Krooninen sairaus

tiivistelmä

taustalla olevaa mekanismia spatiotemporal valvonnan syöpäsolun dynamiikkaa ja sen mahdollista yhteyttä solujen lisääntymistä ei ole vakiintunut. Hyödyntämällä Elintensisäistä kuvantamisen tekniikkaa, huomasimme, että syöpäsolujen liikkuvuutta ja invasiivisia ominaisuudet tiiviisti solusyklin.

In vivo

inokulaation ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, joissa fluoresenssi ubikitinaation-pohjainen solukierron ilmaisin (Fucci) osoittivat odottamattoman ilmiö: S /G2 /M-soluissa olivat liikkumattomia ja invasiivisia kuin G1-soluja. Microarray-analyysit osoittivat, että

Arhgap11a

, joka on tuntemattomia Rho GTPaasia aktivoiva proteiini (RhoGAP), ilmennettiin solusyklin riippuvalla tavalla. Expression of ARHGAP11A syöpäsoluissa tukahdutettu RhoA-riippuvainen mekanismeja, kuten stressi kuitu muodostumista ja fokaalisen adheesion, joka teki solut alttiimpia siirtyä. Olemme myös osoittaneet, että RhoA tukahduttaminen ARHGAP11A indusoi augmentation suhteellisen Rac1 aktiivisuuden, mikä johtaa kasvuun invasiivisia ominaisuuksia. RNAi-pohjainen esto Arhgap11a vähensi hyökkäyksen ja

in vivo

laajentamiseen syöpiä. Lisäksi analyysi ihmisen näytteiden osoitti merkittäviä säätely ylöspäin

Arhgap11a

paksusuolen syövät, joka korreloi kliinisen invaasio tila. Esillä oleva tutkimus osoittaa, että ARHGAP11A, joka on solusyklin riippuvainen RhoGAP, on kriittinen säätelijä syöpäsolujen liikkuvuutta ja on siten lupaava terapeuttinen kohde invasiivisissa syövissä.

Citation: Kagawa Y, Matsumoto S, Kamioka Y, Mimori K, Naito Y, Ishii T, et ai. (2013) Cell Cycle-Dependent Rho GTPaasina Activity dynaamisesti Säätelee Cancer soluliikkuvuus ja Invasion

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e83629. doi: 10,1371 /journal.pone.0083629

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 29., 2013 Hyväksytty: 5. marraskuuta 2013 Julkaistu: 30 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kagawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustukset-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (22113007), jonka ensimmäinen Program opetus-, tiede-, urheilu ja Japanin kulttuuri, avustuksilla kansainvälisen Human Frontier Science Program (RGY0077 /2011) ; ja avustusta Takeda Science Foundation, Cell Science Research Foundation, Kanae säätiön edistäminen lääketieteen ja Nakajima Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Unlimited laajennus johtuu valitsematta solusyklin etenemisen ja lisäsi tunkeutumisen normaaliin lähialueiden ympäristö on valtava ja hengenvaarallista syöpäsolujen. Itse asiassa, solusyklin säätelyssä on ollut merkittävä tutkimuskohde alalla syövän solubiologian.

Lisäksi syöpä on erittäin dynaamisia ominaisuuksia, kuten hyökkäystä ympäröivien kudosten, soluttautuminen verenkiertoon, ja uraauurtava ja uusi ”markkinarako” Kolonisaatiopotentiaalin kaukana sen alkuperästä [1], [2]. Vaikka tekijöistä syöpäsolun mobilisaatio, kuten Rho perheen pieniä G-proteiineja, on tutkittu laajasti [3], yhdistyksen välillä solukierron säätelyssä ja solujen liikkuvuuden syöpäsolujen jää epäselväksi. Selventämiseksi tämän dynaamisen vuorovaikutuksen olisi arvokas tarkkailla spatiotemporal ominaisuudet solukierron säätelyssä ja solujen liikkuvuuden samanaikaisesti

in vivo

.

Äskettäin Elintensisäistä multiphoton mikroskooppinen työssä dissecting ehjä solun ilmiöitä erilaisten biologisten järjestelmien, kuten immuunivasteen [4], [5], tulehdusreaktioita [6], ja luunmuodostusyksikköjä [7]. Tämä kehittynyt kuvantamisen tekniikka on mahdollistanut tarttua dynaaminen käyttäytyminen elävien solujen kudoksia ja elimiä. Syöpäsolut ovat hyvin liikkuvia ja niiden muuttavien käyttäytymistä on arvioitu käyttämällä tätä kuvantamismenetelmä [8] – [10], vaikka sen korrelaatio proliferatiivinen luonne solujen edelleen heikko.

Tässä onnistuimme visualisointiin dynaaminen tapahtumia syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden käyttämällä Elintensisäistä multiphoton mikroskoopilla. Avulla loisteputki ubikinaa–pohjainen solukierron ilmaisin (Fucci), erityinen fluoresoiva proteiini koetin avulla seurataan solusyklin elävissä soluissa, olemme tunnistaneet tiiviin solusyklin ja mobilisointia ominaisuuksia syöpäsoluja.

tulokset

Dynaaminen visualisointi havaitsee solusyklin liittyvän syöpäsolujen mobilisaatio ja invaasiota

in vivo

Hyödynsimme Elintensisäistä multiphoton mikroskopia ja Fucci teknologia [11] tutkia soluun sykli ja muuttoliike elävässä järjestelmässä. Tässä Fucci järjestelmässä Geminin (GMNN), tumaproteiini rikastunut S /G2 /M vaiheita, ja Cdt1, rikastunut G1 vaiheessa, olivat vastaavasti merkitty kasvihuo- ja punainen fluoresoiva proteiineja (kuvio 1A,

ylempi

paneeli). Fucci ilmentäviä HCT116 ihmisen invasiivisen paksusuolen syövän soluja (kuvio 1A,

alempi

paneeli) ympättiin umpisuoli tai ihonalainen kudos immuunipuolustuksen NOD /SCID-hiiren [12] – [14]. Neljä viikkoa istutuksen jälkeen, kasvainten havaittiin intravitally. Olemme ensisijaisesti havaittu S /G2 /M-vaiheen Fucci-vihreät solut pitkin reuna-alueille syövän invaasio päänsä jälkeen ympättiin umpisuoli seinään (kuvio 1 B). Samanlaisia ​​jakautumista muutokset Fucci-vihreä ja infrapuna-soluja havaittiin, kun syöpäsolut ympättiin suoliliepeen tai paksusuolen seinämään (kuvio S1). Ensisijaisen syöpäsolujen jakautuminen S /G2 /M-vaiheisiin havaittiin myös kirurgisesti resektoitiin ihmisen paksusuolen syövän näytteistä (kuvio S2). Syöpäsolut at invaasio päät olivat ensisijaisesti värjättiin vasta-aineiden GMNN [15], [16] verrattuna ei-kasvain alueita tai kasvaimen keskuksia.

(A) perustaminen ja analyysit HCT116 koolonkarsinoomasoluissa vakaasti ilmentävät Fucci. (

Ylä

) Fucci järjestelmä mahdollistaa seurannan solusyklin elävissä soluissa reaaliaikaisesti. Ytimet soluja G1 /G0, varhainen S, ja S /G2 /M-vaihetta on merkitty punainen, keltainen ja vihreä, vastaavasti. (

Ala

) tilannekuvat Fucci ilmentävien HCT116-soluissa. Mittaviivat edustaa 20 um. (B) Elintensisäinen multiphoton kuvantaminen Fucci-positiivisten HCT116-solut ympätään NOD /SCID-hiiriin. (

Vasen

) edustaja kuva Fucci ilmentävien HCT116-solut istutetaan umpisuoli (vihreä: Fucci-vihreä (MAG), S /G2 /M, punainen: Fucci-red (mKO2), G1, sininen : kollageeni kuidut (harmonista sukupolvi (SHG) kuvantaminen)). Mittaviivat edustaa 75 um. (

Oikea

) kvantifiointi numerot Fucci-vihreä ja infrapuna HCT116-solujen eri alueilla ympätty kasvaimia. Keski- ja reunavyöhykkeet määriteltiin alueilla edelleen tai lähemmäs kuin 75 pm välisestä rajasta kasvain ja normaaleissa kudoksissa, vastaavasti. (C) edustaja kuvan reunalla Fucci ilmentävien HCT116 tuumorimassan. Koko alue (

jäljellä

) ja aikasarjan (

oikeus

) on suurennettu kuvaa (yksi per 400 s) syöpäsolujen valtaavat interstitium (vihreä: Fucci-vihreä (MAG), S /G2 /M, punainen: Fucci-red (mKO2), G1, sininen: kollageeni kuidut (SHG imaging) (katso myös elokuva S1). Todellinen kuvia (

ylempi

paneelit) ja solujen liikeratoja (

alempi

paneelit) esitetään. Mittaviivat edustavat 100 um (

jäljellä

) ja 10 um (

oikea

). (D) edustaja kuva extravasating Fucci ilmentävien HeLa-soluissa. koko alue (

jäljellä

) ja aikasarjan (

oikeus

) on suurennettuna kuvien syöpäsolujen extravasating verisuonista (yksi per 12 min) (vihreä: Fucci-vihreä (MAG) , S /G2 /M, punainen: Fucci-red (mKO2), G1, sininen: kollageeni kuidut (SHG imaging) (katso myös elokuva S2). Todellinen kuvia (

ylempi

paneelit) ja solujen liikeradat (

alentaa

paneelit) esitetään. Mittaviivat edustavat 100 um (

jäljellä

) ja 10 um (

oikea

). (E) Cellular potevilla Fucci-kasvihuo- ja – red-positiivisten solujen mitattiin 4 h (katso myös elokuva S3). (

Left

) Vihreä ja punainen palloja edustavat Fucci-vihreä- ja infrapuna-positiivisten solujen, vastaavasti, ja keltaiset viivat esittävät liittyvien liikeradat. Mittaviivat edustaa 100 um. (

Oikea

) Keskiarvo seuranta nopeudet Fucci-kasvihuo- ja infrapuna-positiivisten solujen. Data (n = 379 Fucci vihreä ja n = 259 ja Fucci punainen) saatiin yksittäisiä soluja kolmessa riippumattomassa kokeessa. Nopeudet kahden ryhmän verrattiin Mann-Whitney

U

-testi (p = 0,0191). Mediaani ja kvartiiliväliä kustakin ryhmästä päällekkäin piste tontteja.

Seuraavaksi tutkimme dynaaminen luonne syöpäsolujen

in vivo

. Fucci ilmentäviä HCT116 syöpäsolut olivat hyvin liikkuvia kun inokulaatiokokein ihonalainen kudos, ja jotkut syöpäsolut olivat aktiivisesti valtaavat näyttäessään ”sukeltaa” ympäröivään interstitium aikana kuvantamisen aika-kurssien (kuvio 1 C; Elokuva S1). Erityisesti lähes kaikki sukellus solut olivat vihreä (kuvio 1 C,

nuolenpäät

), mikä viittaa siihen, että syöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasio saattaa olla riippuvainen solusyklin. Lisäksi voimme havaita niiden muuttoliikkeitä aikana ekstravasaatio etäpesäkkeiden (kuvio 1D; Elokuva S2). Joitakin soluja havaittiin siirtyä pois syöpäsolun aggregaatteja juuttunut sisällä verisuonia, ja nämä olivat myös kaikki vihreä. Tietty aika havainto (enintään 2 h) kasvaimen keskiosassa johti pyydystäminen pohjapinta hidas käyttäytymistä sekä streaming liikettä verenkiertoa, erilaisten syöpäsolutyyppien, joka antoi meille kuvan riittävä määrä solujen kvantifiointi (Kuva 1D; Elokuva S3). Yksityiskohtaiset tilastotiedot solun seuranta nopeuden selvästi osoittaneet, että vihreä syöpäsolujen (S /G2 /M-vaihe) on huomattavasti suurempi liikkuvuus kuin punainen G1 solut (keskiarvo seuranta nopeus 1,39 ± 0,08 um /min Fucci-vihreä vs. 1,09 ± 0,06 pm /min Fucci-punainen; p = 0,00191) (kuvio 1 E). Olemme vahvisti, että tietyn ajan Elintensisäistä kuvantaminen (enintään 3 h) ei vaikuta liikkuvuuden syöpäsolujen (kuvio S3). Seuraamalla yksittäisiä soluja ajanjakson ajan, me sulkenut pois mahdollisuuden, että tällaiset liikkuvuuden muutos S /G2 /M vaiheiden kuvasti liikkeen suhteen sytokineesiin. Nämä tulokset osoittavat, että tietyt molekyylit ilmentyy edullisesti S /G2 /M Fucci-vihreä vaiheiden helpottaa siirtymistä ja hyökkäys syöpäsolujen.

tunnistaminen ARHGAP11A kuin solusykliä riippuva liikkuvuus säätelevä molekyyli

Valaistaan ​​molekyylitasolla perusteella solusyklin riippuvaisten motiliteettia, suoritimme cDNA microarray-pohjainen vertaileva analyysien joukossa Fucci-vihreä ja infrapuna soluja viljeltiin

in vivo

(kuvio 2A). Vuonna mikrosiruanalyysi, 2032 mittapäät (1656 geenit) osoitti kaksinkertaisen muutosta ilmaisun (kuvio 2B, taulukko S1). Kuten odotettua, suurin osa näistä koodaavat proteiineja, jotka liittyvät solujen jakautumista ja mitoosin. Perustuen geeni ontologian luokkia, poimimamme liittyvistä geeneistä solujen liikkuminen 1656 ehdokkaita ja totesi, että karakterisoimattomat Rho GTPaasia aktivoiva proteiini (RhoGAP),

Arhgap11a

, oli ensisijaisesti ilmaistuna vihreä S /G2 /M vaiheessa syöpäsolut (kuvio 2B, taulukko S1). Kaikki kolme koettimien

Arhgap11a

geeni korkealle rankattu (5., 12., ja 41.) keskuudessa 2023 antureista. On osoitettu, että Rho perheen pieniä G-proteiineja, kuten Rho, Rac, ja Cdc42, ja niiden säätelymolekyylejä, kuten RhoGAP, yhteistoiminnallisesti ohjata solujen liikkuvuuden sekä normaaleissa ja syöpäsolujen [17] – [21]. Ensisijaisen ilmaus

Arhgap11a

in Fucci-vihreät solut vahvistettiin sekä mRNA (kuvio 2C) ja proteiinin tasot (kuvio 2D). Lisäksi osoitimme ajasta riippuva asteittainen kasvu

Arhgap11a

ilmaisun aikana etenemisensä solusyklin G1: stä S /G2 /M (kuvio 2E, kuvio S4), vahvistamalla ajatus, että

Arhgap11a

ilmentymistä säätelevät solun syklin etenemisen riippuvaisesti. Solusyklin riippuvainen ekspressio Arhgap11a havaittiin myös muissa koolonsyöpäsolulinjoissa lisäksi HCT116, kuten DLD1, HT29 ja KM125M (kuvio 2F) ja HeLa (kuvio S5) sekä ei-syöpäsolulinjoissa, kuten HEK293-soluissa ( Kuva S6), mikä viittaa siihen, että läsnä on yleistä mekanismia tämän ominaisuuden ilmentymisen säätelyyn

Arhgap11a

monissa solutyypeissä. Selvittämiseksi taustalla oleva mekanismi solusyklin riippuvaista ekspressiota Arhgap11a, olemme edelleen tutkittiin transkriptionaalisen kontrollin tämän geenin. E2F-perheen transkriptiotekijöiden on dokumentoitu toimimaan solusykliä riippuvalla tavalla [1]. Huomasimme, että otaksuttu E2F-sitoutuva sekvenssi (TTTCGCGC) [23] on sijoitettu -27–20 emäsparia transkription aloituskohtaan ja Arhgap11a. Kromatiinin immunosaostus (chip) kokeet osoittivat suoraa yhdistys E2F1 tämän alueen kanssa (kuvio 2G), joka voi olla mukana solusyklin riippuvaisen transkription aktivoitumisen tässä lokuksessa. Lusiferaasireport- testi osoitti E2F1-riippuvaisen transkription aktivointi Arhgap11a promoottorin, joka esti yhdessä RB-proteiinin (kuvio 2 H), mikä viittaa mahdolliseen rooliin E2F /Rb reittejä transkriptionaalinen säätely Arhgap11a. Olemme täysin ymmärtää osallistumista muiden transkriptiotekijöitä koska Arhgap11a oleellisesti ilmaistiin myös G1 vaiheessa (kuvio 2D), vaikka voidaan olettaa Rb /E2F reitin olisi vähintään vastaa kasvuun Arhgap11a ilmentyminen S-vaiheessa.

(A) Fucci signaali-pohjainen microarray analyyseja. Fucci-positiiviset HCT116 solut erotettiin Fucci-vihreä (MAG) – ja Fucci-red (mKO2) – positiiviset solut FACS. mRNA eristettiin näistä soluista ja verrattiin mikrosiruanalyysillä (kaksi väriaine-swap kokeita, antaa neljä itsenäistä mikrosirujen analyysit). (B) yhteensä 2023 mittapäät (1656 geenit) osoitti kahtalainen muutoksia ilmaisun (taulukko S1) (P 0,05). Heistä

Arhgap11a

menestyi erittäin hyvin, ja kaikki kolme koettimia

Arhgap11a

olivat kärkipään koettimia RhoGAPs. Kolme koettimet olivat spesifisiä osoitti juoma on

Arhgap11a

mRNA (

jäljellä

). Kolme merkitty pistettä (# 1, # 2, # 3), sirontakuvaajiin edustavat kertamuutoksia (

oikea

). (C) Cell cycle-riippuvaista ekspressiota

Arhgap11a

mRNA varmistettiin qPCR. Ilmaisu data normalisoitiin

GAPDH

(n = 3). (D) Cell cycle-riippuvaista ekspressiota

Arhgap11a

proteiineja. (

Oikea

) Flow rianalyysit Fucci ilmentävien HCT116-soluissa. Solusyklin profiilit olivat värikoodatut: G1, punainen; varhainen S, keltainen; ja S /G2 /M, vihreä (

ylhäällä oikealla

). DNA sisällöt mitattiin Hoechst33342 fluoresenssi (

alhaalla oikealla

), joka vahvistaa, että Fucci signaaleja oikein edustaa solusyklin tasolla (n = 3). (

Vasen

) Cell cycle-riippuvaista ekspressiota ARHGAP11A ja solusyklin markkereita, kuten määritettiin Western-blottauksella (n = 3). (E) aika-riippuvaisen ekspression

Arhgap11a

aikana etenemisen solusyklin G1: stä S /G2 /M. Fucci-red (mKO2) -positiivinen HCT116-solut lajiteltiin käyttäen FACSAria solulajittelijaa ja viljeltiin osoitettujen ajanjaksojen ajan. Virtaussytometria analyysit (

ylempi

) ja suhteet Fucci värejä (

jäljellä

) esitetään kunakin ajankohtana. (

Oikea

) Suhteellinen ilmentyminen

Arhgap11a

tutkittiin qPCR (n = 6). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA (

p

= 0,0001) ja Bonferronin monivertailutesti (***

p

0,01). (F) Cell cycle riippuvainen

Arhgap11a

ekspressio useissa erilaisissa ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Fucci tuotiin eri ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa (HCT116, DLD1, HT29, ja KM12SM). Kaikissa solulinjoissa,

Arhgap11a

ekspressio oli merkittävää suurempi S /G2 /M (

vihreä

) kuin G1-soluissa (

punainen

). (G) kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määrityksessä anti-E2F1-vasta-aine osoitti, että E2F1 sitoutunut oletetun E2F-sitoutumiskohdan

Arhgap11a

promoottori (n = 3). (H) lusiferaasireporttiterilla määritystä

Arhgap11a

promoottorialue (-500 ep), mukaan lukien E2F-sitoutumiskohta (GTTTCGCGC) -20 bp transkription lähtökohta. Kotransfektion E2F1 parannettu transkriptionaalisen aktiivisuuden, kun taas samanaikainen ilmentyminen Rb estänyt sen. Arvot lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin poikki kutakin koetta, valvoa erot transfektion tehokkuus, Ii-galaktosidaasin.

ARHGAP11A on GTPaasia kiihtyvä proteiinia Rho, mutta ei Rac tai Cdc42, ja estää Rho-riippuvainen soluvälitteinen ilmiöitä

ARHGAP11A jo kloonattu ja lueteltu NCBI-tietokanta, mutta sen molekyylipaino toimintoa ei ole vielä tunnettu. Erityisesti oli epäselvää, onko sen otaksuttu GAP domain käyttää todellakin GTPaasia kiihdyttävä vaikutus. Määrittää sen funktion, me eristetty Halo-merkityn ARHGAP11A (tai halo-Tag ainoastaan ​​kontrollina) ilmaistuna HEK293-soluissa (kuvio 3A), ja niitä inkuboitiin sen

in vitro

useita Rho proteiinit, kuten RhoA , Rac1, ja Cdc42 (kuvio 3B). Tässä määrityksessä, mittasimme GAP aktiivisuuden ilmaisemalla epäorgaanisen fosfaatin vapautuu vuoksi GTP hydrolyysin Rho-proteiinit [24]. Tämä solu-free in vitro -määritys osoitti, että ARHGAP11A suuresti kiihtynyt GTP hydrolyysin RhoA, mutta ei, kun Rac1 tai Cdc42 (kuvio 3B). Määrät aktiivisia muotoja Rho proteiinit myös arvioitiin avattavasta määrityksessä GST-Rhotekin (varten Rho) tai GST-CRIB (RAC ja Cdc42) HEK293-soluissa [25]. Transfektio ARHGAP11A vähensi määriä aktiivista RhoA, RhoB, ja RhoC, mutta ei Rac1 tai Cdc42 (kuvio 3C). Olemme myös vahvistanut, että tämä RhoGAP aktiivisuus olennaisesti poistettava, kun sen otaksuttu GAP domain poistettiin (kuvio 3D). Nämä tulokset vahvistavat selvästi, että ARHGAP11A on GAP spesifinen Rho, mutta ei Rac tai Cdc42, jonka vaikutus välittyy sen ennustettu GAP verkkotunnuksen.

(A) Halo-Tagged ARHGAP11A ja Halo-Tag proteiinit ilmaistaan ​​ja puhdistettu HEK293-soluissa. (B) havaitseminen GTPaasi-aktiivisuus mittaamalla epäorgaanisen fosfaatin vapauttaman GTP hydrolyysin Rho proteiinit. ARHGAP11A tehosti GTPaasi aktiivisuutta RhoA, mutta ei Rac1 tai Cdc42. (C) havaitseminen aktiivisia ja yhteensä muotoja erilaisten Rho-proteiinit (RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, ja Cdc42) HEK293-soluissa, jotka on transfektoitu Halo-ARHGAP11A tai sen valvontaan. Expression of ARHGAP11A alentanut aktiivisten muotojen RhoA, RhoB, ja RhoC. (D) arviointi mutantin ARHGAP11A ilman oletetun GAP verkkotunnuksen (ΔGAP).

Aktiivinen RhoA on osoitettu stimuloivan fokaalisen adheesion ja stressiä kuidun muodostuksen aktivointi Rho-liittyvä proteiini kinaasi (ROCK) ja /tai mDia (kuvio 4A) [26]. Yhtäpitävästi, eksogeeninen ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen RhoA (RhoA-Q63L) [27] ja HCT116-soluissa indusoi poikkeavien nousu F-aktiini stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumista, visualisoidaan paksilliini aggregaattien (kuva 4B). Sen sijaan, suppressio Rho aktiivisuuden CT04 (1 ug /ml), joka on voimakas Rho-inhibiittori [28], vähensi muodostumista rasitukseen liittyviä säikeitä ja paikallisia tarttumista (kuvio 4C). Näissä koeolosuhteissa, ylimääräinen ilmentyminen ARHGAP11A estivät merkittävästi muodostumista sekä F-aktiini stressi kuidut (kuvio 4D,

keskimmäinen

paneeli, ja 4E) ja paikallisia tarttumista (kuvio 4D,

oikeus

paneeli, ja 4F). Expression of ARHGAP11A myös alensi fosforyloidun myosiinikevytketjua (pMLC) (Kuva S7). Yhteenvetona, ARHGAP11A, kuten RhoGAP, tukahdutetaan Rho-sidoksissa olevista ilmiöistä, kuten polttoväli tarttuvuus ja stressi kuitu muodostuksena, HCT116 syöpäsoluja. Olemme myös vahvisti funktio ARHGAP11A HeLa-soluissa (kuvio 4G-I).

(A) Kaaviokuva RhoA-välitteisen, solu- välitteisen reaktioita. (B) vaikutus yli-ilmentymisen villityypin (WT) tai konstitutiivisesti aktiivinen (Q63L) RhoA muodostumista F-aktiini stressi kuidut (visualisoitu käyttäen Alexa 568-phalloidin) ja paikallisia tarttumista (värjätään anti-paksilliini). GFP kotransfektoitiin tunnistaa transfektoiduista soluista. Mittaviivat edustaa 15 um. (C) vaikutus CT04, joka on voimakas RhoA estäjä, muodostumista F-aktiini stressi kuidut (visualisoitu käyttäen rodamiini-phalloidin) ja paikallisia tarttumista (värjätään anti-paksilliini). Tumat värjättiin DAPI. Mittaviivat edustaa 15 um. (D) vaikutus yliekspressio Halo-Tagged ARHGAP11A tai sen valvonnan muodostumista F-aktiini stressi kuidut (visualisoitu käyttäen Alexa 568-phalloidin) ja paikallisia tarttumista (värjätään anti-paksilliini) in HCT116-soluissa. Nuolenkärki osoittavat Halo-Tag-ilmentäviä soluja (merkitty Oregon vihreä konjugoidulla Halo-Tag ligandi). Mittaviivat edustaa 10 um. (E) kvantifiointi keskimääräisen intensiteetin F-aktiini in Halo-ohjaus (n = 80) ja Halo-ARHGAP11A ilmentävien (n = 80) HCT116-soluissa. Tiedot koottiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (F) kvantifiointi paikallisessa tarttumisessa Halo-ohjaus (n = 80) ja Halo-ARHGAP11A ilmentävien (n = 80) HCT116-soluissa. Tiedot koottiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (G) vaikutus yliekspressio Halo-Tagged ARHGAP11A tai sen valvonnan muodostumista F-aktiini stressi kuidut (visualisoitu käyttäen Alexa 568-phalloidin) ja paikallisia tarttumista (värjätään anti-paksilliini) HeLa-soluissa. Nuolenkärki osoittavat Halo-Tag-ilmentäviä soluja (merkitty Oregon vihreä konjugoidulla Halo-Tag ligandi). Mittaviivat edustaa 10 um. (H) kvantifiointi keskimääräisen intensiteetin F-aktiini in Halo-ohjaus (n = 80) ja Halo-ARHGAP11A ilmentävien (n = 80) HeLa-solut. Tiedot koottiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. (I) kvantifiointi määrä paikallisessa tarttumisessa Halo-ohjaus (n = 40) ja Halo-ARHGAP11A ilmentävien (n = 46), HeLa-solut. Tiedot koottiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

ARHGAP11A stimuloi syövän soluliikkuvuus tehostamalla Rac aktiviteetti

soluliikkuvuus tiedetään vastavuoroisesti säätelevät erilaiset Rho perheen pieniä G-proteiinit [29] . Kun taas aktiivinen RhoA (tai Rho tai RhoC) stabiloi solun tukirankojen tehostamalla stressisäikeiden ja fokaalisen adheesion muodostumista, aktivoituminen Rac1 (tai Cdc42) herkistää solut joustava ja mobiili, mikä johtaa muodostumiseen lamellipodioihin tai filopodia [29]. N toiminta torjua proteiinien RhoA ja Rac1 toisiaan ohjataan [30], ja esto yhden tuloksia suhteellisen augmentation muiden (kuva 5A). Täällä, käyttämällä Raichu-Rac1, FRET-pohjainen biosensori Rac1 aktiivisuutta yksisoluiset tason [31], [32], tarkastelimme Rac1 aktiivisuutta HCT116-soluissa. Rac1 aktiivisuus oli merkitsevästi suurempi ARHGAP11A ilmentävien solujen verrattuna vale-transfektoitujen (transfektoitu Halo-Tag vain) tai ei-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5 B ja C), mikä viittaa siihen, että mekanismi, jolla tukahduttaminen Rho toiminta johtaa vasta- aktivointi Rac1 klo yksisoluisia tason. Samanlaisia ​​ARHGAP11A aktivaatio Rac1 havaittiin myös HeLa-soluissa (kuvio S8).

(A) Schema edustaa tasapaino RhoA ja Rac1 solun kulkua. (B) analyysit Rac1 aktiivisuutta yksisoluiset tasolla HCT116 soluissa, jotka ilmentävät Halo-ARHGAP11A tai sen Halo valvontaa. Edustavat kuvat Raichu-Rac1 ilmentävien HCT116 soluilla Halo-ohjaus (

vasemmalle

) tai halo-ARHGAP11A transfektio (

oikeus

) olosuhteet. Rac1 aktiivisuutta tarkkailtiin CFP /YFP FRET tunnusluvut on saatu Raichu-Rac1. Expression of Halo-Tag tunnistettiin TMR-konjugoitu Halo-Tag ligandi. Mittakaavapalkki edustaa 5 um. (C) kvantifiointi FRET suhdelukuja Halo-ohjaus (n = 30) ja Halo-ARHGAP11A ilmentävien (n = 30) HCT116-soluissa. (D) Kolmiulotteinen kulttuurin HCT116 transfektoitu Halo-ohjaus tai halo-tagged ARHGAP11A täydennettynä Y27632 (Halo-ohjaus vain). Mittakaavapalkki edustaa 50 um. (E) osuudet pyöreän tyyppinen HCT116 3D kulttuuri transfektoitu Halo-ARHGAP11A tai halo-ohjaus. Round-tyypin solut laskettiin kolmen näkökentän kunkin kolmen erillisen kokeen. Pylväät edustavat keskiarvoa ± s.e.m. (F)

In vitro

invaasiomääritys 3D Matrigel levy. Siirtyneet solut näkyviin värjäämällä kulttuurin kalvo Diff Quik tahra (Dade Behring). HCT116 transfektoitu Halo-ARHGAP11A tai halo-ohjaus, ja villityypin HCT116 käsiteltiin Y27632 käytettiin määrityksessä. (G) kvantifiointi invaasion indeksit 3D Matrigeliä levyn määrityksissä. Invasion indeksit laskettiin yhtälön esitetty menetelmät -kappaleessa. Pylväät edustavat keskiarvo ± s.e.m.

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus Rho inhibition ARHGAP11A valvonnasta syöpäsolun morfologia ja liikkuvuus. Analysoida morfologiset ominaisuudet syöpäsolujen, me käytettyä kolmiulotteisen (3D) matrigeelin kulttuuri (kuva 5 D ja E) [33]. Tuloksissa, yli-ilmentyminen ARHGAP11A johti karamaisen muotoja HCT116-solujen, jotka edustavat tunkeudutaan-altis fenotyyppi. Vastaavia morfogeeniseen muutoksia voidaan myös havaita, kun Rho-välitteistä signalointia estyi Y27632, voimakkaan ROCK-inhibiittori [34]. Olemme edelleen mitattiin

in vitro

muuttavien ominaisuuksien HCT116 solun 3D Matrigel levyille (kuva 5 F ja G) [35], ja yhtäpitävästi, yliekspressio ARHGAP11A tai Y27632 hoito tehostetun migraatio HCT116

in vitro

. Toisaalta, voimakas inhibitio Rho aktiivisuuden korkea pitoisuus Y72632 estetty siirtymistä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että riittävä RhoA esto kuten saavuttaa yli-ilmentyminen ARHGAP11A tehostetun muuttavien aktiivisuutta HCT116 syöpäsoluja.

toiminnallinen vaikutus ARHGAP11A mobilisointia koskevat HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa

in vivo

ja mahdollisuus ARHGAP11A terapeuttisena kohteena invasiivisissa syövissä

analysoimiseksi funktio ARHGAP11A, me syntyy HCT116 solulinjoja, joissa ARHGAP11A ilmentyminen oli stabiilisti vähennetään shRNA (SH). Alennettu ilmentyminen ARHGAP11A vahvistettiin sekä mRNA: ta (kuvio 6A) ja proteiini (kuvio 6B) tasoilla. BrdU lisääntymisen määritys ei todettu eroja valvontaa ja SH-soluissa, mikä viittaa siihen, että ARHGAP11A ei vaikuta solun sisäinen lisääntymistä

in vitro

(kuvio 6C). Toisaalta, joka on

in vitro

solussa invaasiomääritys kanssa Matrigel levy osoitti, että hyökkäys kyky väheni merkittävästi SH-soluissa (kuvio 6D). Seuraavaksi tutkimme roolin ARHGAP11A in

in vivo

liikkuvuudessa siirrostettua syöpäsoluja. Käyttämällä Elintensisäistä multiphoton kuvantamismenetelmiä, osoitimme, että SH-solut olivat vähemmän liikkuvia kuin kontrolli solut ihon alle ympätty kasvaimissa, mikä osoittaa selvästi, että ARHGAP11A säätelee motiliteettia HCT116-syöpäsolujen in vivo (kuvio 6E, elokuva S4). Olemme myös havainneet, että SH-solut olivat vähemmän voi siirtyä pois verisuonista kuin oli kontrolli soluja aikana ekstravasaatio verta asuvien syöpäsolujen (kuvio 6F). Lopuksi tutkittiin miten ARHGAP11A kasvaimen laajentamiseen

in vivo

(kuvio 6G). ARHGAP11A-Knockdown SH-solut osoittivat vähemmän etenemistä päivänä 28 verrattuna villityypin solujen (SH # 1, 6,47 ± 0,33 mm; SH # 2, 6,66 ± 0,32 mm, villityypin, 9,76 ± 0,82 mm, ja SH ohjaus, 9,38 ± 0,97 mm).

(A) perustaminen ARHGAP11A-pudotus HCT116 solulinjoissa (SH # 1, # 2). Vähentynyt ARHGAP11A mRNA ilmentyminen varmistettiin qPCR. (B) ARHGAP11A proteiinin ilmentymistä hallinnassa ja sh-pudotus HCT116-soluissa arvioitiin Western-blottauksella. (C) BrdU runsaudenmäärityksessä näistä HCT116 solulinjoista. Pylväät edustavat keskiarvoja ± s.e.m. (D)

In vitro

invaasiomääritys 3D Matrigeliä elylevyillä. Pylväät edustavat keskiarvoja ± s.e.m. (E)

In vivo

toiminnalliset analyysit ARHGAP11A-pudotus HCT116-soluissa. Edustavat kuvat ohjaus (

vihreä

) ja ARHGAP-taintumisen (

punainen

) HCT116-solut inokuloidaan subkutaanisesti NOD /SCID-hiirten (

ylempi

). Raaka ”yhdistettiin” kuvaa ja kuvien uutetaan vihreä ja punainen kanavat näkyvät. Solun liikkuvuus mitattiin 7 tuntia. Green ja punaiset ympyrät edustavat ohjaus ja ARHGAP11A-knockdown SH # 1 HCT116-soluissa, vastaavasti, ja keltaiset viivat osoittavat niiden liikeradat (katso myös elokuva S4). Mittakaavapalkki edustaa 50 um. (

Ala

) Keskiarvo seuranta nopeuksia valvonta- ja SH-soluissa. Data (n = 440 valvontaa ja n = 215 SH # 1) saatiin yksittäisiä soluja kahdessa riippumattomassa kokeessa. Nopeudet kahden ryhmän verrattiin Mann-Whitney

U

-testi (p = 0,0034). Mediaani ja kvartiiliväliä kustakin ryhmästä päällekkäin piste tontteja. (F) ekstravasaatio ohjaus (

vihreä

) ja SH # 1 (

punainen

) HCT116-soluissa. (

Left

) Vihreät solut edullisesti havaittu ekstravaskulaariseen tilaan, mikä viittaa suuri teho ekstravasaatioon. (

Oikea

) Keskimääräinen määrä kudokseen solua kohti näkökentässä. Tiedot poimittiin 10 näkökentän. (G) In vivo kasvaimen laajenemisen HCT116-soluja. Villityypin ohjaus HCT116-solut (

musta

ympyrät) ja HCT116-solut käsiteltiin salattu ohjaus shRNA (

musta

neliöt), SH # 1 (

punainen

ympyrät), ja SH # 2 (

punainen

neliöt) esitetään. Syöpäsolut (1,0 x 10

6/100 ui PBS) olivat pääasiassa ympättiin ihonalaisen kudoksen. Kasvainten koot mitattiin joka viikko 4 viikkoa siirrostuksen jälkeen. Data edustaa keskiarvoja ± s.e.m. Viiden erillisen kokeen. Tiedot analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA (

p

= 0,0037). (H) Vähentynyt ilmentyminen ARHGAP11A vuonna HCT116-soluissa käsitelty siRNA kohdistaminen ARHGAP11A (arvioitiin qPCR). (I)

In vivo

siRNA hoidossa HCT116 kasvaimia. Ohjaus HCT116-solut (5,0 x 10

6) istutettiin NOD /SCID-hiiriin, ja 1. viikkoa myöhemmin käsiteltiin PBS (

mustaksi

ympyrät), atelokollageenin (

musta täytetty

kolmiot), salattu ohjaus siRNA plus atelokollageenia (

mustaksi

neliöt), tai kaksi siRNA (# 1 ja # 2) vastaan ​​ARHGAP11A plus atelokollageenia (

punainen avoimet

ympyrät ja neliöt, vastaavasti). Kasvainten koot mitattiin viikoittain. Data edustaa keskiarvoja ± s.e.m. Viiden erillisen kokeen. Tiedot analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA: lla (

p

= 0,0001). (J) Kuvia tuumorit leikattiin 35. päivänä (

jäljellä

). Mittakaavapalkki edustaa 10 mm. (

Oikea

) edustaja kuvia SCID hiirillä HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, 35 päivän kuluttua hoidon siRNA (siRNA # 1) tai sekoitettua RNA duplex (ohjaus) yhdessä atelokollageenia. Mittakaavapalkki edustaa 10 mm.

Seuraavaksi arvioimme mahdollisuuksia ARHGAP11A uutena terapeuttisena kohteena inhibitiolle syövän etenemisen.