Krooninen sairaus

tiivistelmä

Matrix (MMP) stimuloida kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden hajottamalla soluväliaineen. Täällä paljastaa odottamaton rooli Mmp10 (stromelysiini 2) ylläpitoon ja tuumorigeenisyystesti hiiren keuhkosyöpään kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSC). Mmp10 ilmentyy erittäin oncosphere rikastettu CSCS ja RNAi-välitteinen knockdovvn

Mmp10

johtaa menetykseen kantasolujen markkerigeenin ilmentymisen ja esto oncosphere kasvun, kloonilaajenemisen, ja muuttuu kasvu

in vitro

. Mielenkiintoista, kloonilaajenemisen

Mmp10

puutteellinen oncospheres voidaan palauttaa lisäämällä eksogeenistä Mmp10 proteiinin elatusaineeseen, osoittaa suora rooli Mmp10, että näiden solujen. Oncospheres esiintyy suurempaa kasvaimeen aloittamista ja metastaattinen aktiivisuus injektoituna ortotooppisesti hiirissä, kun taas Mmp10 puutteesta kulttuureissa osoittavat vakava vika kasvain aloittamista. Toisaalta, oncospheres istutetaan syngeenisiin ei-siirtogeenisiä tai

Mmp10

– /- hiiret eivät osoita merkittävää eroa kasvaimen aloittamista, kasvun tai etäpesäkkeen, mikä osoittaa, että on tärkeää

Mmp10

tuotettu syöpä solujen sijaan kasvaimen microenvironment keuhkojen kasvain aloitus ja ylläpito. Analyysi geenien ilmentyminen tietojen ihmisen syövissä paljastaa voimakas positiivinen korrelaatio kasvaimen Mmp10 ilmaisun ja metastaattinen käytös monissa ihmisen kasvainten tyyppejä. Siten

Mmp10

vaaditaan ylläpitoa erittäin tuumorigeenistä, syöpä-käynnistävän, metastaattinen kantasolujen kaltaisia ​​solupopulaation keuhkosyöpä. Tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa, että

Mmp10

on kriittinen keuhkosyöpä kantasolujen geenin ja uusia terapeuttisia tavoite keuhkosyöpä kantasoluja.

Citation: Justilien V, Regala RP, Tseng IC, Walsh MP, Batra J, Radisky ES, et al. (2012) matriksimetalloproteinaasi-10 vaaditaan Keuhkosyöpä Stem Cell ylläpito, kasvain aloittaminen ja Metastasoitunut Potential. PLoS ONE 7 (4): e35040. doi: 10,1371 /journal.pone.0035040

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 tammikuu 2012; Hyväksytty: 08 maaliskuu 2012; Julkaistu: 24 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Justilien et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health /National Cancer Institute (R01 CA081436-13 ja R21 CA151250-01), V Foundation for Cancer Research, sekä James ja Esther kuningas Biomedical Research Program (1kg-05-33971) ja APF ; Ruth A. Kirschstein National Cancer Institute tutkijatohtorin (CA115160) ja RPR; ja National Institutes of Health Research täydennysosa edistää monimuotoisuutta Terveydenhoitoalan Research Award National Cancer Institute (VJ). APF on Monica Flynn Jacoby professori Cancer Research, lahjoitusvarat rahasto, joka tarjoaa osittaisen tukee tutkijan tutkimusohjelmassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1]. Lopputulokseen NSCLC potilaiden edelleen heikko, mikä korostaa tarvetta tunnistaa tehokkaampia keinoja ennaltaehkäisyyn, diagnosointiin ja hoitoon. Kasvaimet sisältävät alaryhmien soluja, joilla varren kaltaisia ​​ominaisuuksia, jotka ajavat synnyssä [2], [3], [4]. Nämä syövän aloittamista tai syövän kantasoluja (CSCS) osoittavat itseuudistumisen, kasvaimen aloittamaan toiminnan, kloonilaajenemisen kuin ”oncospheres”, kyky tukea kasvaimen huolto- ja etäpesäkkeiden, ja erilaistumaan lyhytaikaisesti-monistamalla, jotka käsittävät suurimman kasvaimen [2], [4], [5], [6]. CSCS jakaa molekyyli ominaisuuksia alkion kantasoluja, kuten ilmaus aldehydiä (ALDH) [7], ja kantasolujen markkereita, kuten CD133 [8], [9], Nanog [10], Oct4 [10], Sox2 [11] ja Notch reseptorit [12]. CSCS on kuvattu monissa muodoissa ihmisen syövän, mukaan lukien keuhkosyövässä [9], [13]. Keskeinen rooli CSCS kasvainten synnyssä osoittaa, että nämä solut on kohdennettava terapeuttisesti tehokkaan syövän hoitoon.

MMP ovat sekaantuneet keuhkojen kasvain leviämisen, invaasio, ja etäpesäkkeiden [14]. Stromelysiinin alaperhe [stromelysiini 1 (Mmp3), 2 (Mmp10) ja 3 (Mmp11)] on usein yli-ilmentynyt NSCLC [15],. Mielenkiintoista, Mmp10 ilmentyy vahvasti NSCLC kasvaimia, mutta ei kasvaimeen liittyvät strooman soluja, kun taas Mmp3 ja Mmp11 ilmaistaan ​​pääasiassa strooman [17],. Olemme viime aikoina osoittaneet, että Mmp10 tarvitaan muunnettava kasvun ja invaasion ihmisen NSCLC-solujen

in vitro

[19], indusoidaan bronchio-keuhkorakkuloiden kantasolut (BASCs) muunnettava onkogeeninen

Kras

[ ,,,0],20], ja edistetään

Kras

-välitteisen keuhko tuumorigeneesiä in vivo [21].

Mmp10

vajausta hiirillä lohkona

Kras

-ja uretaani aiheuttama kasvaimen muodostumisen, vaikutus, joka korreloi kyvyttömyys Mmp10 puutteesta BASCs laajentaa ja tehdään muutos vastauksena uretaani tai

Kras

[21]. Siten Mmp10 välittää kasvaimen aloittaminen säätämällä kasvainta aloittamista cell (BASC) laajennus.

Täällä roolin arvioimiseksi Mmp10 ylläpidossa ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa täysin transformoitujen hiiren keuhkoissa CSCS. Rikastettu CSCS hiiren keuhkon adenokarsinoomasolua ilmaista kohonnut Mmp10, Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 ja Hey2. Nämä viljelmät osoittavat lisääntynyttä ankkurista riippumaton kasvu in vitro, ja parannettu kasvaimen aloittamista, kasvua ja metastaaseja kuin potilaalle tehdä kasvaimia hiirissä. Nämä varren kaltaisia ​​ominaisuuksia vaativat ilmentyminen Mmp10 kasvainsoluissa mutta ei kasvaimeen liittyvät stroomaan. Tuloksemme osoittavat, että Mmp10 on houkutteleva ehdokas kehittämisen mekanismiin perustuvan hoidon kohdistaminen erittäin tuumorigeenisiä keuhko CSCS.

Tulokset

Hiiri keuhko oncospheres ilmaista koholla Mmp10 ja Mmp10 riippuvaisen varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia

Mmp10

on erittäin indusoituu tuumorin aloittamista keuhkojen bronchio-keuhkorakkuloiden kantasolut (BASCs) aktivoinnin onkogeenisten

Kras

[20]. Lisäksi

Mmp10

vajausta hiirillä laskivat

Kras

-välitteisen keuhko- kasvainten muodostumista ja menetys

Kras

-välitteisen BASC laajeneminen in vitro ja in vivo [21]. Suoraan tutkia merkitys Mmp10 keuhkoissa CSC biologian, analysoimme hiiren CMT167 solut, erittäin tuumorigeenistä, metastaattinen solulinja on peräisin spontaanista alveolien keuhkoadenokarsinooma C57BL /6 hiiri [22], [23]. DNA: n sekvensointi paljasti, että CMT167 solut satama aktivoiva

Kras

G12V

mutaatio (kuvio 1A), mikä tekee siitä ihanteellisen matkapuhelinverkon malli tutkia Mmp10 mutantissa

Kras

keuhko CSCS. Toisin kuin CMT167 kasvatettujen solujen kiinnittynyt kulttuuri (kuvio 1 B, vasen), soluja kasvatettiin määritelty kantasolujen keskipitkän matalan tarttuvuuden levyille kasvaa oncospheres (kuvio 1 B, keskellä) muistuttaa CSC kulttuureissa ihmisen keuhkosyövän solulinjat [13] . Nämä oncospheres redifferentiate kun palasi kiinnittynyt kulttuuriin, jolla morfologia verrattavissa vanhempien soluihin (kuvio 1 B, oikealla). CMT167 oncosphere kulttuureissa näytteille ~8-kertainen kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen verrattuna vanhempien soluihin (kuvio 1 C), sopusoinnussa tehostetun tuumorigeenisen ominaisuuksia CSCS [13]. Parannettu pesäkkeenmuodostus on suurelta osin menetetään, kun nämä solut annetaan redifferentiate palauttamalla ne kiinnittynyt kulttuuri (kuvio 1C). Samanlaiset tulokset saatiin käyttämällä toista hiiren keuhkon adenokarsinooman solulinja, Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) (kuvio S1A ja B). LLC soluja kasvatettiin oncospheres kantasolujen kulttuuri esiintyy suurempaa kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumista, mutta menettävät nämä ominaisuudet kun palasi kiinnittynyt kulttuuriin. Nämä tulokset osoittavat, että meidän oncosphere viljelmiä rikastettu syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja.

A) CMT167 solujen satama aktivoiva

Kras

G12V

mutaatio. DNA-sekvenssi kromatogrammi

Kras

alleeli CMT167 soluissa paljastaa kodonin 12 mutaatio glysii- nistä valiiniksi (

Kras

G12V

) (punainen nuoli). B) Faasikontrasti- fotomikrograafeja vanhempien kiinnittyneet CMT167 solut (

vasen paneeli

), CMT167 oncospheres kantasolujen kulttuuri (

keskimmäinen paneeli

) ja redifferentiated oncosphere solujen palanneen kiinnittynyt kulttuuri (

oikea paneeli

). C) CMT167 oncosphere viljelmät ilmentävät parannettu kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Mean fold-muutos CMT167 vanhempien soluista +/- SEM. n = 5, * p 0,00001; ** P 0,00001.

edelleen luonnehtivat oncosphere kulttuureissa, arvioimme heidät ilmentämiseksi hyvin tunnettu kantasolujen liittyvien geenien. QPCR paljasti, että CMT167 oncosphere viljelmät ilmaista koholla mRNA monia geenejä, jotka liittyvät kantasolujen fenotyyppiä [24], mukaan lukien Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 ja Hey2 (kuvio 2A). Silmiinpistävän, näitä viljelmiä myös ilmaista koholla Mmp10 mRNA: ta (kuvio 2A), mutta ei lisätä Mmp2, MMP7, MMP-9, Mmp11, MMP-12 tai Mmp14, muita MMP-lajit yleisesti liittyy keuhkosyöpä (kuvio 2A). Kuten odotettua, oncosphere viljelmät näytteille menetys kantasolujen merkkiaineita ja Mmp10 ilme, kun annettiin redifferentiate on kiinnittynyt viljelmässä (kuvio 2B). Samanlainen kantasolujen markkeri ilmentymistä havaittiin oncosphere kulttuureissa LLC solujen, myös dramaattinen kasvu MMP10, mikä osoittaa, että nämä muutokset eivät ole ainutlaatuisia CMT167 oncospheres (kuvio S1C). CMT167 oncosphere viljelmät erittävät kohonneita Mmp10 proteiinia keskipitkällä verrattuna vanhempien tai redifferentiated kulttuureissa (kuvio 2C), jotka osoittavat toiminnallista merkitystä kohonnut Mmp10 ilmentymisen näissä kulttuureissa. CD133 ja Notch4 kaksi erittäin valikoivia pintamerkkiaineita ilmentyy muissa keuhkojen CSCS [9],. Siksi arvioimme ilmentymistä näiden merkkiaineiden CMT167 vanhempien, oncosphere ja redifferentiated oncosphere kulttuureissa virtaussytometrialla (kuvio 2D). Vanhempien soluviljelmissä sisältävät ~8% CD133

+ /Notch4

+ soluja. Sen sijaan oncosphere viljelmät sisältävät ~38% CD133

+ /Notch4

+ solujen ja redifferentiated kulttuureissa ~6% CD133

+ /Notch4

+ soluja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​esiintyvyys CSCS muissa keuhkosyövän solulinjat [9], mikä osoittaa, että nämä ovat selektiivisiä markkereita CSC-rikastettu kulttuureissa.

A) ilmentyminen syövän kantasolujen merkkiaineiden CMT167 vanhempien ja oncosphere kulttuureissa. QPCR syövän kantasoluja liittyvien geenien; * P 0,05. B) QPCR kantasolujen merkkiaineiden vanhempien, oncosphere ja redifferentiated oncosphere kulttuureissa. Taita vanhemmaissolujen +/- SEM, n = 3; * P 0,05. C) CMT167 oncosphere viljelmät erittävät koholla Mmp10 proteiinia. ELISA Viljelmäsupernatanttien vanhempien, oncosphere ja redifferentiated CMT167 oncosphere kulttuureissa. Mean +/- SEM. n = 3, * p 1 x 10

-8 vanhempien vs. oncospheres; ** P 2 x 10

-8 oncospheres vs. redifferentiated oncospheres. D) virtaussytometria CMT167 vanhempien, oncosphere ja redifferentiated oncosphere kulttuurien CD133 ja Notch4.

Koska oncospheres ilmaista kohonnut Mmp10, me seuraavaksi arvioitava, onko Mmp10 on tärkeää niiden kunnossapitoon ja kasvua. Kolme RNAi lentivirukset suunnattu hiiren Mmp10-RNA: ta tunnistettiin, jotka estävät Mmp10 ilmentymistä (kuvio S2A ja B). Jokainen Mmp10 Knockdown virus aiheutti oikeassa eston kiinnittymisestä riippumatonta kasvua verrattuna ei-kohde (NT) RNAi kontrollisoluja (kuvio S2C). Tehokkain Mmp10 RNAi-konstrukti (# 3) käytettiin saamaan aikaan tehokas knockdovvn Mmp10 mRNA: n sekä vanhempien ja oncosphere viljelmät (kuvio 3A). Mmp10 pudotus aiheutti eston transformoitu kasvun (kuvio 3B), ja menetys ilmaus Nanog, Aldh1, CD133, Notch3 ja 4, Hey1 ja 2, ja Mmp10 (kuvio 3C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin LLC oncosphere kulttuureissa, joissa MMP10 pudotettiin RNAi (kuvio S3A-C). Mmp10 RNAi oncosphere kulttuureissa myös näytteillä lasku CD133

+ /Notch4

+ soluja verrattuna NT RNAi oncosphere kulttuureissa (kuvio 3D). Mielenkiintoista, Mmp10 knockdown myös vähensi CD133

+ /Notch4

+ solujen vanhempien kulttuureissa (välillä ~11%: sta -5%) (kuvio 3D), mikä osoittaa, että Mmp10 on tärkeää ylläpidosta CSC väestön sisällä vanhempien kulttuureissa.

A) QPCR osoittaa RNAi-välitteinen knockdovvn Mmp10 vanhempien CMT167 ja oncosphere kulttuureissa. Suhteessa NT vanhempien soluihin; Keskiarvo ± S.D., N = 3. * p 0,0002 ja ** p = 0,01 vs. NT lapsilukko. B) vaikutus Mmp10 RNAi on kiinnittymisestä riippumatonta kasvua vanhempien ja CMT167 oncosphere kulttuureissa. Suhteessa NT vanhempien soluihin +/- SEM, n = 5; * P 0,05 vs, NT; ** P 0,05 vs. NT vanhempien. C) QPCR kantasolujen merkkiaineiden NT vanhempien ja NT ja Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere soluja. Taita NT vanhempien +/- SEM, n = 3; * P 0,05. D) Virtaussytometria NT ja Mmp10 RNAi vanhempien ja oncosphere solujen CD133: a ja Notch4.

seuraavan määritetään, onko Mmp10 on tärkeää kloonilaajenemisen oncospheres, hyvin määritelty ominaisuus CSCS. Yhden Mmp10 RNAi- ja NT RNAi oncosphere solut maljattiin yksittäisiin kuoppiin vähän tarttuva kudosviljelylevyille ja niiden annettiin klonaalisesti laajentaa. Lähes kaikki NT RNAi solut laajentaa suuriksi oncospheres yli 15 päivän jakson aikana (kuvio 4A, ylempi), kun taas suurin osa Mmp10 RNAi soluista on yksittäisinä soluja (kuvio 4A, alempi). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin LLC oncosphere kulttuureissa (kuvio S3D). Vähentynyt kloonilaajenemisen CMT167 oncospheres johtui geneettinen menetys Mmp10 koska lisäksi rekombinantin Mmp10 viljelyalustaan ​​palautettu kloonilaajenemisen Mmp10 RNAi-soluja (kuvio 4A, alempi). Kvantitointiin vahvisti, että NT RNAi oncospheres kasvavan merkittävästi suurempi kuin Mmp10 RNAi oncospheres, ja lisäksi rekombinantin Mmp10 palauttaa kasvua Mmp10 RNAi solujen, jotka on verrattavissa NT RNAi-soluja mutta sillä ei ole merkittävää vaikutusta NT RNAi-soluissa (kuvio 4B). Eksogeeninen Mmp10 johti myös uudelleen ilmentymisen CD133 ja Notch4 on Mmp10 RNAi-soluissa (kuvio 4C), ja uudelleen ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita (Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4 ja Hey2) (kuvio S4A). Vähentynyt klonaalinen kasvu Mmp10 RNAi oncospheres ei johdu menetystä solujen elinkelpoisuuden, koska nämä solut lisääntyvät nopeudella erotettavissa NT RNAi oncospheres kun se asetetaan takaisin kiinni oleva kulttuuri (kuvio S4b).

A) mikrovalokuvia ja kloonilaajenemisen yhden NT ja Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere solujen läsnä ollessa tai ilman tai rekombinantti Mmp10. B) Colony halkaisija on johdettu yhden CMT167 NT ja Mmp10 RNAi soluja. Mean +/- SEM; n = 10, * p 0,05 vs. päivä 1 kunkin hoidon; ** P 0,05 vs. päivä 15 NT RNAi ilman Mmp10. C) Virtaussytometria NT ja Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere kulttuureissa +/- Mmp10 varten CD133 ja Notch4.

Oncosphere kulttuureissa näytteille Mmp10 kasvain-aloittamaan toiminnan

in vivo

vieressä arvioitiin kasvaimen aloittamista aktiivisuus oncosphere ja vanhempien kulttuureissa potilaalle tehdä injektiolla vasemman koru keuhkosta hiirissä. Alustavat kokeet määritelty, että injektio 100000 vanhempien CMT167 /luc solujen perustettava potilaalle tehdä kasvaimia taas injektio niinkin vähän kuin 1,000 NT RNAi CMT167 /luc soluja oncosphere kulttuureista rutiininomaisesti antoi kasvaimia. Injektio 1000 NT RNAi CMT167 /luc oncosphere solujen johti suuria kasvaimia taas injektio 1000 vanhempien NT RNAi CMT167 /luc-soluja tai Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere solut eivät ole tuottaneet suuria kasvaimia määritettynä elävinä bioluminenssin (kuvio 5A). Patologinen tutkimus keuhkojen kudoksia aikaan uhrin osoittivat, että kasvain ottaa oli 100% NT RNAi CMT167 /luc oncosphere soluja (9/9), joiden keskimääräinen kasvaimen koko 3,63 +/-. 35 mm

2, mutta vain 45% kasvain ottaa vanhempien NT RNAi CMT167 /luc soluja (5/11), jonka keskimääräinen kasvaimen kokoa 0,42 +/-. 06 mm

2, ja 27% kasvaimen kestää Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere soluja (3 /11), joiden keskimääräinen kasvaimen kokoa 0,36 +/-. 09 mm

2. Nämä tiedot validoitava meidän in vivo bioluminenssina mittauksia ja osoitettava, että Mmp10 on ratkaiseva rooli kasvaimeen aloittamaan toiminnan ja kasvun CMT167 /luc oncosphere soluja. Mielenkiintoista, Mmp10 knockdown vanhempien soluissa johtaa myös menetys kasvaimen muodostumisen in vivo (kuvio S5a), mikä osoittaa, että Mmp10 on tärkeää kasvaimen aloittamaan toiminnan on CSC kaltaisen solupopulaation läsnä vanhempien soluviljelmissä. NT RNAi CMT167 /luc oncosphere kulttuureissa myös luotu lukuisia etäpesäkkeitä oikealla lohkoa keuhkojen taas vanhempien NT RNAi CMT167 /luc soluviljelmissä osoitti paljon vähemmän etäpesäkkeitä ja Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere kulttuureissa vähemmän edelleen (kuvio S5B), mikä viittaa rooli Mmp10 metastaattisessa potentiaalia, kiinteistön syyttää keuhkojen CSCS. Näin ollen, Mmp10 on tärkeää parantaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa havaittu oncosphere kulttuureissa.

A, Orthotopic kasvaimen kasvua injektion jälkeen 1000-solujen NT kiinnittynyt, NT RNAi oncosphere tai Mmp10 RNAi oncosphere viljelmistä tarkkailtiin bioluminesenssi ilmoitettuina ajankohtina; * P 0,05 (

vasen paneeli

). Edustavia sivukuvia bioluminesoivista kuvien hiirillä keuhkojen potilaalle tehdä kasvaimia (

oikea paneeli

). Mmp10 toiminto CMT167 oncosphere kasvaimissa on solu autonominen. B) edustaja bioluminesoiviin kuvia NT RNAi CMT167 oncosphere potilaalle tehdä kasvaimet istutettiin NTG ja

Mmp10

– /- vastaanottaja hiiriä. Analyysi C) kasvaimen koon ja D) etäpesäkkeitä NTG tai

Mmp10

– /- hiirissä. C-D, n = 10, keskiarvo +/- SEM.

kasvainten muodostumiseen on riippumaton Mmp10 kasvaimen mikroympäristössä

vaikutuksia Mmp10 vuonna CMT167 soluissa

in vitro

ovat solun itsenäisiä. Emme kuitenkaan voi sulkea pois rooli Mmp10 tuottamien kasvaimeen liittyvien epiteelin, strooman ja /tai immuunisolujen meidän potilaalle tehdä -tuumoritutkimuksia. Ongelman ratkaisemiseksi, me pistetään 1,000 soluja NT RNAi CMT167 /luc oncosphere kulttuureissa kumpaankaan NTG tai

Mmp10

– /- hiirissä. Mitään merkittäviä eroja kasvaimen kasvua (kuvio 5B), primaarikasvaimen koko (kuvio 5C) tai etäpesäkkeitä (kuvio 5D) nähtiin NTG ja

Mmp10

– /- vastaanottaja hiiriä, mikä osoittaa, että Mmp10 ilmaisemat oncospheres, mutta ei Mmp10 tuotettu muiden kasvaimeen liittyvien solujen, on kriittinen kasvaimen muodostumisen. Olemme aiemmin osoittaneet, että Mmp10 ilmaistaan ​​häviävän pieniä määriä keuhkoissa epiteelin, mutta on erittäin indusoituu BASCs aktivoinnin onkogeenisten

Kras

[20]. Näin ollen kasvaimen solut ovat merkittävä lähde Mmp10 keuhkoissa kasvaimen kantavien hiirten.

Oncosphere viljelmiä erilaistuvat bulk kasvainsolujen jälkeen potilaalle tehdä injektion

CSCS aloittaa ja ylläpitää kasvaimia ylläpitämällä CSC väestö ja erilaistumaan lyhytaikaisesti vahvistavat soluja, jotka muodostavat pääosan kasvain. Arvioida kohtalo CMT167 oncospheres jälkeen ortotrooppisella kasvaimen muodostumisen, me eristetty kasvainsolujen ortotooppisten kasvaimia, jotka ovat peräisin näistä viljelmistä ja analysoitiin ne CD133

+ /Notch4

+ -soluista (kuvio 6). Tuolloin injektion oncosphere viljelmät osoittivat merkittävää rikastumista CD133

+ /Notch4

+ soluja (~36%) (kuvio 6A). Sitä vastoin tuumorisolut eristetään ortotooppisten kasvainten koostui ~11% CD133

+ /Notch4

+ soluja, sopusoinnussa vanhempien CMT167 solut (kuvio 6B). Nämä tiedot osoittavat, että oncosphere viljelmät levittää populaation CD133

+ /Notch4

+ varsi kaltaisia ​​soluja, ja myös erilaistua lyhytaikaisesti-monistamalla kasvainsoluja in vivo. Olemme myös tutkineet jakeluun CMT167 oncosphere solujen potilaalle tehdä kasvaimissa immunohistokemiallisesti varten Mmp10 ja Notch4 (kuvio 6C). Ensisijainen kasvaimia peräisin oncospheres osoittivat hieman koholla Mmp10 värjäyksen tummempi Mmp10 värjäys alueilla, joilla kasvain on vuorovaikutuksessa ympäröivän strooman. Kasvaimeen liittyviä strooman ja normaali keuhkojen epiteelin tahra negatiivisia Mmp10, sopusoinnussa vähäisyys Mmp10 ilmentymisen normaalissa keuhkojen epiteelin [20]. Notch4 värjäys osoitti samanlaista mallia, mikä osoittaa, koekspressio Mmp10 ja Notch4 kasvainsoluissa rajapinnassa kasvaimen ja ympäröivän strooman (kuvio 6C, ylempi).

Virtaussytometrinen analyysi CD133 ja Notch4 ilmentymisen CMT167 oncospheres ennen injektiota ortotooppisesti hiirissä (A) ja CMT167 eristetyt solut ortotooppisten kasvaimia (B). C) Mmp10 ja Notch4 värjäytymistä ensisijainen CMT167 oncosphere kasvain (

ylälevyissä

) ja metastaattinen vaurio (

alapaneelit

).

Mmp10 ilmentyminen liittyy etäpesäke keuhkosyövän solujen

Tuoreimpien tietojen mukaan CSCS asuvat ennalta metastaattisen lokeroita vastuussa etäpesäkekasvainkudoksen leviämistä. Koska yhdistys stemness ja metastaattisen potentiaalin, arvioimme ilmaus Mmp10 ja Notch4 sisään etäpesäkeleesioita kasvaimista peräisin oncospheres. Mielenkiintoista, sekä Mmp10 ja Notch4 värjäys oli voimakas ja tasainen etäpesäkeleesioita (kuvio 6C, alempi), mikä osoittaa, että nämä vauriot ovat rikastuneet Mmp10-Notch4 kaksinkertainen positiivinen CSCS. Samanlainen yhdistys Mmp10 ilmaisun kanssa etäpesäkeleesioita ihmisen syövissä ei havaittu, kun analysoimme julkisesti saatavilla geenin ilmentymisen aineistoja ihmisen kasvaimista käyttäen NextBio bioinformatiikan työkalu. Analyysi paljasti voimakas positiivinen korrelaatio Mmp10 ilmaisun ja etäpesäkkeiden mahdollisuus ihmisen NSCLC, peräsuolen syöpä, melanooma, rintasyöpä, munuaissyöpä ja eturauhassyövän (taulukko 1). Siten Mmp10 lla näyttää olevan laaja merkitys ihmisen maligniteetti.

Keskustelu

Pieni alipopulaatio itseuudistuvien kantasolujen kaltaisia ​​soluja voi olla vastuussa aloittamisesta, ylläpito, eteneminen ja metastaattinen leviäminen kasvaimia. Kuitenkin suhteellisen vähän tiedetään molekyylitason mekanismeja CSC ylläpitoon. CSCS voi paeta tavanomaisen kemoterapian, luontaisten lääkeresistenssin ja /tai suhteellinen liikkumattomuus, jolloin tauti uusiutuu ja köyhien potilaiden hoitotuloksiin. Siksi terapeuttiset strategiat ja joilla pyritään estämään CSCS voi parantaa kliininen tulos syöpäpotilailla.

Vaikka MMP ovat pitkään osallistuvat kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden, äskettäin osoittaneet, että Mmp10 yli-ilmennetään ihmisen NSCLC ja

Kras

transformoiduista BASC keuhkosyövän-aloittamista solujen [19], [20] ja että Mmp10 tarvitaan transformoidaan kasvun ja invaasion ihmisen NSCLC-solujen

in vitro

[19]. Lisäksi Mmp10

– /- hiirillä merkittävä lasku uretaani- ja

Kras

indusoimaan keuhko- kasvainten synnyssä johtuu vika Mmp10 puutteesta BASCs laajentaa vastauksena kasvaimia

Kras

[21]. Tässä raportoimme yllättävä tulos, että Mmp10 edistää keuhkosyövän aloittamista ja etäpesäkkeiden kautta ylläpito CSC-kuin väestön keuhkojen syöpäsoluja.

CSCS määritellään niiden kyky kloonaamalla laajentaa, erilaistuvat bulk kasvainsoluihin , ja aloittaa kasvaimia saajaeläimissä. Tässä osoitamme, että Mmp10 yliekspressoituu CSC-rikastettu oncosphere kulttuureissa kahdesta hiiren keuhkon adenokarsinooma solulinjojen ja tarvitaan parannettu muuttaneet kasvun ja kloonilaajenemisen

in vitro

, ja kasvaimen aloittamisen

in vivo

. Inhibitio

Mmp10

ilmentymisen oncospheres merkittävästi vähentää ilmentymistä kantasolujen liittyvien transkriptiotekijöiden ja solun pinnan markkereita, mikä osoittaa, että Mmp10 on kriittinen säilyttämään keuhkojen CSC identiteetin. Mmp10 ilmentyminen on myös kohonnut CSCS eristettiin ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat [27], mikä viittaa siihen, että Mmp10 voi toimia myös ylläpitoon näiden CSCS.

avain tehokkaasti kohdistaminen NSCLC CSCS on tarkasti tunnistaa tämän alaryhmän sisällä kasvaimia. BASCs ovat otaksuttu kasvaimeen aloittamista soluja, joista

Kras

indusoimaan hiiren keuhkokasvaimia peräisin. BASCs näytteille pinnan ilmentyminen Sca1 Spc ja CCSP kuitenkin tähän mennessä ihmisen bronchioalveolar kantasoluja, jotka ilmentävät SP-C: n ja CCSP ei ole eristetty, ja Sca1 ei ilmenny ihmisen keuhkojen soluihin [28]. Mielenkiintoista on, CMT167 oncosphere viljelmät eivät ole vain rikastettu CCSP

+ /SPC

+ soluissa (tietoja ei ole esitetty), mutta myös CD133

+ /Notch4

+ soluja, kaksi markkereita osallisena sekä ihmisten ja hiiri CSCS eri kasvain muodoissaan, mukaan lukien keuhkojen [25], [29]. Esto Notch signalointi estää kyky glioblastooma johdettujen CSC neuropallojen levittämään kasvaimia ja köyhdyttää CD133

+ varsi kaltaisia ​​soluja neuropallojen [29]. Samoin, Notch inhibitio estää proliferaation ja kasvaimen aloittamaan toiminnan ihmisen keuhkojen CSCS [25]. Havaitsimme merkittävän rikastamisen Notch4

+ /CD133

+ solujen CMT167 oncospheres muutamia yhdellä positiivisten solujen viittaa siihen, että koekspressoimalla näiden molekyylien on velvollinen pitämään CMT167 CSCS. Siten Notch4 ja CD133 voi olla hyödyllinen merkkiaineiden keuhkojen CSCS eri lajeissa.

Tuloksemme antaa suoraa näyttöä siitä roolista

Mmp10

keuhkojen CSCS on solu autonominen. Meidän potilaalle tehdä kasvain malli osoittaa Mmp10 värjäystä kasvainsoluissa mutta ei kasvaimeen liittyvää strooman tai morfologisesti normaali keuhkojen epiteelin. Vielä tärkeämpää on, ei havaittu merkittäviä eroja kasvaimen määrää, kokoa tai etäpesäkeleesioita muodostama oncosphere solujen ortotooppisesti injektoida syngeenisiin NTG tai Mmp10

– /- hiirissä. Näin ollen, vaikka monet MMP tuottama kasvaimeen liittyvien strooman pelata näkyvä roolit invasiivisia ja metastaattisen ominaisuuksia keuhko- kasvainsolujen, Mmp10 tuotetaan pääasiassa keuhkojen kasvainsolujen tukemaan itsenäistä kasvua CSCS. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​lukuisia raportteja, että Mmp10 ilmentyy ihmisen NSCLC soluissa eikä ympäröivä normaali tai kasvaimeen liittyvää keuhkokudokset [15], [17], [18]. Jatkotutkimuksissa keskitytään määrittämisestä molekyylitason mekanismeja, jotka edistävät Mmp10 välittämää CSC leviämisen.

Huono tulos keuhkosyöpäpotilaita johtuu metastasoituneen levittäminen ja kestävyys kasvainsolujen kemoterapiaa, kaksi ominaisuutta syyttää CSCS. Primaarisissa oncosphere johdettu kasvainten havaitsimme parannettu Mmp10 ja Notch4 värjäys rajapinnassa kasvaimen ja ympäröivän kudoksen, mikä viittaa rooli Mmp10

+ /Notch4

+ solujen tuumori-invaasio. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien rahoitusta, Mmp10 tarvitaan hyökkäystä ihmisen NSCLC-solujen

in vitro

[19], ja nykyinen havainto, että Mmp10 edistää metastaattisen käyttäytymistä CMT167 oncosphere johdettujen kasvaimia. Mielenkiintoista on, että kasvaimen solut etäpesäkeleesioita tasaisesti ilmaista Mmp10 ja Notch4 viittaa siihen, että ne ovat peräisin, ja joka on hyvin rikastettu, CSCS. Mmp10 pudotus johtaa huomattavaan vähenemiseen etäpesäkeleesioita osoittaa, miten tärkeää on Mmp10 metastaattisessa käyttäytymistä.

analyysi ilmaisun profilointi tietojen NSCLC paljasti merkittävä korrelaatio Mmp10 ilmaisun ja syövän etenemiseen, paikallinen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [30 ]. Havaitsimme vastaavia yhteyksiä välillä Mmp10 ilmaisun ja metastaattisen käyttäytyminen paksu- ja peräsuolisyövän, melanooma, rinta-, munuais- ja eturauhasen syöpiä (taulukko 1). Näin ollen, Mmp10 voi olla laaja rooli metastaattisen käyttäytymisen monenlaisia ​​ihmisen syövissä. Käyttämällä bioinformatiikka lähestymistapa, olemme hiljattain osoittaneet, että Mmp10 ilmentyminen ihmisen kasvaimissa liittyy sekä alkion kantasolujen geeni allekirjoitukset ja metastaattista potentiaalia [21]. Mielenkiintoista, CSCS näyttää edistävän chemoresistance ja äskettäisessä tutkimuksessa kävi ilmi, että Mmp10 yliekspressoituu sisplatiinin kestävä verrattuna sisplatiiniin herkkiä ihmisen munasarjan adenokarsinooma soluihin [31]. Lisätutkimuksia tarvitaan, onko Mmp10 edistää etäpesäke ja chemoresistance ihmisen kasvainsoluissa ylläpitämällä erittäin metastaattinen, solunsalpaajaresistentti syövän kantasolujen populaatio, koska meidän nykyinen data hiiren keuhkon adenokarsinoomasolua ennustaisi.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, entsyymejä, ja lentivirus- RNAi-välitteinen geenin pudotus

CMT167 ja LLC-soluja, jotka ilmentävät tulikärpäsen lusiferaasi olivat lahja tri Raphael Nemenoff (University of Colorado, Denver, CO) sekä olivat tunnettu aiemmin [32]. Lyhyesti, nämä solut transfektoitiin pGL3 sisälsi tulikärpäsen lusiferaasi konstitutiivisesti ohjaa SV40-promoottori, ja solut, jotka ekspressoivat korkeita lusiferaasia valittu neomysiinin vastustuskyky [32]. Rekombinantti ihmisen proMmp10 katalyyttinen domeeni ilmennettiin E. coli -kannassa BL21 (DE3), joka on eristetty inkluusiokappaleista, puhdistettu, uudelleenlaskostettu ja aktivoitu

in vitro

käsittelemällä 4-aminophenylmercuric asetaattia, olennaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu Mmp3 [33]. Tiedot konstruktin ja menetelmiä on annettu julkaistavaksi muualla [34]. Pitoisuuksia aktivoitua Mmp10 määritettiin UV-absorbanssilla 280 nm: ssä käyttäen laskettua molaarista ekstinktiokerrointa 29910 M

-1cm

-1. Spesifinen aktiivisuus Mmp10 (43,75 U /ug, 1 U = 100 pmol /min 37 ° C: ssa) määritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19]. 100 U /ml Mmp10 lisättiin kuten on esitetty kuviossa legendoja.

Lentivirusvektorit, jotka sisältävät lyhyen hiusneulan RNAi vastaan ​​hiiren Mmp10 saatiin Sigma-Aldrich. Ei-kohde-ohjaus sisältävän lentivirusvektorin lyhyen hiusneula-RNA-konstrukti, joka ei tunnista mitään hiiren tai ihmisen geeneistä (NT) käytettiin negatiivisena kontrollina. Solut transdusoitiin rekombinantti lentiviruksen ja stabiilit transfektantit valitaan puromysiiniresistenssin kuten aiemmin on kuvattu [19]. RNAi sekvenssit on esitetty kuviossa S1A. Tehokkuutta Mmp10 pudotus arvioitiin kvantitatiivisella PCR: llä (QPCR).

Enrichment, kloonilaajenemisen ja redifferentiaatiota keuhkojen CSCS

CSCS oli rikastettu CMT167 ja LLC-soluja viljelemällä 10000 solua /ml seerumin vapaa DMEM-F12 -alustassa (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 50 ug /ml insuliinia (Sigma-Aldrich), 0,4% albumiini naudan Fraction V (Sigma-Aldrich), N-2 Plus Media Supplement (R 0,05.