Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on immuuni reaktiivinen maligniteetti monimutkaisen immunosuppressoivilla verkko, joka pilaa onnistunut immuuni hävittämiseksi. Tämä tukahduttava microenvironment saattaa välittää rekrytointi tai induktio CD4

+ säätelijä-T-solujen (Tregs). Tutkimuksemme pyrki tutkimaan yhdistys kasvaimen infiltroituneen CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, ja muiden immuunijärjestelmän tekijät, joilla kliinistä tulosta serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla. Suoritimme immunofluoresenssimenetelmällä ja kvantifiointiin intraepiteliaalisten kasvainta infiltroituneen kolminkertainen positiivinen Tregs (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+) sekä CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD3

+ ja CD8

+ T-solujen kasvain näytteet 52 potilailla, joilla on korkea vaiheessa vakavien munasarjasyöpäpotilailla. Kolmekymmentä-yksi potilaista oli hyvä selviytyminen (ts 60 kuukautta) ja 21 oli huono selviytyminen 18 kuukautta. Yhteensä solumäärät sekä solusuhteilla verrattiin näistä kahdesta tulos ryhmää. Kokonaismäärät CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD3

+ ja CD8

+ soluja merkitsevää eroa ryhmien välillä. Kuitenkin suurempi osuus CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg, CD8

+ /CD4

+ ja CD8 /CD4

+ CD25

+ FOXP3

– soluja nähtiin hyvä tulos ryhmässä verrattuna potilailla, joilla on huono tulos. Nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että suhteet CD8

+ sekä CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs ja CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-solut liittyvät tautiin lopputulos munasarjasyöpä. Yhdistys on ilmeistä suhteissa kuin absoluuttisia määrä T-solujen viittaa siihen, että efektori /vaimennin suhde voi olla tärkeämpi mittari on tulos kuin yksittäisten solujen määrä. Siten immunoterapia strategioita, jotka muuttavat CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs tai CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-solujen CD8

+ efektori solut voivat olla käyttökelpoisia parannettaessa tulosten munasarjasyöpä.

Citation: Preston CC, Maurer MJ, Öberg aL, Visscher DW, Kalli KR, Hartmann LC, et al. (2013) tunnusluvut CD8

+ T-solujen CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ ja FOXP3

– T-solut korreloivat Poor kliinistä hyötyä Human seroosit munasarjasyöpä. PLoS ONE 8 (11): e80063. doi: 10,1371 /journal.pone.0080063

Editor: Muriel Moser, Université Libre de Bruxelles, Belgia

vastaanotettu: 14 elokuu 2013; Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 14 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Preston et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia KLK, ELG, LCH: P50-CA116201, R01-CA122443, ja P50-CA136393.The rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on korkein kuolleisuus syöpien yksin naisille. Huolimatta monista terapeuttisia ponnisteluista hyödyntämällä uutta chemotherapies, paranemisasteella ei ole parantunut merkittävästi vuosikymmeniin [1-3]. On tunnettua, että kliinisiä tuloksia munasarjasyövän ovat varsin heterogeenisiä eikä helposti ennustaa tavanomaisilla kliinisillä ja patologinen ominaisuudet (esim luokalla kasvainhistologiaa) [4-6]. Tämä viittaa siihen, että voi olla muita kasvaimen mikroympäris- tai isäntä ominaisuuksia, joilla on määräävä asema selviytymistä. Viime vuosina on ollut kiinnostusta ymmärtämään rooli potilaan immuunivasteen hänen munasarjasyöpä, sillä tauti on uskotaan olevan luontaista vastustuskykyä reaktiivinen maligniteetti monimutkaisen tukahduttava verkko, joka tehokkaasti pilaa onnistunut immuunivasteen poistaminen. Kuluneen vuosikymmenen aikana, tutkimukset ovat osoittaneet, että on tärkeää immuunijärjestelmän vaikuttaa potilaiden hoitotuloksiin. Erityisesti Zhang ja työtovereiden julkaissut tutkimuksen, joka osoitti, että suurin osa munasarjasyöpä potilaista oli kasvain infiltroituneen CD3

+ T-soluissa ja että tunkeutumisen positiivisesti pelastautumiskoulutukseen liittyvä [7]. Läsnäolo T-solujen oli erityisen hyödyllinen niille henkilöille, jotka osoittivat täydellistä hoitovastetta kirurgian ja kemoterapia, jossa viiden vuoden eloonjääminen oli 74% verrattuna 12% niitä ilman T-solujen. Myöhemmät tutkimukset ovat puhdistettu ymmärrystämme sisäisen kasvaimen T-soluja, kuten työn Sato et al., Joka osoitti potilailla, joilla oli korkea infiltroivien sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL), oli keskimääräinen eloonjäämisaika on 55 kuukautta verrattuna niihin, joilla on vähän tai no CTL joka oli selviytymisen 26 kuukauden [8]. Ainutlaatuinen piirre tavanomaisen hoitostrategioita munasarjasyövän on, että T-solu-toiminto nopeasti talteen seuraavia tavanomaisia ​​kemoterapia [9]. Antigeenit, joihin potilaat ovat luonnollisesti vastaamisen parhaillaan tutkittu järjestelmällisesti [10,11]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että kasvaimen vastaisen immuniteetin esiin vastaan ​​munasarjojen syöpien ja vaikutusten kliininen taudinkulku. Kuitenkin, nyt on selvää, että anti-kasvain immuniteetin vastapainotrukki jota immunosuppressoivilla mikroympäristön [7,12-15].

Yksi solu tekijöitä, jotka voivat välittää tämän immuunisuppressiota kasvaimen mikroympäristössä on sääntelyn T-solu (Treg) väestöstä. Tutkimus Tregs on edennyt nopeasti, etenkin yhteydessä syöpään. Tregs ovat heterogeeninen CD4

+ T-solu alaryhmästä, jonka ensisijainen tehtävä on immuuni asetus estämällä toiminnon aktivoitujen T-solujen. CD4

+ Tregs voidaan jakaa kahteen subsets: luonnossa esiintyvä Tregs joiden CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ fenotyyppiä ja indusoi Tregs jossa on muuttuva CD25 ilme [12]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että forkhead laatikko P3 (FOXP3) on keskeinen transkriptiotekijä, joka säätelee kehitystä ja toimintaa CD4

+ Tregs [16,17]. Lisäksi tutkimukset ovat myös osoittaneet, että ilmaus CD25, osa korkean affiniteetin IL-2-reseptori, on välttämätöntä Treg selviytyminen, joka on erittäin riippuvainen IL-2 [18,19]. Viime vuosikymmenen aikana on ollut useita tutkimuksia yhdistää Tregs pelastautumiskoulutukseen monissa syöpien riskiä. Munasarjasyövän, Curiel ja työtovereiden aluksi osoitti vahvan yhteyden CD4

+ CD25

+ T-soluja, joilla on heikko säilymisen [14]. Huomattavaa on, että erityinen rooli kolmen värjättyä CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ T-soluja ei ole arvioitu. Muutamaa vuotta myöhemmin, Sato ja työtovereiden eivät näe mitään suoraa yhteyttä CD25

+ FOXP3

+ T-solujen munasarjasyöpä, mutta se osoitti, että alhainen CD8

+ T-solujen määrässä ja CD8

+ /CD25

+ FOXP3

+ T-solu-suhde oli yhteydessä heikompaan selviytymistä, jälleen populaatiossa vaihtelevalla histologialtaan [8]. Vielä tuoreemmassa tutkimuksessa, Milne ja kollegat osoittivat, korkea laatu vakavien munasarjasyövän, että lasken intraepiteliaalisten solujen yksittäin värjätään FOXP3

+ liittyi parantunut eloonjääminen [20]. Kuitenkin, niiden tutkimus ei erikseen määritellä solutyypin ilmentävien FOXP3. Koska muut solut lisäksi T-solut ilmentävät FOXP3 (esim kasvainsolut ja B-solut), merkitystä, että työ, vaikka mielenkiintoisia, jää epäselväksi [21,22]. Lisäksi koska molemmat CD8

+ ja CD4

+, sääntely- ja

in vitro

aktivoitu T-solujen tiedetään ilmaista FOXP3, erityinen identiteetti solutyypin mukana muuttamalla selviytyminen on tuntematon. Kuitenkin viime aikoina, Kryczek ja kollegat osoittivat, että ensisijainen kasvaimia tai autoimmuunisairaus vaurioita, FOXP3 ja CD25 on erittäin spesifinen ja luotettava merkki asettaa ensisijaisen ihmisen CD4

+ Tregs [23].

pääpaino meidän oli tutkia yhdistyksen kasvaimen soluttautua CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs ja muut T-solujen kliinistä tulosta epiteelin munasarjasyöpä potilaille, koska tämä lähestymistapa kolminkertainen värjäystä ei ole tehty ovarioiden parhaan tietomme. Erityisesti olemme tutkineet ainutlaatuinen kohortin rajoittaa potilaisiin, joiden pitkälle vakavien munasarjasyöpä (yleisin ja kaikkein vaarallisin histologia), muodostuu kahdesta potilailla, joiden hyvin erilaisia ​​kliinisiä tuloksia, yksi erittäin huono selviytyminen ( 18 kk) ja toinen potilaita, joilla on paljon parempi eloonjäämisen ( 60 kuukautta).

Materiaalit ja menetelmät

potilaiden ja kliinisiä tekijöitä

tutkimus hyväksyttiin Mayo Clinic Institutional Review Board ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen tutkimukseen yksilöiden käyttämistä. Virrankulutus- tehtiin kautta simulointi arvioida määrää tarvittavat näytteet havaitsemiseksi mielekästä selviytymisen ero munasarjasyöpäpotilaalle. Viisikymmentä kaksi potilasta, valitaan erilaisia ​​tulos ryhmistä, joilla on heikko tulos ( 18 kuukautta selviytyminen) ja hyvä tulos ( 60 kuukautta selviytyminen), edellyttäen 82,5% teholla alfa on 0,05 havaitsemaan kokonaiselinajan riskisuhde oli 1,65 välisen dikotominen CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg ryhmittymien kaikissa munasarjasyöpä potilaille. Tämä tarkoittaa vähintään 80% teholla havaitsemaan vaikutuksen koko (muutos määrä tai CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs) 0,8 arvioitaessa Tregs välillä erilaisia ​​tulos ryhmien kehno tulos (

n

= 21) ja hyvä tulos (

n

= 31), jossa on Kruskall Wallace testi, koska tehty tässä tutkimuksessa. Kaikki näytteet valitaan potilaita, joilla optimaalisesti rajatusta, korkea vaiheessa vakavien munasarja-, munanjohtimen tai ensisijainen vatsakalvon syöpä.

Värjäys ja immunofluoresenssianalyysillä kudosnäytteiden

Kaikki jäädytettyjen yksilö lohkot, aikaisemmin upotettu Tissue-Tek (MMA Sakura Finetek, Torrance, CA), olivat cryosectioned (5pm), kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan, ilmakuivattiin 1 tunti ja säilytä -80 ° C: ssa käyttöön asti. Ennen värjäystä, kaikki levyt blokattiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (25 ° C) seerumittomalla proteiini lohkon (Dako, Carpinteria, CA) ja pestiin sitten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Värjäys suoritettiin inkuboimalla dioja huoneenlämmössä (25 ° C) kosteissa pimeässä kammioissa 2 tuntia ensisijainen vasta laimennettuna vasta-laimentimeen reagenssia (Dako, Carpinteria, CA). Kanin polyklonaalista anti-ihmisen FOXP3 (Abcam, Cambridge, MA) käytettiin laimennoksena 1:75, hiiren monoklonaalinen anti-ihmisen CD4 (Abcam, Cambridge, MA) 1: 100, rotan monoklonaalinen anti-ihmisen CD25 (Abd Serotec, Raleigh, NC) 1: 100, hiiren monoklonaalinen anti-humaani CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA) 1: 100, ja hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-CD3 (BD ​​Pharmingen, San Diego, CA) 1:50. Seuraavat värjäys primaarisilla vasta-aineilla, objektilasit pestiin sitten 15 minuutin ajan PBS: llä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan kosteassa pimeässä kammiossa sekundaarisia vasta-aineita (Alexa fluor 405, 488 ja 594 on konjugoitu, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY), jonka laimennoksena 1: 500. Vasta-aineet FOXP3, CD4 ja CD25 käytettiin kolminkertainen värjäykseen Tregs taas vasta-CD3 ja CD8 käytettiin yhtenä tahroja. Yksin värjätään solut myös vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, 100 ng /ml) 30 minuuttia. Ihmisen nielurisakudoksessa käytettiin positiivisena kontrollina ja negatiivisia kontrolleja tehtiin jättämällä pois primaarinen vasta-aine ja käyttämällä isotyyppikontrolleja kullekin vasta-aineelle.

Konfokaalimikroskopia ja solujen kvantifiointi

Värjätyt objektilasit arvioitiin käytettäessä LSM 510 konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Oberkochen, Saksa). Epiteelinsisäisen värjätyt solut arvioitiin suuritehoisen suurennus skannattu aloilla satunnainen epiteelin kohdat välttämällä strooman alueilla. Skannattu kentät olivat toisistaan ​​päällekkäisyyksien välttämiseksi ja valkaisun sekä kattamaan koko kasvain osassa. Kaksikymmentä satunnainen kentät (300 um

2) on digitaalisesti valokuvattiin kullekin potilaalle näytteestä. Kvantifiointi positiivisten solujen suoritettiin manuaalisesti tarkkailijat sokeita kaikkien kliinisten tietojen. Osajoukko satunnaisesti valittua näytettä tarkistaa toissijainen tarkkailija. Kokonaismäärät solujen kunkin kentän kirjattiin joko triple värjätään (CD4, CD25 ja FOXP3) tai yhden värjättyä (CD8 tai CD3) näytteitä.

Kun kasvainnäytteestä tutkittiin karkeasti alla konfokaalimikroskopia, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä havaittiin sekä strooman ja epiteelin. Siten huolellinen huomiota kiinnitettiin vahvistamisesta laskenta kentät yksinomaan epiteelin alueilla. Seuraavat solut määrällisesti kolminkertainen värjättyä näytteitä ja käyttää analyysissä: CD4

+ CD25

+ FOXP3

+, CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD4

+ CD25

-FOXP3

-, CD4

+ CD25

-FOXP3

+, CD4

-CD25

+ FOXP3

+, CD8

+ DAPI

+ ja CD3

+ DAPI

+. Epiteelinsisäisen kasvain soluttautuminen Tregs määriteltiin CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ soluja, joilla CD4 (punainen merkkivalo) ja CD25 (vihreä signaali) tahrat havaittiin sytosolin ja kalvon alueille antaa oranssi ja /tai keltainen kuvio ja FOXP3 (sininen signaali) havaitaan sisäinen ydin- ja tyypillisesti pilkullinen tahra kuvio. Ensisijainen arviointi CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg kvantifiointiin oli koko Treg laskea kaikissa 20 kuvia kasvaimesta näytteestä. Tämä tehtiin päinvastoin kuin aikaisemmissa tutkimuksissa, jotka yleensä määrällisesti Tregs käyttäen käyttäjäystävällinen tunnistettu painopistealueista tunkeutuminen [8,14]. Testasimme ovatko nämä aikaisemmat menettelyt myös käyttämällä toisen asteen mittauksia kunkin kasvaimen, eli korkein yksittäinen kuva count kasvaimesta näytteestä (max1) ja summa kolmen suurimman laskee kasvaimesta näytteestä (MAX3).

Kasvain infiltroituneen lymfosyyttien eristäminen

lisätutkimuksia, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) kerättiin kuudesta munasarjojen kasvaimia ja eristettiin epäjatkuvalla Ficoll-gradientilla, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, lymfosyytit erotettiin kasvainsoluja sentrifugoimalla solususpensio on kaksi kerrosta Ficoll-gradientilla, 100% kerroksen pohjalle ja 75% kerroksen päälle. Eristetty TIL värjättiin sitten virtaussytometrianalyysiä, kuten alla on kuvattu.

Virtaussytometria

solun pinnalla ja solunsisäinen markkeri värjäys suoritettiin eristetyissä TIL (1 x 10

6), kuten on kuvattu aiemmin [25]. Kaksi koesarjaa suoritettiin; ensimmäisen sarjan un stimuloiduista värjättiin seuraavilla konjugoiduilla vasta-aineilla: CD3-PE-Cy7, CD4-Pacific Blue, CD8-Alexa Fluor 700, CD1c-APC, BDCA2-FITC ja CD68-PerCP-Cy5.5. Toisessa, asetamme värjätään un stimuloiman ja stimuloitujen solujen CD4-Tyynenmeren sininen, CD25-PE, FOXP3-Alexa Fluor 647 ja TGF-β-PE-Cy7. Ennen värjäystä TIL stimuloitiin inkuboimalla 5 ug /ml konkanavaliini A (Con-A, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ja 0.7μl /ml BD GolgiStop ™ (BD Bioscience, San Jose, CA) 8 tunnin ajan, sitten pestiin, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin (PBS, jossa 1 mM /l EDTA: a ja 3% naudan seerumin albumiinia). FOXP3 ja sytokiinien värjäys suoritettiin valmistajan solunsisäinen värjäysmenettelyä (eBioscience, San Diego, CA). Tarvittaessa isotyypin vasta-aineita käytettiin kontrolleina. Kaikki vasta-aineet hankittiin BD Bioscience (San Jose, CA) lukuun ottamatta seuraavia aineita: TGF-β-PE-Cy7 ja CD3-PE-Cy7 olivat eBioscience (San Diego, CA), BDCA2-FITC Miltenyiltä Biotec (Auburn , CA) ja CD68-PerCP-Cy5.5 hankittiin BioLegend (San Diego, CA). Näytteet ajettiin FACS Scan II ja analysoitiin käyttäen FlowJo 10.0.5.

Tietojen analysointi

jakaumat CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg laskee potilaiden välillä on hyvä ja huono tulos tutkittiin graafisesti ja verrattiin käyttäen Wilcoxonin-sum testejä (Mann-Whitney

U

testi). Tunnusluvut laskettiin määrä CD8

+ solujen määrä jaettuna CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs tietylle potilaalle. Solulaskennat voidaan tiivistää mediaani ja kvartiiliväli (IQR). Pareittain vertailut virtaussytometrialla tietojen pariksi Studentin t-testiä käytettiin. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p-arvo ≤ 0,05.

Tulokset

Clinical potilasryhmät

Viisikymmentä kaksi kasvainnäytteestä täyttävät tutkimuskriteeri valittiin kudospankille. Potilaiden ominaisuudet on koottu taulukkoon 1. Potilaiden mediaani-ikä tutkimuksessa oli 65 vuotta (vaihteluväli, 37-86 vuotta). Kaikki potilaat diagnosoitiin pitkälle (71% vaiheessa III, 29% vaihe IV) tauti, olivat optimaalisesti rajatusta, ja oli kasvaimista vakavasta morfologia. Eloonjäämismediaani köyhien tulos ryhmässä oli 12,4 kuukautta (vaihteluväli 3,0-16,7) ja mediaani eloonjäämisen hyvään lopputulokseen ryhmä ei ole vielä päästy 73,8 kuukautta seuranta-ajan mediaani (vaihteluväli 60,1-116,8).

Hyvä tulos

Huono tulos

(

n

= 31) (

n

= 21) P-valueAge at DiagnosisMedian62.069.00.0059Range (37,0-80,0) (50,0-86,0) StageIII23 (74,2%) 14 (66,7%) 0.56IV8 (25,8%) 7 (33,3%) GradeLow3 (9,7%) 0 (0,0%) 0.20High28 (90,3%) 21 (100 %) Vital StatusAlive24 (77,4%) 0 (0,0%) NADead7 (22,6%) 21 (100,0%), ensimmäinen rivi ChemotherapyPlatinum2 (6,5%) 1 (4,8%) 0.20Platinum ja Taxane27 (87,1%) 15 (71,4%) Other2 (6,5%) 5 (23,8%) Taulukko 1. Potilastiedot.

Hyvä tulos 60 kuukautta selviytyminen, huono tulos 18 kuukautta selviytymisen; kaikki tapaukset olivat serous syöpiä ja optimaalisesti cytoreduced. CSV Lataa CSV

leimaus intraepiteliaalisten kasvainta infiltroituneen T-solujen

intraepiteliaalista infiltroituvat solut (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, CD4

+, CD8

+, CD3

+, CD4

+ CD25

+ FOXP3

– ja CD4

+ CD25

-FOXP3

+) kvantitoitiin ja analysoida kaikilla aloilla. Edustavia skannattu kentät kasvaimen soluttautua otaksuttu CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs sekä CD4

+ CD25

+ FOXP3

– esitetään kuviossa 1A. Kuvio 1B esittää edustaja CD8

+ ja CD3

+ T-solujen tunkeutuminen. Analyysi paljasti vaatimaton, mutta tilastollisesti merkitsevä lineaarinen korrelaatio laskee CD3

+ T-solujen ja CD4

+ tai CD8

+ T-solut (kuvio 1 C).

(A) Kuva CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs munasarjojen kasvain näytteissä. Ylhäällä vasemmalla paneeli esittää CD4 lauseke (punainen merkkivalo), ylhäällä oikealla paneeli näyttää CD25 ilmaisu (vihreä signaali), alhaalla vasemmalla paneelissa näkyy FOXP3 lauseke (sininen signaali) ja alhaalla oikealla paneeli esittää yhdistetyt signaalit osoittavat nuolet kolminkertaistaa värjätään CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs. Tässä kuvassa Tregs nähdään kiinteässä yhteydessä CD4

+ CD25

+ FOXP3

– soluja. (B) Kuva intraepiteliaalisten soluttautua CD8

+ sytotoksisten T-solujen (vasen paneeli) ja CD3

+ lymfosyyttien (oikea paneeli) in munasarjasyöpä. Tämä edustaja scan näyttää CD8 ja CD3 ilmaisun (punainen signaali = CD8 tai CD3, sininen signaali = DAPI) munasarjojen kasvain massa. (C) Korrelaatio juoni vertaamalla CD3 laskee joko CD8 (täytetyt symbolit) ja CD4-solujen määrä (avoimet symbolit). Symbolit edustavat summa 20 kentät lasketaan ainutlaatuinen potilaalle. Kaikki potilaat ovat edustettuina. Insertti linjat ovat tuotteen lineaarisen regressioanalyysin. (D) Näyttää yleinen keskiarvo (± SEM,

n

= 52) CD3

+, CD4

+ ja CD8

+ T-solujen määrä on (summa 20 kentät) kaikille potilailla. (E) Korrelaatio juoni verrataan koko Treg (ts CD4

+ CD25

+ Foxp3

+) laskee summaan maksimi 3 (MAX3) kentät tai maksimaalinen kentän count (max1). Symbolit edustavat summa 20 kentät lasketaan ainutlaatuinen potilaalle. Kaikki potilaat ovat edustettuina. Insertti linjat ovat neliösumman regressiolinjoja.

Koska ennen Tutkimuksissa tarkasteltiin ja lueteltu ei-satunnainen T-solu rikastettu aloilla, tutkimme onko tämä lähestymistapa arvioimalla korrelaatio koko CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg count kaikilla 20 kentät ja max1 ja MAX3 laskee. Kuten kuviossa 1D oli erittäin vahva tilastollisesti merkitseviä korrelaatioita, mikä viittaa siihen, että ennen lähestymistapoja luetellaan soluttautua T-solut ovat pääosin voimassa.

T-solujen määrässä ei suoraan korreloi kliinisten tutkimusten tulosten ihmisen serous munasarjasyövän

Ensimmäinen kohdennettiin korrelaation valkosolujen lopputulokseen ryhmiä. Toisin kuin ennen työn intraepiteliaalisten CD3

+ T-soluja ei havaittu merkittävästi eri tasoilla, jos potilaalla on hyvä tulos (mediaani 154 soluja (summa 20 kentät), IQR 89-297) verrattuna potilaisiin, joilla on huono tulos (mediaani 179, IQR 73-333, taulukko 2). Samoin määrät soluttautua CD4

+ (370, IQR 249-461 hyvässä ryhmässä vs. 377, IQR 264-524 köyhissä ryhmässä) ja CD8

+ T-soluja (115, IQR 53-180 hyvässä ryhmässä vs. 48, IQR 17-180 köyhissä ryhmässä) eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä hyvän ja huonon lopputuloksen ryhmiä.

Hyvä tulos (n = 31) B Huono tulos (n = 21)

Mediaani

IQR

Mediaani

IQR

P- arvo

Cell Counts

1CD3

+15489-29717973-3330.881CD4

+370249-461377264-5240.514CD8

+11553-1804817-1800.271CD4

+CD25

+FOXP3

+10155-16110992-1460.444CD4

+CD25

+FOXP3

-14890-187147105-2310.251Ratios

2CD8

+/CD3

+0.580.34-0.910.430.20-0.700.198CD4

+/CD3

+2.061.33-3.431.731.32-3.670.985CD8

+/CD4

+0.270.20-0.440.130.07-0.370.050CD3

+/CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 1.720.95-2.681.380.79-2.490.695CD3

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-1.310.71- 2.061.240.72-1.640.490CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 0.980.49-1.790.320.25-1.020.027CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-0.650.43-1.190.460.13-0.770.048CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 2.912.59-4.313.042.39-3.460.332CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-2.501.94-3.192.161.80-2.640.351Table 2. Vertailua T-solujen tasot tai suhteet.

1Sum solun laskennat kaikki 20 kentät,

2Ratio summasta kaikkien 20 aloilla; IQR, kvartiiliväli; tilastollisesti merkittäviä muutoksia on lihavoitu. CSV Lataa CSV

käyttäminen CD25 ja FOXP3 markkereita, CD4

+ T-solut voidaan jakaa neljään ryhmään. Kaksi suurta ryhmää olivat CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs (~ 33,2% kaikkien potilaiden) ja CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-solut (~ 43.1 %). Kaksi muuta pienet ryhmät olivat CD4

+ CD25

-FOXP3

+ T-solut (~ 14,4%) ja CD4

+ CD25

-FOXP3

– T-soluja (~ 9,3 %). Näimme eroa tasojen CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-solut välillä potilaiden hoitotuloksiin ryhmiä. Mediaani tasot olivat 148 soluja (IQR 90-187) hyvään lopputulokseen ryhmä ja 147 (IQR 105-231) köyhien tulos ryhmässä (taulukko 2). Samoin mediaani laskee CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs potilailla, joilla on hyvä tulos ei ollut erilainen verrattuna potilailla, joilla on huono tulos. Kaikki kasvain näytteet osoittivat CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg tunkeutuminen jossa yhdistetty erilaisia ​​14-350 soluja. Prosenttiosuus CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs joukossa koko intraepiteliaalisten CD4

+ infiltroituvat solut oli 31 ± 10% hyvään lopputulokseen ryhmässä verrattuna 34 ± 11% huono tulos potilasryhmälle (p = 0,319).

Yksi merkittävä havainto näistä vertailuissa on, että CD4

+ T-solujen määrässä oli korkeampi kuin CD3

+ laskee kun vastaavuutta odotettiin. (Kuviot 2A). Yksi mahdollinen syy korrelaation puuttuminen voisi olla, että CD4- ja CD8-vasta-aineita värjäys molempia lymfoidi- ja myeloidisoluissa, koska se on aiemmin raportoitu, että sekä markkereita voidaan ilmentää eri leukosyyttien subsets, mukaan lukien imukudos- ja myelooinen. Vaihtoehtoisesti CD3 voitaisiin säädellä vähentävästi T-solujen johtuu kroonisesta stimulaation kasvaimen mikroympäristössä [26,27]. Ottaen huomioon nämä asiat, me puhdistettu kasvainta infiltroivia mononukleaarisia soluja kolmesta munasarjasyöpäpotilaalle, värjättiin ne eri lymfoidi- ja myelooinen merkkejä ja suorittaa virtaussytometrianalyysin. Värjäys paljasti, että 26 ± 3% (n = 3, SEM) ja 34 ± 4% CD4

+ ja CD8

+ solut, ovat vastaavasti CD3 negatiivinen (kuviot 2B-C). Analyysi CD11 c

+, BDCA2

+ ja CD68

+ soluja, viittaa siihen, että myeloidinen DC, -DC ja makrofagit yhdessä muodostavat yhteensä alle 5% kunkin CD4

+ ja CD8

+ solujen munasarjojen kasvaimia (kuviot 2D-G).

(AB) Bar kaavioita keskiarvo (± SEM,

n

= 3) tasoja CD3-CD4

+ tai CD8

+, vastaavasti prosentteina kokonaismäärästä CD4

+ tai CD8

+ T-soluja, vastaavasti. (C) esitetty 4 edustavia kaksivärinen piste tontteja värjäystä joko CD4- tai CD8-aidatulla soluissa. Vasta-erityispiirteet on merkitty akselin kanssa. (D) Näkyy ovat keskiarvo (± SEM,

n

= 3) tasot CD11 c

+, BDCA2

+ ja CD68

+ soluja yhteensä CD4

+ tai CD8

+ soluja (X-akseli).

T-solujen suhdeluvut korreloi kliinisten tutkimusten tulosten ihmisen serous munasarjasyövän

näkeminen ei assosiaatioita absoluuttisten määrien CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs ja kliinisistä tuloksista, keskityimme suhdelukuja oli aiemmin kuvattu [8,28]. Mediaani CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg suhde havaittiin merkitsevästi suurempi potilailla, joilla hyvään tulokseen verrattuna potilailla, joilla on huono tulos (0,98 vs. 0,32, p = 0,027 , taulukko 2, kuvio 3A). Sen sijaan mediaani CD3

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg ja CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg suhteet eivät olleet merkittävästi erilaiset ryhmien kesken. Kun lisätutkimuksia, yllättäen myös havaittu, että hyvä tulos potilailla oli keskimäärin CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

– suhde, joka oli merkitsevästi korkeampi hyvä ryhmä (0,65) kuin verrattuna köyhien ryhmään (0,46, p = 0,048) (taulukko 2, kuvio 3B). Kun CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg ja CD4

+ CD25

+ FOXP3

– osuutta tarkasteltiin yhdessä (eli kaikki CD4

+ CD25

+) ja kuten on esitetty kuviossa 3C, suhteet ryhmien välillä pysyivät huomattavan erilaiset. Kuten ikä havaittiin olevan hieman erilainen ryhmien välillä, me varmistanut, että assosiaatiota solumäärät ja ryhmä säilyi johdonmukainen säätämisen jälkeen ikä on logistinen regressiomalli (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Ympyräkaavio esittää jakelu CD4

+ T-solujen suhteen CD25 ja FOXP3 värjäytymistä kaikilla potilailla. (BD) Scatter dot ploteista suhteiden CD8

+ T-solujen määrä on sen Tregs (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+) (B), CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-soluja (C), tai yhdistää CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ ja CD4

+ CD25

+ FOXP3

– T-soluja (D) sekä hyvän tuloksen ja huono lopputulos ryhmiä.

verrattaessa suhteet lasketaan kolmen suuren tahrat (CD3, CD4, ja CD8), vain mediaani CD8

+ /CD4

+ T-solu-suhteilla, jotka olivat 0,27 ja 0,13 vastaavasti, että hyvän ja huonon lopputuloksen ryhmät, olivat tilastollinen merkitsevästi erilainen (p = 0,050), mikä on sopusoinnussa merkittävä suhde CD8

+ T-solujen joko CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs tai CD4

+ CD25

+ FOXP3

– edellä kuvatulla tavalla. Mikään muu suhteet (esim CD8

+ /CD3

+ T-solujen ja CD4

+ /CD3

+ T-solu-suhteet) vaihteli huomattavasti hyvän ja huonon lopputuloksen ryhmissä (taulukko 2).

Lopuksi näki, että molemmat FOXP3

+ ja FOXP3

– CD4

+ T-solut, jotka liittyvät tuloksen kun tarkastellaan suhteessa CD8

+ T-solut, me spekuloi että nämä solut olivat Tregs kykenevät tuottamaan immuunijärjestelmän sääntely sytokiinin, TGF-β. Tämän testaamiseksi me puhdistettua kasvaimeen cross- (TIL) ja stimuloi sitten suoraan

ex vivo

kanssa ConA, jonka jälkeen solunsisäisen sytokiinin värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa 4A, TIL peräisin CD4

+ CD25

+ T-solut olivat seos FOXP3

+ ja FOXP3

– T-soluja. Ilman stimulaatiota, joka on murto-osa (12 ± 4%, n = 3, ± SEM) puhdistettua T-solujen yllä ilmentymisen FOXP3. Kun stimulaatio, prosenttiosuus CD4

+ CD25

+ T-solut, jotka ilmentävät FOXP3 kasvoi 42 ± 9% koko CD4

+ CD25

+ T-soluja. Ilman stimulaatiota, 5 ± 3% CD4

+ CD25

+ T-solut tuottivat TGF-β ja stimulaation jälkeen, tämä nousi 34 ± 9% (p = 0,04, kuvio 4B).

(A) Näytössä on kolme pistettä tontteja puhdistettua kasvainta infiltroituneen CD4

+ T-soluja stimuloidaan ConA tai median yksin. Solut aidatulla CD4 ja CD25. (B) Pylväskaaviot osoittaa keskiarvoa (± SEM,

n

= 3 ainutlaatuinen potilaan näytettä) prosenttiosuus FoxP3

+ ja TGF-β-T-solujen joukossa koko CD4

+ CD25

+ T-solut stimuloidaan joko ConA tai median yksin. P-arvo, joka on saatu pariksi Studentin T-testi.

Keskustelu

Ymmärtäminen patologinen rooli Tregs, joilla on kyky tukahduttaa aktivoidut T-solut munasarjasyöpä mikroympäristö on tärkeä kehittää uusi immuuni-pohjainen hoitojen ja määritetään potilaan ennustetta. Tässä tutkimuksessa, löysimme ensimmäistä kertaa, että CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs liittyy tulokseen erityisesti vakavien munasarjasyövän vaan ainoastaan ​​yhteydessä CD8

+ T-solut . Se, että vaikutus Tregs on havaittavissa vain silloin, kun arvioidaan suhteessa sytotoksisten CD8

+ T-solujen on yhdenmukainen malli, joka mahdollisesti tuhoisia kasvain-immuunivasteita vastapainona ovat kasvaimen mikroympäristössä vahva immunosuppressiota [29] . Tämä viittaisi siihen, että strategiat, joilla pyritään ehtyminen Tregs ja samanaikainen rokote stimulointi T-soluja olisi tehokkaita poistamaan munasarjojen syöpien ja parantavan eloonjäämistä [30]. Useat lääkkeet, joiden tiedetään olevan käyttökelpoisia Treg heikentävien aineiden, kuten syklofosfamidi, anti-CD25-vasta-aine, tai denileukiini diftitoksi ovat käytettävissä yhdistelmähoito uuden rokotteen tai otto- T-solujen hoidon lähestymistavat [31,32]. Vaihtoehtoisesti Quezada ja työtovereiden osoittavat, että tarkastuspiste anti-CTLA-4-esto yhdessä rokotteen hoito voisi myös olla tehokkaita muuttaa tasapainoa poistamatta Tregs, mikä viittaa mahdollisen käyttö äskettäin hyväksytty anti-ihmisen CTLA-4-vasta-aineen munasarjasyöpä [ ,,,0],33,34].

ex vivo

kokeet osoittivat, että vain pieni osa ei-stimuloitujen CD4

+ CD25

+ T-solut säilytetään FOXP3 ilmaisua, joka myöhemmin kasvoi upon aktivointi. Tämä harvemmin FOXP3

+ T-soluja, suhteessa immunofluoresenssivärjäyksen tuloksia, voi heijastaa alas säätely FOXP3, sopusoinnussa havaintojen ihmisen FOXP3 ilmentymistä säätelee T-solujen aktivaation eikä kehitysvammaisten ohjelmoida se on hiiren Tregs [ ,,,0],35]. Näin ollen ilmaus FOXP3 T aktivaation jälkeen on aiheuttanut ristiriitoja siitä, onko FOXP3 on Treg markkeri ihmisillä. Eräät tutkimukset ovat osoittaneet, että FOXP3 ilmentyminen on herätetty aktivoiduissa T-soluissa ilman sääntelytoimien, joka voisi johtaa yksi spekuloida, että jotkut CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ T-solujen munasarjasyöpä ehkä ole sääntelyn. Sen sijaan muut tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivoituneet T-solut, jotka säätää ylös FOXP3 todellakin välittää suppressiivinen aktiivisuus solussa-yhteyttä tai sytokiinin riippuvaisella tavalla (eli IL-10 ja TGF-β) [36,37].