Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lung adenokarsinooma on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien sekä miehillä ja naisten maailmassa. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet diagnosoinnissa ja hoidossa, kuolleisuus kokonaispituudeltaan 5 vuoden pysyvyys on vain 15%. Tämä korkea kuolleisuus johtuu luultavasti aikaisin etäpesäkkeitä. Vaikka useita tunnettuja merkkiaineita korreloi huono /etäpesäke ennusteen keuhkoadenokarsinooma potilailla immunohistokemiallisesti ilmoitettiin, molekyylimekanismeihin keuhkoadenokarsinooma kehityksestä ovat edelleen epäselvää. Tutkitaan uusia molekyylimarkkereita ja niiden signalointireiteissä on ratkaiseva avustaisivat hoitoon keuhkoadenokarsinooma potilaista.

Menetelmät /Principal Havainnot

tunnistaa uusia keuhkoadenokarsinooma liittyvien /etäpesäke geenejä ja selvittämään taustalla molekyylitason mekanismeja näiden tavoitteiden keuhkosyöpä etenemisen, loimme bioinformatiikan järjestelmä koostuu integroimalla kolmesta geeniekspressioprofiili aineistoja, kuten pareittain keuhkoadenokarsinooma, toissijainen etäpesäkkeitä vs. hyvänlaatuisia kasvaimia, ja sarjan invasiivisen solulinjoissa. Niistä romaani tavoitteita tunnistettu, FLJ10540 yliekspressoitui keuhkosyövässä kudosten ja liittyy solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lisäksi käytimme kaksi koekspressoimalla tunnistamis-, jossa reitin FLJ10540 oli mukana. Keuhkojen adenokarsinooma array profiilit ja kudosten microarray IHC värjäys tiedot osoittivat, että FLJ10540: n ja VEGF-A, samoin kuin FLJ10540 ja fosfo-AKT osoittavat positiivista korrelaatiota, vastaavasti. Stimulointi keuhkosyövän solujen VEGF-A aiheuttaa lisääntymiseen FLJ10540 proteiinin ilmentymisen ja parantaa kompleksimuodostuksesta PI3K. Hoito VEGFR2 ja PI3K inhibiittorit vaikuttavat solumigraation ja invaasiota aktivoimalla PI3K /AKT-reitin. Lisäksi knockdovvn FLJ10540 destabilizes muodostumisen P110-α /P85-α- (PI3K) kompleksi, mikä edelleen tukee osallistumista FLJ10540 että VEGF-A /PI3K /AKT-reitin.

Johtopäätökset /Merkitys

Tämä havainto asettaa vaiheessa lisätestejä FLJ10540 uutena terapeuttisena kohteena hoitoon keuhkosyöpä ja voi edistää uusien hoitostrategioiden jotka pystyvät estää PI3K /AKT-reitin keuhkojen syöpäsoluja.

Citation: Chen CH, Lai JM, Chou TY, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA ylössäätelee FLJ10540 ja säätelee Migration and Invasion of Lung Cancer kautta PI3K /AKT Pathway. PLoS ONE 4 (4): e5052. doi: 10,1371 /journal.pone.0005052

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 joulukuu 2008; Hyväksytty: 12 helmikuu 2009; Julkaistu: 01 huhtikuu 2009

Copyright: © 2009 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain avustusta Chang Gung Hospital (CMRPD140211) ja NSC (94-2752-B-010-002-PAE) Chen-Kung Chou, NSC (Program for Interdisciplinary Research Project: NSC97-2627-B-010 -011 Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 ja J.-M. Lai), ja NSC97-3112-B-010-025-CC1, Taichung Veteran General Hospital (TCVGH-957326D), ja edistävän ohjelman Academic Excellence yliopistojen (National Yang Ming University) Chi-Ying Huang, ja NSC (95-3112-B-075-002 ja 96-3112-B-075-001) Yu-Chung Wu. Gene Expression Analysis Core Facility tukee National Research Program for Genomic Medicine (NRPGM), National Science neuvosto, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien sekä miesten ja naisten maailmassa [1] – [2]. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet diagnosoinnissa ja hoidossa, kuolleisuus ovat edelleen korkealla, joiden kokonaispituus 5 vuoden pysyvyys on vain 15%. Leikkaus on edelleen ensimmäinen valinta hoidon paikallisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja tarjoaa parhaan mahdollisuuden katua. Kuitenkin, kun ensimmäistä kertaa todettiin, useimmat potilaat jo edennyt sairaus, ja vain 35% potilaista, joilla ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ovat oikeutettuja resektio [3]. Novel molekyylimarkkerit tai tavoitteita auttamiseksi diagnosoinnissa ja hoidossa on ratkaiseva parantamiseksi kuolleisuutta.

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ovat tärkeitä alueita tutkimuksen määrittämiseksi aggressiivinen fenotyyppi ihmisen syövistä, jotka ovat tärkeimpiä syitä syöpäkuolemista [4]. Prosessi etäpesäke on hyvin monimutkainen ja sitä pidetään myöhään tapahtuma kasvainten synnyssä, eli solut lisääntyvät, menettävät yhteyden viereisiin soluihin, kulkeutua interstitiaalinen matriisi, hyökätä verisuonten ja imusuonten, ja tallettaa imusolmukkeisiin. Muuttoliike ja hyökkäys solut näyttävät olevan tulosta monimutkaisesta vuorovaikutuksesta lukuisia proteiinin perheitä, jotka osallistuvat tähän prosessiin. Mekanismit solujen liikkumisen ovat tärkeitä paitsi osana perus solu- ja kehitysprosesseja, mutta myös synnyssä erilaisten sairauksien [5]. Tullakseen metastaattinen, kasvainsolut on lisättävä ilmentymistä eri etäpesäkkeiden edistäviä geenejä. Kuitenkin keuhkosyöpä, molekyylit ja mekanismeista solumigraation tai invaasion edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

Tuotanto ja eritys VEGF-A on yleisesti havaittu aggressiivisin kasvaimia, ja ilme VEGF-A: syvästi vaikuttaa ennuste syöpäpotilaiden, mukaan lukien keuhkosyöpä, [6] – [8]. VEGF-A on yksi voimakkaimmista stimulaattoreita angiogeneesin tunnistettu tähän mennessä, vaikuttaa endoteelisolujen verisuonten läpäisevyyttä, proliferaatio, ja liikkuvuus [7]. Vaikka eri solunsisäiset signaalireitit on ehdotettu välittävän biologiset aktiivisuudet VEGF-A: endoteelisoluissa, signalointi tapahtumia osallistuu solujen vaeltamiseen ja invaasion vasteena VEGF-A stimulaation keuhkosyöpä ei täysin tunneta.

FLJ10540 on useita nimiä, kuten CEP55 [9], C10orf3 [10], ja URCC6. CEP55 merkitty GFP-C paikantuu sentrosomimäärän interfaasivaiheessa soluissa, että kara midzone aikana Anaphase, sekä keskiosalla aikana sytokineesiin [9], [11] – [12]. Lisäksi CDK1, ERK2 ja PLK1 yhteistyötä fosforylaation CEP55 mitoosin aikana, joka tarvitaan oikein mitoosi lokalisointi CEP55 ja sen toiminta aikana sytokineesiin [9]. FLJ10540 on yli-ilmentynyt aikana ihmisen paksusuolen [10] ja maksasyövän [13] kasvainten synnyssä, viittaa siihen, että se voi toimia onkogeenin kasvainten kehittymiseen. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentyminen FLJ10540 edistää solun transformaatio aktivoitumisen kautta PI3K /AKT [13]. Ei kuitenkaan laajamittainen analyysi FLJ10540 ilmaisun ja sen ennusteeseen viittaavia ja toiminnallinen merkitys ihmisen keuhkosyöpä on suoritettu.

aggressiivinen käytös pahanlaatuisten syöpäsolujen määritetään monimutkainen joukko signalointipolkujen jotka säätelevät keskeisiä toimintoja , kuten kasvuun, selviytyminen, muuttoliike, ja hyökkäystä. PI3K /AKT signalointireitille on olekaan yhteydessä kaikki neljä näistä vastauksista. [14] – [17]. Lisänäyttöä tärkeydestä PI3K /AKT signalointia syöpä tulee tutkimuksiin, jotka on havaittu yli-ilmentymisen ja hyperactivation PI3K /AKT monenlaisia ​​ihmisen kasvaimista, kuten keuhkosyöpä, ja tämä liittyy usein huonoon ennusteeseen [18]. Kertyvät todisteita aiemmista selvityksistä viittaa mahdolliseen rooliin PI3K /AKT maahanmuutto- ja hyökkäys eri solutyyppejä, mukaan lukien keuhkosyöpä [19], maksasyöpä [20], rintasyövän [21], ja haimasyövän [22].

tässä tutkimuksessa osoitamme, että FLJ10540 yliekspressoituu keuhkoadenokarsinooma ja että ektooppinen ilmentyminen FLJ10540 edistää solujen muuttoliikettä ja invaasiota. Ihmisen keuhkoadenokarsinooma näytteitä, FLJ10540 korreloi positiivisesti VEGF-A: ilmaisu, joka määritetään geeniekspressioprofilointi ja IHC värjäytyminen kudossiruina. Lisäksi stimulaatio VEGF-A johti lisääntymiseen FLJ10540-proteiinin ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla CL

1-0 keuhkosyövän soluja. Lisäksi FLJ10540 osittain translokoituu sytoplasmasta solukalvoon ja parantaa kompleksin muodostumisen PI3K mukaisesti VEGF-A stimulaatiota. Lopuksi, VEGF-A vaikuttaa solumigraation ja invaasiota aktivoimalla FLJ10540 /PI3K /AKT-reitin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että FLJ10540 yliekspressio liittyy parannettu metastaattista potentiaalia ja ne voivat toimia mahdollisen uuden terapeuttinen kohde keuhkoadenokarsinooma.

Tulokset

Kohonnut FLJ10540 ilmentyminen keuhkoissa adenokarsinooman ja invasiivisen keuhkosyöpäsolua linjat

merkittävä haaste postgenomiset aikakausi on määrittää, kuinka priorisoida differentiaalisesti ilmaisi ja huonosti tunnettu tavoitteiden syöpään liittyvien microarray profilointi tutkimuksissa. Täällä voimme perustaa bioinformatiikka foorumin yhdistämällä kolme erilaista microarray aineistoja paljastaa keskeisten sääntelyviranomaisten mukana etäpesäke keuhkosyöpään. Kuvio 1 esittää kaavamaisen tietojen integroinnin lähestymistapoja ja FLJ10540 ilmaisun tietoja eri luokkiin. Ensinnäkin, näytteet 26 sairastavien potilaiden keuhkojen adenokarsinooma, vahvisti histopatologisesti, alistettiin Affymetrix microarray profilointia. Perustuen 26 ensisijaisen keuhkoadenokarsinooma yksilöitä, 826 ulos 22283 differentiaalisesti ilmaisi selostukset vierekkäisten ei-kasvain ja kasvain alueet ryhmittyivät Wilcoxonin testi (

p

0,01), joka perustuu kaksinkertaiseksi erot ja testattiin käyttämällä Benjamini ja Hochberg vääriä löytö korko korrelaatio (

p

0,01). Nämä molekyylien muotokuvia, jotka sisältävät 192 säädelty ja 634 alassäädetty selostukset, voisi menestyksekkäästi erottaa potilaiden viereisen ei-kasvain ja kasvain alueilla hierarkkinen klusterointi (kuvio S1A). Toiseksi julkinen pääsy microarray data (ladata GEO) hankittiin eri microarray aineistoja, jotka normalisoitiin kvantiiliestimaattorilla normalisointi käyttämällä R perustaa mahdollisten etäispesäkkeellisestä biomarkkereiden tunnistamiseen alustalla. Vertasimme 225 toissijainen etäpesäkkeitä (mukaan lukien 20 kasvainetäispesäkkeiden että imusolmuke ja 200 etäpesäkkeitä) ja 30 hyvänlaatuisia saada sarjaa mahdollisia metastaattisen onkogeenien (871) ja metastaattinen synnyssä (1042). Lopuksi priorisoida tavoitteet ja vahvistamaan meidän etäpesäkkeiden liittyvien geenien solulinjoissa, sarja keuhkoadenokarsinooma solulinjojen, mukaan lukien CL

1-0, CL

1-1, CL

1-5 ja CL

1-5-F4, yhä astetta invaasiokyvyn [23], altistettiin myös microarray profilointia. Kaikkiaan 6238 selostukset olivat korkeammat ekspressiotasot korkean hyökkäyksen kyky solulinjassa CL

1-5-F4 kuin vanhempien CL

1-0 solua. Leikkauspiste kolmen aineistojen paljastaa monia uusia tavoitteita. Olemme tunnettu geenit, jotka ovat konservoituneita ainoastaan ​​selkärankaisilla, mutta ei selkärangattomat, paljastaa joitakin uusia ihmisen syöpää erityisiä poikkeavuuksia. Tämän seurauksena olemme keskittyneet huonosti tunnettu geeni

FLJ10540

.

(A, vasen paneeli) Mikrosiruanalyysi ekspressiomalleja

FLJ10540

keuhkojen adenokarsinooman potilailla normalisoitiin vastaan ilmaisua kuvioita HG_U133A pelimerkkejä. N: viereisen ei-tuumorikudoksia; T: tuumorikudoksia. Boxplot esittää datan jakelun ryhmittely luokittelua ja osoittaa, että on tilastollisesti merkittävä ero (

p

0,0001) välillä kasvainkudoksessa ja viereisen nont-umor kudosten samasta keuhkosyöpä potilaalle. (A, oikea paneeli) mRNA tasot

FLJ10540

näytteissä 16 keuhkosyöpäpotilaita määritettiin Q-RT-PCR. Tulokset normalisoitiin suhteessa ekspressiotasot

GAPDH

mRNA kussakin pariksi näytteen ja piirretään boxplot. (B) Mikrosiruanalyysi ekspressiomalleja

FLJ10540

verrattiin joukossa 30 hyvänlaatuisia kasvaimia, 20 kasvaimen metastaasit imusolmuke, ja 200 etäpesäkkeitä, ja ne osoittivat, jossa boxplot. (C, vasen paneeli) mRNA tasot

FLJ10540

määritettiin Q-RT-PCR keuhkosyövässä solulinjoissa. Tulokset normalisoitiin suhteessa tasoon

GAPDH

mRNA kussakin solulinjassa. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (C, oikea paneeli) Yhteensä proteiini eristettiin CL

1-0 ja CL

1-5-F4 solujen ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-FLJ10540. β-aktiini käytettiin sisäisenä latauskontrollina.

FLJ10540

näyttelyesineitä sääteli ekspressiokuvioita keuhkossa adenokarsinoomat (kuvio 1A, vasen paneeli) ja metastaattinen allekirjoitukset (kuvio 1 B). Vahvistaa geenin ilmentymisen profilointi tiedot

FLJ10540

, Q-RT-PCR suoritettiin 16-pareittain keuhkoadenokarsinooma kasvain ja viereisen ei-kasvain näytteitä. Kuvio S1B osoittaa, että yliekspressio

FLJ10540

oli havaittavissa meidän keuhkoissa potilaan näytteitä, 15 ulos 16 keuhko- potilaan kasvaimissa (94%), mikä osoittaa suurempaa signaalin jälkeen normalisoinnin

GAPDH

samanarvoisesta mallin lastaus. Keskimääräinen ekspressiotaso

FLJ10540

keuhkojen adenokarsinooman oli 8 kertaa suurempi kuin viereisillä ei ollut kasvainta keuhko- kudosnäytteet, analysoituna boxplot (kuvio 1A, oikea paneeli). Me seuraavaksi todentaa ilmentymistä FLJ10540 edustavissa ja juuri jäädytetty keuhkoadenokarsinooma ja viereisen ei-kasvainnäytteestä immunohistokemiallisesti värjäys käyttäen anti-ihmisen FLJ10540 aineita. Meidän tiedot osoittavat, että taso FLJ10540 on kasvanut tuumorin näytteissä, verrattuna, että viereisen ei-tuumorikudoksissa (tuloksia ei ole esitetty).

ilmentäminen FLJ10540 sarjassa invasiivisen ihmisen keuhkon adenokarsinoomassa solulinjat

aikana keuhkojen kasvainten kehittymiseen, yksi kriittisimmistä siirtymät on etenemistä

in situ

ja invasiivisen karsinooman. Tutkimaan mahdollista roolia FLJ10540 vuonna invasiivisuus keuhkojen adenokarsinoomasolua, ensin tutkinut ilmaus

FLJ10540

paneelissa solulinjoista, CL

1-0, CL

1-1 CL

1-5, ja CL

1-5-F4, joko alhaisen tai korkean invasiivisia kykyjä, kuten aiemmin on kuvattu [23] Q-RT-PCR. Tulokset osoittivat, että tasot

FLJ10540

mRNA olivat suuret CL

1-5 ja CL

1-5-F4 soluja, jotka ovat korkeat invasiivisia ja metastaattinen kykyjä, mutta olivat huonompi alhaisen invasiivisia CL

1-0-solut (kuvio 1 C, vasen paneeli). FLJ10540 proteiini tasot olivat selvästi korkeampia erittäin invasiivisia CL

1-5 soluissa kuin matalan invasiivisia CL

1-0 soluja, kuten Western blot -analyysillä (kuvio 1 C, oikea paneeli). Tulokset osoittivat, että säätelyä FLJ10540 mRNA: ta ja proteiinin ilmentyminen korreloi positiivisesti invasiivista kykyä keuhkosyövän soluja, nostaa sitä mahdollisuutta, että säätelyä

FLJ10540

voi johtaa joihinkin poikkeavuuksia löydetty ihmisen keuhkojen adenokarsinooma .

yli-ilmentyminen FLJ10540 edistää solujen muuttoliikettä ja invaasiota

Koska FLJ10540 yliekspressoituu keuhkoadenokarsinooma ja erittäin invasiivinen keuhkosyövän solulinjaa, näytti mahdolliselta, että sen ilmentyminen voi vaikuttaa solun liikkuvuus. Selventää roolia FLJ10540 liikuntakyvyn nisäkkään soluissa, me tutki yliekspressio FLJ10540 pystyi vaikuttamaan solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Kaksi eri solutyyppejä käytettiin arvioimaan tämän mahdollisuuden. Ensinnäkin CL

1-0 soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti hemagglutiniini (HA) hännitetty FLJ10540 perustettiin. Useita vakaa transfektantit yhä tasojen FLJ10540 proteiinin valittiin (kuvio 2A, vasen paneeli) lisätutkimuksiin. Mielenkiintoista, FLJ10540 yliekspressio CL

1-0 soluihin liittyvä silmiinpistävän muuttunut solujen morfologia. FLJ10540 yliekspressoitu kloonit väheni solun koon ja näytti olevan kara-muotoinen ja lisäsi solujen välinen erotus verrattuna vehikkelikontrolliin klooneja, jotka oli pyöreä (kuvio 2A, keskimmäinen paneeli). Kuitenkin leviämisen nopeus, määritettynä MTT-määritystä, ei ollut merkitsevästi erilainen kuin ajoneuvon ohjaus- tai soluja, jotka ilmentävät FLJ10540 aikana 24 tuntia (kuvio 2A, oikea paneeli). Jotta voidaan tutkia vaikutuksen FLJ10540 ihmisen keuhkosyövän solumigraatio, stabiilit solulinjat ilmentävät HA-FLJ10540 tai ajoneuvon hallinnan ympättiin Transwell kammiot. Tulokset osoittivat, että FLJ10540 CL

1-0-vakaa transfektantit voisivat lisätä muuttoliike, mitattuna TranswellTM migraatiokokeessa; tämä verrattiin ajoneuvon ohjaus, jossa hyvin harvat solut vaelsivat (kuvio 2B, vasen yläpaneeli). Määrällisesti muuttoliike kyky FLJ10540 CL

1-0-vakaa transfektantit oli noin 6-7 kertaa suurempi kuin ajoneuvon ohjaus (kuvio 2B, oikea yläpaneeli). Me seuraavaksi toteutti

in vitro

invaasiomääritys käyttäen Matrigel päällystettyä sulkusuodin. Jälkeen 24 tunnin inkubaation Matrigel päällystettyä TranswellTM kammio, FLJ10540 CL

1-0-vakaa transfektantit olivat tunkeutuneet tyvikalvon materiaalin läpi ja johdetaan huokoset päästä alapintaan suodattimen (kuvio 2B, vasen alapaneeli) . Samoin FLJ10540 CL

1-0 ilmentävät solut osoittivat 10-12 kertaa suurempi hyökkäys kyky kuin ajoneuvon ohjaus soluja (kuvio 2B, oikea alapaneeli).

(A, vasen paneeli) HA-koodattu -FLJ10540 vakaa klooneja CL

1-0 soluja perustettiin. Solulysaatit altistettiin immunoblot-analyysi anti-HA-vasta-aine. (A, keskimmäinen paneeli) Phase-kontrasti kuvia yksikerroksisiin CL

1-0 soluja, jotka ilmentävät FLJ10540 ja ajoneuvon hallinnan näytettiin. (A, oikea paneeli) Voit mitata solujen kasvu, 5 x 10

3 solujen ajoneuvon-CL

1-0 ja CL

1-0-FLJ10540 stabiileja klooneja maljattiin päivä 0 96- kuoppalevyille 10% FBS: ää. Solut laskettiin osoitettuina ajankohtina MTT-määrityksellä (OD

570) määrittää solun kasvua. Data normalisoitiin vastaan ​​OD

570 arvoa päivänä 0. kasvuvauhti CL

1-0 soluissa esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (B, ylempi paneeli) migraatiokokeessa, 5 x 10

3 solujen ajoneuvon-CL

1-0 ja CL

1-0-FLJ10540 stabiileja klooneja ympättiin yläosaan Transwell insertin . 24 tunnin kuluttua solut on yläpuolinen raaputettiin, ja solut, jotka vaelsivat pohjaan kiinnitettiin ja värjättiin Giemsa. Siirtyminen suhteellinen-kertainen ajoneuvon-CL

1-0 ja CL

1-0-FLJ10540 vakaa kloonien normalisoitui kanssa ajoneuvon hallinnan ja esitetään kaavamaisesti. (B, alapaneeli) Jotta invaasiomääritys, 1 x 10

4 solut ympättiin jälkeen Matrigeliä lisättiin. Invaasio suhteellinen-kertainen vakaan kloonin normalisoitui vastaan ​​ajoneuvon soluihin ja edustaa kaavamaisesti. Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

Toiseksi, jotta klonaalisia vaikutuksia, retrovirus–pohjainen Flag-merkitty FLJ10540 infektoitiin osaksi RK3E solulinjassa (kuvio S2A), joka oli aiemmin käytetty menestyksekkäästi arvioida kulkeutumista tai invaasio aiheuttama erilaisten geenien ja signalointireittejä, kuten fibroblastikasvutekijä 9 (FGF9) [24], k-ras [25], ja Snail [26]. RK3E soluilla useita piirteitä epiteeli, kuten lähes normaali karyotyyppi ja alhainen tausta solumigraation ja invaasiota. Mixed altaat tartunnan saaneiden RK3E soluja käytettiin siirtymisen ja invaasion määrityksissä. Jälleen FLJ10540 ilmentävät solut osoittivat 4-5 kertaa suurempi maahanmuutto kyky kuin ajoneuvon ohjaus soluja (kuvio S2B) ja 7 kertaa suurempi hyökkäys kyky kuin ajoneuvon ohjaus soluja (kuvio S2C). Yhdessä nämä havainnot tukevat hypoteesia, että FLJ10540 voi edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota nisäkässoluissa.

Knock-down endogeenisen FLJ10540 siRNA estää keuhkosyöpäsolua muuttoliikettä ja invaasiota

Varmista, että FLJ10540 vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota ihmisen keuhkosyövän soluja, käytimme siRNA lähestymistapa estää endogeenisen ilmentymisen FLJ10540 ja sitten analysoitiin migraation ja invaasion kyvyt CL

1-5 ja H1299 soluja. Ensimmäinen, tutkia spesifisyys siRNA: iden, HA-merkitty FLJ10540 ekspressiokonstrukti oli ko-transfektoitiin kolmella eri siRNA: illa; Näiden koostui kahdesta kemiallisesti syntetisoituja siRNA: t, jotka ovat spesifisiä FLJ10540 (siFLJ10540-1 ja siFLJ10540-2) ja negatiivinen kontrolli siRNA, joka oli kukin transfektoitiin HEK293T-soluissa. Molemmat FLJ10540 siRNA: t osoittivat lähes täydellisen inhibition HA-merkityn FLJ10540 ilmaisu, kuten on esitetty Western blot -analyysillä käyttäen anti-HA-vasta-, kun taas taso HA-merkitty FLJ10540 pysyi korkeana negatiivisen kontrollin siRNA (tuloksia ei ole esitetty). Toiseksi, tarkastella, jos tietty FLJ10540 siRNA: t voivat estää endogeenisen FLJ10540 ilmaisun CL

1-5 ja H1299 soluja, transfektoimme siRNA osaksi CL

1-5 ja H1299 soluja 24 tunnin ajan, jonka jälkeen Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aine FLJ10540. Tulokset osoittivat dramaattisen väheneminen FLJ10540 proteiinin tasot sekä FLJ10540 siRNA: t, ja ei ollut merkittävää vähentämistä FLJ10540 kun negatiivinen siRNA käytettiin (kuvio 3A ja B, vasen paneeli). Kuitenkin leviämisen nopeus, määritettynä MTT-määritystä, ei ollut merkitsevää eroa negatiivisen kontrollin solut ja solut, jotka ilmentävät FLJ10540 siRNA aikana 24 tuntia (kuvio 3A ja B, keskimmäinen paneeli). Kolmanneksi tutkia vaikutusta siRNA FLJ10540 transfektion muuttoliikettä, negatiivinen kontrolli ja siRNA FLJ10540-transfektoitujen CL

1-5 tai H1299 solut erikseen siirrostettiin TranswellTM jaostoa päällystämättömän suodattimia. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubaation motiliteettia potentiaalia siRNA FLJ10540-solujen havaittiin on vahvasti inhiboi siRNA: t (kuvio 3A ja B, oikea paneeli). Lopuksi, samalla paneelit negatiivinen tai FLJ10540 siRNA transfektoidut solut ympättiin Matrigel päällystetty Transwell kammioon. 24 tunnin kuluttua inkubaation invasiivista potentiaalia siRNA FLJ10540 solut näyttivät vähentää merkittävästi (kuvio 3A ja B, oikea paneeli). Nämä tulokset tukevat vahvasti ajatusta, että FLJ10540 on rooli solujen vaeltamiseen ja invaasiota ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

(A ja B, vasen paneeli) Negatiivinen kontrolli siRNA kahdella eri FLJ10540 siRNA: t (siFLJ10540-1 ja siFLJ10540-2) transfektoitiin CL

1-5 ja H1299-soluja 24 tunnin ajan. Transfektion jälkeen Western blotting suoritettiin käyttäen anti-FLJ10540 ja anti-β-aktiini-vasta-aineita. (A ja B, keskimmäinen paneeli) Voit mitata solujen kasvu, 5 x 10

3 solujen negatiivinen kontrolli-CL

1-5, CL

1-5-FLJ10540 siRNA: t, negatiivinen kontrolli-H1299, ja H1299-FLJ10540 siRNA: t maljattiin päivänä 0 96-kuoppaisilla levyillä, joissa 10% FBS: ää. Solut laskettiin osoitettuina ajankohtina MTT-määrityksellä (OD

570) määrittää solun kasvua. Data normalisoitiin vastaan ​​OD

570 arvoa päivänä 0 kunkin hoidon. Kasvunopeus CL

1-5 ja H1299 solut esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (A ja B, oikea paneeli) Siirtyminen suhteellinen viisinkertaiseksi ja hyökkäyksen suhteellinen-kertainen CL

1-5 ja H1299 normalisoitiin vastaan ​​negatiivisen kontrollin soluissa ja edustaa kaavamaisesti. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

käyttäminen käsite syn-ilmentymisen paljastaa VEGF-A, mutta ei VEGF-B, ylävirran säätelijänä FLJ10540

geenit kuuluvat samaan polku on usein sama ekspressioprofiileja, jota kutsutaan syn-ilmaisun [27]. Näin ollen kartoittaa mahdolliset signalointireitille tai ylävirtaan säädin (t) osallistuvat FLJ10540-esiin muuttoliike ja invaasio ominaisuudet, käytimme meidän keuhkosyöpä microarray aineisto, kuten edellä on kuvattu, perehtyä toiminnalliset konkordanssin koekspressoi geenejä. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin tutki mRNA ilmaisun profiilia

FLJ10540

korreloi tahansa ligandin tai reseptorin meidän keuhkosyöpä microarray tietokanta (kuvio 1). Näistä koekspressoi- geenejä, ykkösehdokas

VEGF-A

, joka oli hyvin korreloi positiivisesti mRNA ilmentymistason

FLJ10540

pariksi keuhkosyöpäpotilaita (r = 0,7 p 0,001) (kuvio 4A). VEGF-A tiedetään olevan kriittinen pro-angiogeeninen tekijä, jolla on kykyä säädellä monia vaiheita angiogeenisen prosessin, kuten solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, ja selviytyminen [28], [29]. Itse asiassa, VEGF-A on erittäin ilmaistaan ​​monta pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä, [30], [31], [32], ja ekspressio VEGF-A liittyy huonoon ennusteeseen [33], [34] ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke [35], nostaa sitä mahdollisuutta, että biologisia rooleja ja FLJ10540: n ja VEGF-A voi olla toiminnallisesti liittyvät keuhkojen adenokarsinooma.

(A) Mikrosiruanalyysi ekspressiomalleja

VEGF-A:

ja

FLJ10540

keuhkojen adenokarsinooman potilasta esitetty. Tulokset normalisoitiin vastaan ​​ilmaus kuviot 56 pelimerkkiä (HG_U133A). N: viereisen ei-tuumorikudoksia; T: tuumorikudoksia. (B, vasen paneeli) VEGF-A indusoi kasvua FLJ10540-proteiinin tasojen annoksesta riippuvalla tavalla. Hoidon jälkeen erilaisilla pitoisuus VEGF-A (vasen paneeli) tai VEGF-B (oikea paneeli) 10 minuutin ajan CL

1-0 soluja, koko proteiinit uutettu CL

1-0 soluihin ja tutkittiin jossa vasta-aine FLJ10540. (B, keskimmäinen paneeli) seerumia CL

1-0-soluja esikäsiteltiin tai ilman eri pitoisuuksilla SU5416 2 tunnin ajan; Sitten soluja stimuloidaan 20 ng /ml VEGF-A: ssa 10 minuutin ajan. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (C) seerumin puutteessa CL

1-0-soluja esikäsitellään tai ilman SU5416 2 tunnin ajan; Sitten soluja stimuloitiin VEGF-A: n (pitoisuudella 20 ng /ml) 3 tunnin ajan. Siirtyminen ja invaasio suhteellinen-taittuu normalisoitiin vastaan ​​ajoneuvon soluja. (D, vasen, ylempi paneeli) migraatiokokeessa, 5 x 10

3 solujen ajoneuvon-CL

1-0 ja CL

1-0-FLJ10540 stabiileja klooneja ympättiin huipulle transwell lisätä ja annettiin kiinnittyä 12 tunnin ajan, ja sitten inkuboitiin kanssa tai ilman VEGF-A (20 ng /ml) 3 tunnin ajan. Lopussa määrityksen, solujen on yläpuolinen raaputettiin, ja solut, jotka vaelsivat pohjaan kiinnitettiin ja värjättiin Giemsa. (D, vasen, alapaneeli) varten invaasiomääritys, 1 x 10

4-solut ympättiin, kun Matrigel lisättiin, ja inkuboitiin sitten kanssa tai ilman VEGF-A (20 ng /ml) 3 tunnin ajan. Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (E) Epäsuora immunofluoresenssi analyysi FLJ10540 VEGF-A-käsitellyt solut. Proteiinin ilmentymisen ja solunosasijaintia FLJ10540 analysoitiin läsnä ollessa tai ilman VEGF-A: ta (20 ng /ml) CL

1-0-soluihin käyttäen immunofluoresenssimikroskopialla. Sen jälkeen, kun on inkuboitu kanssa tai ilman VEGF-A: ssa 30 min tai 180 min, solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä ja käsiteltiin epäsuoran immunofluoresenssimikroskopialla. FLJ10540 kulkeutua solukalvoon, kun VEGF-A hoitoon (Arrowhead). Bar: 10 pm.

Koska merkittävä rooli VEGF-A: säätelyssä maahanmuutto- ja invasiivisuus, olimme ensimmäinen kiinnostuneita onko VEGF-A voi moduloida FLJ10540 proteiinin ilmentymisen. Tulokset osoittivat, että ekspressiotaso on FLJ10540 on yliaktiivista VEGF-A annosriippuvaisesti CL

1-0 keuhkosyövän soluja (kuvio 4B, vasen paneeli). Me seuraavaksi kysytään antagonistista vaikutusta SU5416, VEGFR-2-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla, on biologisia vaikutuksia VEGF-A voisi johtua inhibition FLJ10540-proteiinin yli-ilmentymisen indusoima VEGF-A keuhkosyövän soluja. Tulokset osoittivat, että ylösajon FLJ10540 läsnä VEGF-A: estettiin lisäämällä samanaikaisesti SU5416 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B, keskimmäinen paneeli). Päinvastoin, proteiini taso FLJ10540 ei vaikuttanut käsittelemällä VEGF-B (kuvio 4B, oikea paneeli). Itse asiassa,

FLJ10540

ei jaa vastaava ilmaisu kuvioita

VEGF-B

, ainakaan meidän keuhkosyöpä mikrosirun, joka tukee sitä ajatusta, että synexpression malleja voitaisiin käyttää päätellä toimintaa tuntemattoman geenin [27].

VEGF-A aiheuttama FLJ10540 yli-ilmentymisen ja translokaation tehostaa keuhkosyöpäsolua muuttoliikkeen ja invaasion kautta EMT-riippumattoman reitin

testaamiseksi biologista merkitystä VEGF-A- aiheuttama säätelyä FLJ10540, tutkimme vaikutus FLJ10540 siirtolaisuudesta ja invaasio läsnä ollessa tai poissa ollessa VEGF-A. Ensin tutkittiin, vanhempien CL

1-0 soluja voisi näyttää soluliikkuvuus stimulaation jälkeen VEGF-A. Kuviossa 4C, CL

1-0 solut osoittivat enemmän muuttoliikkeen ja invasiivisia kyvyt läsnä VEGF-A yksinään kuin VEGF-A yhdistettynä SU5416 tai pelkästä, mikä viittaa siihen, että lisäys VEGF-A lisäsi merkittävästi muuttoliikkeen ja hyökkäys CL

1-0 soluja, jotka rinnastettiin kasvu FLJ10540 tasoilla. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin FLJ10540 CL

1-0-vakaa transfektanttien kanssa tai ilman VEGF-A stimulaatio (kuvio 4D).

Sen testaamiseksi, solunosasijaintia FLJ10540 voitaisiin muuttaa keuhkosyöpäsoluissa upon VEGF-A stimulaatiota, otimme epäsuoralla immunofluoresenssilla lähestymistapa tarkkailla FLJ10540 lokalisointi CL

1-0 keuhkosyövän soluja tai ilman VEGF-A stimulaatiota. Kuten kuviossa 4E, VEGF-A käsittely ei johtanut ainoastaan ​​lisääntymiseen FLJ10540-proteiinin ekspression, mutta se myös edistää translokaatiota murto-osa FLJ10540 solukalvoon. Lisäksi erot solujen morfologia olivat ilmeisiä, esiin laajentaminen VEGF-A käsiteltyjen solujen (kuvio 4E, 30 min ja 180 min) verrattuna pyöristetty CL

1-0-soluja (kuvio 4E, 0 min ). Nämä morfologiset muutokset sai meidät tutkimaan ilmiötä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Aikana tumorigeneesin, EMT voi lisätä liikkuvuutta ja invasiivisuus syöpäsolujen ja pahanlaatuisiksi saattaa liittyä signalointipolkujen edistää EMT [36]. Aiemmassa tutkimuksessa on myös, että solunulkoisia signaaleja aiheuttama VEGF-A vahvasti osallisena EMT ihmisen haimakarsinooma- soluihin [37]. Sen tutkimiseksi, FLJ10540 voisi välittää VEGF-A aiheuttama EMT, mikä parantaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota, käytimme H1299 ja CL

1-0 keuhkosyövän soluja, kanssa tai ilman VEGF-A stimulaatiota, käsitellä tätä kysymystä. Kuitenkin kasvusta huolimatta soluliikkuvuus yliekspressiolla FLJ10540 tai vähentämällä soluliikkuvuus by FLJ10540 välittämän siRNA: t, erot FLJ10540 tasoja ei mitenkään muuta ekspressiotasot jonkin markkeriproteiinien liittyy EMT, kuten E-kadheriinin ja vimentiinista ( dataa ei esitetty). Siksi FLJ10540 se näyttää välittävän muuttoliikettä ja hyökkäyksen vaikutuksia VEGF-A riippumatta EMT ja ei näytä olevan osuutta säätelyssä EMT, ainakin keuhkosyövän solulinjat analysoimme.

Positiivinen (A). Kolmen riippumattoman kokeen.