Krooninen sairaus

tiivistelmä

plasmasytooma- variantti translokaatio 1-geeni (

PVT1

) on lncRNA joka on nimetty onkogeenin koska sen panos fenotyypin useiden syöpien. Vaikka mekanismia, jolla

PVT1

vaikutteita tautiprosessit on tutkittu useita syöpätyyppejä, sen rooli kohdunkaulan kasvainten synnyssä on tuntematon. Siten esillä tutkimus suunniteltiin tutkimaan rooliin

PVT1

kohdunkaulan syövän

in vitro

ja

in vivo

.

PVT1

ilmentyminen mitattiin kvantitatiivinen PCR (qPCR) 121 invasiivisen kohdunkaulan karsinooma (ICC) näytteet, 30 normaali kohdunkaula näytteitä, ja kohdunkaulan solulinjat. Funktionaaliset määritykset suoritettiin käyttäen sekä siRNA ja LNA välittämä knockdovvn tutkimaan

PVT1 ’

n vaikutukset kohdunkaulan syövän solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, apoptoosin, ja sisplatiinin vastus. Tuloksemme osoittavat, että

PVT1

ilmentyminen lisääntyy merkittävästi ICC kudoksessa ja normaalissa kohdunkaula ja että korkeampi ilmentyminen

PVT1

korreloi huonompi kokonaiselossaolo. Kohdunkaulan syövän solulinjoissa,

PVT1

Knockdown johti merkittävästi vähentynyt solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion, kun apoptoosin ja sisplatiinia sytotoksisuutta lisääntyivät merkitsevästi näissä soluissa. Lopuksi osoitamme, että

PVT1

ilmentyminen täydennetty vastauksena hypoksia ja immuunivasteen stimulaation ja että tämä lncRNA assosioituu monitoimisen ja stressi-reagoiva proteiini, nukleoliinin. Yhdessä tuloksemme osoittavat vahvaa todistetta onkogeenisessä rooli

PVT1

kohdunkaulan syövän ja lainata käsityksen mahdollisia mekanismeja, joilla

PVT1

yliekspressio auttaa ajamaan kohdunkaulan syövän syntymistä.

Citation : Iden M, Fye S, Li K, Chowdhury T, Ramchandran R, Rader JS (2016) lncRNA

PVT1

Auttaa Kohdunkaulan syövän Fenotyyppikuvaus ja Associates kanssa Poor Patient ennuste. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10,1371 /journal.pone.0156274

Editor: Bibekanand Mallick, National Institute of Technology, Rourkela, Intia

vastaanotettu: 15 elokuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2016 Julkaistu: toukokuu 27, 2016

Copyright: © 2016 Iden et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat naisten terveys -tutkimusohjelma Medical College of Wisconsin (https://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). Rahoittajat ollut mitään roolia missään osassa valmistelua tämän käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Long-koodaavaa RNA: t ( lncRNAs) tarjoavat tärkeitä kohteita syövän diagnostiikassa ja terapeuttisia johtuen niiden kriittinen rooli lukuisissa solun prosesseissa, kuten epigeneettiset muutokset, geeni edistäjä ja kasvaimia estävä aktiivisuus, ja miRNA ionikomplekseja. LncRNAs ovat laajoja genomissa, usein osoittavat solujen tyypille ja ajallinen sääntely geeniekspression, ja voivat vaikuttaa monet solun prosessit useiden eri erillisten mekanismien [1]. Plasmasytooma- variantti translokaatio 1 (

PVT1

) on erittäin konservoitunut lncRNA ~ 50 kb alavirtaan

MYC

joka on herättänyt merkittävää huomiota syöpä kentän ansiosta usein yhteistyössä monistuksen

MYC

useita kiinteitä kasvaimia [2]. Ensimmäiset tutkimukset, jotka osoittavat, että

PVT1

voivat edistää syövän synnyn osoitti usein toiselle siirtäminen hiiren plasmasytoomiin [3,4] ja ihmisen Burkittin lymfoomaa [5-7]. Kasvaimia synnyttävän vaikutukset

PVT1

on edelleen korostettu enemmän tuoreet tutkimukset sen yli-ilmentymisen ja vahvistus useita syöpätyyppejä [8-17]. Vielä tärkeämpää on,

PVT1

ilmentyminen on korreloi merkitsevästi kliinisiä piirteitä, kuten riski, toistuminen, ja selviytymistä erilaisissa syövissä [8,11-13,18].

Huolimatta runsaasti tietoa koskien onkogeeninen ominaisuudet

PVT1

useita syöpiä, hyvin vähän tiedetään sen tarkka biologinen funktio. Itse asiassa muutamat tutkimukset tarjoavat

PVT1

mekanistista tiedot tavattoman viittaavat siihen kykenee sen vaikutukset soluun-tyyppi ja /tai tautikohtaista tavalla. Esimerkiksi

PVT1

toiminto on katsottu johtuvan sen sitoutumisesta ja vakauttamiseen Myc [19] ja Nop2 [17] proteiinien rinta- ja maksasyövän, vastaavasti. Mahalaukun syöpäsoluja,

PVT1

toimii tukahduttaa ilmaisun p15 ja p16 kautta fyysinen vuorovaikutus Polycomb ryhmän proteiini, EZH2 [20]. Myös kautta EZH2 rekrytointi ja sääntely tyreotropiini reseptoriin,

PVT1

indusoi kilpirauhasen syöpäsolut [21]. Lopuksi, laskennallinen analyysi

PVT1

viittaa siihen, että se voi vaikuttaa sitoutumisen ja varastoimalla mir-200 perheenjäsenille rintasyöpäkudosnäytteessä [14]. Koska niiden monimutkaisuuden ja leveys tulosten Näiden tutkimusten korostaa tautikohtaisia ​​tutkimus

PVT1

mekanismeja.

kiinnostusta

PVT1

peräisin työmme ja toisten osoittamalla, että se on usein sivusto HPV integraation kohdunkaulan syövän, edelleen viittaa tärkeä biologinen funktio [22-24]. Niinpä pyrimme paremmin määritellä rooliin

PVT1

kohdunkaulan syövän synnyn tutkimalla

PVT1

ekspressiokuvioita kohdunkaulan syövän kasvaimia ja solulinjojen ja toiminnalliset vaikutukset tämän lncRNA syövän liittyvissä prosesseissa kuten leviämisen, solun liikkuvuus, apoptoosin, ja chemoresistance. Lopuksi, koska monet lncRNAs luottavat proteiinin kumppaneita toteuttamaan niiden vaikutukset, käytimme RNA affiniteettikromatografialla ja massaspektrometriaa sekvensointi valaista kohdunkaulan syövän soluspesifisestä

PVT1

sitoutumispartnereihin.

Methods

tutkimusprotokolla hyväksyi Institutional Review board of Medical College of Wisconsin IRB (PRO00011466; Molecular Characterization of Kohdunkaulan syöpä).

Soluviljely

SiHa (ATCC® HTB35 ™), HeLa (ATCC® CCL2 ™), ja DoTc2 4510 (ATCC® CRL-7920 ™) ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja HPV 16 E6 /E7-transformoitujen, normaali ectocervical solut (Ect1 /E6E7; ATCC® CRL-2614 ™ ) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Kohdunkaulan syövän soluja ylläpidettiin joko Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM, SiHa- ja HeLa) tai Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (MEM; DoTc2), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, ATCC). Ect1 /E6E7 soluja pidettiin Keratinosyyttien-Serum Free väliaineessa (GIBCO), 0,1 ng /ml ihmisen rekombinantti-EGF: ää, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta, ja lisäksi kalsiumkloridia 44,1 mg /l. ATCC todentaa kaikissa solulinjoissa tutkimalla niiden lyhyen tandem-toisto (STR) DNA. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteassa atmosfäärissä 95% ilmaa ja 5% CO

2. Solut kerättiin käyttämällä trypsiini-EDTA (0,25% trypsiiniä, 0,53 mM EDTA, ATCC) ja laskettiin käyttäen trypaanisineä 0,4% Solution (Amresco, Solon, OH) ja hemasytometriä laskenta kammio. Joitakin kokeita, sisplatiinia (1 mM; Sigma, St. Louis, MO) liuotetaan tislattuun veteen ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Solut altistettiin sisplatiinia 10 uM, 50 uM ja 100 uM elatusaineeseen 4 h elatusaineissa. Sisplatiini sisältävä kasvatusliuos poistettiin ja korvattiin tuoreella kasvualustojen 4 tuntia myöhemmin ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Kokeita varten tutkimalla

PVT1

ilmaisua seuraava hypoksia ja immuunivasteen stimulaatio, SiHa soluja vastaavasti käsiteltiin kobolttikloridia (150 uM, Sigma) tai interferoni alfa (IFN-α, 10 uM, Sigma) 48 tuntia ennen RNA (ao). Lopuksi muut SiHa soluja käsiteltiin sykloheksamidin (10 uM, Sigma) eri ajankohtina ennen kuin sille hajoamiseen varten Myc Western blottauksella.

transfektoinneilla

Solut (2,0 x 10

5) solut maljattiin 6-kuoppaisille astia ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten solut transfektoidaan 2 Sirna (siRNA) suunniteltu vastaan ​​

PVT1

yhdistetty ekvimolaarisessa suhde (20 tai 40 nM, FlexiTube Hs_PVT1_5 ja Hs_PVT1_6, Qiagen, Valencia, CA) tai negatiivinen kontrolli siRNA (AllStar Negative Control; Qiagen) konjugoituna Alexa Fluor 488. Transfektiot suoritettiin käyttäen DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) kohti valmistajan ohjeiden. Transfektiotehokkuutta seurattiin fluoresenssimikroskopialla ja vahvisti kautta kvantitatiivinen PCR (qPCR) 48 h transfektion jälkeen. siRNA transfektiot suoritettiin sekä SiHa- ja HeLa kohdunkaulan solulinjoissa ja käyttää leviämisen, apoptoosin ja solukuoleman, ja muuttoliike ja invaasion määrityksissä.

lukittu nukleiinihappo (LNA) oligonukleotidi transfektioiden soluja (2,0 x 10

5) maljattiin 6-kuoppaisille astia ja seuraavana päivänä transfektoitiin 10 nM PVT1_10 tai PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, MA) tai sekoitettua kontrollipeptidiä LNA (negatiivinen kontrolli A, Exiqon) käyttäen DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) konsentraationa 0,2 ui 100 ul: ssa elatusainetta. Sekvenssit PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA ja negatiivinen kontrolli A ovat 5′-AACACGTCTATACGC-3 ’, 5′-AGATCACTGTAAATCC-3′ ja 5’-GGCAGGATCTATGGCA-3 ’, vastaavasti. Transfektointiväliainetta korvattiin tuoreella kasvualustojen 24 h transfektion jälkeen ja loppupään, jotka suoritettiin 48 tuntia myöhemmin. LNA-transfektoidut SiHa soluja käytetään vahvistamaan vaikutusten siRNA transfektion soluproliferaatioon, määrittämiseksi vaikutusten

PVT1

Knockdown sisplatiinilla reagointikykyä, Myc hajoaminen kokeita, ja vaikutukset nukleoliinin riippuvan mRNA ilmaisua.

RNA: n eristys, cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

RNA eristettiin käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX) ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä suuren kapasiteetin RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Joitakin kokeita, elävät viljellyt solut pestiin 1 x PBS: llä ja erotettiin sytoplasman ja ydinvoiman RNA osia käyttämällä ionisia pesuaineita jälkeen PARIS kit ohjeet (Life Technologies). RNA eristettiin kustakin osasta ja DNaasi käsiteltiin käyttäen DNA-free-Kit (Life Technologies). Expression of

PVT1

,

MYC

ja ohjaus

RPS18

arvioitiin käyttäen EvaGreen qPCR Mastermix (MidSci, St. Louis, MO) on StepOnePlus Real-Time PCR System ( Life Technologies). Lämpötilasyklit ohjelmaan sisältyi ensimmäisen entsyymin aktivointi vaiheessa 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä, joka koostuu 10 sekunnin denaturointivaihe 95 ° C: ssa, ja 1 min pariutumis /pidennys-vaihe 60 ° C: ssa kaikkien alukkeiden. Fluoresenssin voimakkuus mitattiin 62 ° C lopussa kunkin syklin. Forward- ja reverse-alukkeet

PVT1

olivat 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 ’ja 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3′, 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ’ja 5′-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ ja

MYC

, ja 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ’varten

RPS18

(tietojen normalisointi) .s varten

PVT1

olivat 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3′ ja 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 ’ , 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ’ja 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ varten

MYC

, ja 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ’varten

RPS18

(tietojen normalisointi).

Expression of miRNA suoritettiin käyttäen TaqMan® MicroRNA määritykset (Life Technologies) ja HSA-miR-1204 (002872), HSA-miR-1205 (002778), HSA-miR-1206 (002878), HSA-miR-1207 -3P (002826), HSA-miR-1207-5P (241060_mat), HSA-miR-1208 (002880), ja RNU48 (001006; datan normalisointi) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, RNA eristettiin käyttäen Mirvana miRNA eristäminen Kit ja cDNA syntetisoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies), jossa säädetään alukkeita kunkin miRNA. qPCR monistus suoritettiin sitten on StepOnePlus Real-Time PCR System käyttäen valmistajan parametrit. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena käyttäen 2- ΔΔCt menetelmää suhteellisen geeniekspression, ilmoitettuna 2-ΔΔCt.

RNA fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH) ja immunosytokemia

ViewRNA TYPE 6 koetinsarjojen ( Affymetrix, Santa Clara, CA) on suunniteltu vastaan ​​

PVT1

(NR_003367.2) käytettiin havainnollistamaan

PVT1

ilmaisun

in vitro

. Kokeet suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan käyttäen reagensseja annetaan QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay Kit (Affymetrix). Lyhyesti, SiHa-solut ympättiin 12 mm: n pyöreä peitinlaseille ja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin ennen kiinnitettiin 4% formaldehydiä. Sitten solut pestiin 1 x PBS: llä ja inkuboitiin 5 min Pesuaine Ratkaisu läpäiseväksi. Solut pestiin kerran ja inkuboitiin Working proteaasiliuoksesta 25 min. Probes laimennettiin (1: 100) ennen lämmitettiin mittapäät liuotinta ja inkuboitiin solujen kanssa 3 tunnin ajan 40 ° C: ssa. Solut pestiin, hybridisoitiin Working esivahvistimen Mix Solution 30 minuuttia 40 ° C: ssa, pestään uudelleen ja hybridisoitiin Working vahvistin Mix Solution 30 minuuttia 40 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun lisää pesun jälkeen solut hybridisoidaan leimattujen koettimien 30 min 40 ° C: ssa. Tämän inkuboinnin jälkeen peitelasit pestiin, värjättiin DAPI, ja asetettiin lasilevyille. Solut kuvattiin Zeiss LSM510 -konfokaalimikroskoopilla sijaitsevat Lasten Research Institute Imaging Core Medical College of Wisconsin. Kuvat käsiteltiin Adobe Photoshop CS5.1.

co-värjäys nukleoliinin kanssa

PVT1

RNA FISH, immunosytokemia suoritettiin ennen värjäystä DAPI askel edellä. Solut pestiin 3 kertaa PBS: llä + 1% BSA: ta ja 0,1% Tween-20, ja sitten tukossa huoneen lämpötilassa 2 h estopuskurissa (PBS + 10% BSA: ta, 0% normaalia aasi seerumia ja 0,1% Tween-20). Peitinlasit inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa yön estopuskurissa, joka sisältää polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu nukleoliinin (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Cell pestiin jälleen 3 kertaa ja niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa lohkossa, joka sisälsi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta visualisointiin nukleoliinin. Lopullisen pesun jälkeen, peitelaseja asennetaan käyttäen Vectashield mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Medium DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja kuvattiin edellä kuvatulla tavalla.

Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä Cell Proliferation Elisa BrdU (kolorimetrinen) kit (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 48 h transfektion jälkeen, 1,0 x 10

4-solut maljattiin 96-kuoppaisille astia ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja leimataan BrdU: ssa 2 tuntia, kiinteät, ja inkuboitiin anti-BrdU-POD. Sitoutumattoman peroksidaasin konjugaatteja poistettiin pesemällä. Substraattia lisättiin sitten ja absorbanssi-arvot (370 nM-492 nM) mitattiin 15 minuuttia myöhemmin.

PrestoBlue® solunelinkykyisyysmäärityksen myös käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. SiHa-solut transfektoitiin LNA kuten edellä on kuvattu. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle (1,0 x 10

4 solua /kuoppa) ja altistettiin sisplatiinia (Sigma) eri pitoisuuksilla välillä 10-200 uM: ssa 4 tuntia. Sisplatiini kasvatusliuos poistettiin ja korvattiin kasvualustojen jälkeen 4 h altistuksen ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, fluoresenssi mitattiin inkuboinnin jälkeen soluja kanssa PrestoBlue® reagenssi 1 h 37 ° C: ssa.

solukuoleman ja apoptoosin määrityksiä

Solukuolema määritettiin käyttämällä Cell Death Detection ELISA Kit (Hoffmann-La Roche) per valmistus suuntiin. Lyhyesti, 48 h transfektion jälkeen, 0,5 x 10

5-solut kerättiin ja lyysattiin. Cellular nukleosomit sidottiin valmisteltuun ELISA-levylle kautta histoni komponentteja. Anti-DNA-peroksidaasia lisättiin, ja sitoutumattoman peroksidaasin konjugaattien poistettiin pesun. Substraattia lisättiin sitten ja absorbanssi mitattiin 15 minuuttia myöhemmin (405 nM-490 nM). Apoptoosin tunnettu siitä, että mitataan aktiivinen kaspaasi-3 (ng /mg kokosolulysaattia) käyttäen ihmisen kaspaasi-3 (Active) ELISA Kit (Life Technologies, Grand Island, NY). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen solut (1,0 x 10

6) hajotettiin Cell uuttopuskuria (Life Technologies), johon on lisätty proteaasi-inhibiittori Cocktail (Sigma) ja fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (Sigma).

solumigraation ja invaasio määritykset

Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, väliaineessa, joka sisältää seerumia poistettiin ja solut pestiin 1 x PBS: llä viljeltiin sitten 24 h seerumittomassa EMEM. Nälkiinnyttämisjakson mentyä, solut kerättiin käyttäen HyQTase ja päällystetty (1 x 10

5 solua) ja päälle Corning TranswellTM läpäisevä tukee (Corning, Tewksbury, MA). Muuttoliikettä määrityksiä, TranswellTM kalvot tasausta kasvatusväliaineessa 24 tuntia ennen solun kylvö. Invaasiolle määrityksiä, Transwell kalvot päällystettiin Matrigelillä Matrix (Corning, 1: 6 EMEM) ja kuivattiin 6 h 37 ° C: ssa. Soluja viljeltiin ja puuttuessa kemoattraktanttia (EMEM + 20% FBS) ja korjattu 6 h tai 48 tuntia myöhemmin analysoida muuttoliikkeen ja invaasio, vastaavasti. Non-muuttajan solut poistettiin yläpinnasta Transwell kalvon vanupuikolla, kun taas siirtotyöläisten solut kiinnitettiin ja värjättiin Crystal Violet (EMD Millipore, Billerica, MA) ja visualisoidaan /laskettiin valomikroskoopilla.

Western blotting

tuore kohdunkaulan kudoksen tai 3,6 x 10

6 solut pestiin 1 x PBS: lla ja lyysattiin 10 minuuttia jäillä käyttämällä Cell Extraction Buffer (Life Technologies) täydennettynä 1 mM PMSF (Sigma) ja Protease Inhibitor Cocktail (Sigma). Pilkkoutumattomiin solujätteet pelletoitiin sentrifugoimalla 10000 rpm, ja jäljellä oleva lysaatti kvantitoitiin käyttäen Bradford-määritys (Sigma). Lysaattia (20 ug) ajettiin ulos Criterion Tris-HCl polyakryyliamidigeelissä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), siirrettiin PVDF-kalvoille, blokattiin 1 x TBS + 10% rasvatonta kuivamaitoa huoneenlämpötilassa 1 h, ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (Myc tai nukleoliinin, 1: 1000; Cell Signaling Technology) yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä, kalvot pestiin, inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa HRP-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (1: 5000, Cell Signaling Technology), ja kehitettiin käyttäen ECL (Life Technologies). Kemiluminesenssin mitattiin Molecular Imager ChemiDoc XRS + (Bio-Rad Laboratories) ja visualisoidaan proteiini kvantitoitiin käyttäen Image Lab Software (Bio-Rad Laboratories).

RNA affiniteettikromatografialla ja massaspektrometria sekvensointi

useita päällekkäisiä sense- ja antisense-yksijuosteista DNA-oligonukleotidit (ssDNA oligoja, 100 nt pitkä) tuli vastaan ​​täydellinen sekvenssit eksonien 2 ja 9

PVT1

(NR_003367.3; Eurofinsille MWG Operon, Huntsville, AL) . Eksonit 2 ja 9 valittiin perustuu niiden lisääntynyt alttius proteiiniin sitoutumisen määritetty

in silico

. ssDNA hybridisoitiin saatiin kaksijuosteista DNA: ta (dsDNA), jotka kaikki oli T7-promoottorin sekvenssin 5′-päässä. T7 sisältävä dsDNA oli

in vitro

-transcribed käyttäen MaxiScriptR T7 Kit (Ambion) ja tuloksena jälkeen RNA 3′-biotinyloitu kanssa Pierce Desthiobiotinylation Kit (ThermoScientific). Desthiobiotinylated RNA: t inkuboitiin streptavidiini-sidottu magneettisten helmien Pierce Magnetic RNA-proteiini Pull-Down Kit (Thermo Scientific) kohti valmistajan protokollaa. Pesun jälkeen 200 ug SiHa kokosolulysaatissa lisättiin RNA-sitoutunut streptavidiini magneettisiin helmiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa samalla varovasti sekoittaen 90 min. 3 pesun jälkeen pesupuskurilla (Thermo Scientific 20164), RNA-sitoutuneet proteiinit eluoitiin SDS-näytepuskurissa ja erotettiin SDS-PAGE 12% akryyliamidigeelille. Sen jälkeen hopeavärjäys, proteiini bändit kiinnostava oli massaspektrometrian sekvensoitiin Taplin massaspekrometria Facility (Harvard Medical School, Boston, MA). Massaspektrometria ”osumaa” analysoitiin ainutkertaisten ja koko saatujen peptidien ja käyrän alla. Jokainen osuma oli

in silico

trypsiiniä pilkottu ja lukumäärän peptidejä saadaan

in silico

ruoansulatus verrattiin lukumäärän peptidien saatu massaspektrometrialla tuloksia. Vain ne proteiinit, jotka oli 20% tai enemmän trypsiinin sulavaa fragmentit Esillä katsottiin olevan totta osumia. Western-blottauksella (kuten edellä on kuvattu) sen jälkeen, RNA affiniteettikromatografiaa käytettiin lisäksi vahvistaa paikkansa osumia.

RNA immunosaostuksella

RNA immunosaostuksella (RIP) analyysit suoritettiin käyttäen Magna RIP RNA-sitova proteiini immunosaostus Kit (EMD Millipore) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokosolulysaattia 1,7 x 10

7 SiHa soluja käytettiin immunosaostuksella Myc ja nukleoliinin vasta-aineita (sama kuin Western blotting). Koska epäspesifinen IgG ohjaus, puhdistettua kanin lgG: tä rinnakkain. Proteiinin ruoansulatus, RNA eristettiin ja DNaasi käsitellä käyttämällä DNA-vapaa Kit (Life Technologies). Tasot

PVT1

määrä määritettiin tulo ja Immunopresipitoidun RNA.

Data Analysis ja tilastot

Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena ja eroja keskimääräisen analysoitiin Studentin

t

testit (kaksisuuntainen). Tulokset on graafisesti keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvon. Sisplatiinin annos-vaste-käyrät muodostettiin käyttäen vaihtelevan kaltevuus malli. Kaikki tilastolliset analyysit ja kuvaajien tietojen tehtiin käyttämällä GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), lukuun ottamatta eloonjääminen analyysi, joka suoritettiin käyttäen SPSS11.0 ohjelmistoa (Chicago, IL). Kaplan-Meier selviytymisen käyrät piirrettiin ja verrattiin käyttäen log-rank (Mantel-Cox) testejä. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

PVT1

ilmentymistä ylössäädellään kasvaimissa kohdunkaulan syöpäpotilaiden ja korreloivat huonompi selviytyminen

PVT1

on monen eksonin geeni, jossa on yhtenäinen genomin alueella, joka sisältää klusterin 6 selityksin MikroRNA (miRNA).

PVT1

ja paikallisen miRNA ilmentymisen tasot määritettiin qPCR varten syöpä- ja viereisten normaaleissa kudoksissa kohdunkaulan syöpäpotilailla.

PVT1

ekspressio oli merkittävästi suurempi kasvaimia kohdunkaulan syövän potilaista verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen (n = 127 kasvaimen; n = 30 vieressä normaali; p 0,001; kuvio 1A). Expression of miRNA 1204 ja 1206 (mutta ei 1205, 1207-3p, 1207-5p, tai 1208, S1A-S1D kuvio) oli merkitsevästi korkeampi kasvaimen verrattuna normaaliin viereiseen kohdunkaulan kudoksen (kuvio 1B ja 1C). Huomattavaa on, että koska

PVT1

ja

MYC

usein yhteistyössä monistettiin syövän, me lisäksi tarkasteltiin ilmentymisen

MYC

kohdunkaulan syövän ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Vaikka havaitsimme suuntaus lisääntynyt

MYC

syövän verrattuna viereiseen normaaliin, ero keskimäärin ilmaus

MYC

ei ollut tilastollisesti merkittäviä eroja näiden kahden ryhmän (S1E kuvio).

(A)

PVT1

ekspressio oli merkittävästi suurempi ensisijainen kohdunkaulan kasvaimet (n = 127) verrattuna viereiseen normaaliin kohdunkaulan kudoksen (n = 30; p 0,001). Expression of miRNA 1204 (B; p 0,05) ja 1206 (C; p 0,001), mutta ei muita paikallisia miRNA, oli myös merkitsevästi suurempi kohdunkaulan kasvainkudoksessa (n = 38) verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen (n = 18) . (D) Kaplan-Meier tonttien paljasti yhteenliittymän korkeamman kasvain

PVT1

tasoa huomattavasti huonommat elossaoloaika verrattuna alempiin

PVT1

tasolla (p = 0,03).

127 kohdunkaulan syövän potilaiden jaettiin korkean ja matalan

PVT1

ilmentävä ryhmiä, käyttäen mediaani

PVT1

ekspressiotaso, tutkia niiden vastaavuus ennustetta. Käyttämällä Kaplan-Meier selviytymisen analyysin ja log-rank testeissä havaittiin, että korkea

PVT1

ilmentyminen korreloi merkitsevästi lyhyempi kumulatiivisen elinaika kohdunkaulan syöpäpotilaille (p = 0,03; kuvio 1 D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yleensä,

PVT1

ilmentyminen on kohonnut kohdunkaulan syövän kasvaimia ja että korkeampi ilmentyminen

PVT1

, sitä huonompi ennuste.

PVT1

ilmentymistä kohdunkaulan syövän solulinjoissa

Ennen meidän

in vitro

tutkimus rooliin

PVT1

kohdunkaulan syövän solujen, päätimme

PVT1

ekspressiotasot erilaisissa kaupallisesti saatavilla kohdunkaula solulinjat kautta qPCR (kuvio 2A). Out of 4 kohdunkaulan riviä, HPV 16-positiivisten SiHa soluja, osoitti suurinta

PVT1

ilme, alin

PVT1

ilmentymistä havaittiin HPV 16 E6 /E7-transformoitujen solujen johdettu normaalista ectocervix (Ect1 /E6E7). Seuraavaksi pyrittiin selvittämään erityisiä onkogeenisen stressitekijöitä, jotka voivat ajaa tehostettu

PVT1

ilmentymistä kohdunkaulan syöpä. Tätä varten olemme alttiina SiHa soluja (joita käytetään jäljellä Tutkimustemme) erilaisiin transformative ärsykkeille, ennen kuin mitattiin vaikutukset

PVT1

ilmaisun kautta qPCR. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että

PVT1

ilmentyminen SiHa soluissa lisäsi merkittävästi vastauksena 48 h inkuboitu INF-α tai hypoksia mimeetti, kobolttikloridia (CoCl

2; kuvio 2B). Muut ärsykkeet, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF), insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF), forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (proteiinikinaasi C aktivaattori), ja gamma-säteilytys ei merkittävästi vaikuta

PVT1

ilmaisu (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi tutkimme solunosasijaintia

PVT1

käyttäen RNA FISH ja löysi ilmentymä

PVT1

sekä sytoplasmassa ja tumassa SiHa soluja. Edelleen, ohjaus antisense-transfektoiduissa SiHa (kuvio 2C) osoittivat samanlaisia ​​ydin- ja sytoplasman

PVT1

värjäystä, josta puuttui

PVT1

pudotus soluja (kuvio 2D). Yhteenvetona,

PVT1

ilmentyy eri solulinjoissa, jotka ovat peräisin ihmisen kohdunkaula, voidaan täydennetty immuuni- ja hypoksinen ärsykkeitä, ja on lokalisoitu koko tumassa ja sytoplasmassa viittaa siihen, että tämä lncRNA voivat osallistua eri kohdunkaulan syövän solujen prosessit , mahdollisesti kautta useamman kuin yhden ainutlaatuisen mekanismin.

(A)

PVT1

ilmaisun kaupallisesti saatavissa kohdunkaulan solulinjoja. Alin

PVT1

ilmentymistä havaittiin HPV 16 E6 /E7-transformoitujen solujen johdettu normaalista ectocervix (E6 /E7-Ecto), kun taas SiHa kohdunkaulan syöpäsolut osoittanut nopeinta

PVT1

ilme verrattuna 2 muut kohdunkaulan syöpää johdettuja linjoja (HeLa ja DoTc2). (B) ilmentäminen

PVT1

SiHa- soluissa entisestään kun 48h hoidon INF-α (10 uM) tai hypoksia jäljittelevää kobolttikloridia (CoCl

2; 150 uM). Edustavat kuvat RNA FISH kokeiden SiHa-soluissa, jotka on transfektoitu joko kontrolli (C) tai

PVT1

(D) LNA. Ohjaus LNA-transfektoiduissa soluissa näytteillä pistemäinen signaalit

PVT1

(punainen) sekä tumassa (värjättiin DAPI sinisenä) ja sytoplasmassa. Sekä ydin- ja sytoplasman

PVT1

värjäytymistä ei havaittu

PVT1

LNA-transfektoiduissa soluissa. Vaihe kuva (alhaalla vasemmalla paneeli) kuvaa solujen morfologia. Mittakaava (valkoinen) = 10 pm. * P 0,05, ** p 0,01.

PVT1

hiljentäminen vähenee kohdunkaulan syövän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

Seuraavaksi SiHa solut transfektoitu

PVT1

-targeted siRNA (siPVT1) käytettiin tutkimaan vaikutuksia tämän lncRNA kohdunkaulan syövän solujen proliferaatiota ja liikkuvuuteen. Transfektion

PVT1

-targeting siRNA: t johtivat keskimäärin 70% pudotus on

PVT1

verrattuna ohjata-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A). Edelleen, ei ollut merkitsevää eroa paikallisen miRNA (1204-1208) tai

MYC

mRNA: n ekspression siPVT1 verrattuna salattu valvonta-transfektoiduissa soluissa (siCONT, S2 kuvassa). siPVT1-transfektoidut SiHa solut osoittivat merkittävää laskua BrdU, mitta jäljittelevän soluja, 72 h transfektion jälkeen verrattuna siCONT, mikä viittaa siihen, että

PVT1

on rooli ajo solujen lisääntymisen (kuvio 3B). Nämä vaikutukset

PVT1

Knockdown on SiHa leviämisen vahvistettiin myös transfektoimalla

PVT1

-targeted LNA. Lopuksi verrattuna siCONT soluihin, siPVT1 soluilla merkittävä lasku muuttoliike (kuvio 3C) ja invaasiota (kuvio 3D) potentiaalia. Huomattavaa on, että nämä vaikutukset

PVT1

Knockdown on jäljitelty toisessa kohdunkaulan syövän solulinja, HeLa (S3 kuvassa), joka tarjoaa lisätukea rooli tämän lncRNA Kohdunkaulan syövän syntymistä.

(A ) transfektio SiHa kohdunkaulan syöpäsolut siRNA kohdistaminen

PVT1

(siPVT1) johtivat noin 70% knockdown vuonna

PVT1

lncRNA ilmaisu verrattuna soluihin transfektoitu salatun ohjaus siRNA (siCONT) . (B) SiHa-soluja, jotka on transfektoitu siPVT1 osoitti merkittävän laskun proliferaatiossa kuin siCONT soluihin. Transfektoidut SiHa soluja arvioitiin myös muutoksia (C) maahanmuutto ja (D) invaasio 6 h tai 48 h seuraava käyttöönotto kemoattraktanttia (FBS), tässä järjestyksessä. siPVT1 solut osoittivat merkittävää vähenemistä sekä solumigraatioon ja invaasio verrattuna siCONT soluihin. Kvantitatiiviset tulokset piirretään vasemmalla, kun taas edustavia kuvat ovat oikealla. *** P 0,001, **** p 0,0001

PVT1

hiljentämisen lisää apoptoosin ja vastaus sisplatiiniin kohdunkaulan syöpäsolut

Toistaiseksi siRNA-välitteisen knockdovvn strategioita kohdistaminen

PVT1

ovat osoittaneet sen roolia sisplatiinin herkkyys pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma [25] ja mahasyövän solujen [26]. Kuitenkin antiapoptoottinen allekirjoituksen aiheuttama

PVT1

muissa syöpäsolutyyppien [8,18,20,26] voi ilmoittaa, että sen osuus sisplatiinin vastus on kauaskantoisempia. Niinpä seuraava kokeet suunniteltiin roolin tutkimiseksi

PVT1

apoptoosin ja sisplatiinin herkkyyttä kohdunkaulan syöpäsoluja. Joka ulottuu edellä mainitut havainnot, tuloksemme osoittavat, että

PVT1

pudotus SiHa- soluissa merkittävästi kohonneeseen sytoplasminen histoni liittyvän DNA-fragmentteja (kuvio 4A) ja aktiivinen kaspaasi-3 (kuvio 4B), mikä viittaa siihen, että

PVT1

voi myös edistää kohdunkaulan syövän synnyn estämällä solukuoleman ja apoptoosin. Edelleen,

PVT1

pudotus joko siRNA (kuvio 4C) tai LNA oligonukleotidit (kuvio 4D) johtaa lisääntyneeseen reagointikykyä SiHa solujen sisplatiinia. Yhdessä solussa fenotyyppinen (tappio

PVT1

) funktionaaliset tiedot viittaavat siihen, että

PVT1

tarvitaan leviämisen, huolto- ja sisplatiinin kestävyys kohdunkaulan syöpäsoluja.

siPVT1 solujen näytteillä merkittävä kasvu solukuoleman (A) ja apoptoosin (B) verrattuna siCONT soluihin. (C) Leviämisen siPVT1 SiHa solujen väheni huomattavasti vastauksena useita annoksia sisplatiinia. (D) Annos-vaste-käyrä ohjaus ja

PVT1

LNA-transfektoitujen SiHa-soluissa 4 h hoito sisplatiinilla.