinin α2β1 voisi olla tärkeä rooli muuttuneessa vuorovaikutuksen IR solujen ja ECM. Vahvistaa, onko kohonnut integriini α2β1 on välttämätön IR solun invasiivisuus, knockdovvn α2 ilmentymisen IR soluissa kahdenlaisia ​​siRNA erityisiä integriiniin α2 toteutettiin, ja vaikutus varmistettiin RT-PCR (Kuva. 3A, vasemmalla). Todellakin, knockdovvn α2 heikentynyt IR soluelongaatiota (Fig. 3A, oikealla) ja hyökkäyksen kollageenigeelissä (Elokuva S1, S2).

(A) Semi-kvantitatiivinen analyysi mRNA tasojen integriinin alayksiköiden, mukaan lukien α1, α2, α4, α5, ja β1, P ja IR solujen RT-PCR. (B) kvantitatiivinen analyysi mRNA-tasojen integriini α2, ja β1 alayksiköiden P ja IR-solujen qRT-PCR: llä. Intensiteetti signaalien kvantitoitiin densitometrialla ja normalisoitu β-aktiini. Edustus on keskiarvo ± S.D suhteellisen mRNA tasolla (** p 0,01) 3 erilliselle kokeelle, merkitty kertainen muutos suhteessa P soluihin. (C) analyysi proteiinin tasot integriini α2, ja β1 alayksiköiden P ja IR-soluja viljeltiin 3D kollageenin geelin western-blottauksella. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

(A) Knockdown integriinireseptoriperheen α2 alayksikköä IR-soluissa johti kierroksen morfologia 3D kollageenigeelissä. IR-solut, jotka oli transfektoitu 2 siRNA: t spesifinen integriini α2 (siα2-1 tai siα2-2), tai tietyn siRNA suunnattu Azami-Green (Siag) kontrollina, siirrettiin 3D kollageenigeelin ja viljeltiin 24 h . Vasen: RT-PCR-tuloksiin tarkistaa vaikutuksen tietyn knockdovvn integriinin α2. Oikea: edustavat kuvat solun morfologioita. Suurennus yksittäisen solun edustaa valkoiset laatikot. Mittakaava, 20 um. (B) Toiminnallinen esto integriini α2β1 aiheuttama palautuva takaisinveto ulokkeita ja invasiivisuus IR soluja. Time-lapse tarkkailu IR käsiteltyjen solujen BHA2.1 3D kollageenigeelissä-hiekkaa. Edustaja kuvia IR-soluja, jotka olivat ei-käsiteltyjen (NT), käsiteltiin BHA2.1 (BHA2.1), tai pestään pois (Huuhtele) tuoreella väliaineella on esitetty. Valkoiset laatikot hahmotella tietty alue, joka suurennettu. Mittakaava, 100 pm. (C) Cell morfologia analyysi BHA2.1 käsiteltyjen IR-soluissa vastaan ​​kontrollit, 3D kollageenigeelissä mittaamalla prosenttiosuus pitkänomaisen solujen yhteensä, ilmaistuna keskiarvoina ± SD (*** p 0,001) 3 riippumattoman kokeen mukaan lukien noin 100-soluja. (D) kvantifiointi nopeus P ja IR solujen 3D kollageenigeelissä-hiekka 6 tuntia, ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle lukien noin 50 solua. (E) konfokaali kuvia edustajan MFP488 phalloidin-värjätään P ja IR rakeita kollageenigeelissä 0 h tai 24 h. Mittakaava, 200 um. (F) kvantifiointi alueen pallosia, jonka ImageJ ohjelmisto. (G) kuvasuhde pallosia laskettiin kehä

2 /[4π (alue)]. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle kolmena kappaleena.

Koska integriinit sitoutuvat suoraan komponenttien ECM ja antaa pitoa tarpeen solujen liikkuvuutta ja invaasiota , me tutki vuorovaikutusta integriini α2β1 ja ECM oli tärkeää IR soluinvaasiota. Toiminto-estävää vasta-ainetta BHA2.1 (400 ng /ml), joka tunnistaa I-domeeni α2, sitoutumiskohdan kollageenien, on käytetty hoitamaan IR solut geeliin. Ajastettu havainto osoitti, että aktivaation salpaamiseksi integriinin α2β1 indusoi sekä supistuminen solun ulkonemien ja alhainen invasiivisuus pian hoidon jälkeen, ja poistamalla vasta-aine lisäämällä tuoretta väliainetta palauttaa invaasiota (Fig. 3B, Elokuva S3). BHA2.1 hoito vähensi suhde pitkänomaisen fenotyypin (Fig. 3C) ja hyökkäys nopeus IR-soluissa (kuvio. 3D), ja poisti pallojakaantuminen invaasiota (Kuva. 3E-3G), mikä viittaa siihen, että funktionaalinen integriinin α2β1 vaaditaan IR soluinvaasiota.

Lisääntynyt EGFR ja aktivointi IR Solut on mukana IR Cell Invasion

EGFR on reseptori tyrosiinikinaasin, joka on usein yli-ilmentynyt tai satamiin konstitutiivisesti aktiivinen mutaatioita NSCLC [19]. Niinpä pyysimme onko korjauksilla EGFR tapahtui IR-soluissa. Yllättäen sekä EGFR transkription taso ja proteiinia taso oli paljon koholla IR-soluissa, verrattuna P-soluissa (kuvio. 4A, 4B). Tasaisen laadukas EGFR aktivointi signalointi liittyvää jäännös Tyr1068 havaittiin myös IR-soluissa ilman stimulaatiota EGFR ligandin (Fig. 4B). Näin ollen spesifinen estäjä kohdistettu tyrosiinikinaasin EGFR, PD168393 (10 uM), on käytetty hoitamaan IR-soluja, ja sen osoitettiin vähentävän fosforylaatiota EGFR (Fig. 4C), suhde pitkänomaisen IR-soluissa (kuvio. 4D , 4E), ja hyökkäys nopeus (Fig. 4F). Kuten integriinin α2β1 esto, PD168393 käsiteltyä IR pallosia säilyi säännöllisesti pallosia ilman volyymilisäyksellä (Fig. 4G, 4H) tai ulkoneman (Fig. 4G, 4I). Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että EGFR-signalointireitin on mukana lisääntynyt invasiivisuus IR-soluissa.

(A) kvantitatiivinen analyysi EGFR-mRNA-tasojen P ja IR-solujen qRT-PCR: llä, keskiarvoina ± SD suhteellisen mRNA-tasolla (*** p 0,001) 3 itsenäisestä kokeesta, merkitty kertainen muutos suhteessa P-soluissa. (B) analyysi proteiini veren kokonaiskolesterolia EGFR ja fosforyloidun EGFR (Tyr1068) western-blottauksella. Signaalien voimakkuus kvantitoitiin densitometrillä ja normalisoida GAPDH. Tulokset esitetään keskiarvoina ± S.D suhteellisen proteiinin taso (** p 0,01), 3 itsenäisestä kokeesta, merkitty kertainen muutos suhteessa P-soluissa. (C-E) EGFR aktivaation aiheuttama kierroksen morfologia IR soluja. IR solujen 3D kollageenigeelissä käsiteltiin 10 uM EGFR-inhibiittoria PD168393 tai DMSO kontrollina 24 tuntia. (C) Expression analyysin fosforyloidun EGFR (Tyr1068) ja yhteensä EGFR päässä PD168393- ja DMSO-käsiteltyjen näytteiden Western-blottauksella. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. (D) Kuvat ovat solun morfologiat PD168393-käsiteltyjen näytteiden verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin. (E) prosenttiosuus pitkänomainen solujen määrä määritettiin 3 erilliselle kokeelle mukaan lukien noin 100 solua, *** p 0,001. (F) kvantifiointi nopeuden DMSO tai PD168393 käsiteltyjen IR solujen 3D kollageenigeelissä-hiekka 6 h esitetään keskiarvoina ± S.D (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle lukien noin 50 solua. (G) konfokaali kuvia edustavien MFP488 phalloidin-värjätty IR rakeita kollageenin geeli 0 t ja IR pallosia käsiteltiin DMSO tai PD168393 24 tuntia. Mittakaava, 200 um. (H) kvantifiointi alueen pallosia, jonka ImageJ ohjelmisto. (I) kuvasuhde pallosia laskettiin kehä

2 /[4π (alue)]. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle kolmena kappaleena.

integriini α2β1 ja EGFR edistää IR Cell Invasion Osittain läpi PI3K /Akt

edelleen tunnistaa mekanismia integriinireseptoriperheen α2β1- ja EGFR-riippuvaista IR soluinvaasiota, olemme kartoitettiin useita tärkeitä loppupään molekyylejä, jotka säätelevät integriinin α2β1 ja /tai EGFR, kuten MEK /Erk1 /2 [20], [21] , PI3K /Akt [21], [22], Stat3 [23], ja p38 MAPK [24], [25]. Joukossa, Western blotting osoitti vain Erk1 /2 ja Akt aktivointi voidaan merkittävästi yliaktiivista IR-soluissa, jossa formereihin kokonais- ja fosforyloidun proteiinin tasot välttämättömien tähteiden signaalin siirtoon (Kuva. 5A). Vahvistamaan, onko niiden aktivointi liittyy IR soluun invasiivisuus, erityisiä estäjät kohdistaminen niiden vastavirtaan kinaasien käytettiin myös MEK estäjä U0126 (10 uM) ja Erk1 /2 ja PI3K estäjän LY294002 (50 uM) ja Akt. Aktivointi Akt ja Erk1 /2 kumottiin vähentynyt fosforylaatio kun esto niiden alkupään molekyylien (Fig. 6A). Morfologia-analyysi osoitti, että LY294002 käsittely laski prosenttiosuus pitkänomaisen solujen (Fig. 5c), ja siten hyökkäyksen nopeus (Fig. 5D), kun taas U0126 hoitoa ei. Johdonmukaisesti, 3D pallojakaantuminen invaasiomääritys osoitti, että IR soluinvaasiota osaksi kollageenigeelissä tukahdutettiin vasta hoidon jälkeen LY294002, kun taas U0126 oli vähäinen vaikutus (Kuva. 5E, 5G), vaikka pallojakaantuminen laajennus estyi hieman (Kuva. 5F). Nämä tulokset viittaavat siihen osallistuminen PI3K /Akt, mutta ei MEK /Erk1 /2, vuonna invasiivisia signaalitransduktion IR-soluissa.

(A) Expression analyysi koko ja fosforyloidun Akt-muotoja (Ser473), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38 (Thr180 /Tyr182) ja Stat3 (Ser727) western-blottauksella. Intensiteetti signaalien kvantitoitiin densitometrialla ja normalisoida GAPDH. Tulokset esitetään keskiarvoina ± S.D suhteellisen proteiinin taso (** p 0,01), 3 itsenäisestä kokeesta, merkitty kertainen muutos suhteessa P-soluissa. (B-C) vaikutukset estämällä Akt ja Erk1 /2 aktivointi morfologiaan IR soluja. (B) Faasikontrasti- kuvia PI3K estäjän LY294002 (50 uM) tai MEK estäjä U0126 (10 uM) käsiteltiin IR-soluissa verrattuna DMSO-käsiteltyjen IR soluja 24 h 3D kollageenigeelissä (C) prosenttiosuus pitkänomainen solujen määrällisesti 3 riippumattomat kokeet mukaan lukien noin 100 solua, *** p 0,001. (D) kvantifiointi nopeus DMSO, 50 uM LY294002- tai 10pM U0126-käsiteltyjen IR solujen 3D kollageenigeelissä-hiekka 6 tuntia, edustettuina keskiarvot ± SD (*** p 0,001) 3 itsenäisestä kokeet mukaan lukien noin 50 solua. (E) konfokaali kuvia edustavien MFP488 phalloidin-värjätty IR rakeita kollageenin geeli 0 t ja IR pallosia käsiteltiin DMSO, LY294002, tai U0126 24 tuntia. Mittakaava, 200 um. (F) kvantifiointi alueen pallosia, jonka ImageJ ohjelmisto. (G) kuvasuhde pallosia laskettiin kehä

2 /[4π (alue)], ja tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD (*** p 0,001) 3 erilliselle kokeelle kolmena kappaleena.

(A) asetus EGFR PI3K /Akt ja MEK /Erk1 /2 signalointireitteihin. IR solujen 3D kollageenigeelissä käsiteltiin DMSO (kontrolli), EGFR-inhibiittorin PD168393 (10 uM), PI3K-inhibiittori LY294002 (50 uM), tai MEK-inhibiittori U0126 (10 uM) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin, ja määrät fosforyloidun ja koko Akt (Ser473) ja Erk1 /2 (Tyr202 /Tyr204) analysoitiin western-blottauksella.