Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tarkka havaitseminen ominaisuuden erittämät proteiinit paksusuolen syövän kasvainsolujen biologisista nesteistä voisi toimia biomarkkereiden taudin. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tunnistaa ja validoida uusia seerumin biomarkkereita ja jolla on todennäköisesti käyttökelpoisuus varhaiseen diagnosointiin paksusuolensyöpä.

Methods

Tutkimus järjestettiin kolmessa peräkkäisessä vaiheessa: 1) biomarkkereiden löytö, 2) tekniset ja biologiset validointi, ja 3) proof of concept testata mahdollinen kliininen käyttö valittujen biomarkkereiden. Priorisoidut osajoukko differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä kudostyypeistä (50 paksusuolen limakalvon syöpään-vapaiden yksilöiden ja 100 normaali-kasvaimen pareittain paksusuolensyöpä potilasta) validoitu ja testattiin edelleen sarjassa seeruminäytteiden 80 paksusuolen syövän tapauksissa 23 potilaalla on adenooma ja 77 syöpää vapaa valvontaa.

tulokset

tietojenkeruuvaiheessa, 505 ainutlaatuinen ehdokas biomarkkereiden tunnistettiin, erittäin merkittäviä tuloksia ja suuren kapasiteetin erottamaan eri kudosten tyyppejä. Sen jälkeen myöhemmin priorisointia testattu kaikki geenit (N = 23) on validoitu kudoksessa, ja yksi niistä, COL10A1, osoittivat merkittäviä eroja seerumin proteiineihin tasoilla valvontaa, potilailla, joilla on adenooma (p = 0,0083) ja paksusuolen syöpätapausta (p = 3.2e-6).

Johtopäätös

Esitämme juokseva prosessi tunnistamista ja edelleen validointi biomarkkereita varhaisia ​​paksusuolensyöpä joka tunnistaa COL10A1 proteiini seerumissa mahdollisena diagnostinen ehdokas havaita sekä adenooma vaurioita ja kasvain.

Impact

käyttö halpa seerumin testi paksusuolen syövän seulontaan olisi parannettava osallistumista ja edistää vähentää taakkaa tämä sairaus.

Citation: Solé X, CROUS-Bou M, Cordero D, Olivares D, Guinó E, Sanz-Pamplona R, et al. (2014) Discovery ja validointi New Mahdolliset biomarkkereita Early Detection of Colon Cancer. PLoS ONE 9 (9): e106748. doi: 10,1371 /journal.pone.0106748

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Espanja

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2014; Hyväksytty: 01 elokuu 2014; Julkaistu: 12 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Solé et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Geeniekspressiota aineisto on saatavilla National Center for Biotechnology Informationin Gene Expression Omnibus kanssa GEO sarja hakunumerolla GSE44076. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Katalonian syöpäinstituutti (ICO) ja yksityinen säätiö Biomedical Research Institute of Bellvitge (IDIBELL), The Instituto de Salud Carlos III [myöntää PI08-1635, PI08-1359, PS09-1037, PI11-1439], CIBERESP CB06 /02/2005 ja ”Acción Transversal del Cancer”, Katalonian hallitus DURSI [avustus 2009SGR1489], Fundació Yksityinen Olga Torres (FOT), Espanjan Association syöpää vastaan ​​(AECC) Tiedesäätiö, Euroopan komissio [myöntää FP7-COOP-Health-2007-B HiPerDART], ja Xarxa de bancs de Kasvaimet de Catalunya sponsoroi Pla johtaja d’Oncología de Catalunya (XBTC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat jättänyt patenttihakemuksen käyttöä koskevat COL10A1 biomarkkerina varhaiseen diagnosointiin paksusuolen syövän otsikko: ”SERUM biomarkkereiden diagnosoinnissa peräsuolisyövän”. Eurooppalainen patentti numero: EP2680003A1 (28.06.2012) ja Espanja ES2436667A2 (01.3.2014). Kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikkien PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti yli yksi miljoonaa uutta tapausta ja puoli miljoonaa kuolemantapausta ympäri maailmaa joka vuosi [1]. Viiden vuoden suhteellinen eloonjäämisluvut ovat alle 50%, mutta tämä suuresti riippuu vaiheessa aikaan diagnoosi [2]. Ei ensisijainen ennaltaehkäisevä toimenpide on osoittautunut osoitettu vähentävän ilmaantuvuus, mutta varhainen havaitseminen kautta väestön seulontaa on todettu vähentävän kuolleisuutta [3].

Nykyään on olemassa keskustelua siitä, mikä testi olisi käytettävä CRC seulontaan. Kunnes lisätodisteita on kerätty, nykyisen Euroopan suuntaviivat hyväksy ulosteen piilevän veren testi seuraa uudistettuun kolonoskopia, joka on terapeuttinen kun kokoisen adenoomia tunnistetaan [4]. Useimmat väestöpohjainen seulonta ohjelmat käyttävät guaiac perustuvat ulosteen piilevän veren testi, joka biokemiallisesti tunnistaa pieniä jälkiä verestä peräisin verenvuodon vaurioista ulosteet, tai ulosteen immunologisia testi, joka perustuu immuunidetektio ihmisen hemoglobiinin ulostetta. Nämä kokeet on herkkyys on 80%, CRC ja 28% varten adenooma 1 cm, ja erityispiirteet välillä 91-94% [5]. Lisäksi potilaan hoitomyöntyvyyttä ulosteesta perustuvissa määrityksissä on taipumus olla alhainen [6]. Käyttö kolonoskopia kuin kultainen standardi CRC seulonta on kiistanalainen. Se on raportoitu suurempi herkkyys (97%) ja spesifisyys (98%) varhaiseen diagnosointiin CRC, mutta sillä on myös useita sudenkuoppia liittyvät siihen: lisääntynyt taloudellisia kustannuksia; vaatimus korkeasti koulutettua henkilöstöä; epämukava suolen valmistelu; invasiivisuus; riski sairastuvuutta ja kuolleisuutta kiinnitetty menettelyä [7], [8]. Lisäksi niissä maissa, joissa kansallinen kolonoskopia seulontaan on käytettävissä, noudattaminen on usein alhainen [9].

Serum-pohjainen merkkiaineita olisi erittäin houkutteleva CRC seulonnan koska ne ovat vähän invasiivisia ja voidaan integroida minkä tahansa rutiini terveyden lääkärintarkastus ilman ylimääräisiä ulosteesta näytteenotto, mikä lisää hyväksyntää potilaiden keskuudessa. Nykyinen molekyylibiologian menetelmät mahdollistavat helpomman sukupolven monet hypoteeseja ehdokas biomarkkereita diagnoosi, ennuste tai terapeuttisen vasteen CRC, mutta tarve asianmukainen validointi on usein raportoitu [10] – [12]. Taustalla hypoteesi on se, että tuumorisolujen CRC, jopa sen pre-invasiivisia vaiheissa, kärsivät tärkeää geneettiset muutokset, jotka aiheuttavat vapautumisen ominaisuus proteiineja tai nukleiinihappoja mahdollisesti havaittavissa biologisissa nesteissä, joka on saatu ei-invasiivisia menetelmiä, kuten verta tai ulostetta [11] . Havaitseminen molekyylibiologian tekniikoita näiden aineiden toimii biomarkkerina taudin kehittää diagnostisia testejä, joilla parannetaan ennusteita nykyisten seulontatestien. Siksi käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja vahvistaa uusia seerumin biomarkkereita ja jolla on todennäköisesti käyttökelpoisuus varhaiseen diagnosointiin paksusuolensyöpä.

Methods

biomarkkereiden arviointi Tässä tutkimuksessa järjestettiin peräkkäinen ja peräkkäisiä vaiheita löytö, tekniset ja biologiset validointi, ja proof of concept testata mahdollinen kliininen käyttö valittujen biomarkkereiden. Ensinnäkin geenien ilmentyminen microarray analysoitiin tunnistamiseksi ehdokas biologisten merkkiaineiden kudosnäytteitä paksusuolen syöpätapausta ja syöpää vapaa ohjaimet (

Discovery Phase

). Toiseksi, käyttämällä vaihtoehtoista tekniikkaa, joka perustuu kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (RT-qPCR), valikoima differentiaalisesti ilmentyvien geenien validoitiin samalla joukko kudosbiopsioista (

Tekninen validointivaihe

), sekä koepaloja saatu riippumaton joukko potilaita (

Biologiset validointivaihe

). Lopuksi, mahdollinen kliininen käyttö lupaavimmista validoitu ehdokkaiden testattiin seeruminäytteistä paksusuolensyöpä tapauksissa pieni joukko adenoomien ja syöpää vapaa säätimet havaitseminen vastaavan erittyvän proteiinin käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) testit (

Proof of Concept Phase

). Raportoitu Stard suuntaviivat [13] ovat olleet perustana määriteltäessä protokollaa.

Potilaat ja näytteet

pääpiirteet aiheita mukana tässä tutkimuksessa esitetään taulukossa 1. Colon kasvain ja pariksi viereinen (~5-10 cm) patologisesti normaali limakalvo kudosnäytteitä tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin aikaan leikkauksen useista tapauksista, joissa tapauksesta diagnoosi paksusuolen adenokarsinooma osallistuvien Bellvitge yliopistollisen sairaalan (Barcelona, ​​Espanja) tammi 1996 joulukuuta 2007. Mukana tapauksissa valittiin muodostamaan homogeeninen joukko potilaita, joilla on vaiheen II, mikrosatelliitti-vakaa satunnaista paksusuolen syöpä. Potilaille suoritettiin radikaaleja eikä saanut kemoterapiaa ennen leikkausta. Patologit vahvistanut kaikki paksusuolen syövän diagnostiikassa ja valittu tuoretta kudosnäytteitä kasvain ja viereisen limakalvon otettiin tästä lähempänä resektio marginaali. Hematoksyliini- eosiinilla värjäys suoritettiin levyllä leikkaus tuumorinäytesylinterin ohjata patologi valinnassa alueella, jossa on vähintään 75% syöpäsoluja. Näyttämö ryhmittely seurannut arvovaltainen UICC opas ”TNM Atlas, 6th Edition”. Paras approksimaatio tämän luokituksen oli peräisin kerätyistä tiedoista aikaan diagnoosi tapauskohtaisesti.

kudosnäytteitä paksusuolen limakalvon syöpään vapaa verrokit saatu kolonoskopia helmikuusta 2010. peräkkäisten potilaiden, joille tehtiin kolonoskopia merkitty oireet (yleensä anemia, verenvuoto, vatsakivut tai muuttunut rytmi) kutsuttiin osallistumaan. Ne negatiiviset tulokset (eli ilman paksusuolen leesioita) on mukana tässä tutkimuksessa. Mikään niistä ei raportoitu suvussa syöpää.

Lopuksi seeruminäytteistä paksusuolen syöpätapausta ja syöpää vapaa verrokkia, joka valitaan epidemiologisten tapauskontrollitutkimuksessa geenien ja ympäristön vuorovaikutukset, joka on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [ ,,,0],14]. Kaikki seeruminäytteet kerättiin ennen leikkausta tapauksiin ja juuri ennen kolonoskopia valvonnasta.

yksinkertaistamiseksi nimeäminen eri näytteestä tyyppejä, tässä käytämme

kasvain

(T), kun viitataan kasvain näytteet paksusuolen syövän potilaille,

viereisen normaalin

(A), kun viitataan patologian normaalin paksusuolen limakalvon näytettä paksusuolen syövän potilaiden, ja

syövän

(F), kun viitataan paksusuolen limakalvon näytteitä syöpää ilmaiseksi yksilöitä.

Clinical Research Ethics komitean Bellvitge yliopistollisen sairaalan hyväksynyt tutkimussuunnitelman, ja kaikki henkilöt edellyttäen kirjallinen lupa osallistua ja geneettisiä analyysejä tehtävää niiden näytteistä.

RNA louhinta

Yhteensä RNA eristettiin pakastetusta kudosnäytteistä käyttämällä Exiqon miRCURY RNA Isolation Kit (Exiqon A /S, Tanska), mukaan valmistajan protokollaa, ja kun otetaan huomioon kaikki suositellut varotoimet välttämiseksi RNA hajoamiselle RNaaseja. Uutetaan RNA kvantitoitiin NanoDrop ND-1000 spektrofotometriä (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Laatu Näiden RNA-näytteet edelleen tarkastetaan käyttäen RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja noudattamalla valmistajan ohjeita, ja vahvistettiin geelielektroforeesilla. RNA eheys numerot (RIN) osoitti hyvälaatuista ([Q1 = 7,5; Mediaani = 8.25; Q3 = 8,9] kasvaimia, [Q1 = 7; Mediaani = 7,5; Q3 = 8] viereisiin normaali ja [Q1 = 7,8; ​​Mediaani = 8,3; Q3 = 8,65] terveen normaali). RNA puhtaus mitattiin absorbanssisuhde 260 nm ja 280 nm (keskiarvo = 1,96, SD = 0,04), ilman eroja kudostyyppejä.

Discovery series – ilmaisu paneelit

löytö sarja mukana 100 paria kasvain ja vieressä normaalin paksusuolen limakalvon näytteet ja 50 näytettä paksusuolen limakalvon syöpään vapaa yksilöitä (yhteensä n = 250). Kokonais-RNA uutettiin näistä näytteistä hybridisoitiin päälle Affymetrix Human Genome U219 array-levyt (Affymetrix, Santa Clara, CA) ja noudattamalla valmistajan suositusten mukaisesti. Neljä näytettä (kaksi vierekkäistä normaali-kasvaimen paria) jätettiin pois aineisto jälkeen laadunvalvontaa. Siten lopullinen aineisto 246 paneelit käytettiin seuraaviin analyyseihin.

Mittaustulosten normalisoitiin käyttämällä Robust Multiarray keskiarvo algoritmi [15] toteutetaan

affy

paketti [16] on Bioconductor suite (https://www.bioconductor.org) [17]. Kaikki tilastollinen analyysi tehtiin siksi, että R tilastollisen tietojenkäsittelyn ohjelmistot (https://www.r-project.org) [18].

Ennen ero ilmaisua analyysi suoritettiin, matala-variantti ja Y-kromosomi transkriptien poistettiin myöhemmin analyysejä. Jäljellä probesets, regularisoitu Studentin t-testejä käytettiin havaitsemaan merkittäviä yli-ilmentymisen vierekkäisten normaalin (A) tai kasvainnäytteet (T) ja syöpä-free limakalvon (F). Bonferroni korjausta käytettiin aiheutua moninkertaisia ​​hypoteesin testaukseen. Jotta kaventamaan perin saanut luettelot, ehdokas probesets olivat edelleen suodatettu eri kriteereihin: alhainen ekspressiotasot ja alhainen vaihtelu syöpää vapaa limakalvolla; suuri keskimääräinen kertaluokkamuutos välillä T /F tai A /F; ja tasalaatuisuus vaikutusten joukossa useita koettimia samaa geeniä, kun käytettävissä. Probesets että läpäissyt suodatuskriteerit kartoitettiin geeneihin, yksiköt käytettyjen tietojen loppupään analyyseihin.

Priorisointijärjestelmä menettely suoritettiin valita paras ehdokas geenit validointi käyttäen julkisesti saatavilla [19] – [24] . Kriteerit osuus liittyivät toistettavuutta ja spesifisyys kysymyksiä: havaittu toistettavuus ilmaisun erot; hyvin alhainen ilmaisun veressä kudoksessa; ja valinta geenien suuri ilmentymisen paksusuolen kudoksessa verrattuna muihin kudoksiin mukaan GeneCards tietokantaan (https://www.genecards.org) [25], vaikka useimmat geenit ilmennettiin useita kudoksissa. Geeniekspressiota aineisto on saatavilla National Center for Biotechnology Informationin Gene Expression Omnibus [26] kanssa GEO sarja tallennusnumero GSE44076 ja projektin verkkosivuilla (https://www.colonomics.org).

Tekninen ja biologinen validointi – RT-qPCR ilmentämiseen arviointia

Expression tasoja valittujen geenien arvioitiin RT-qPCR sekä löytämisen sarjan ja ylimääräinen 104 näytettä (70 pariksi viereisen normaali /kasvaimen kudokset paksusuolensyöpä potilasta ja 34 syövän vapaa tarkastukset). Nämä näytteet kerättiin tammi 1996 ja kesäkuu 2011 noudattaen samaa protokollaa ja varastoidaan samoissa olosuhteissa kuin löytö sarja. cDNA syntetisoitiin uutetusta mRNA kanssa transkriptio ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi kit (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) tavanomaisten menettelyjen mukaan.

Kahdet alukkeet suunniteltiin kullekin geenille, ja jokaisen sarjan määritettiin vuonna päällekkäisiä. Kolme ohjaus geenit olivat mukana analyysissä:

ACTB

,

TPT1

, ja

UBC

.

ACTB

valittiin perustuu laajoihin edellisestä kirjallisuudessa osoittaa sen sopivan taloudenhoito geeni geenien ilmentymisen analysointiin paksusuolen näytteissä [27] – [29].

UBC

ja

TPT1

valittiin perustuen suuren vakauden niiden ekspressiotasoja kaikilla näytteitä meidän array data (kuviot S1 ja S2). Kiinnostavaa kyllä, ne olivat myös aikaisemmin oletettu mahdollisesti sopivia taloudenhoito geenejä geeniekspression määrityksiä paksusuolen näytteissä [29].

Multipleksoidut RT-qPCRs määritykset tehtiin käyttäen Biomark Dynamic Array 96 × 96 Laatat (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Olevia kuvia analysoitiin Fluidigm Biomark ohjelmistoa käyttäen vakioparametrit. Raaka qPCR data prosessoitiin HTqPCR paketti v1.10.0 [30]. Ennen arviointia ero ilmaisun eri kudosten tyyppejä, ilmaisu matriisi suodatettiin laadunvalvontatarkoituksissa.

UBC

lopulta valittiin taloudenhoito ohjaus perustuu vakauteen sen kynnyssyklistä arvot (kuva S2). Mann-Whitney testiä käytettiin vertaamaan ilmentymisen tasojen syövän vapaa ja viereisen normaalin näytteiden välillä syöpää vapaan ja kasvainnäytteet. Jokainen alukejoukko analysoitiin itsenäisesti, ja alukeyhdistelmän että osoittanut nopeinta merkittäviä tuloksia analysoitaessa differentiaalikaavojen valittiin edustajana.

tunnistaminen seerumin biomarkkerit – proof of concept seulontaan voimassaolon

testaamiseksi mahdollinen arvo varhaiseen toteamiseen, parhaiden ehdokkaiden biologisesta validointi analysoitiin seeruminäytteistä sarjassa 80 paksusuolensyöpä tapauksissa 23 potilaalla on adenooma ja 77 syöpää vapaa valvontaa, kaikki testataan kahtena lisätä tarkkuutta kokeilun. Kymmenen millilitran näytteitä perifeerisen laskimoverta kerättiin paksusuolensyöpä tapauksissa potilaalla on adenoomien ja valvontaa. Sentrifugin jälkeen 15 minuuttia 1000 rpm: llä 30 minuutin kuluessa keräämisestä, seerumin jaettiin eriin ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Kaupalliset ELISA-tuotesarjoja Life Sciences Inc ja R 0,05, Bonferronin korjattu). Erityisesti on kiinnitetty huomiota yli-ilmentyvien geenien, koska nämä erot ovat todennäköisesti havaittiin seerumissa, ja sen vuoksi soveltuu paremmin käytettäväksi diagnostiikkaan biomarkkereita. Mielenkiintoista, huomattavan tason päällekkäisyyttä (3101 koetinsarjojen, ~56%) havaittiin näiden kahden luettelot koetinsarjojen, mikä viittaa siihen, että vierekkäiset normaali limakalvo syöpäpotilailla oli jo kokenut merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen, ja kasvava että on tärkeää käyttää syöpä-vapaa limakalvon referenssinä kudosta. Global tulosten ero ilmentymisen analyysi esitetään kuvioissa 1b ja 1c.

priorisoida ehdokkaita diagnostisten biomarkkerit, joukko suodattimia sovellettiin lähtökohtaisista ilmentyvät eri koetinsarjojen. Nämä suodattimet perustuivat ensisijaisesti tilastolliset kriteerit (eli suuri kertamuutosta välillä A /F tai T /F, alhainen ilmaisun ja alhainen vaihtelu F näytteistä). Nämä suodattimet tuottivat lopullinen määrä 242 valittujen koetinsarjojen välillä A /F ja 443 välillä T /F, joka vastaa joukon 194 ja 352 geenit, vastaavasti (taulukko S2).

Tämä ensimmäinen valinta toimitti luettelon 505 ainutlaatuinen ehdokkaan biomarkkereita erittäin merkittäviä ilme eroja kasvain ja syöpä-vapaa kudosta. Koska tekniset vaikeudet johdettu validointi niin paljon biomarkkereiden, lisää teknistä ja biologista perusteita sovellettiin edelleen kaventamaan luettelo mahdollisista ehdokkaista. Tämä toinen sarja suodattimia perustuivat arviointiin johdonmukaisuutta eri probesets kunkin geenin; vahvistus tuloksemme riippumattomia ja julkisesti saatavilla geeniekspression aineistot; ja nolla tai alhainen ilmentymistaso näiden geenien verinäytteissä syöpää vapaiden yksilöiden. Lisäksi aiempaa tietoa ja molekyylitason tietoa kustakin geenistä oli koottu kirjallisuudesta ja online-tietokantojen varmistaa valintaan luotettavin ehdokkaat (eli proteiini eritystä, kudosspesifisyys proteiinin toimintaan, aiemmin esitetyn näytön biomarkkerina mm). Luettelo 23 parhaat ehdokkaat lopulta valittu validoitavaksi seuraavassa vaiheessa (taulukko 2, sarakkeet 1-2).

Tekniset ja biologiset validointi

Jotta luotettavuus saadut tulokset geeniekspression paneelit, valinta 23 biomarkkereita validoitiin vaihtoehtoisella tekniikalla (RT-qPCR) sekä samoja näytteitä (eli tekninen validointi), sekä myös riippumattomalla sarjaan vastaavia kliinisiä ja epidemiologisia ominaisuuksia (biologisten validointi).

Kuva 2 näyttää kaksisuuntainen geenin ja näytteen ryhmittely RT-qPCR ilmentymisen arvot sekä tulokset teknisten (kuva 2a) ja biologiset validointi (kuvio 2b). Vaaka akselit lämpökarttoja (eli sarakkeet) osoittavat selvää erottaminen kasvainnäytteestä viereisistä normaalia ja syöpää vapaa ryhmiä. Pystyakselin geenien (eli rivit) osoitti kahden klustereita geenejä, yksi niille ilmentyvät differentiaalisesti välillä A /F ja toinen ilmentyy differentiaalisesti välillä T /F. Nämä tulokset suuresti jäljitellä ekspressiokuvion havaittu taulukot tietojenkeruuvaiheessa vahvistamalla mahdollista roolia näiden geenien diagnostisia biomarkkereita paksusuolen syöpä. Muodollinen vertailu ilmaisun eroja näytetyypeille teknisestä ja biologinen validointi on esitetty taulukossa 2, sarakkeet 3-4. Vaikka vain p-arvot on esitetty taulukossa 2, ilmaisu tasojen aikana vahvistettujen geenit käyttäytyi johdonmukaisesti koko eri vaiheissa, kuten kuviossa S3.

Näytteet värikoodatut päälle lämpökarttoja perustuvat kudoksen tyyppi (eli syöpää vapaa limakalvon = vihreä, viereiseen normaaliin kudokseen paksusuolen syöpäpotilaiden = sininen, kasvainkudoksen = punainen).

Proof of Concept – tunnistaminen seerumin biomarkkereita

koska lentäjä proof-of-concept osoittaa niiden mahdolliset käyttökelpoisuus paksusuolensyöpä varhaisdiagnostiikan biomarkkereita, valikoima 9 geenien testattiin seerumissa käyttäen ELISA. Priorisointi näistä ehdokkaista perustui laajaan kirjallisuuskatsaukseen ja saatavuuden kaupallinen ELISA kit.

Tulokset Kunkin proteiinin on esitetty kuvassa 3. Merkillistä, kollageenin tyyppi X alfa 1 (COL10A1) näkyy hyvin suurilla pitoisuuksilla paksusuolen syöpätapausta ja adenoomia verrattuna kontrolleihin (p = 3.2e-6 ja p = 0,0083, vastaavasti). Pitoisuudet seerumissa COL10A1 kontrolleissa adenoomien ja paksusuolen syövän tapauksissa vaihe on esitetty kuvassa S4. Mielenkiintoista, tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin, kun valvonta verrattiin kunkin yksi eri kasvain vaiheissa, paitsi vaihe I, luultavasti johtuen pienestä näytteen koosta tähän ryhmään. Viljelyala vastaanotin toimii (ROC) käyrä oli 0,75 syövän ja 0,76, kun adenooma ja paksusuolensyöpä katsottiin yhdessä (kuva 4), joka osoittaa potentiaalia hyvä luokitus kyky. Matriksimetalloproteinaasi-7 (MMP7) osoitti myös merkittävää yhdistys, mutta ei vielä pidetä, koska se johtui ali adenoomissa kontrolleihin verrattuna, mikä edusti vastakkaista tunnetta differentiaalikaavojen että yritimme vahvistaa. O yhdistelmä COL10A1 minkä tahansa muiden proteiinien huomattavasti alue ROC-käyrän alla (tuloksia ei ole esitetty).

. Vastaanotin toimii ominaiskäyrät sekä adenoomien ja paksusuolen syövän yhdessä (violetti) ja paksusuolen syövän tapauksissa vain (punainen). B. Eri merkki cutpoints vastaan ​​herkkyys ja tarkkuus käyrät.

Keskustelu

CRC seulonnan ulosteen piilevän veren testi on osoittanut tehoa satunnaistetuissa tutkimuksissa. Kuitenkin alhainen spesifisyys testi osoittaa, että tarvitaan tarkempaa vaihtoehtoisten diagnostisia testejä. Sigmoidoskopiaa, kolonoskopia ja tietokonetomografia skannaus (eli virtuaalinen kolonoskopia) ovat vahvoja vaihtoehtoisia ehdokkaita, mutta kaikki tärkeitä rajoituksia, lähinnä niiden kustannukset ja mahdolliset vakavat sivuvaikutukset ja vähentää osallistumista. Osallistuminen on tärkeä tekijä seulontaan tehokkuuden, ja se on myös yleinen havainto, että seulonta perustuu ulosteen piilevän veren testi on alhainen työvoimaosuus [31] – [33]. Siten diagnostinen testi, joka perustuu rutiininomainen verikoe olisi todennäköisesti pystyy saavuttamaan suurempi osuus väestöstä, ja terveysviranomaiset puoltavat tällaisen testin, jos tehokkuus ja kustannukset olivat samankaltaisia ​​ulosteen piilevän veren testi. Näiden tilojen mielessä, aloitimme tämän tutkimuksen etsiä diagnostisia biomarkkereita, jotka voidaan havaita veressä on yksinkertainen ja edullinen ELISA-testi.

tutkimuksen geeniekspression paksusuolikudos on vahvistanut edellinen havainnot, että suuri useita geenejä vapautettiin kasvain verrattuna viereiseen normaaliin limakalvolle. Noin 20000 geenejä kuulusteltiin ilmaisussa array, ja suodatuksen jälkeen useat rajoittavat kriteerit, 505 ainutlaatuinen ehdokas biomarkkerit on tunnistettu (taulukko S2), jossa on erittäin merkittäviä tuloksia ja suuren kapasiteetin erottamaan pariksi kasvain ja vieressä normaali näytteitä. Vahva piirre tutkimuksen suunnittelu on sisällyttäminen joukko näytteitä syöpään vapaa ohjaimet (n = 50). Tämä on antanut meille mahdollisuuden tunnistaa geenejä, jotka eivät näytä ilmaisua eroja vierekkäisten normaalin ja kasvainkudoksen välillä paksusuolen syöpäpotilaiden sekä vahvistaa, että yli-ilmentynyt geenejä kasvaimet eivät näy korkeat ekspressiotasot syöpää vapaa paksusuolikudos, mikä voi sulkea pois niiden mahdollinen käyttö biomarkkereita. Olemme aiemmin kuvattu, että geenien ilmentyminen vierekkäisten normaalin paksusuolen limakalvon syöpää sairastavan potilaan jo on merkittävästi muuttunut verrattuna syöpää vapaa paksusuolen limakalvolla [34], mikä lisää tarvetta sisällyttää kudoksen syöpää vapaiden yksilöiden hankkeisiin, joilla pyritään löytää diagnoosi biomarkkereita paksusuolensyöpä.

suuri määrä ehdokkaita analyysissä yksilöidyt ilmentymisaineistoapukeinojen johti meidät priorisoimaan mitkä valittaisiin edelleen validointi. Käytimme yhdistelmä kriteereitä, jotka sisältyvät johdonmukaisuutta muiden julkisesti saatavilla aineistoja ja kirjallisuus; vähän tai ei lainkaan ekspressiotasot syöpää vapaa limakalvon tai muissa kudoksissa; ilmaus hallitseva paksusuolen syövän kudoksen; ja valinta eritettävän proteiineja. Koska tunnistaminen seerumin proteiineihin on kallista ja aikaa vievää, suoritimme tekninen ja biologinen validointi parhaat ehdokkaat ennen kuin yrität ELISA. Teknisen validointi (eli samassa näytesarja mutta erilaisella tekniikalla) oli merkittävä toistettavuus ilmaisun tasoeroja mitattiin RT-qPCR ja mikrosirut kaikkien testattujen geenien, mikä vahvistaa, että ilmaisu aineisto saatu Affymetrix HG-U219 mikrosiruja oli laadukkaiksi ja luotettavasti tunnistaa ilmentymisen eroja eri kudosten tyyppejä. Siksi odotamme, että määrä vääriä positiivisia jäljellä luettelossa (ei vahvistettu) merkittävistä differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä kudostyypeistä olevan pieni. Lisäksi vahvistus aiemmin havaittujen erojen biologisesti itsenäinen aineisto korostetaan myös pätevyyden saatujen tulosten kanssa mikrosiruja.

Seuraava askel juokseva Validointiprosessi pyrkimällä tunnistamaan seerumin vastaavaan proteiineja meidän kandidaattigeenit ja arvioida niiden mahdollista käyttöä varhaisen diagnoosin. Olemme myös potilaiden alaryhmään, joilla adenooma, koska tämä on myös tärkeä kohde CRC seulontaan. Käyttämällä kaupallisia ELISA voisimme arvioida proteiinin tasot kaikkien geenien priorisoidaan. Merkillistä, COL10A1 osoitti asiaa tarpeeksi eroja valvontaa ja paksusuolen syöpäpotilaiden (p = 3,2 x 10

-6) jota ehdotetaan mahdollisena diagnostinen ehdokas. MMP7 osoitti myös jonkin verran eroja adenoomia (p = 0,0092), mutta osoitti vastakkaiseen suuntaan odotettua yhteen.

Olemme tunnistaneet proteiini COL10A1 joka, kun havaitaan korkeina pitoisuuksina veressä, voi olla osoitus läsnä kasvainleesioksi paksusuolessa. Tämä proteiini valittiin jälkeen Sarjatutkimuksissa jossa aloitimme tutkia koko genomin ekspressiotietojen paksusuolen kudoksessa. Kohonneita seerumin COL10A1 havaittiin sekä adenooma ja paksusuolen syöpäpotilailla. Alue ROC-käyrän alla oli 0,76, mikä tekee COL10A1 on lupaava diagnostinen biomerkkiaine. Cutpoint 280 ng /ml saavutetaan 0,63 herkkyys ja 0,85 spesifisyys paksusuolisyövän tai adenooma (Kuva 4). Samanlaisia ​​arvot saatiin syöpään vain. Muutama syöpää vapaa koehenkilöillä osoittivat korkeita COL10A1 seerumissa, korkeampi kuin keskimäärin adenooma, mikä osoittaa, että muut prosessit eivät liity peräsuolen muutoksia voidaan lisätä COL10A1 tasoja.

COL10A1

on lyhyt ketju kollageeni pääasiassa ilmaiseman kondrosyyttien aikana luutuminen. Viat tätä proteiinia ovat liittyneet Schmid-tyypin metaphyseal chondrodysplasia [35]. COL10A1 ei ilmenny normaaleissa paksusuolen epiteelissä, mutta on suora transkription kohteena

RUNX2

[36], transkriptiotekijä, joka ilmentyy syöpäsoluissa, ja on liittynyt useita syöpiä. Kohonnut ilmentyminen

COL10A1

havaittu kasvaimia voi olla epäsuora vaikutus korkeamman tason sääntelyn muutokset tapahtuvat kasvain. Itse asiassa olemme huomanneet korkea korrelaatio RUNX2 ja

COL10A1

ilmentyminen kasvaimissa (Pearson R = 0,5, tuloksia ei ole esitetty). Meidän ekspressiotietojen yksilöi myös korkea korrelaatio

COL10A1

ja muita geenejä:

SFRP4

,

INHBA

,

TNFSF4

jotka osallistuvat sytokiinien ja Wnt signalointia