Krooninen sairaus

tiivistelmä

ADAM 17 (TNF-α konvertoivan entsyymin, TACE) on potentiaalinen kohde syövän hoidossa, mutta pienmolekyylisalpaajien raportoitu tähän mennessä eivät ole erityisesti tätä ADAM perheenjäsen. Tämä kalvoon sitoutuneiden metalloproteinaasi vastaa ektodomeenin irtoaminen patologisesti merkittäviä alustoille mukaan lukien TNF-α ja EGFR ligandien. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida farmakokinetiikkaa, farmakodynamiikkaa ja antituumoriteholla Ensimmäisen erityisiä estäjä, anti-ihmisen ADAM17 IgG-, klooni D1 (A12). Käytimme vatsaonteloon ksenografteissa ihmisen munasarjasyövän solulinja IGROV1-Luc Balb /c-nude-hiiriin, valittiin, koska se oli aiemmin raportoitu, että kasvu näiden ksenograftien inhiboituu knock-down TNF-α.

In vitro

, 200 nM D1 (A12) esti irtoaminen ADAM17 substraatteja TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amfireguliini (AREG), HB-EGF: n ja IL-6Rα, mistä IGROV1-Luc-soluja , (4,7 nM IC

50 TNF-α irtoaminen). In IGROV1-Luc ksenografteissa

in vivo

, D1 (A12) IgG osoitti farmakokinetiikan soveltuvat tehotutkimukseen yhdellä i.p. 10 mg /kg D1 (A12) riitä pitämään IgG plasma ja askitesneste pitoisuus on yli 100 nM yli 7 päivää. Plasman puoliintumisaika oli 8,6 vuorokautta. Seuraavaksi tehokkuus Tutkimus suoritettiin, annostus D1 (A12) tai anti-ihmisen TNF-α-vasta infliksimabia 10 mg /kg q7d, määrällisesti IGROV1-Luc kasvain taakkaa bioluminenssina. D1 (A12) IgG osoitti vähentää merkittävästi kasvaimen kasvua (p = 0,005), 56% auton hallinnan. Yllättäen D1 (A12) ei pienentänyt pitoisuus verenkierrossa ihmisen TNF-α, mikä viittaa siihen, että toinen entsyymi voi kompensoida eston ADAM17

in vivo

(mutta ei

in vitro

). Kuitenkin D1 (A12) se osoitti selkeän farmakodynaamisia vaikutuksia hiirillä, joilla on merkittäviä eston varisemisessa kasvain ADAM17 substraatteja TNFR1-α, AREG, ja TGF-α (4-15-kertainen vähennyksiä, p 0,0001 kaikkien kolmen) . Siten D1 (A12) on anti-ADAM17 aktiviteetti

in vivo

, estää irtoaminen EGFR ligandien ja on potentiaalia käytettäväksi EGF-ligandi kasvaimet.

Citation: Richards FM, Tape CJ , Jodrell DI, Murphy G (2012) Anti-Kasvaimen vaikutukset Tietyn Anti-ADAM17 Vasta käytettäessä Munasarjasyöpä Model

in Vivo

. PLoS ONE 7 (7): e40597. doi: 10,1371 /journal.pone.0040597

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 11 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Richards et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus työtä tällä tutkimuksen rahoittivat Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org), lupanumeroon C96 /A8333. Prof. Murphyn Chair rahoitti yleishyödyllinen lahjoitus Univerity Cambridgen Hutchison-Whampoa Ltd. Hän ei ole työntekijä Hutchison Whampoa, ja Hutchison Whampoa ole kaupallisia etuja missään tekijöiden tutkimusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: CJ Tape ja G . Murphy on nimetty keksijöiden patenttihakemuksessa US61 /438354, joka kattaa vasta-aineen, joita käytetään näissä tutkimuksissa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä Cambridgen yliopistossa. Kirjoittajat ilmoittavat, että mitään muuta kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

TNF-α konvertoivan entsyymin (TACE, ADAM17) on kalvoon sitoutunut metalloproteinaasi vastuussa pilkkominen ja ektodomeenin irtoaminen TNF-α, EGFR-ligandien ja muiden patologisesti merkittäviä alustoille. Dysregulaatio ektodomeeni leviämistä liittyy autoimmuuni- ja sydän- ja verisuonitaudit, neurodegeneraatio, infektio, tulehdus ja syöpään [1].

ADAM17 on liitetty moniin syöpiin. Se on yli-ilmentynyt munasarjasyöpä [2], rintasyöpä [3], [4], haiman adenokarsinooma [5], kolorektaalisyövän [6], mahasyöpä kantasoluja [7], GIST [8], ei-pienisoluinen keuhkokarsinooma [9], ja pään ja kaulan alueen syöpä [10], [11]. ADAM17 on raportoitu olevan suora toiminnallinen rooli valvoa proliferaatiota ja /tai migraatiota peräisin olevien solujen monista kasvaintyypit [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18] [19], [20], ja se on liitetty ohjaukseen endoteelisolujen migraatiota [21] ja että patologisen angiogeneesin [22], [23], joka on myös merkitystä kasvaimen kasvua. ADAM17 voidaan aktivoida kemoterapiaa, jolloin kasvutekijän irtoaminen, mikä lietsoo vastus kolorektaalisyövässä malleissa [15], [24]. ADAM17 voi myös myötävaikuttaa vastustuskyvyn trastutsumabille (Herceptin

TM) rintasyövässä [25]. Näin ollen, ADAM17 tekee houkutteleva kohde inhibiittoreiden, joilla olisi laaja kirjo terapeuttista potentiaalia hoidettaessa potilaita, joilla on syöpä.

Pienet molekyyli-inhibiittorit ADAM17 on kehitetty, mutta mikään niistä ei ole vielä esitetty täydellinen spesifisyys ADAM17 . Esimerkiksi INCB3619 ja INCB7839 estävät ADAM10, ADAM17 ja matriisimetalloproteinaaseja MMP2, MMP-12 ja MMP15 [9], [26], [27], [28]. Kaksi ADAM17 estäjiä, jotka ovat edenneet pisimmälle kehittämiseen [29] ovat DPC 333 (BMS-561392) [30] ja TMI-005 (apratastat) [31]. Nämä molemmat näkyä estävä vaikutus muihin MMPS eikä etene vaiheen II tutkimus toksisuuden takia tai tehon puutteen. Laajakirjoinen MMP-inhibiittorit (marimastaatti, prinomastaatin, tanomastat), joka myös estää Adams, eivät ole edenneet pidemmälle vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa puutteen vuoksi tehon ja merkittävää toksisuutta [32], [33], [34], [35], viittaa siihen, että spesifisyys on keskeinen kehitettäessä metalloproteinaasi-inhibiittorit.

erityinen ihmisen ADAM17 estävää vasta-ainetta, D1 (A12), on viime aikoina kehitetty, joka estää proteo- ADAM17 substraattien (TNF-α, AREG, jne., ) syöpäsoluissa

in vitro

[36]. Tavoitteena Tässä raportoidut tutkimukset oli arvioida soveltuvuutta D1 (A12) vasta-terapeuttiseen käyttöön, tutkimalla sen farmakokinetiikkaa, farmakodynamiikkaa ja antituumoriteholla hiirillä. Päätimme käyttää IGROV1-Luc malli munasarjasyövän, jonka on raportoitu olevan TNF-α- riippuvainen [37].

Korkea TNF-α on havaittu munasarjasyövän [38 ], [39], [40], erityisesti korkean asteen serous type [41], ja anti-TNF-α-vasta infliksimabi (Remicade

TM), on tutkittu sen tehoa vastaan ​​munasarjasyöpä [42 ]. IGROV1-Luc malli on ihmisen -tuumoriksenografti malli vatsaonteloon levittää munasarjasyöpäpotilailla. IGROV1-Luc solut erittävät TNF-α ja pudotus TNF-α ilmentyminen transfektiolla IGROV1-Luc-solujen anti-TNF-α shRNA raportoitiin aiemmin estää kasvaimen kasvua [37]. Esto ADAM17 D1 (A12) vasta-aineen odotetaan estävän TNF-α eritystä ja siten estävät kasvua IGROV1-Luc kasvaimet

in vivo

. Vertailun, ryhmä hiiriä käsiteltiin infliksimabi, jonka odotettiin suoraan vähentää toiminnallista ihmisen TNF-α, myös johtaa kasvun estyminen on IGROV1-Luc kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja kemikaalit

eristäminen ja puhdistaminen ihmisen anti-ADAM17-vasta-aineen D1 (A12) on kuvattu aiemmin [36]. Lyhyesti, D1 (A12) IgG ilmaistiin transfektoimalla HEK293-solut ja elatusaine kerättiin. Vasta-aine puhdistettiin väliaineesta kromatografoimalla 2-proteiinia L saraketta (Pierce) ja sen jälkeen 2 meloni Gel saraketta (Pierce) ja AKTA FPLC, ja sitten dialysoitiin steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,4, ja steriloitiin suodattamalla. Infliksimabi (Remicade

TM, Janssen Biotech Inc.), ystävällinen lahjoitus Prof. Peter Taylor (Kennedy Institute of Rheumatology), liuotettiin steriiliin suolaliuokseen. Ohjata ihmisen plasman IgG (R D Systems Duoset sarjat: ihmisen TNF-α (TNFSF1A, kissa. No. DY210), ihmisen liukoista TNFR1-α (TNFRSF1A, kissa. No. DY225), ihmisen TGF-α (cat. No. DY239), ihmisen AREG (cat . No. DY262), ihmisen IL-6Rα (cat. No. DY227) ja ihmisen HB-EGF (DY259). DY210 sarja varmistettiin olevan spesifisiä ihmisen TNF-α testaamalla rekombinantti hiiren TNF-α tällä pakki, ei ollut ristireaktioita.

Jos kasvain Homogenaatteja käytettiin, raaka nM pitoisuudet naattia ratkaisu oli muunnetaan nmol per mg kudosta, ja käyttämällä sitten olettaen, että kudoksen tiheys on 1 g /ml, molaarinen pitoisuus kudoksessa laskettiin.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet kasvaimen ja maksan jälkeen antigeenin haku entsyymidigestiolla (proteinaasi k) 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Ihmisen IgG, jolla hiirillä oli annosteltu (D1 (A12) tai infliksimabi) havaittiin sitoutumisen biotiini-SP-konjugoidulla AffiniPure F (ab ’) 2-fragmentti, aasin anti-ihmis-IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), mitä seurasi värjäys DAB + kromogeenin. Objektilasit skannattiin ScanScopeXT (Aperio Technologies, Inc.) 20X suurennus ja skannattuja kuvia näytettiin käyttäen Spectrum v10 ohjelmistoa (Aperio Technologies Inc). Ei kuvankäsittelyyn suoritettiin.

Tulokset

vaikutus D1 (A12) vasta-aineen IGROV1-Luc solujen

in vitro

IGROV1-Luc kasvainsoluja

in vitro

erittyy TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, AREG, HB-EGF: n ja IL-6Rα, kaikki tunnetut substraatteja irtoaminen aktiivisuuden ADAM17, elatusaineeseen, vaikka stimuloimaton (kuvio 1A). Kun on stimuloitu PMA pitoisuudet näiden proteiinien irtoa väliaineeseen lisättävä vähintään 5-kertainen (lukuun ottamatta IL-6R-α, 2,7-kertainen lisäys). Tämä PMA-stimuloiduissa kasvu estyi lisäämällä 200 nM D1 (A12) IgG (kuvio 1A). Inhibitiota TNF-α irtoaminen D1 (A12) oli annoksesta riippuvainen, ja IC

50 IGROV soluissa 4,7 nM (kuvio 1 B). D1 (A12) oli tehokkaampi inhibiittori TNF-α irtoaminen kuin N-TIMP-3 (IC

50 72 nM), joka on luonnollinen metalloproteinaasi-inhibiittori on aiemmin osoitettu estävän ADAM17 [43]. D1 (A12) IgG inhiboi myös konstitutiivisia vuodattamalla TNF-α väliaineeseen pidemmän ajan (kuvio 1C). D1 (A12) ei inhiboinut proliferaatiota IGROV1-Luc-solut

in vitro

läsnä normaalin kasvualustaa (tuloksia ei ole esitetty), joka on yhdenmukainen vaikutus TNF-α shRNA on IGROV1-Luc soluja kuten aiemmin on raportoitu [37].

(A) D1 (A12) IgG estää PMA aiheuttaman vuodattamalla ADAM17 alustojen IGROV1-Luc soluviljelyalusta. Alusta kerättiin 90 minuutin kuluttua lisäämällä PMA: (100 ng /ml), D1 (A12) IgG (200 nM) tai liuotinta valvontaa. Proteiinit kvantifioitiin ELISA-menetelmällä. (B) estyvän annosriippuvaisesti TNF α irtoaminen 1 tunti esikäsittelyn kanssa D1 (A12), N-TIMP-3 tai ohjata ihmisen plasmasta IgG ennen PMA stimulaatiota. (C) D1 (A12) IgG estää konstitutiivinen vuodattamalla TNF-α päässä IGROV1-Luc-solujen elatusaineeseen. Alusta kerättiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 48 tuntia tai ilman IgG: t 200 nM. Virhe palkit osoittavat keskihajonnan.

IGROV1-Luc Kasvainkasvua

in vivo

IGROV1-Luc solut kasvoivat ja levitetään vatsaonteloon nude-hiirissä (kuvio 2A ), kuten aiemmin raportoitu [37], jossa yksittäiset kasvain massat esittää histologisen ulkonäön sopusoinnussa ihmisen korkealuokkaisesta vakavien munasarjan adenokarsinooma (M. Jimenez-Linan, henkilökohtainen tiedonanto). Suurin talletukset kasvain oli haimassa, omentum ja suoliliepeen kaikki hiiret. Vuoteen päätepisteen noin päivän 32-35, kasvain kantavien hiirten olivat kehittyneet (askites nestettä). Ihmisen TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amfireguliini (AREG), ja HB-EGF (ADAM17 substraatteja) havaittiin kierto IGROV1-Luc on kasvain, jolla on suurina pitoisuuksina askitesnesteessä ja pienempiä pitoisuuksia plasmassa (kuten on esitetty ajoneuvon kontrolliryhmien tehokkuuden tutkimus, joka on esitetty myöhemmin).

(A) Esimerkki kasvun IGROV1-Luc vatsaonteloon kasvain, mitattuna bioluminesenssi, 11-29 päivää injektion jälkeen solujen. (B ja C) farmakokinetiikka D1 (A12) nude-hiirissä sen jälkeen, kun yksittäinen annos 10 mg /kg i.p. N = 2 tai enemmän hiirtä aikapistettä kohti. Virhepylväät edustavat standardi keskivirhe (B) pitoisuudet plasmassa ei ollut kasvainta kantavissa hiirissä. (C) Plasma ja askitesneste pitoisuudet IGROV1-Luc tuumoreita kantavaa hiirtä. (D) D1 (A12) IgG hiiren plasmassa: kyky sitoutumisesta ADAM17 ja FcγR1. Plasma kerättiin osoitettuina aikoina annostuksen jälkeen hiiret kerta-annoksen 10 mg /kg D1 (A12). Sitova aktiivisuus

in vitro

verrattiin sitomiskapasiteetti D1A12 kantaliuosta. Virhe palkit edustavat keskivirheen keskiarvon.

farmakokinetiikkaa D1 (A12) IgG

farmakokinetiikkaa (PK) ja D1 (A12) vasta-aine tutkittiin yhdellä 10 mg /kg annos ip, ei-kasvain-hiirissä (kuvio 2B). PK muuttujat laskettiin ei ollut kasvainta kantavien hiirten käyttäen WinNonlin noncompartmental analyysiohjelmassa: plasman C

max = 523 +/- 58 nM, T

max 2 päivää, puoliintumisaika 8,6 päivää. Suppeampi otantaa sitten suoritettiin hiirillä, joilla IGROV1-Luc kasvaimia (kuvio 2C), jossa D1 (A12) IgG osoitti samanlaista kinetiikkaa ei-kasvain hiirille. Sen jälkeen 10 mg /kg: n annos i.p. C

max oli 425 +/- 51 nM plasman ja 391 +/- 19 nM askiittinesteessä, alempi kuin plasman C

max hiirissä ilman kasvaimia. Nämä tiedot riittivät ennustaa, että kiertävä D1 (A12) pitoisuuksia yli 100 nM voidaan ylläpitää annostelemalla 10 mg /kg kerran 7 päivän välein. 100 nM D1 (A12) on riittävä pitoisuus aiheuttamaan maksimaalisen eston ADAM17 funktion IGROV1 soluviljelmässä (kuvio 1 B).

havaitseminen D1 (A12) vasta-aine ELISA ei välttämättä tarkoita, että vasta-aine oli säilyttänyt sen aktiivisuus, kuin se voisi olla osittain denaturoitu, niin sitoutumisaktiivisuus plasman D1 (A12) vasta-aine arvioitiin (kuvio 2D ja kuvio S1). D1 (A12) vasta-aine hiirten veriplasmasta kaikissa aikapisteissä 1-9 päivää säilyi kyky sitoutua ADAM17 (100% päivänä 9, verrattuna D1 (A12) kantaliuos). Sen sijaan kyky D1 (A12) sitoutumaan ihmisen FcγR1 väheni ajan, sitovia 9 päivän kuluttua hiiren vain 32%: n sitoutumisen D1 (A12) kantaliuos.

tehotutkimukseen ja farmakodynamiikka

Todettuaan, että D1 (A12) aineella on sopiva PK ominaisuuksia, testasimme vaikutus viikoittain annostelun IGROV1-Luc ksenografteissa 10 mg /kg D1 (A12) (n = 11), verrattuna 10 mg /kg saaneiden (n = 8) ja PBS-vehikkeliä (n = 12). Ennen ensimmäistä annosta päivänä 4 sen jälkeen, kun solu injektion ei ollut merkittävää eroa kasvaintaakkaa ryhmien välillä: Avg Radiance (x 10

6 p /s /cm

2 /Sr) 2,71 +/- 1,35 , 2,92 +/- 1,23 ja 2,65 +/- 0,91 ajoneuvojen, infliksimabi ja D1 (A12) ryhmät, vastaavasti. Kasvainten kokoa päätepisteessä päivänä 32 on esitetty kuviossa 3. D1 (A12) ryhmä oli huomattavasti pienempi tuumorikuorma (Avg Radiance x 10

6 p /s /cm

2 /Sr) päivänä 32 23,3 +/- 9,1 verrattuna vehikkeliryhmässä (41,8 +/- 17,2, p = 0,005). Keskimääräinen tuumoritaakka D1 (A12) ryhmä päätepisteessä oli 56% ajoneuvon ohjaus. Sen sijaan ei ollut tuumorin kasvua hiirissä infliksimabia verrattuna ajoneuvoon siten, että kasvain taakka 39,1 +/- 11,6 infliksimabiryhmässä (p = 0,68).

kasvu IGROV1-Luc i.p. hiirissä annostellaan viikoittain ajoneuvon, 10 mg /kg infliksimabia tai 10 mg /kg D1 (A12), mitattuna bioluminesenssin. Keskiarvo ja keskihajonta päivä 32 tuumorikuorma näkyy ilmaistuna keskim Radiance. N = 12 ajoneuvojen, n = 8 infliksimabi ja N = 11 D1 (A12).

Sen varmistamiseksi, että terapeuttiset pitoisuudet vasta oli saavutettu, pitoisuus D1 (A12) ja infliksimabille määritettiin plasman ja askitesneste (kuvio 4A) ja kasvaimen homogenaateissa (kuvio 4B). Kuten odotettua, ei ihmisen IgG havaittu missään näytteissä ajoneuvosta-käsitellyssä ryhmässä. D1 (A12) ja infliksimabille olivat läsnä suurina pitoisuuksina plasmassa ja askitesneste asianmukaisissa hoitoryhmässä, ja molemmat vasta-aineet olivat havaittavissa kasvain sekä haima ja omentum. Pitoisuus D1 (A12) oli korkeampi kasvaimen kuin infliksimabi, mutta infliksimabi oli korkeampi plasman ja askitesnesteestä kuin D1 (A12).

Näytteet otettiin päätepisteen (päivä 33), 20 tuntia sen jälkeen, kun lopullinen vasta-aineen annosta. (A) Pitoisuudet plasmassa ja askitesnesteessä. Vaakapalkeilla edustavat keskiarvo ja keskihajonta. (B) pitoisuudet homogenaateissa kudosta kasvaimen haimassa ja omentum. (C) Immunohistokemia havaitsemaan ihmisen IgG IGROV1-Luc kasvain ja maksassa. Top: mouse ID 901, käsiteltiin D1 (A12), jossa nuoli merkinnällä asemaa verisuonen; keskimmäinen: mouse ID 903, infliksimabia; pohja: mouse ID 902, vehikkeliä. Kuvat otettiin 20X suurennoksella.

tutkimiseksi jakelua D1 (A12) ja infliksimabi tuumorikudokseen, anti-ihmis-IgG immunohistokemia suoritettiin parafiinileikkeillä päässä kasvaimia (kuvio 4C). Kaksi terapeuttinen vasta-aineet olivat havaittavissa niin vahvoja IHC värjäytyminen maksassa, ja molemmat olivat myös havaittavissa kasvainkudoksen, mutta jakelu näytti rajoittuvan verisuonia.

Voit selvittää joko vasta-aineella oli farmakodynaamiset vaikutukset olemme analysoineet plasmassa ja askitesnesteestä tuotteiden ADAM17 sheddase aktiivisuuden, eli liukoisen humaani-TNF-α, liukoinen TNFR1-α, TGF-α ja amfireguliini (AREG) (kuvio 5). Kaikki neljä proteiinien analysoitiin osoittivat merkittävästi korkeampia pitoisuuksia askiittinesteessä kuin plasmassa. Kuten odotettua, oli merkittävä väheneminen sTNF-α in askitesnesteestä infliksimabia saaneista hiiristä verrattuna ajoneuvon (3,7-kertainen vähentäminen, p 0,0001). Yllättäen ei ollut merkittävää vähenemistä sTNF-α, että D1 (A12) saaneilla hiirillä (P = 0,06). Kuitenkin D1 (A12) se osoitti selkeän farmakodynaamisia vaikutuksia vähentämällä huomattavasti askitesnesteestä pitoisuuksia liukoista TNFR1-α (4,4-kertainen vähentäminen, P 0,0001), AREG (5,4-kertainen vähentäminen, P 0,0001) ja TGF-α ( 15-kertainen pieneneminen, P 0,0001). D1 (A12) vähensi merkittävästi plasman liukoisen TNFR1-α (P 0,0001), AREG (P = 0,012) ja TGF-α (P = 0,005).

pitoisuudet katkaistun tuotteiden ADAM17 alustoille plasmassa ja askitesnesteessä päätepisteessä (päivä 33), mitattuna ELISA. Vaakapalkeilla edustavat keskiarvo ja keskihajonta. Tähdellä osoittavat ryhmät merkittävästi erilainen (P 0,05) PBS-kontrolliryhmään samalla nesteen tyyppi.

Keskustelu

Olemme tutkineet biologinen aktiivisuus D1 (A12), monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen ADAM17, joka estää ADAM17 toiminnon verkkotunnusten inhibition ektodomeenia. Olemme osoittaneet, että vasta-aine (nanomolaarisilla pitoisuuksilla) estää irtoaminen ADAM17 substraatteja, mukaan lukien TNF-α ja AREG in IGROV1-Luc-solut

in vitro

.

PK ominaisuudet D1 (A12 ) IgG hiirillä havaittiin olevan sopiva tehon tutkimista varten. Puoliintumisaika plasmassa on yhdenmukainen julkaistun arvot puoliintumisaika ihmisen IgG-vasta-aineiden hiiren plasmassa [46]. Plasman ja askites C

max olivat alhaisemmat kasvain kantavien hiirten kuin plasman C

max hiirissä ilman kasvaimia. Kuitenkin, tämä ei ole yllättävää, koska suurempi koko kehon nesteen kasvaimen kantavien hiirten johtuen askitesnesteestä osastoon. Plasman ja askitesnesteestä pitoisuuksia D1 (A12) IgG olivat hyvin samankaltaisia ​​kunkin yksittäisen hiiren, sekä PK ja tehoa, mikä viittaa siihen, että vasta-aine kykenee tasaantua näiden kahden osaston jälkeen joko IP tai IV annostelua. Olemme osoittaneet, että D1 (A12) vasta-aine on rakenteellisesti stabiili hiiren liikkeeseen, säilyttäen kyky sitoa ihmisen ADAM17 jopa 9 päivää annostuksen jälkeen. Kuitenkin kyky D1 (A12) sitoutua ihmisen FcγR1 väheni ajan hiiren plasmassa, siten, että vain 32%: n sitoutumisaktiivisuus säilyi jälkeen 9 päivää hiirellä. Alennetun FcγR1 sitova kapasiteetti voi johtua liukoisia Fc-reseptoreita on läsnä hiiren seerumin. Esimerkiksi hiiren FcRn sitoo ihmisen IgG1 suurella affiniteetilla [47] ja vastaa pitkän

in vivo

puoliintumisaika vasta [48].

PK ominaisuuksia ja vakautta D1 (A12) IgG hiiren liikkeessä osoitti, että viikoittain annoksia tulisi säilyttää pitoisuuksia tarpeeksi korkea biologisesti aktiivinen

in vivo

, joten tehoa tutkittaessa on IGROV1-Luc malli. D1 (A12) vasta-aine osoitti antituumorivaikutuksia, jossa tuumorikuorma lopussa tutkimuksen noin 56% ajoneuvon kontrolliryhmään. Tämä oli vaatimaton antituumorivaikutuksen, ja joitakin mahdollisia selityksiä käsitellään alla.

Kasvainten homogenaatteihin oli pitoisuuksia D1 (A12) IgG yläpuolella solu IC

50, mutta analyysi IHC osoitti rajallinen tunkeutuminen pidemmälle kasvain verisuonia. Samanlaisia ​​rajoitettu tunkeutuminen on havaittu ksenograftikasvaimissa korkean affiniteetin anti-HER2-vasta-aine trastutsumabi [49], joka on kuitenkin tehokas lääke

in vivo

. Jakelu monoklonaalisia vasta-aineita kasvainkudokseen on osoitettu olevan rajoitettu tunkeutuminen läpi hiussuonten seinämien ja myös muita tekijöitä, kun vasta-aine on ylittänyt verisuonen seinämään [50]. Tunkeutuminen D1 (A12) voi olla parempi kasvaimissa enemmän läpäisevä alukset kuin ne, jotka IGROV1 kasvaimia. Kuitenkin rajoitettu kasvaimen tunkeutuminen D1 (A12) IgG IGROV1-Luc kasvaimia ei estänyt vasta aiheuttaa selkeän farmakodynaamisten vaikutusten (vuodattaa ADAM17 substraattien, katso alla). Mielenkiintoista on, että D1 (A12) pitoisuus oli korkeampi kasvaimen kuin infliksimabi, mutta pienempi plasmassa ja askitesneste kuin infliksimabi, mikä johtunee sijainnin kohde kullekin vasta-aineelle (ADAM17 kasvaimen solukalvoon, verrattuna kiertävän TNF-α, joka on läsnä suurina pitoisuuksina plasmassa ja askites).

Voit selvittää, onko vasta-aineet lyömällä tavoitteensa ja ottaa farmakodynaamisia vaikutuksia, ELISA-määritykset ja ADAM17 alustoille suoritettiin plasma- ja askitesneste näytteitä lopussa tehoa tutkimus. Ajoneuvon-käsitellyistä hiiristä osoittivat paljon suurempina pitoisuuksina liukoisen TNF-α, TNFR1-α, AREG ja TGF-α askiittinesteessä kuin plasmassa, mikä viittaa siihen, että nämä proteiinit eivät ole vapaasti tasapainottua välillä plasman ja askites osastoja, toisin kuin annosteltu IgGs joka ei tasapainottuvat osastojen välillä.

vertailu D1 (A12) hoidetussa ryhmässä, jossa ajoneuvon hallintalaitteita osoittivat, että D1 (A12) ei merkitsevästi estä vuodattaa ADAM17 substraattien, EGFR-ligandien TGF-α ja AREG, ja TNFR1-α. Kuitenkin D1 (A12) ei estä merkitsevästi TNF-α irtoaminen

in vivo

, mikä oli yllättävää, koska TNF-α irtoaminen estyi D1 (A12) on IGROV1-Luc solujen

in vitro

. Puute esto TNF-α irtoaminen

in vivo

saattaisi selittää suhteellisen vaatimaton kasvaimen vastainen vaikutus vasta-aineen, koska TNF-α ajateltiin olevan keskeinen tekijä kasvaimen kasvua tässä mallissa, joka perustuu shRNA työ Kulbe,

et

al

[37], mutta infliksimabi data confounds tämän hypoteesin (katso alla).

ADAM17 on pidetty avain vastaava entsyymi irtoaminen TNF-α, mutta tuloksia D1 (A12) vasta-aine, viittaavat siihen, että toinen entsyymi voi korvata, kun ADAM17 aktiivisuus estyy IGROV1-Luc-soluja kasvatettiin

in vivo

(mutta ei

in vitro

). Tämä voi olla ADAM10: ADAM10 on osoittanut TNF-α sheddase aktiivisuuden ADAM17 puutosta hiiren fibroblasteja [51] ja on liitetty TNF-α tuotanto Manttelisolulymfoomapotilailla [52]. Myös Hikita et al [53] osoitti, että vaikka ADAM17 on todellakin merkittävä TNF-α sheddase makrofageissa, ADAM10 on myös TNF-α sheddase in adenovirus-transformoituja ihmisen alkion munuaisen 293A-solut, NIH3T3 hiiren alkion fibroblasteissa ja hiiren endoteelisolujen. Myös silloin, kun yliekspressoituina ADAM19 voi olla omiaan aiheuttamaan TNF-α irtoaminen [54]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio TNF-α irtoaminen kasvaimista

in vivo

, esto sekä ADAM17, ADAM10 ja ADAM19 voidaan tarvita.

in vivo

tutkimuksissa kasvaimen solut ovat altistuneet D1 (A12) 28 päivän ajan, ja jos korvaavat mekanismit olivat hitaita kehittää, tämä voi selittää, miksi tämä korvaus ei havaittu

in vitro

määritykset, jotka suoritettiin yli 48 tuntia tai vähemmän. Toinen mahdollinen selitys puute eston TNF-α irtoaminen

in vivo

on, että irtoaminen trans voitaisiin esiintyviä, jossa hiiren ADAM17 isännän soluihin, joita ei säännellä D1 (A12), voisi pilkkoa TNF-α viereisten ihmisen kasvainsoluissa. Tietääksemme trans-irtoaminen ei ole raportoitu ADAM17, mutta se on jo ADAM10 pilkkomisen efriini A5 [55]. Tämä viittaisi siihen, että TNF-α irtoaminen rajoittui erittäin aktiivinen alueille isäntä-kasvaimen vuorovaikutus kuten klo hyökkääviä marginaalit.