Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa säätelevät useat effektorit jotka sisältävät Akt ja pyruvaattikinaasia M2 (PKM2). Mucin 1 (MUC1) on heterodimeerinen glykoproteiini, jota poikkeavasti yli-ilmentyy ihmisen rinta- ja muut syövät. Tässä osoitamme, että muutos rotan fibroblastien onkogeenisel- MUC1-C alayksikkö liittyy Akt välittämää nousua glukoosin otto ja laktaatintuotto, sopusoinnussa stimulaation Glykolyysivaiheen. Tulokset osoittavat myös, että MUC1-C sytoplasmadomeenissa sitoutuu suoraan PKM2 klo B- ja C-verkkotunnuksia. Vuorovaikutusta MUC1-C sytoplasminen domeeni Cys-3 ja PKM2 C-domeeni Cys-474: n havaittiin edistää PKM2 toimintaa. Toisaalta, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) -välitteisen fosforylaation MUC1-C sytoplasminen domeeni on Tyr-46 siirrettävä sitoutumisen PKM2 Lys-433, ja se esti PKM2 toimintaa. Ihmisen rintasyövän soluja, hiljentäminen MUC1-C liittyi vähenemistä glukoosin otto ja laktaatintuotto, vahvistaa osallistumista MUC1-C sääntelyssä Glykolyysivaiheen. Lisäksi, EGFR-välitteisen fosforylaation MUC1-C rintasyöpäsoluissa liittyi lasku PKM2 toimintaa. Nämä havainnot osoittavat, että MUC1-C alayksikköä säätelee Glykolyysivaiheen ja että tämä vaste siirrettyyn osittain PKM2. Siten yli-ilmentyminen MUC1-C onkoproteiinin erilaisissa ihmisen karsinoomia voisi olla merkitystä Warburg vaikutus aerobinen Glykolyysivaiheen.

Citation: Kosugi M, Ahmad R, Alam M, Uchida Y, Kufe D (2011) MUC1-C onkoproteiinin säätelee Glykolyysi ja pyruvaattikinaasi m2 Toiminta syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (11): e28234. doi: 10,1371 /journal.pone.0028234

Editor: Rebecca BERDEAUX, University of Texas Health Science Center at Houston, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2011; Hyväksytty 4 marraskuuta 2011; Julkaistu: 28 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Kosugi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grants CA97098, CA42802 ja CA100707 myönsi National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: DK omistaa tasapuolisuus Genus Syöpätautien on konsulttina. Suku Oncology hallussaan patenttihakemukset solu-tunkeutuva peptidejä, kuten GO-203, joka lohko MUC1-C toimintaa ja yhtiö on liittyvä peptidi kliinisessä kehityksessä. Ei ole kaupan tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpäsolut eroavat normaalista kollegansa metabolinen eroja, jotka ovat lisääntynyt hyödyntäminen glukoosi aerobinen Glykolyysivaiheen. Tämä ominaisuus pahanlaatuisten solujen, joka tunnetaan nimellä Warburg vaikutus, yhdistää korkea glukoosin kulutusta, joilla on tehostunut laktaatin tuotantoa hapen läsnä ollessa [1]. Aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa on yhteydessä lisääntyneen ilmentymisen glykolyyttisistä geeneistä [2], [3]. Pyruvaattikinaasia (PK) on yksi ilmen- tymisen lisääntymisen glykolyyttisen geenin tuotteita, joka katalysoi tuotanto pyruvaatin ja ATP fosfoenolipyruvaattia (PEP) ja ADP. On neljä PK-isoentsyymien, M1, M2, L ja R. M1 isoformia ilmentyy useimmissa aikuisen soluissa. M2 isoformi (PKM2), silmukointivarianttia M1, löytyy alkion soluissa, normaaleissa lisääntyvien solujen ja syöpäsolujen [4]. Heterogeeninen ydinaseiden ribonukleoproteiineissa sitoutuvat PKM1 mRNA ja estävät sen liittämiseen [5]. Muuntaminen PKM2 ilmaisun PKM1 syöpäsoluja kääntää Warburg vaikutus ja liittyy menetys tuumorigeenisyyden perustamisesta tärkeyttä PKM2 aerobista Glykolyysivaiheen ja leviämisen pahanlaatuisten solujen [6]. Erillinen alue PKM2, verrattuna PKM1, toimintoja allosteeriset aktivointi entsyymin fruktoosi-1,6-bisfosfaatti- (FBP) [7] ja sen inaktivointia fosfotyrosiini sisältävät proteiinit [8], [9]. Näissä olosuhteissa, sääntely PKM2 toiminnan sanelee aineenvaihduntaa glukoosin pyruvaattia, joka muunnetaan laktaattidehydrogenaasin (LDH) ja laktaatti tai käytetään mitokondrioiden trikarboksyylihappo (TCA-kierto) [10]. Nämä havainnot ovat siten tukenut tarvetta paremmin ymmärtää signaaleja, jotka säätelevät aerobinen Glykolyysivaiheen ja PKM2 aktiivisuutta pahanlaatuisten solujen.

mukiinia 1 (MUC1) proteiinia yli-ilmentyy useimmissa ihmisen karsinoomia ja tietyt hematologisia syöpiä, joten se yksi yleisempiä muutoksia ihmisen syövissä [11]. MUC1 ilmaistaan ​​kaksi alayksikköä, jotka muodostavat heterodimeerin on solukalvon. Suuri MUC1 N-terminaalinen alayksikön (MUC1-N) on sijoitettu solun ja sisältää glykosyloidun tandem-toistojen, jotka ovat ominaisia ​​limakalvon perheen. MUC1-C-terminaalinen alayksikön (MUC1-C) ulottuu solukalvon ja sisältää 58 aminohapon solunulkoinen domeeni ja 72 aminohapon cytoplamic domeeni [11]. MUC1-C solunulkoinen domeeni on vuorovaikutuksessa galektiini-3 ja siten muodostaa komplekseja solun pinnalla, jossa epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [12]. Aktivointi EGFR on puolestaan ​​liittyy fosforylaation MUC1-C sytoplasmadomeenissa [11]. Merkittävää on, yli-ilmentyminen MUC1-C-alayksikön, ja erityisesti sytoplasminen domeeni, on riittävä indusoimaan ankkuroitumisesta riippumattomaan kasvuun ja kasvainten muodostumiseen [13], [14]. Yliekspressioon MUC1 syöpäsoluissa, MUC1-C alayksikön kertyy sytoplasmaan ja on suunnattu tumaan, jossa se edistää geenin ilmentymisen säätelyyn [11]. Tässä suhteessa MUC1-C-indusoitu muutos liittyy geenien aktivaation mukana leviämisen ja kasvaimen kehittymisen [15], [16]. MUC1-C aiheuttaa myös allekirjoituksen liittyy rasva-aineenvaihdunnan ja säätelyä geenit, jotka säätelevät kolesterolin ja rasvahappojen synteesi [17]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että MUC1-C aktivoi PI3K- Akt-reitin [18], [19], mikä puolestaan ​​stimuloi toimintaa glykolyyttisellä entsyymien, heksokinaasi ja phosphofructose kinaasi. On kuitenkaan ole tiedossa yhteys MUC1-C ja glykolyyttisellä reitin.

Tämä tutkimukset osoittavat, että MUC1-C säätelyyn osallistuvan glukoosin oton ja laktaatin tuotantoa MUC1-C aiheuttamaa muutosta rotan fibroblastien ja ihmisen rintasyövän soluja. Tulokset osoittavat myös, että MUC1-C sytoplasmadomeenissa vaikuttaa suoraan PKM2 ja säätelee PKM2 toimintaa. MUC1-C sytoplasminen domeeni sisältää Cys-tähteen, joka sitoutuu PKM2 C-domeeni Cys-474 ja stimuloi PKM2 toimintaa. Sitä vastoin EGFR-fosforyloitu MUC1-C sytoplasminen domeeni on vuorovaikutuksessa PKM2 C-domeeni Lys-433 ja estää PKM2. Nämä havainnot osoittavat, että yli-ilmentyminen MUC1-C syöpäsoluissa myötävaikuttaa sääntelyyn aerobinen Glykolyysivaiheen.

Tulokset

MUC1-C aiheuttama muutos liittyy induktioon aerobinen Glykolyysivaiheen

MUC1-C-alayksikön koostuu 58 aminohapon (aa) ekstrasellulaarinen domeeni, 28 aa transmembraanidomeeni ja 72 aa sytoplasminen domeeni (Fig. 1A). Expression of MUC1-C sytoplasmisen domeenin (MUC1-CD) in 3Y1-fibroblasteissa liittyy induktioon pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa ja kasvaimen muodostumista nude-hiirissä [13], [14]. Esillä olevissa tutkimuksissa havaittiin, että MUC1-CD aiheuttama muutos 3Y1-solujen liittyy kasvuun glukoosin sisäänoton (Fig. 1 B) ja laktaatin (Fig. 1 C), mikä on yhdenmukaista stimulaatio glykolyysin. Arvioida, ainakin osittain, perustan tämän vastauksen, tutkimukset suoritettiin määrittämään vaikutuksia PKM2. Erityisesti oli merkittävä kasvu PKM2 toimintaa MUC1-CD transformoitu 3Y1-fibroblasteissa (kuvio. 1D). 3Y1 /vektori-solut ilmentävät PKM2, mutta ei PKM1, ja MUC1-CD aiheuttama muutos ei ollut ilmeistä vaikutusta PKM2 tasossa (Fig. 1 E). Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että PKM2 inhiboi fosforylaatio Tyr-105 tietyissä syöpäsoluissa [9]. MUC1-CD aiheuttama muutos ei liittynyt muutosta Tyr-105 fosforylaation (kuvio. 1 F). Lisäksi, ei ollut ilmeistä solujen uudelleenjako PKM2 määritettynä konfokaalimikroskopialla (kuvio. S1). Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Akt aktivaatio määritettynä fosforylaatio Ser-473 on lisääntynyt 3Y1 /MUC1-CD-soluja verrattuna, että löytyy 3Y1 /vektori-soluja [18]. Sen arvioimiseksi, onko lisäys p-Akt vastaa aktivointi PKM2, me vaiennettu Akt että 3Y1 /vektorin ja 3Y1 /MUC1-CD-soluissa (kuvio. 1G) ja mitattiin glukoosin oton, laktaattituotanto ja PKM2 toimintaa. Tulokset osoittavat, että hiljentäminen Akt vähentää glukoosin sisäänottoa sekä 3Y1 /vektori ja 3Y1 /MUC1-CD-solut (Fig. 1 H, vasemmalla). Lisäksi hiljentäminen Akt että 3Y1 /vektorin ja 3Y1 /MUC1-CD-soluissa liittyi osittainen pienenemistä laktaatin (Fig. 1 H, oikealla). Sitä vastoin, hiljentäminen Akt oli vähän, jos lainkaan vaikutusta PKM2 toimintaa 3Y1 /MUC1-CD-solut (Fig. 1 I), mikä osoittaa, että MUC1-CD-välitteisen induktion PKM2 ei ole riippuvainen Akt aktivointia.

A. Rakenne MUC1-C-alayksikön solunulkoisen domeenin kanssa (ED), transmembraanidomeeni (TM) ja aminohapposekvenssi sytoplasmisen domeenin (MUC1-CD). CQC motiivi ja EGFR fosforylaatiokohdan on korostettu. B ja C. 3Y1 /vektori ja 3Y1 /MUC1-CD-solut analysoitiin glukoosin oton (B) ja laktaatin tuotanto (C). Tulokset (keskiarvo ± SD viisi erillistä koetta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​nmol /10

6 solua. D. Lysaatit rat 3Y1 /vektori ja 3Y1 /MUC1-CD-solut analysoitiin PKM2 toimintaan. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​suhteellisena PKM2 aktiivisuus verrattuna, että saatu 3Y1 /vektori-solut (määritetty arvo on 1). Opiskelijan t-testiä käytettiin määrittämään p-arvot. E ja F. Lysaatit 3Y1 /vektorin ja 3Y1 /MUC1-CD solut immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. G-I. 3Y1 /vektori ja 3Y1 /MUC1-CD-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai Akt siRNA altaat 72 tuntia. Lysaatit ilmoitettu solut immunoblotattiin anti-Akt ja anti-β-aktiini (G). Ilmoitettu solut analysoitiin glukoosin oton (H, vasemmalla) ja laktaatin (H, oikealla). Tulokset (keskiarvo ± SD kolme toistoa) ilmaistaan ​​nmol /10

6 solua. Lysaatit ilmoitettu solut analysoitiin myös PKM2 aktiivisuus (I). Tulokset (keskiarvo ± SD kolme toistoa) ilmaistaan ​​suhteessa PKM2 aktiivisuus verrattuna, että saatu 3Y1 /vektori-solut (määritetty arvo on 1).

MUC1-C sytoplasminen domeeni Cys-3 jäännös vuorovaikutuksessa PKM2

Voit selvittää MUC1-CD vuorovaikutuksessa PKM2 ja siten vaikuttaa sen toimintaan, coimmunoprecipitation tehtiin tutkimuksia, joissa 3Y1 /MUC1-CD solulysaateista. Analyysi anti-PKM2 saostuu immunoblottauksella anti-MUC1-C tukenut yhdistys näiden proteiinien (Fig. 2A). In GST avattavasta kokeissa inkubointi 3Y1 /vektorin solulysaateista GST ja GST-MUC1-CD tuki siten vuorovaikutusta PKM2 ja MUC1-CD (Fig. 2B). Ulottaa nämä havainnot soluihin, jotka ilmentävät endogeenista MUC1, coimmunoprecipitation tutkimuksia tehtiin lysaatit ihmisen ZR-75-1 rintasyövän soluja. Täällä PKM2 oli havaittavissa komplekseja 25-20 kDa MUC1-C alayksikköä (Fig. 2C). Pull-down kokeita ZR-75-1 solulysaateista myös osoittanut sitoutumista MUC1-CD PKM2 (Fig. 2D). Tutkimukset MUC1-CD häviämämutantit osoitti lisäksi, että yhdessä PKM2 on myönnetty MUC1-CD (1-45) eikä MUC1-CD (46-72) (Fig. 2D). Inkubointi GST-MUC1-CD puhdistetulla yhdistelmä-His-merkitty PKM2 vahvisti suoran sitoutumisen MUC1-CD ja PKM2 (Fig. 2E). Tulokset osoittivat myös, että MUC1-CD (1-45) eikä MUC1-CD (46-72) vastaa suoraa vuorovaikutusta (kuvio. 2E). MUC1-CD sisältää CQC motiivi (aa 1-3), joka edistää muodostumista MUC1-C-homodimeerejä (Fig. 1A) [20]. Mutaatio CQC motiivi AQA (C1A /C3A) tukkima sitoutuminen MUC1-CD PKM2 (Fig. 2F). Sitoutuminen MUC1-CD PKM2 myös kumottu kanssa C3A, eikä C1A, mutantti, joka osoittaa, että Cys-3 on vastuussa vuorovaikutuksesta (Fig. 2F). Nämä havainnot osoittavat, että MUC1-C kumppaniaan PKM2 soluissa suoran vuorovaikutuksen välittämä MUC1-C sytoplasminen domeeni Cys-3 jäämiä.

. Lysaatit 3Y1 /MUC1-CD solut altistettiin immunosaostus kontrolli-lgG tai anti-PKM2. Sakat immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. B. Lysaatit 3Y1 /vektorin soluja inkuboitiin GST tai GST-MUC1-CD. Adsorbaateilla glutationihelmiin immunoblotattiin anti-PKM2. Tulo GST-proteiinien arvioitiin Coomassie blue -värjäyksellä. C. lysaatit ihmisen ZR-75-1 rintasyövän solut immunosaostettiin kontrolli-IgG tai anti-PKM2. Sakat immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. D. ZR-75-1 solulysaateista inkuboitiin GST, GST-MUC1-CD ja osoitetun GST-MUC1-CD deleetiomutantteja. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-PKM2. Tulo GST-proteiinien arvioitiin Coomassie blue -värjäyksellä. E. PKM2 inkuboitiin GST, GST-MUC1-CD ja osoitettua GST-MUC1-CD deleetiomutantteja. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-PKM2. F. PKM2 inkuboitiin GST, GST-MUC1-CD ja merkitty GST-MUC1-CD-mutantteja, joissa Cys-1 ja /tai Cys-3 oli substituoitu Ala. Adsorbaatteja immunoblotattiin anti-PKM2.

MUC1-CD sitoutuu suoraan PKM2 B-domain Cys-165 ja C-domeenin Cys-474

PKM2 koostuu N-pään (aa 1-43), A1-domeeni (aa 44-116), B-domain (aa 117-218), A2-domain (aa 219-389) ja C-domain (aa 390-531) [7] (Fig. 3A). Sitoutuminen MUC1-CD oli havaittavissa PKM2 (1-218) ja PKM2 (390-531), mutta ei PKM2 (219-389) (Fig. 3B). Edelleen analyysi PKM2 (1-218) deleetiomutanttien osoittivat, että MUC1-CD sitoutuu suoraan B-domeeni (aa 117-218), eikä N-terminaaliseen päähän (aa 1-43), tai A1-domeeni (aa 44-116 ) (Fig. 3C). PKM2 B-domeeni sisältää kaksi kysteiiniä asemissa 152 ja 165. mutaatio PKM2 (117-218) Cys-152: sta Ala (C152A) ei ollut vaikutusta vuorovaikutuksesta MUC1-CD (Fig. 3d, vasemmalla). Sen sijaan sitoutuminen MUC1-CD ja PKM2 (117-218) kumottiin muta- Cys-165 Ala (C165A) (Fig. 3d, oikealla). Mitä tulee PKM2 C-domain (aa 390-531), Cys-tähteitä sijaitsevat asemissa 423, 424 ja 474. Sidonta MUC1-CD PKM2 (390-531) ei vaikuttanut mutatoimalla Cys-423 Ala ( C423A) (Fig. 3E, vasen) tai Cys-424: sta Ala (C424A) (Fig. 3E, keskellä). Kuitenkin vuorovaikutus MUC1-CD on vaimennettu mutaatio PKM2 (390-531) Cys-474 tähteen Ala (C474A) (Fig. 3E, oikealla). Nämä havainnot osoittavat, että MUC1-CD Cys-3 tähde sitoutuu suoraan (i) PKM2 B-domain Cys-165, ja (ii) PKM2 C-domeeni Cys-474.

. Kaaviokuva PKM2 proteiinin N-päähän (N) ja A1-, B-, A2- ja C-domeenit. Korostettu ovat Cys-165 ja Cys-474 tähteitä. B ja C. MUC1-CD inkuboitiin GST ja osoitti GST-PKM2 deleetiomutantteja. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C. Tulo GST-proteiinien arvioitiin Coomassie blue -värjäyksellä. D. MUC1-CD inkuboitiin GST, GST-PKM2 (117-218) ja GST-PKM2 (117-218), jossa on valittu C152A ja C165A mutaatioita. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C. E. MUC1-CD inkuboitiin GST, GST-PKM2 (390-531) ja GST-PKM2 (390-531), jossa on valittu C423A, C424A ja C474A mutaatioita. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C.

Fosfory- MUC1-CD sitoutuu PKM2 C-domain Lys-433

MUC1-C sytoplasmadomeenissa on fosforyloitu Tyr -46 by EGFR (Fig. 1A) [21]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että tietyt fosfotyrosiinivasta- peptidit vuorovaikutuksessa PKM2 C-domain ja estää sen toimintaa [8]. Sen määrittämiseksi, ovatko tyrosiinifosforyloituu MUC1-C sytoplasmadomeenissa sitoutuu PKM2, ensin inkuboitu MUC1-CD ja MUC1-CD (Y46F) EGFR ja ATP. Analyysi reaktiotuotteiden immunoblottauksella anti-P-Tyr vahvisti fosforylaatio Tyr-46 (Fig. 4A, vasemmalla). Kuten löytyi MUC1-CD, inkubointi p-MUC1-CD kanssa PKM2 deleetiomutanttien osoittanut sitoutumista PKM2 (1-218) ja PKM2 (390-531) (Fig. 4A, oikealla). Sitoutumisen p-MUC1-CD oli myös havaittavissa PKM2 (390-531 /C474A) (Fig. 4B), joka tukee vuorovaikutus, jota ei ole välittyy PKM2 Cys-474 tähteen. Jatkaa näitä havaintoja, MUC1-CD (C3A) mutantti, joka on vailla sitoutumisen PKM2, alistettiin EGFR fosforylaatiota. Vertailu MUC1-CD (C3A) ja p-MUC1-CD (C3A) vahvistettiin, että EGFR fosforylaatiota indusoi sitoutumisen PKM2 (390-531) (Fig. 4C). Nämä tulokset vahvistavat myös kokeissa, joissa sitoutumisen täyspitkän PKM2 oli havaittavissa p-MUC1-CD (C3A) eikä MUC1-CD (C3A) (Fig. 4D). PKM2 C-domain sisältää Lys-433 jäännöksen, joka on välttämätön fosfotyrosiinille peptidin sitovaa [8]. Itse asiassa, mutaatio PKM2 (390-531) Lys-433 glutamaatti (K433E) osittain vähentynyt sitoutumisen p-MUC1-CD (Fig. 4E). Inkubointi ZR-75-1 solulysaateista GST-PKM2 (390-531) ja GST-PKM2 (390-531 /K433E) lisäksi osoittaneet, että sitoutuminen endogeeniseen MUC1-C osittain pienensi K433E mutaatio (Fig. 4F) . Nämä havainnot osoittavat, että fosforylaatio MUC1-C sytoplasminen domeeni Tyr-46 jäännöksen antaa tuotteelle sitoutumisen PKM2 C-domain Lys-433.

. His-merkitty MUC1-CD ja MUC1-CD (Y46F) inkuboitiin EGFR puuttuessa ja läsnä ATP. Reaktion tuotteet analysoitiin immunoblottauksella anti-p-Tyr ja anti-MUC1-C (vasemmalla). GST ja ilmoitettu GST-PKM2 deleetiomutantit inkuboitiin EGFR-fosforyloitu MUC1-CD (p-MUC1-CD) (oikealla). Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C. Tulo GST-proteiinien arvioitiin Coomassie blue -värjäyksellä. B. GST ja GST-PKM2 (390-531 /C474A) inkuboitiin MUC1-CD tai p-MUC1-CD. Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C. C. GST ja GST-PKM2 (390-531) inkuboitiin MUC1-CD (C3A) tai EGFR-fosforyloitu p-MUC1-CD (C3A). Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C. D. PKM2 inkuboitiin GST, GST-MUC1-CD (C3A) ja EGFR-fosforyloitua GST-p-MUC1-CD (C3A). Adsorbaateilla immunoblotattiin anti-MUC1-C ja anti-p-Tyr. E ja F. GST, GST-PKM2 (390-531): n ja GST-PKM2 (390-531 /K433E) inkuboitiin p-MUC1-CD (E) tai ZR-75-1 solulysaatti (F). Adsorbaatteja immunoblotattiin anti-MUC1-C.

stimulaatio PKM2 aktiivisuuden MUC1-CD Cys-3

PKM2 on allosterically aktivoidaan sitomalla FBP: n C-domeeni [7]. Mahdollisten toiminnallinen merkitys vuorovaikutusta MUC1-CD ja PKM2, inkubointi MUC1-CD PKM2 liittyi vaatimaton stimulaation PKM2 aktiivisuuden (Fig. 5A, vasemmalla). MUC1-CD aiheuttama stimulaatio PKM2 riippui MUC1-CD Cys-3 motiivin että MUC1-CD (C3A) ei ollut ilmeistä vaikutusta PKM2 aktiivisuutta (Fig. 5A, oikealla). Kuten on esitetty aikaisemmin [7], FBP oli tehokas stimuloimaan PKM2 aktiivisuuden (kuvio. 5B). Lisäksi lisäämällä sekä FBP ja MUC1-CD johti vähintään lisäaineen lisäys (kuvio. 5B), mikä osoittaa, että MUC1-CD voi edistää FBP aiheuttama PKM2 aktivointi. Jatkaa näitä havaintoja, inkuboimme PKM2 GO-203, peptidi, joka sisältää poly-Arg ([R]

9) ja MUC1-CD sekvenssi CQCRRKN ​​sisälsi Cys-3 jäännöksen, joka näytettiin yllä sitoutuvan PKM2 ( kuva 5C). GO-203 oli erittäin tehokas stimuloimaan PKM2 toimintaa, kun taas kontrolli-peptidiä, joka on nimetty CP-2, jossa Cys-3 jäännös on substituoitu Ala (AQARRKN) oli pieni vaikutus (kuvio. 5C). Lisäksi mutaatio PKM2 Cys-474, mutta ei Cys-165, Ala johti kumoamisen GO-203-indusoimaa kasvua PKM2 aktiivisuuden (kuvio. 5D). Inkubointi PKM2 sekä FBP ja GO-203 osoitti lisäksi, että GO-203 on lisäaine kanssa FBP asiakkuutta PKM2 aktiivisuutta (kuvio. 5E). Nämä havainnot osoittavat, että vuorovaikutus MUC1-CD Cys-3 tähteen ja PKM2 Cys-474 stimuloi PKM2 toimintaa.

. Rekombinantti PKM2 inkuboitiin ilman, ja kun läsnä on ilmoitettua pitoisuuksien MUC1-CD (vasen) tai MUC1-CD (C3A) (oikealla) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tulokset (keskiarvo + SD viisi erillistä koetta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus. B. PKM2 inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden FBP yksin, MUC1-CD yksinään tai FBP ja MUC1-CD. Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus. C. aminohapposekvenssit GO-203 ja CP-2-peptidien. PKM2 inkuboitiin 100 uM GO-203 tai CP-2. Tulokset (keskiarvo + SD viisi erillistä koetta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus. D. PKM2 ja osoitetut PKM2 mutantit inkuboitiin ilman (avoimet pylväät) ja läsnä oli 100 uM GO-203 (täytetyt pylväät). Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saatiin ilman GO-203. E. PKM2 inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla FBP yksin, GO-203 yksin tai FBP ja GO-203. Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus.

tyrosiini-fosforyloituu MUC1-CD inhiboi PKM2 aktiivisuutta

sitoutuminen tyrosiini-fosforyloituu peptidien PKM2 C-domeeni on estoon liittyvän PKM2 [8]. Näin ollen meillä verrattiin MUC1-CD ja EGFR-fosforyloitiin p-MUC1-CD PKM2 toimintaa. Kuten edellä on esitetty, FBP aiheuttama stimulaatio PKM2 lisättiin MUC1-CD (Fig. 6A). Vertailun, fosforyloitu p-MUC1-CD oli tehoton lisäämään PKM2 aktiivisuuden (Fig. 6A). Nämä tutkimukset p-MUC1-CD ovat kuitenkin hankaloittaa saattaa joko stimuloivia vaikutuksia Cys-3 ja estäviä vaikutuksia p-Tyr-46. Näin ollen kokeet suoritettiin MUC1-CD (C3A) mutantti, joka on tehoton stimuloimaan PKM2. Täällä, MUC1-CD (C3A) ei ollut mitään näkyvää stimuloiva vaikutus ja EGFR-fosforyloitiin MUC1-CD (C3A) tukahdutetaan PKM2 aktiivisuus (Fig. 6A). Kontrollina, MUC1-CD (Y46F), mutantin, joka oli inkuboitu EGFR: n ja ATP oli vähän, jos lainkaan vaikutusta (Fig. 6A). Vahvista Näiden havaintojen syntetisoimme peptidejä, jotka vastasivat ohjaus- ja EGFR-fosforyloitiin MUC1-CD Tyr-46 (YEKV) motiivi (Fig. 6B). Fosfo-Tyr-46-peptidi, mutta ei fosforyloitumaton muodossa, esti PKM2 aktiivisuus (Fig. 6C). Kokeita suoritettiin myös GO-203 yksin ja yhdessä fosfo-Tyr-46 peptidi. Näissä koeolosuhteissa, GO-203 aiheuttama stimulaatio PKM2 toiminta ei vaikuttanut fosfo-Tyr-46 peptidi (Fig. 6D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että EGFR-välitteisen fosforylaation MUC1-CD: YEKV motiivi estää PKM2 toimintaa ja että GO-203-indusoidun stimulaation PKM2 ei estänyt tätä mekanismia.

. PKM2 inkuboitiin 10 uM FBP puuttuessa (kontrolli) ja läsnä oli 10 uM fosforyloitumaton ja EGFR-fosforyloitiin MUC1-CD, MUC1-CD (C3A) ja MUC1-CD (Y46F). Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus. B. sekvenssit Tyr-46 ja fosfo-Tyr-46 peptidejä. C. PKM2 inkuboitiin 10 uM FBP puuttuessa (kontrolli) ja läsnä oli 100 uM fosfo-Tyr-46 peptidi tai Tyr-46-peptidin. Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus. D. PKM2 inkuboitiin ilman (Control) ja läsnä oli 20 uM GO-203 yksin, 100pM fosfo-Tyr-46 peptidi yksin tai GO-203, jossa fosfo-Tyr-46 peptidi. Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, joka saadaan ohjaus.

MUC1-C edistää aerobinen Glykolyysivaiheen rintasyöpäsoluissa

Sen määrittämiseksi, endogeeninen MUC1-C vaikuttaa Glykolyysivaiheen, tutkimme ZR-75-1 ja MCF-7 rintasyöpäsolujen vakaat vaiennettu MUC1-C lauseke (Fig. 7A). Downregulation MUC1-C ei ollut vaikutusta PKM2 tasoilla tai fosforylaatio Tyr-105 (Fig. 7A). Merkittävää on, analyysi sekä ZR-75-1 ja MCF-7-soluja, osoitti, että hiljentäminen MUC1-C liittyy vähentyneeseen glukoosin oton (Fig. 7B) ja väheni laktaatin (Fig. 7C), mikä osoittaa, että MUC1-C edistää glykolyysin rintasyöpäsoluissa. Sen lisäksi, että tukahduttaminen Glykolyysivaiheen, hiljentäminen MUC1-C siirrettävä pienenemistä ZR-75-1 ja MCF-7 pesäkkeiden muodostumista (Kuva. 7D).

. Lysaatit ZR-75-1 ja MCF-7-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti tyhjän vektorin tai MUC1siRNA immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. B. ilmoitettu solut analysoitiin glukoosin oton. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​nmol /10

6 solua. C. ilmoitettu solut analysoitiin laktaatin tuotantoa. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​suhteessa laktaatin tuotantoa verrattuna, että solut, jotka ilmentävät tyhjän vektorin (annetaan arvo 1). D. ilmoitettu solut maljattiin pehmeä agar ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 14 päivää. Tulokset (keskiarvo ± SD kahdesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​pesäkkeitä suhteellinen osuus, joka saatiin ZR-75-1 tai MCF-7-solut, jotka ilmentävät tyhjän vektorin (kukin annetaan arvo 1).

Effects of MUC1-C PKM2 toimintaa rintasyöpäsoluissa

Tutkimukset suoritettiin sen määrittämiseksi, onko vaikutus MUC1-C aerobinen Glykolyysivaiheen rintasyöpäsoluissa liittyy muutoksiin PKM2 toimintaa. 24 tunnin kuluttua kulkua ZR-75-1-solujen, PKM2 aktiivisuus väheni downregulation MUC1-C lauseke (Fig. 8A, vasen). Sen sijaan 72 tunnin viljelyn, hiljentäminen MUC1-C liittyi lisääntyminen PKM2 aktiivisuuden (Fig. 8A, vasen). Nämä havainnot vastasi kasvu laajuus MUC1-C tyrosiinifosforylaation 24-72 tunnin viljelyn (Fig. 8A, oikealla). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin MCF-7-solut (Fig. 8B, vasen ja oikea), mikä osoittaa, että MUC1-C tyrosiinifosforylaatiostatuksessa edistää sääntelyn PKM2. Siinä päättelyä, tutkimukset suoritettiin vaikutusten arvioimiseksi EGF stimulaatiota. Treatment of MCF-7 /vektori-solujen EGF liittyi kasvua fosforylaation MUC1-C tyrosiini (Fig. 8C, vasemmalla). Lisäksi EGF stimulaatio MCF-7 /vektori, mutta ei MCF-7 /MUC1siRNA, solut johti downregulation of PKM2 aktiivisuuden (kuvio. 8C, oikealla). Nämä havainnot osoittavat, että tyrosiinifosforyloituu MUC1-C estää PKM2 aktiivisuutta rintasyövän solujen ja että tämä vaikutus on selvempi vastauksena EGR stimulaatiota.

A ja B. Lysaatit ilmoitetusta ZR-75-1 ( A) ja MCF-7 (B) solut kerättiin osoitettuina aikoina, kun kanavan analysoitiin PKM2 aktiivisuus (vasemmalla). Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​suhteellisena PKM2 aktiivisuus verrattuna siihen, joka saatiin soluissa, jotka ilmentävät tyhjän vektorin (annetaan arvo 1). ZR-75-1 /vektorin (A) ja MCF-7 /vektorin (B) solulysaateista inkuboitiin myös anti-MUC1-C ja sakat immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla (oikealla). C. MCF-7 /vektorin ja MCF-7 /MUC1siRNA-solut jätettiin käsittelemättä ja stimuloitiin EGF 5 min. Lysaatit MCF-7 /vektori-soluja inkuboitiin anti-MUC1-C ja sakat immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla (vasemmalla). Lysaatit analysoitiin PKM2 aktiivisuus (oikea). Tulokset (keskiarvo + SD kolmesta erillisestä kokeesta) ilmaistaan ​​suhteellinen PKM2 aktiivisuus verrattuna, että stimuloimattomissa MCF-7 /vektori-soluissa.

vaikutukset ilmentävät MUC1 (C3A) mutantti on PKM2 aktiviteetti

Voit selvittää vaikutukset hiljentäminen MUC1-C voisi johtua vuorovaikutusta MUC1-C sytoplasmadomeenia ja PKM2, tehtiin tutkimuksia, joissa HCT116-solut, jotka ovat null MUC1 ilmaisun ja olivat vakaasti transfektoitu ilmaista tyhjän vektorin, villityypin MUC1 tai MUC1 kanssa C3A mutaatio (Fig. 9A). MUC1 ja MUC1 (C3A) ilmentyminen ei ollut vaikutusta PKM2 tai p-PKM2 (Tyr-105) tasot (Fig. 9A). Glukoosin oton lisääntyi HCT116 /MUC1, mutta ei HCT116 /MUC1 (C3A), soluihin (kuvio. 9B). Samanlaisia ​​tuloksia saadaan, kun mitataan laktaatin (Fig. 9C). MUC1, mutta ei MUC1 (C3A), ilmentyminen liittyi myös nousua PKM2 aktiivisuuden (kuvio. 9D). Lisäksi, kuten on esitetty aiemmin [20], MUC1 ilmentyminen liittyi nousua HCT116 pesäkkeiden muodostumista ja tämä vaikutus kumottiin MUC1 (C3A) mutantti (kuvio. 9E). Nämä havainnot osoittavat, että salpaamalla vuorovaikutusta MUC1-CD ja PKM2 vaimentaa MUC1-CD-välitteisen vaikutuksia glykolyysin, PKM2 aktiivisuus ja pesäkkeiden muodostumista.

. Lysaatit HCT116-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti tyhjän vektorin, villityypin MUC1 tai MUC1 (C3A) immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. B. ilmoitettu solut analysoitiin glukoosin oton. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​nmol /106 solua. C. ilmoitettu solut analysoitiin laktaatin tuotantoa. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​suhteessa laktaatin tuotantoa verrattuna, että solut, jotka ilmentävät tyhjän vektorin (annetaan arvo 1). D. Lysaatit ilmoitetusta solut analysoitiin PKM2 toimintaa. Tulokset (keskiarvo ± SD kolmesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​suhteellisena PKM2 aktiivisuus verrattuna siihen, joka saatiin soluissa, jotka ilmentävät tyhjän vektorin (annetaan arvo 1). E. ilmoitettu solut maljattiin pehmeä agar ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 14 päivää. Tulokset (keskiarvo ± SD kahdesta erillisestä kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena) ilmaistaan ​​pesäkkeitä suhteellinen osuus, joka saatiin HCT116 /vektori-solut (määritetty arvo on 1).

Keskustelu

MUC1-C onkoproteiinin edistää Glykolyysivaiheen

Useimmat syöpäsolut ovat riippuvaisia ​​aerobista Glykolyysivaiheen varten tuottaa energiaa, joka tarvitaan solun prosesseihin. Tämä muuttunut aineenvaihdunta, joka tunnetaan nimellä Warburg vaikutus, liittyy lisääntynyt glukoosin kanssa vähentynyt käyttö TCA aikana, siten, että pyruvaatin syntyy glykolyysin aikana muutetaan laktaatiksi [22].