Krooninen sairaus

tiivistelmä

biomarkkereita, jotka ennustavat vastaus kohdennettuja terapia onkologiaan ovat olennainen osa henkilökohtaisen lääketieteen. Prekliinisissä hoitovasteen tutkimuksissa että esillä malleja villityypin

KRAS

tai mutantti

BRAF

kolorektaalisyöpä käsitelty joko setuksimabi tai vemurafenib vastaavasti me osoittavat, että [

18F] -FLT PET, ei-invasiivisia molekyylikuvantaminen lukemiselle tymidiinin taltiointi, heijastaa tarkkaan pro-selviytymisen vastauksia täsmähoitoihin että välittävät PI3K-mTOR aktiivisuutta. Aktivointi pro-selviytymisen mekanismeja muodostaa perustan lukuisia muotoja vastarintaa. Tämän vuoksi päättelemme, että [

18F] -FLT PET voi palvella uudenlainen ja mahdollisesti ratkaiseva merkitys ennustaa kasvaimia, jotka näytteille molekyyli- piirteitä, jotka heijastavat niskoittelu on MAPK-täsmähoitoihin. Vaikka nämä tutkimukset keskittyivät peräsuolen syövän, me kuvitella, että tulokset voivat olla sovellettavissa muihin kiinteisiin kasvaimiin samoin.

Citation: McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Washington MK, Manning HC (2014) 3 ’ -deoksi-3 ’- [

18F] -Fluorothymidine PET Imaging heijastaa PI3K-mTOR-välitteistä Pro-Survival vastaus Kohdennettu Therapy in peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (9): e108193. doi: 10,1371 /journal.pone.0108193

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2014; Hyväksytty: 24 elokuu 2014; Julkaistu 23 syyskuuta 2014

Copyright: © 2014 McKinley et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimusrahoitus : R25 CA136440, K25 CA127349, P50 CA128323, P50 CA095103, R25 CA092043, R01 CA140628, RC1 CA145138, R01 CA046413, P30 DK058404, The Kleberg Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lisääntynyt kyky nopeasti ja halvalla luonnehtivat geneettisen perustan yksittäisen potilaan kasvain, henkilökohtainen hoitomuodot ovat nopeasti yleistyvät onkologian. Landmark esimerkkejä menestyksestä henkilökohtaisen lääketieteen onkologiaan käyttää myös vemurafenib hoitoon

V600EBRAF

melanooma [1] ja trastutsumabi hoitoon

HER2

yliekspressoivassa rintasyöpiä [2]. Kanssa kasvava riippuvuus molekyylirakennetta suunnattu hoitoja, on edelleen yhtä tärkeä haaste kehittää ja todentaa erityisiä biomarkkerit, jotka heijastavat tavoite esto, polku inaktivaation, ja ennustaa kaiken kliinisen vasteen. Useimmat biomarkkereita hyödynnetään onkologian opiskelu vaatii kudosnäytteen ottaminen, joka on erittäin altis otantavirhe ja bias takia heterogeenisuus. Seerumin-pohjainen biomarkkereiden puuttuu kyky suoraan visualisoida kasvain ja osoittavat, että mitattu vaikutus on suoraan seurausta kasvaimen vasteen. Noninvasiivinen kuvantaminen kiertää nämä rajoitukset ja tarjoaa merkittäviä etuja perinteisiin biomarkkereita. Niistä kuvantamismodaliteetit käytettävissä kliinisesti, herkkyys ja kyky helposti tuottaa biologisesti aktiivisia molekyylejä joissa positroneja säteilevää isotooppien tekee positroniemissiotomografia (PET) yksi houkutteleva yksityiskohtaiset havaitsemiseksi kasvaimia ja profilointi biologisia vasteita terapiaan.

Meidän laboratorio on tutkinut biologinen perusta 3′-deoksi-3 ’[18F] -fluorothymidine ([

18F] -FLT) kerääntyminen kasvaimissa [3] – [6] ja muut sairaan kudoksen [7]. Tymidiinianalogi, [

18F] -FLT kehitettiin alun perin palvelemaan ei-invasiivisia mitta soluproliferaatioon selviä hyödyllisyys onkologiaan [8], [9] raportoimalla tymidiini pelastus polku, joka tarjoaa DNA esiasteita jakaantuvissa soluissa. Kun solu sisäistämisen, [

18F] -FLT on fosforyloitiin katalysoi sytosolin tymidiinikinaasi-entsyymi 1 (TK1) ja loukkuun solun. TK1 aktiivisuus korreloi kanssa DNA-synteesiä ja taipumus vähentyneen lepotilassa olevat solut. [

18F] -FLT on tutkittu laajasti markkerina hoitovaste kirjo kasvain tyypit ja hoidot sekä prekliinisen ja kliinisen asetukset [10]. On kuitenkin tärkeää huomata, että toisin kuin enemmän yleistettävissä leviämisen markkereita, kuten Ki67, [

18F] -FLT PET heijastaa proliferatiivisen indeksit vaihtelevia ja mahdollisesti epäluotettavia laajuudessa [6], [11]. [

18F] -FLT-PET voi syrjiä kohtalaisen proliferatiivinen, tymidiini meripelastus-ajettu kasvaimia näistä erittäin proliferatiivisen kasvaimia, jotka käytetään ensisijaisesti

de novo

tymidiiniä synteesiä. Huolimatta puute korrelaatio leviämisen joissakin olosuhteissa, me visioi että TK1 tasoja, ja siten [

18F] -FLT PET, voisi heijastaa muita mahdollisesti tärkeitä molekyyli- liittyvät tapahtumat hoitovaste.

käyttäminen prekliinisen malleja kolorektaalisyövän osoitamme kahdessa tapauksessa, joissa [

18F] -FLT PET ei korreloi leviämisen, vaan heijastaa PI3K-mTOR välittämä pro-selviytymisen vastauksia täsmähoitoihin. Näissä asetuksia, [

18F] -FLT PET oli ristiriitainen 2-deoksi-2 – [

18F] fluori-D-glukoosi ([

18F] -FDG) PET, yleisimmin käytetty merkkiaineen Clinical oncology, joka ei ollut herkkä mTOR- tai PI3K-signalointia. Setuksimabi estoa MAPK-aktiivisuuden villityypin

KRAS

solulinjassa malli ja vemurafenib estoa BRAF on

V600EBRAF

mutantti solulinjassa malli ei ollut vaikutusta [

18F] -FLT PET ellei PI3K-mTOR myöhemmin heikennetty farmakologisesti tai

kautta

geneettinen hiljentäminen. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset osoittavat uusi rooli [

18F] -FLT PET keinona ennustaa kasvaimia, jotka vastustavat MAPK esto kautta PI3K-mTOR aktivaation peräsuolen syövän ja mahdollisesti muita kiinteitä kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja hiiri malleja

kaikki tutkimukset hyväksynyt Vanderbilt University Institutional animal Care ja käyttää komitean ja yritettiin minimoida eläinten kärsimyksiä. DiFi ihmisen solut olivat lahjoitus tri Bruce Boman [12] ja COLO 205-solut saatiin ATCC: stä (CCL-222). DiFi ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) ja COLO 205 soluja kasvatettiin RPMI (Cellgro), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, (Atlanta biologisten), 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (GIBCO), 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. C225 saatiin Vanderbilt Pharmacy, PLX4032 ja PLX4720 syntetisoitiin, kuten on kuvattu [13], PP242 saatiin Sigma Aldrich, ja BEZ235 päässä Selleck Chem. Kantaliuoksia kunkin lääkkeen valmistettiin ja jaettiin eriin saavuttaa lopulliset lääkepitoisuudet

in vitro

tutkimuksissa.

in vivo

tutkimuksissa solulinja -ksenografteja syntyy kateenkorvattomissa nude hiiriä (Harlan) kuvatulla [3] ja käsittely alkoi, kun tilavuus oli noin 150 mm

3. Hoitoon DiFi ksenograftien, suolaliuos ajoneuvon, 20 mg /kg, tai 40 mg /kg setuksimabia annettiin i.p. joka kolmas päivä. PET kuvantaminen DiFi ksenograftin kantavien hiirten suoritettiin 7 päivää hoidon alkamisesta, 24 tunnin kuluttua kolmas käsittely. COLO 205 ksenografteja, hiiriä käsiteltiin DMSO ajoneuvon, 60 mg /kg PLX4720, tai 40 mg /kg BEZ235 päivittäin suun kautta letkulla (100 ui: n kokonaistilavuus). PET kuvantaminen COLO 205 ksenograftin hiirille suoritettiin 4 päivää sen jälkeen, kun hoidon aloittamisesta, noin 24 tuntia kolmannen hoidon. Hiiret tapettiin välittömästi päättymisen jälkeen PET-kuvantamiseen.

siRNA menetelmiä

Raptor (L-004107-00) ja satunnaisessa järjestyksessä (D-001810-01) siRNA reagenssit saatiin Thermo Scientific. siRNA transfektoitiin DiFi soluihin käyttäen DharmaFect transfektion kit (Thermo Scientific) kohti valmistajan ohjeiden mukaan. Lyhyesti, 500000 DiFi solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua, siRNA lisättiin sopiviin kuoppiin. 48 tunnin kuluttua, suolaliuosapuainetta, 0,5 ug /ml tai 5,0 ug /ml C225 lisättiin sopiviin kuoppiin. Sen jälkeen vielä 24 tunnin ajan, solut kerättiin Western-blottauksella ja qRT-PCR: llä, kuten on kuvattu alla.

Radioaktiivisia synteesi

[

18F] -FLT valmistettiin kahdessa vaiheessa, yhden astian reaktiossa kuvatun [4], [14]. [

18F] -FLT saatiin keskimääräinen radiokemiallinen puhtaus 98,3% ja spesifinen aktiivisuus ≥345.5 TBq /mmol. [

18F] -FDG syntetisoitiin Vanderbilt University Medical Center Radiopharmacy ja jakelee PETNET. Keskimääräinen radiokemiallinen puhtaus tuote oli 98,5% ja spesifinen aktiivisuus oli yli 37 TBq /mmol.

Small-eläin kuvantamisen

Small-eläin PET kuvantaminen suoritettiin käyttäen omistettu microPET skanneri ( Concorde Microsystems Focus 220). Hiiriä pidettiin alle 2% isofluoraani anestesian hapessa 2 l /min ja pidettiin lämpimänä kautta kiertävä vesi lämpötyyny ajaksi PET scan. Sillä [

18F] -FLT PET kuvantamisen eläimille annettiin 7,4-9,3 MBq (200-250 pCi) laskimoon. Eläimet saivat vapaasti ruokaa ja vettä aikana 40 minuutin oton aikana, jonka jälkeen anesthetization ja 20 minuutin kuvan hankinta. On [

18F] -FDG PET kuvantamisen, hiiriä pidettiin paastolla noin 6 h ennen kuvausta ja lämmitetään lämmitetyn (31 ° C) kammion 1 h ennen [

18F] -FDG injektion aikana ja kertymävaiheen minimoida ruskean rasvan imeytymisen [

18F] -FDG. Hiirille annettiin 7,4-9,3 MBq [

18F] -FDG suonensisäisesti ja annettiin vapaasti vettä aikana 50 minuutin oton aikana seurasi 10 min PET hankintaan.

PET data rekonstruoitiin käyttämällä OSEM3D /KARTTA. Tuloksena kolmiulotteinen rekonstruktiot oli x-y-vokselifantomeita koko 0,474 mm ja toisistaan ​​siivu päässä 0,796 mm. ASIPro ohjelmisto (Siemens) käytettiin manuaalisesti vetää kolmiulotteinen olevien kiinnostavien alueiden tuumorin tilavuuden. Kasvaimen näytteet heti talteen seuraavia [

18F] -FLT-PET ja flash jäädytettiin nestetypessä. [

18F] -FLT sisäänotto kvantifioitiin prosenttiosuutena injektoidusta annoksesta grammaa kudosta (% ID /g) jakamalla ROI aktiivisuutta injektoidusta annoksesta ja kertomalla 100

Immunoblottausmääritys

in vitro

tutkimuksia varten solut lyysattiin CelLytic M (Sigma Aldrich), sentrifugoitiin 16000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti poistetaan ennen mittausta proteiinipitoisuuden bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä (Thermo Scientific). Sillä

in vivo

tutkimuksissa, tuore kudos homogenisoitiin CelLytic MT (Sigma Aldrich) lyysipuskuria, sentrifugoitiin 16000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti poistettiin ennen mittausta proteiinin pitoisuus BCA määritys. Ennen resoluutio elektroforeesilla, 20-40 ug proteiinia kustakin näytteestä ladattiin 7,5-12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (PerkinElmer). Membraanit blokattiin yön yli 4 ° C: ssa tris-puskuroidussa suolaliuoksessa 0,1% Tween-20 (TBST), joka sisälsi 5% w /v rasvatonta maitojauhetta. Myöhemmin kalvot kuulusteltiin vasta-aineita saadaan Cell Signaling Technology ellei toisin mainita p-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), TK1 (Abcam, # 57757), p27 (# 3686 ), p-AKT Ser473 (# 4060), p-AKT Thr308 (# 4056), AKT (# 4685), p-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), p-4EBP1 Thr37 /46 ( # 2855), p-MEK Ser217 /221 (# 9154), MEK (# 9126), DUSP6 (# 3058), β-aktiini (# 4970), β-tubuliinia (Novus Biologicals, # NB600-936). Kalvoja hybridisoitiin 1 tunti koettimena huoneenlämpötilassa TBST: ssä, jossa 3% naudan seerumin albumiinia (BSA). Kalvot, viljeltiin sen jälkeen 1 tunnin ajan huoneenlämmössä piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch) laimennettuna 1:5000 TBST, joka sisälsi 3% BSA: ta. Länsi Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) käytettiin kemiluminesenssiosoitusta on Xenogen IVIS 200.

immunohistokemia (IHC) B

Eläimet tapettiin ja kasvaimen kerättiin välittömästi PET kuvantamisen Myöhemmässä kiinnitettiin 10% formaliinilla 24 tunnin ajan. Kudokset siirrettiin sitten 70% etanolia ennen parafiiniin. Leikeltiin (5 um paksuus) ja värjättiin p-rpS6 (Cell Signaling, # 4858, 1:100 ensisijainen laimennus), p-AKT Ser473 (Cell Signaling, # 4060, 1:100 ensisijainen laimennus), Ki67 (Dako, # M7240, 1:100 ensisijainen laimennus), p27 (Dako, # M7203, 1:100 ensisijainen laimennus). Lyhyesti, kudosnäytteet de-paraffinized, vedettömät, ja antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraatti- puskuria (pH 6,0) liuosta 15 minuutin ajan 105 ° C: ssa seurasi 10 minuutin penkki jäähtyä. Sitten näytteet käsiteltiin 3% vetyperoksidilla poistaa endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Leikkeet tämän jälkeen tukittiin seerumittomalla proteiinin esto-reagenssia 20 minuuttia. Primaarista vasta-ainetta havaitsemista suoritettiin käyttäen seuraavaa järjestelmää: Kudosleikkeitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 60 minuutin ajan huomattava laimennoksia, jota seuraa 30 minuutin inkubaatio käyttämällä Envision + System-HRP leimatun Polymer havaitsemismenetelmä (Dako, Carpinteria, CA). Värjäys valmistui kanssa inkuboinnin jälkeen 3,3′-Diaminobenzidine alustaan-kromogeeniliuoksen. Tissue dioja oli kuvattu at 40x suurennus ja käsin teki määrittää positiivisten solujen prosenttiosuuden kohti suuri teho kenttä.

qRT-PCR

RNA kerättiin RNeasy ehdottivat toimittajan (QIAGEN) . Sekä cDNA ja reaaliaikainen PCR kokeet suoritettiin käyttäen iScript cDNA synteesi kit ja iQ SYBR Green Supermixiä (BIO-RAD) by toimittaja opetusta. Monistamiset suoritettiin BIO-RAD CFX96 Real-Time System 40 sykliä. Tiedot hankittiin Bio-Rad CFX Manager -ohjelmisto ja kertamuutoksia analysoitiin kuvaamalla tavalla Schefe et al [15]. Ihmisen TK1 (5′-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 ’eteenpäin, 5′-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3′ reverse), ihmisen P27 (5’-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3 ’eteenpäin, 5′-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3’ reverse) saatiin Integrated DNA Technologies.

tilastollinen analyysi

Tilastollisesti merkittävä tiedot arvioitiin käyttämällä ei-parametrinen Wilcoxonin Rank Sum (Mann-Whitney U) kokeista käyttäen GraphPad Prism 4 ohjelmistopaketti. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos p 0,05.

Tulokset

asetukseen TK1 seuraavista EGFR saarto villityypin

KRAS

peräsuolen syövän solut

Aiemmin , osoitimme, että kuvantaminen lukemien EGFR käyttöasteen ja apoptoosin, mutta ei [

18F] -FLT PET, ennusti vastaus setuksimabin DiFi solulinjassa ksenografteissa että ilmentävät villin tyypin KRAS ja näytteille EGFR vahvistus [3], [12] . Siksi tässä tutkimuksessa, ensin pyrki selvittämään suhteita EGFR saarto Setuksimabihoitoa ja TK1 sääntelyä. Aluksi käytimme viljeltyjä DiFi solujen arvioimaan ajallinen suhde setuksimabi altistumisen ja p-ERK, TK1, ja p27-proteiinin tasot yli 24 tuntia (Fig. 1A). Kuten odotettua, p-ERK tasot olivat lähes välittömästi heikennetty, osoittaa dramaattinen väheneminen ensimmäisen tunnin setuksimabin altistuksen (5,0 ug /ml), ja loput hyvin alle lähtötasolle jopa 24 tuntia. Paradoksaalisesti TK1 nousivat seuraavat setuksimabi altistuksen, joka oli korkeimmillaan 12 tuntia, ja sitten nopeasti laski alle lähtötasolle. Proteiini tasoilla solusyklin estäjä p27 nousi dramaattisesti ja tasaantui 12 tuntia. Käänteinen suhde TK1 ja p27-proteiinin tasot sekaantunut p27 on keskeinen tekijä TK1 sääntelyn DiFi soluissa.

(A) Western blot of DiFi solulysaateista seuraavat setuksimabi altistuksen (5 ug /ml) johti nopeaan vaimennus loppupäässä MAPK tavoitteita kuten p-ERK, joka pysyi hyvin alle lähtötasolle 24 tuntia. Paradoksaalisesti TK1 proteiini nousivat 1-12 tuntia, kunnes p27-proteiinin tasot nousivat, jolloin TK1 putosi palje lähtötilanteessa. (B) DiFi soluja käsiteltiin joko 0,5 ug /ml tai 5,0 ug /ml setuksimabia johti 50%: n vähennys ja täynnä vaimennus p-ERK-proteiinin tasot, vastaavasti 24 tuntia. 0,5 ug /ml TK1 tasot pysyivät muuttumattomina huolimatta vaatimaton nousu p27-proteiinin tasoa. Kuitenkin 5,0 ug /ml setuksimabia johti huomattavasti vähentynyt TK1 on suuri nousu p27-proteiinin tasoa. PI3K-mTOR aktiivisuus, mitattuna p-AKT Ser473, p-rpS6, ja p-4E-BP1, oli joko ylläpitää tai kohonnut 0,5 ug /ml setuksimabia mutta vaimenee 5,0 ug /ml setuksimabia. (C) qRT-PCR-analyysi osoitti

TK1

mRNA oli merkittävästi vähentynyt 0,5 ug /ml (p = 0,0279) ja 5,0 ug /ml (p = 0,0186), kun taas ei muutosta

p27

mRNA-tasot havaittiin joko annoksella. (D) hiljentäminen mTORC1 helpottanut upregulation p27 ja heikennettyjä TK1 proteiinin tasot 0,5 ng /ml setuksimabia vaikuttamatta anti-MAPK aktiivisuuden vaikutukset setuksimabia. Tasot p-AKT Ser473, p-rpS6, ja p-4E-BP1 vähennettiin 0,5 ug /ml setuksimabia altistus Raptor pudotus, mutta ei salattu siRNA-ohjaus. (E) Todisteena toimivuutta p27,

TK1

mRNA tasot pienennettävä 0,5 ug /ml ja 5,0 ug /ml kanssa Raptor knockdown.

edelleen arvioimiseksi väliset suhteet MAPK-reitin inhibitio, TK1 asetus, ja p27, DiFi solut altistettiin kaksi konsentraatiota (0,5 ug /ml ja 5,0 ug /ml), setuksimabin 24 tunnin ajan (Fig. 1 B). 0,5 ug /ml, TK1 proteiini tasot pysyivät muuttumattomina huolimatta vaatimattomasti koholla P27 ja noin 50%: n vähennys p-ERK ja p-AKT Ser473. Sitä vastoin 5,0 ug /ml altistumista johti dramaattisesti heikennettyjä TK1 tasoilla. Samanlainen ajan kulku Tutkimuksen alennetaan TK1 korreloi vahva kasvu p27. Lisäksi täydellinen vaimennus p-ERK ja p-ATK Ser473 havaittiin 5,0 ug /ml. Toisin kuin proteiini,

TK1 mRNA

yleensä seuraa p-ERK tasot suoremmin (Fig. 1 C), joka ei ole yllättävää, koska

TK1

riippuvuutta E2F transkription [16], loppupään tuote MAPK toimintaa. Mielenkiintoista,

p27

mRNA ei vaikuttanut setuksimabi altistumisen, mikä viittaa siihen, että kohonnut p27-proteiinin tasot johtui esto loppupään tavoitteita, jotka vaikuttavat transkription jälkeinen muutos p27, jossa AKT tyypillisesti yksi näistä [17]. Sen määrittämiseksi, TK1 proteiinin tasot havaittiin 0,5 ng /ml säteilyaltistus- säilyivät lisääntynyt translaation tehokkuutta, mittasimme p-rpS6 ja p-4E-BP1 tasoa, molemmat tuotteet pro-translationaalisen PI3K-mTOR aktiivisuutta (Fig. 1 B) . Löysimme p-rpS6 tasoilla vaimennettava vain korkein pitoisuus setuksimabia. Lisäksi p-4E-BP1 tasot olivat koholla alhaisempi pitoisuus setuksimabin, mikä viittaa enemmän mahdollisuuksia käännettäväksi ribosomin korkki [18]. Yhdessä kanssa

TK1

mRNA, nämä tulokset voivat ehdottaa, että translaation tehokkuutta TK1 alemmalla tasolla setuksimabin altistumisen todennäköisesti edetä aktivoimalla mTOR.

hiljentäminen mTOR-PI3K Helpottaa setuksimabin välittämää vaimennus TK1 tasojen DiFi soluissa

Tutkiakseen roolin mTOR on TK1 sääntelyä tässä yhteydessä olemme vaiennetaan mTOR käyttämällä siRNA on Raptor, keskeinen jäsen toiminnallisen mTOR Complex 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. Puuttuessa mTORC1 aktiivisuuden, TK1-proteiinin tasot vaimennetaan sekä 0,5 ug /ml ja 5,0 ug /ml pitoisuuksia setuksimabi, ilman selvää vaikutusta MAPK-reitin aktiivisuutta (Fig. 1 D). Kuten odotettua, Raptor hiljentäminen suurempana setuksimabia välittämää vaimennus p-AKT Ser473 ja p-rpS6 sekä estämällä fosforylaation 4E-BP1. Lisäksi heikennetty TK1 proteiinin tasot, mTORC1 inaktivointi lisännyt p27-proteiinin tasoa, joka näytti olevan ainakin osittain vastuussa

TK1

transkription säätelyyn alimmalla tasolla setuksimabin altistuksen (Fig. 1 E). Mielenkiintoista on, kuten aiemmin havaittiin nousu p27-proteiinin tasoja on sinänsä ei ole kasvaneeseen tuotteeseen

p27

transkription (Fig. S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mTOR aktivointi luojana sen vaikutus TK1 läpi alavirran efektoreja kuten AKT ja ERK läpi translaation jälkeisen modifikaation ja hajoaminen solusyklin estäjät, kuten p27 [17]. Todisteena tästä, mTORC1 esto yhdessä EGFR saarto johti syvällinen vähentämiseen TK1 proteiinin tasoja ei havaittavissa Setuksimabihoitoa altistuminen yksin alhaisempi pitoisuus.

[

18F] -FLT PET heijastaa eston PI3K-mTOR aktiivisuuden setuksimabia käsitelty DiFi solulinja ksenografteissa

in vivo

myöhemmin kuvattavan DiFi ksenograftin kantavien hiirten kanssa [

18F] -FLT PET seuraavat Setuksimabihoitoa (20 mg /kg tai 40 mg /kg) tai suolaliuosta ajoneuvon. Suostumuksella meidän aiempien tutkimusten [3], samankaltainen [

18F] -FLT kertymistä havaittiin ksenografteissa vehikkeliä tai 20 mg /kg setuksimabia. Lisätään annosta setuksimabin 40 mg /kg johti vähentynyt [

18F] -FLT kertymistä (Fig. 2A). Vähentynyt TK1-proteiinin tasot havaittiin 40 mg /kg annos suhteessa ajoneuvo- ja 20 mg /kg setuksimabia-käsitellyt tuumorit (Fig. 2B). Samanlainen

in vitro

tutkimuksissa vähentynyt TK1 proteiinin tasot korreloivat koholla p27-proteiinin, mutta ei

p27

mRNA (kuva. S2). Lisäksi p-AKT Ser473 tuumoriproteiinia-tasot lisääntyivät 20 mg /kg: n annos verrattuna sekä ajoneuvon ja 40 mg /kg setuksimabi. TK1 proteiini tasot olivat vaikuta pienempinä annoksina setuksimabi huolimatta vähensi

TK1

mRNA (Fig. 2C), joka laskettiin suhteessa ajoneuvon käsiteltyihin kontrolleihin molemmilla tasoilla setuksimabin altistumista. IHC kuvantamisen haun Ksenograftikudoksista kuvitettu että PI3K-mTOR aktiivisuus, mitattuna p-rpS6 ja p-AKT Ser473 tasoilla, estyi korkeimmalla setuksimabi valotus (Fig. 2D, kuvio. S3). Mielenkiintoista, Ki67 väheni molemmilla tasoilla setuksimabin altistumisen (kuvio 2D, kuvio. S4), mikä viittaa siihen, että [

18F] -FLT PET on irrotettu tuotannosta standardimittareihin leviämisen alemmalla annoksella. Vaikka [

18F] -FLT PET näytti olevan herkkiä PI3K-mTOR aktiivisuus, [

18F] -FDG PET kuvantaminen ei ollut herkkä tätä ilmiötä. Havaitsimme vähensi [

18F] -FDG otto suhteessa ajoneuvon hallintalaitteita molemmilla tasoilla setuksimabin altistumisen (Fig. S5). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että [

18F] -FLT PET tarjoaa ainutlaatuisen tietoja mTOR signalointia, joka ei vangiksi [

18F] -FDG PET tai standardimittareihin leviämisen, kuten Ki67 IHC.

DiFi tuumoriksenografteja oli kuvattu 7. päivänä 20 mg /kg tai 40 mg /kg setuksimabin hoito-ohjelmia. (A) [

18F] -FLT PET oli vain pienentää DiFi ksenografteissa hoidettiin 40 mg /kg (p = 0,0012). (B) Western blot -analyysi kudoksissa korjattu välittömästi kuvioinnin jälkeen vahvisti, että TK1-proteiinin tasot olivat vain laskivat 40 mg /kg annoksella. Lisääntynyt p27-proteiinin tasot havaittiin 40 mg /kg annostasoilla. Lisääntynyt p-AKT Ser473 proteiinin tasot havaittiin 20 mg /kg annoksella. (C) Samanlainen

in vitro

havaintoja,

TK1

mRNA väheni merkittävästi sekä 20 mg /kg (p = 0,0009) ja 40 mg /kg (p = 0,0001) annostasoilla. (D) IHC-analyysi p-rpS6 ja p-AKT Ser473 osoitti hieman koholla värjäytymisen tasot 20 mg /kg. Kuitenkin molemmat merkkiaineet suuresti vähentynyt 40 mg /kg. Ki67 immunoreaktiivisuus laskettiin molemmilla tasoilla setuksimabin altistumisen.

TK1 proteiinin tasot eivät vastaa

V600EBRAF eston COLO 205 soluja

Samalla tavalla kuin DiFi malli Setuksimabihoitoa saaneilla, arvioimme suhteet tavoite inhibition alavirran efektoreja, ja TK1 tasot

V600EBRAF ilmentävää solulinjaa, COLO 205, käsiteltiin selektiivinen

V600EBRAF estäjä (Fig. 3). PLX4032 valotus 48 tuntia johti konsentraatiosta riippuvaisen eston p-MEK tasolle. Paradoksaalisesti p-ERK kohoamiseen pitoisuudesta riippuvalla tavalla, paitsi suurimmalla annoksella (5 uM) (Fig. 3A). Epäsuhta p-MEK ja p-ERK ei havaittu altistuksen kesto on 2 tuntia (Kuva. S6) tai 24 tuntia (Kuva. S7). Vaikka p-AKT Ser473 tasot vain kohtalaisen pelkistettiin PLX4032 altistumista 48 tuntia, havaitsimme pitoisuudesta riippuvainen lisäys p-rpS6 joka korreloi lisääntyminen p-ERK. Samanaikaisesti lisääntynyt p-rpS6 ja vähentynyt DUSP6 tasolla ehdotetaan, että lisäys p-ERK oli ainakin osittain seurausta pienentyneestä fosfataasin aktiivisuus, joka todennäköisesti liittyy mTOR aktivointi [20]. PLX4032 altistumisen seurauksena lievän nousun p27-proteiinin tasoa. TK1 kohoamiseen hieman pienemmillä PLX4032 pitoisuuksina ja sama kuin ajoneuvon korkeammilla altistumisen, paitsi korkein pitoisuus (5 uM). Yllättäen

TK1

mRNA näytti tiiviimmin estoon p-MEK ja, toisin kuin TK1 proteiini tasoilla vähenivät olennaisesti pitoisuudesta riippuvasti (Fig. 3B).

COLO 205 soluja kerättiin 48 tunnin PLX 4032 altistus 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM tai 5 uM. (A) Western blot analyysi osoitti tavoite esto p-MEK huolimatta kasvavista p-ERK tasolle. PI3K-mTOR signalointi koholla PLX 4032-riippuvaisella tavalla kuin näytteillä vakaan nousun p-rpS6 tasolle. ERK-fosfataasi DUSP6 väheni yhdessä mTOR signalointi ja oli kääntäen verrannollinen p-ERK tasolle. Lievää p27 tasot havaittiin samanaikaisesti vain vaatimattomia muutoksia TK1 tasoilla, paitsi suurimmalla annoksella PLX4032. (B) Vähentynyt

TK1

mRNA havaittiin kaikkina lääkkeen pitoisuus on yli 10 nm (p 0,05).

[

18F] -FLT PET, mutta ei [ ,,,0],

18F] -FDG PET, heijastaa kohonnut mTOR aktiivisuus ja korreloi puute p-ERK inhibitio PLX4720-käsitelty COLO 205-ksenografteja

Hiiret, COLO 205-ksenografteja hoidettiin päivittäin 60 mg /kg PLX4720 4 päivää ja kuvaamisen kanssa [

18F] -FLT PET tai [

18F] -FDG PET (Fig. 4). Suostumuksella

in vitro

tutkimukset osoittavat, että BRAF esto oli vain vähän vaikutusta TK1 tasoilla COLO 205 soluja, käsittelemällä PLX4720 oli vähän vaikutusta [

18F] -FLT PET kuvantaminen. Toisaalta, [

18F] -FDG PET väheni merkittävästi, käsiteltiin samalla tavalla ikäryhmien (Fig. 4B). Suostumuksella kuvantamisen, TK1 tasot PLX4720 saaneista ksenografteissa olivat samankaltaisia ​​apuaineella hoidettuihin kontrolleihin. Myös samanlainen

in vitro

tutkimuksissa löydettiin kohonnut p-ERK tasoilla ja p-rpS6 tasot PLX4720 käsitelty ksenografteissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin, vaikka inhibitio BRAF efektori, p-MEK.

(A) edustaja poikittainen [

18F] -FLT ja [

18F] -FDG PET kuvien jälkeen hankitut kolme päivittäistä hoitoja ajoneuvon tai 60 mg /kg PLX4720 (kasvain merkitty nuolenpää). (B) kvantifiointi PET kuvatun aineiston samanlainen [

18F] -FLT otto ajoneuvojen saaneilla ja PLX4720 hoidetuilla kasvaimia. Toisin kuin [

18F] -FLT PET, PLX4720 altistuminen aikaansaama merkittävä väheneminen [

18F] -FDG otto (p = 0,0006). (C) Western blot-analyysi ajoneuvo- ja PLX4720 käsitellyn kasvainkudoksen vahvisti, että PLX4720 ei ollut vaikutusta TK1-proteiini- tasojen kanssa [

18F] -FLT PET. Kohdista inhibitio mitattuna p-MEK tasot havaittiin. Kuitenkin samanlainen

in vitro

tutkimuksissa PLX4720 saaneista COLO 205 ksenografteissa osoittivat kohonnutta p-ERK ja p-rpS6 proteiinin tasot suhteessa ajoneuvon hallintalaitteita.

asetukseen TK1 seuraavat mTOR tai dual PI3K-mTOR esto ja

V600EBRAF eston COLO 205 soluja

tarkastella mTOR roolin TK1 asetuksessa seuraavissa

V600EBRAF esto, viljellyt COLO 205 soluja käsiteltiin samanaikaisesti 250 nM pp242, valikoiva mTORC1 /mTORC2 inhibiittori [21] ja kasvavia pitoisuuksia PLX4032 48 tunnin ajan (Fig. 5). Lisäämällä PP242 oli vain vähän vaikutusta PLX4032-riippuvaisen inhibition p-MEK, mutta esti tehokkaasti aktivointi p-AKT at Ser473 ja tylpät aikaisemmin havaittu aktivaatio p-rpS6 aiheuttama PLX4032 altistus (vertaa Fig. 3A). Kuitenkin mTOR saarto oli riittämätön vaimentamaan p-ERK tai p-AKT Thr308 tasot PLX4032 riippuvalla tavalla, eikä täysin vaimentaa p-rpS6 tasot (Fig. 5A). Kuten ainoana lääkkeenä

in vitro

tutkimuksissa, p-rpS6 aktivointi korreloi hieman vaimennus DUSP6 tasoa ja lievää p-ERK suuremmilla PLX4032 pitoisuuksilla. Kuitenkin yhdistetty inhibitio p-AKT Ser473 ja p-MEK johti dramaattisesti vähentynyt TK1, sekä proteiini- ja mRNA-tasolla. Läsnäollessa kohonnut p27,

TK1

mRNA väheni dramaattisesti, joilla on merkittäviä vähennyksiä havaittiin PLX4032 alhaisina pitoisuuksina kuin 10 nM (kuvio. 5A). Lisäksi, mikä viittaa siihen, että AKT-vaikutusta oli vastuussa translaation jälkeisen modifikaation ja hajoamista p27, kun läsnä on p-AKT Ser473 inhibition, p27-proteiini on dramaattisesti kohonnut, mutta

p27

mRNA ei ollut (kuvio. 5C).

(A) Western blot COLO 205 soluja käsiteltiin PP242 (250 nM) ja lisäämällä PLX4032. Samanlainen kuin yhden aineen PLX4032, p-MEK, mutta ei p-ERK, inhiboitui PLX4032-riippuvaisella tavalla. Yhdenmukainen mTORC1 /mTORC2 esto, p-AKT Ser473, mutta ei p-AKT Thr308, estyi. Toisin kuin yhden aineen PLX4032, mikä johti konsentraatiosta riippuvaisen aktivaation p-rpS6, yhdistetty hoito ylläpidetään p-rpS6 tasot oleellisesti lähtötasolle lukuun ottamatta korkein PLX4032 pitoisuus. Vastaavasti, DUSP6 tasot olivat kääntäen verrannollinen p-ERK-proteiinin tasoja. Yhdistetyllä mTOR ja

V600EBRAF saarto, P27 ja TK1 proteiinin tasot korreloi käänteisesti ja vaikuttaa dramaattisesti PLX4032 altistumista. (B) Samoin

TK1

mRNA huomattavasti pienempi PLX4032 alhaisina pitoisuuksina kuin 10 nM. (C) Vaikka kohonnut p27-proteiinin tasoa,

p27

mRNA ei vaikuttanut yhdistetyn mTOR-

V600EBRAF esto.

Koska yhdistetty

V600EBRAF-mTOR esto oli riittämätön vaimentaa p-rpS6, ja kytketään sen havainnon kanssa, että PI3K-vaikutus ja alavirran signalointia on ehdotettu mekanismi vastustuskyvyn BRAF inhibition kolorektaalisyövässä [22] ja melanooma [23], [24], arvioimme vaikutuksia dual PI3K-mTOR eston COLO 205 soluja yhdessä

V600EBRAF esto (Fig. 6). COLO 205 soluja käsiteltiin joko PLX4032, BEZ235, pieni molekyyli dual estäjä PI3K ja mTOR [25], tai yhdistelmä 24 tuntia. Todellakin, estämällä sekä mTOR aktiivisuus, mitattuna p-AKT Ser473, ja PI3K mitattuna p-AKT Thr308, läsnäollessa PLX4032 suurempana p27-proteiinin tasot ja laski TK1 proteiinin tasoja. Nämä tulokset pyydetään arviomme tämän yhdistelmän

in vivo

.

Yhden aineen PLX4032 johti aktivointi p-AKT Ser473 seuraavan 24 tunnin altistumisen kahtena pitoisuutena (100 nM, 1 uM).