PLoS ONE: Beclin 1 ja UVRAG suojaavan säteilyn aiheuttamien DNA-vaurio ja ylläpitää sentrosomimäärän vakaus peräsuolen syövän solut
tiivistelmä
Beclin 1 vuorovaikutuksessa UV-säteilytys-resistenssiin liittyviä geeni (UVRAG) muodostamaan ytimen komplekseja, jotka aiheuttavat autophagy. Vaikka solujen viallisia autophagy ovat alttiita perimän epävakaisuuden että vaikuttavan kasvainten kehittymiseen, ei tiedetä, Beclin1 tai UVRAG voi säädellä DNA-vaurio /korjausvastausviestin syövän hoitoon vakiintuneilla kasvainsoluissa. Huomasimme, että siRNA knockdovvn
Beclin 1
tai
UVRAG
voi lisätä säteilyn aiheuttamien DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t), osoitetaan Patm ja γH2Ax ja edistää peräsuolen syövän solukuolemaa. Lisäksi knockdovvn
Beclin 1
,
UVRAG
tai
ATG5
prosenttiosuus kasvoi säteilytettyjen solujen ydin- teoriapuitteet ilmentävien 53BP1, merkkiaine homologisella lopussa liittyä muttei RAD51 ( homologinen rekombinaatio), vertailuryhmän siRNA.
Beclin 1
siRNA osoitettiin vaimentaa UVRAG ilme. Solut, joissa
UVRAG
häviämämutantti puutteellinen Beclin 1 sitoutumisen kohonneen säteilyn aiheuttamien DSB ja solukuolemaa verrattuna soluihin ektooppiseen villityypin
UVRAG
. Knockdovvn
Beclin 1
tai
UVRAG,
mutta ei
ATG5,
johti merkittävään kasvuun sentrosomimäärän (γ-tubuliinin värjäys) säteilytettyyn soluissa verrattuna valvoa siRNA . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Beclin 1 ja UVRAG antavat suojan säteilyn aiheuttamien DNA DSB: t ja voi pitää sentrosomimäärän vakauden muodostuneen kasvaimen soluihin.
Citation: Myung Park J, Tougeron D, Huang S, Okamoto K, Sinicrope FA (2014) Beclin 1 ja UVRAG suojaavan säteilyn aiheuttamien DNA-vaurio ja ylläpitää sentrosomimäärän vakaus peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (6): e100819. doi: 10,1371 /journal.pone.0100819
Editor: Ilja Ulasov, Swedish Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu: 05 helmikuu 2014; Hyväksytty: 29 toukokuu 2014; Julkaistu: 23 kesäkuu 2014
Copyright: © 2014 Myung Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Institute (5 K05 CA142885 ja CA113681, sekä FAS). DT on vastaanottaja rahoitustukea Multi-Organisaation teemakohtainen Institute for Cancer ja Ranskan National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Macroautophagy on catabolic, lysosomaalisen hajoamisen polku, joka ylläpitää solun biosynteesin aikana aineenvaihdunnan, hypoksinen tai sytotoksiset stressi [1]. Keskeinen säätelijä autophagy on Beclin 1, jonka proteiini on keskeinen osatekijä luokan III PI3K /Vps34 monimutkainen, että tarvitaan autophagosome muodostumisen ja kypsymisen [2]. Beclin 1 vuorovaikutuksessa useita proteiineja kuten autophagy sääntelyviranomaiset, organelle kalvo ankkuri proteiineja, ja Bcl-2 ja Bcl-x
L. Kelattu kela domain Beclin 1 toimii proteiini vuorovaikutus alustan rekrytoida kaksi suurta autophagy sääntelyviranomaisten Atg14 ja UV-säteilyn kestävyys liittyvä geeni (
UVRAG
) tuotteen [3]. UVRAG, alunperin tunnistettu kyvyllään täydentää UV-säteilyn herkkyys tuumorisoluissa, assosioituu Beclin 1-Bcl-2-PI (3) KC3 moniproteiinikompleksin missä se ja Beclin 1 vuorovaikutuksessa kautta kela kela domain (CCD) ja keskinäisessä riippuvuussuhteessa aiheuttaa autophagy [4].
Beclin 1
ja
UVRAG
toimivat tuumorisuppressorigeeneille, ja
Beclin 1
+/-
hiirten osoitettiin olevan kasvaimeen altis [5]. Beclin 1 karttoja alueen kromosomissa 17q21, ja
Beclin 1
[6] ja
UVRAG
[7] monoallelically poistetaan tietyissä syövissä. Allelic menetys
Beclin 1
ja vialliset autophagy osoitettiin herkistää soluja metabolisen stressin [8], ja aktivoida DNA-vaurioita vastaus yhdessä aneuploidiaan kuolemattomaksi hiiren epiteelisoluissa ja nisäkasvainten [8].
perustettu kasvaimia, pohjapinta autophagy ylössäädellään hengissä aineenvaihdunnan, hypoksinen tai sytostaattihoidossa liittyvää stressiä, mikä osoittaa, että autophagy voi toimia mekanismina terapeuttisia vastus [9]. Autophagy inhibition on osoitettu lisäävän syöpäsolujen herkkyyttä kemoterapiaa tai sädehoitoa, perustamisesta autophagy uutena kohteena terapiassa [10], [11]. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että solujen viallisia autophagy ovat alttiita perimän epävakaisuuden lisääntyneeseen DNA-vaurioita ja aneuploidia- [8], [12]. Kuitenkin todisteet tukevat rooli autophagy perimän suojaa perustettu syöpiä on rajallinen ja rooli Beclin 1, jos sellainen on, ei tiedetä. On raportoitu, että UVRAG on kaksijakoinen rooli kromosomi vakauden todettiin olevan riippumaton autophagy [13]. Syöpähoitojen aiheuttavat DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t), jotka aktivoivat DNA korjausmekanismit myös ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) ja homologinen rekombinaatio (HR) palauttaa genomista eheys [14]. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että UVRAG voi edistää DNA: n DSB korjaus suoraan sitova ja aktivoimalla DNA-PK NHEJ [13]. Histone H2AX, substraatti ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin (DNA-PK) (avainentsyyminä NHEJ), fosforyloituu seriinin 139 ja muodostaa pesäkkeitä siitä DSB sivustoja, jotka voivat toimia markkerina DSB: t [ ,,,0],15]. Huolto genomista eheys edellyttää asianmukaista kromosomi erottelua solunjakautumisen aikana, joka on suurelta osin riippuvainen kokoonpano sukkularihmaston kojeen sentrosomien. Extra sentrosomien lähes väistämättä aiheuttaa karan epämuodostumia ja virheellisiä kromosomi eriytymistä [16], että vastauksena DNA-vaurioita, voi johtaa aneuploidian ja perimän epävakaisuuden [17]. Viat liittyvien geenien DNA: n korjaukseen on osoitettu aiheuttavan poikkeavuuksien sentrosomimäärän numero, joka on yhteinen ihmisen kasvaimissa [18].
Vaikka rooli Beclin 1 ja UVRAG on tutkittu asettaminen tuumorigeneesiä [4 ], [13], [19], tiedetään vähän niiden rooli sääntelyn genomisen vakautta ja mahdollista merkitystä heidän vuorovaikutuksen tässä prosessissa vakiintuneissa kasvaimia. Perehtyä mekanismi (t), jolla tuumorisolun autophagy voi antaa hoitoa vastus, tutkimme kyky Beclin 1 ja /tai sen kofaktori UVRAG säädellä DNA-vaurioita vastaus ja sentrosomimäärän kolorektaalisyövässä (CRC) solulinjat. CRC kestävät hyvin DNA vahingoittamatta hoitoja kuten solunsalpaajahoito ja säteily joita yleisesti annetaan samanaikaisesti klinikalla. Tässä suhteessa olemme aiemmin raportoitu, että Beclin 1 yliekspressio nähtiin lisääntynyt eloonjääminen paksusuolensyöpä hoidetuilla potilailla 5-fluorourasiilia tukihoitona [20]. Nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että Beclin 1 ja UVRAG vuorovaikutuksessa säädellä DNA vaurioita /korjaus, joka hyödyntää muiden homologisten loppuun tuloaan ja ylläpitää sentrosomimäärän vakautta vastauksena säteilylle.
UVRAG
häviämämutantti puutteellinen Beclin 1 sitoutumisen onnistunut suojaamaan DSB: ihin, jotka osoittavat, että on tärkeää niiden vuorovaikutusta ylläpitoon genomista vakautta.
Materiaalit ja menetelmät
Cell Culture , Drugs, Reagenssit ja Cell säteily
Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HT-29 ja DLD1, ja HeLa kohdunkaulan karsinooman soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% antibiootti /antimycotic. 293T-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (Sigma Chemical Co.), ja täydennetty kuten edellä. Kaikki solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), ja aiemmin on kuvattu [21], [22], lukuun ottamatta HeLa-soluissa, jotka oli saatu Dr. S. Kaufmann Mayo Clinic [23]. Soluja käsiteltiin 5-fluorourasiilin, bafilomysiini A1 (Sigma B1793), ja spautin-1 (Cellagen Technology, C3430-2s) kuten on osoitettu. Lääkkeet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jota käytetään myös hoidon valvonnan. Soluja myös käsitelty ionisoivalla säteilyllä, jossa on cesium 137 lähde on MARK 1-25 säteilyttäjällä (JL Shepherd ja Associates).
Sirna (siRNA) B
transfektoitiin siRNA oligonukleotidien käyttäen Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen) ja kohdistaminen sekvenssit
Beclin 1
(GGGTCTAAGACGTCCAACA),
soluliman liittyvä proteiini kevytketjun 3 B
(
LC3B
) (GAAGGCGCTTACAGCTCAA),
UVRAG
(TCACTTGTGTAGTACTGAA), ja
autophagy proteiinia 5
(
ATG5
) (GGCATTATCCAATTGGTTT) mukaan valmistajien protokollan. Suorittamaan kaksinkertainen Knockdown, solut transfektoitiin kaksi siRNA oligonukleotidien erilaisille proteiineja, 24 h välillä solujen toipua.
Lentivirusvektorikonstruktit Short Hairpin RNA
Short hiusneula-RNA (shRNA) templaattioligonukleotidejä ( syntetisoida Mayo Clinic Molecular Biology Core Facility) ligoitiin lentiviruksen shRNA kloonaus ja ekspressiovektorin pSIH1-H1 (System Bioscience, Mountain View, CA. ohjaus shRNA sekvenssi oli CAACAAGATGAAGAGCACCAA (Sigma). Kohdentava sekvenssi ubikitiinispesifinen peptidaasi 10 (
USP10)
oli GCCTCTCTTTAGTGGCTCTTT. Lentivirus tuotanto käyttämällä 293T-soluja ja transduktio kohdesoluihin suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. puromysiinille (2 ug /ml; Sigma, P8833) lisättiin 48 tuntia post transduktio ja puromysiiniresistenttiä soluja käytettiin.
Kohdunulkoinen ilmentäminen Retrovirusperäinen
UVRAG
cDNA
UVRAG
(Origene) alakloonattiin pBabe- puro vektori, jossa on N-terminaalin 3-tag. tuottoa mutatoitunut
UVRAG
kanssa poistetaan kela-kela domain (
ΔCCD
) [25] saavutettiin PCR käyttämällä päällekkäisiä alukkeita joka kesti kiinnostavan alueen. Pseudo-kirjoittanut retrovirus valmistettiin käyttäen näitä
UVRAG
rakentaa kohti aiemmin kuvattua menettelyä [24]. Aminohapot 144-269 poistettiin, jolloin saatiin
UVRAG ΔCCD
mutantti.
elinkykyyn ja apoptoosi Analyysit
3-4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -5- (3-carboxymethoxyphenly) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) kolorimetristä määritystä käytettiin mittaamaan solujen elinkelpoisuus. Apoptoosimäärityksessä suoritettiin käyttäen anneksiini V /PI-värjäyksen ja kaspaasi-3-pilkkoutumisen, kuten aiemmin on kuvattu [22].
immunoblottauksella
Protein näytteet valmistettiin ja ladattiin sitten SDS-PAGE-geeli, jossa elektroforeettinen siirto päälle polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Bio-Rad), kuten aiemmin on kuvattu [24]. Vasta-aineet seuraavat proteiinit hyödyntää: Beclin 1, lohkaista kaspaasi-3, γH2Ax, H2AX, pCHK2, LC3, UVRAG, ATM (kaikki Cell Signaling Technology, 1:1000), γ-tubuliinin, Patm (EPITOMICS, 1:2000 ) ja P62 (MBL, 1:2000). Proteiinivyöhykkeet kvantifioidaan ja normalisoidaan γ-tubuliinin käyttäen ImageJ (National Institute of Health).
klonogeeninen eloonläämismääritys
Kaksisataa solut ympättiin kuhunkin kuuden kuoppalevylle ja sen jälkeen säteilytetty (4 Gy) yksin tai, kun läsnä on 5-fluorourasiilin (5-FU) (2 uM). Kun oli inkuboitu 7-14 päivää, solut kiinnitettiin 10% metanoli /10% etikkahappo, ja sitten värjättiin 0,4% kristallivioletilla 10% metanolia. Määrä pesäkkeiden 50 solua määritettiin ja ilmaistiin suhteellista muutosta lääkettä saaneissa
vs
käsittelemättömät solut.
Immunosaostaminen
Solut lyysattiin CHAPS puskurissa [5 mmol /l MgCl
2, 137 mmol /l KCI: a, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /l EGTA: ta, 1% CHAPS, 10 mmol /L HEPES (pH 7,5)] 30 minuutin ajan jäissä ja sitten kirkastettiin sentrifugoimalla 17000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lysaatit inkuboitiin vasta-aineen kanssa yön yli 4 ° C: ssa. Antigeeni /vasta-kompleksi siepattiin käyttäen magneettisia proteiini-A /G-helmiä (Thermo Scientific) 2 h 4 ° C: ssa. Sitoutumattomat proteiinit pestiin kolme kertaa 1 ml: lla CHAPS-puskuria ilman proteaasi-inhibiittoreita. Sitoutuneet proteiinit helmille eluoitiin inkuboimalla MAP näytepuskuriin 10 min ja myöhemmin lastattu immunoblottauksella.
Immunofluoresenssi- ja konfokaalimikroskopialla
Soluja viljeltiin lasipohjaisella ruokia päällystetty poly- L-lysiiniä (MatTeck Corp.) ja tämän jälkeen altistettiin y-säteilylle (2-8 Gy). Solut kiinnitettiin 10 minuuttia 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssa, ja estettiin 3% naudan seerumin albumiinia (BSA). Seuraavaksi solut värjättiin ensisijainen vasta-aineita 53BP1 (Cell Signaling Technology, 4937, 1:100), tai RAD51 (Calbiochem, PC130, 1:100), jonka jälkeen vastaava fluoresoiva sekundaarisia vasta-aineita (Alexa Fluor 488 tai 568, Molecular Probes, Invitrogen). Näytteet huuhdeltiin, upotettiin 0,05 ug /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) 5 minuuttia, ja asennettu peitinlasit käyttäen Prolong Gold (Invitrogen). Fluoresenssi konfokaalimikroskopia suoritettiin käyttäen Axiovert 100 M mikroskooppi varustettu Plan-Apochromat 63 X /1.4 objektiivilinssin ja Zeiss LSM510 ohjelmistot (Carl Zeiss). Solujen prosenttiosuus, jotka sisältävät yli 10 ydin- fluoresoivia kohti solujen kokonaismäärä laskettiin tutkimalla vähintään 100 solua viidellä osoitteessa 63x kutakin koetilalle.
värjäystä sentrosomien, sytoplasman tubuliinia köyhtynyt mikroputkeen vakauttaminen puskuria (3 moll /l EGTA, 50 mmol /L Putket, 1 mmol /l MgSO
4, 25 mmol /l KCI). Solut kiinnitettiin 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa metanoli [26], läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä, ja inkuboitiin salpauspuskurilla (5% vuohen seerumia, 1% glyserolia, 0,1% BSA, 0,1% kalan ihon gelatiini). Seuraavaksi solut värjättiin primäärisen vasta-aineen γ-tubuliini (Sigma, GTU-88, 1:5000) ja sen jälkeen vastaavan fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineita. Prosenttiosuus soluja, joissa on enemmän kuin 2 sentrosomien määritettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia, jossa on vähintään 100 solua viiden kentät 63x laskettiin kunkin kokeellisen kunnossa.
Tilastollinen analyysi
Tilastollinen vertailu kokeita varten viljellyissä soluissa suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä. Tilastolliset testit olivat kaksipuolisia merkitsevyystasolla määritelty
P
0,05.
Tulokset
cytoprotective vaikutus
Beclin 1
sisään altistuneiden solujen 5-FU ja /tai säteily
määritetään, onko tukahduttaminen Beclin 1 voi parantaa chemoradiation aiheuttamaa sytotoksisuutta. Koolonsyöpäsolulinjoissa käsiteltiin γ-säteilyä (4 Gy) joko yksin tai yhdessä 5-FU: ta (2 pM). Käsitellyissä soluissa,
Beclin 1
pudotus
vs
ohjaus siRNA oli osoitettu vähentävän merkitsevästi solujen elinkykyä (Fig. 1A, B,
jäljellä paneelit
).
Beclin 1
Knockdown myös vähentynyt pitkäaikainen klonogeeniset solujen selviytymistä jälkeen säteilystä ± 5-FU verrattuna solujen ohjaus siRNA (Fig. 1A, B,
oikea paneeli
). Näissä kokeissa, paitsi että kliinisesti saavutettavissa annos 5-FU oli minimaalinen vaikutus säteilyn määrästä solukuolema.
A, B,
HT-29 (A) tai DLD1 (B) transfektoitiin
Beclin 1
vs. verrokki siRNA ja saaneet sädehoitoa (RT; 4 Gy) joko yksin tai yhdessä 5-FU: ta (2 pM). Tulokset MTS (24 h) ja klonogeeniset selviytymisen määritykset näkyvät. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin kaksipuolinen Studentin t-testiä ja määritellään *
P
0,05.
C
, solut sisältävät
Beclin 1
tai ohjaus siRNA oli säteilytetty (4 Gy) ja sitten koetettiin ekspressioon LC3I-II, γH2Ax, ja pilkotaan kaspaasi-3 immunoblottauksella 24 tuntia . Proteiinivyöhykkeet kvantifioidaan ja suhteellinen intensiteetti oli merkitty alla vastaavaan blot. Vain LC3II kvantitoitiin varten LC3 proteiinia.
D,
ajan kuluessa säteilyn vaikutusta Patm ilmaisun solujen
Beclin 1
siRNA vs ohjaus siRNA.
E
, vaikutus
Beclin 1
siRNA on autophagic vuon soluissa, joita oli käsitelty RT (4 Gy) ja /tai 5-FU (4 uM).
voit selvittää Beclin 1 voidaan säädellä DNA-vaurioita vastaus, tutkimme säteilyn vaikutusta ilmennettäessä DSB merkkiaineiden fosforyloituu histoni H2AX (γH2Ax) [27] ja fosforyloituu ataksia telangiektasian mutatoitunut (Patm). ATM on kriittinen anturi DNA-vaurion joka on osallisena DNA: n korjaukseen ja G2-to-M tarkastuspiste ohjaus [28], ja jonka aktivointi vaatii autofosforylaation [29]. Tukahduttaminen
Beclin 1
siRNA lisääntynyt γH2Ax ilmaisu kaksinkertaiseksi, indusoi Patm, ja lisääntynyt kaspaasi-3 katkaisun (2-kertaisesti), jotka oli altistettu säteilylle verrattuna kontrolliin siRNA (Fig. 1 C, D). Modulointi γH2AX 24 tunnin todennäköisesti edustaa ei-korjattu, jäljellä DNA-vaurioita postitse säteilytys. Sitten määritetään, onko
Beclin 1
siRNA voi estää säteilyn aiheuttamien autophagic muutostilassa. Käyttämällä bafilomysiini A1, joka estää vakuolaarisen H + ATP, havaitsimme kertyminen sytosolin (LC3I) ja kalvoon sitoutunut (LC3II) muodot LC3 (Fig. 1 E), jonka suhde korreloi laajuus autophagosome muodostumisen [1], [30]. Käsitellyissä soluissa 5-FU + säteilyn ja bafilomysiini A1,
Beclin 1
pudotus on todettu heikentävän kertyminen LC3I-II verrattuna valvoa soluja ja lisätä ilmentymisen autophagy substraatin p62 /sequestosome1 [24] sopusoinnussa esto autophagic flux (Fig. 1 E).
määritetään sitten kyky Beclin 1 ja UVRAG moduloivan DNA-vaurioita vastaus säteilytettyyn soluissa. Expression of 53BP1 on anturi DNA-vaurioita ja edistäjänä NHEJ [31], kun taas RAD51 on kriittinen säätelijä DNA korjaukseen läpi HR [32]. Säteilytys liittyi kasvuun prosentuaalinen solujen 10 53BP1 ydin- pesäkkeitä 4 tunnin kuluttua, joka oli merkitsevästi (p 0,05) parannettu
Beclin 1
,
UVRAG
tai
ATG5
pudotus
vs.
kontrollisoluja (Fig. 2A).
ATG5
Knockdown soluja käytettiin kontrollina käytöstä autophagy. Säteilytys myös lisänneet RAD51 pesäkkeitä, jotka eivät eroa merkittävästi joukossa
Beclin 1
,
UVRAG
tai
ATG5
pudotus
vs
ohjaus soluja (kuvio . 2B).
A, B,
immunofluoresenssivärjäystä 53BP1 (A) tai RAD51 (B) suoritettiin HT-29-solujen pudotus on
Beclin 1
UVRAG
tai
ATG5
ja altistuneet säteilylle (2 Gy) on ilmoitettu aikoina. Prosenttiosuus solujen 10 ydin- pesäkkeet ekspressoivat joko 53BP1 tai RAD51 laskettiin ja piirrettiin kuten on esitetty. 53BP1 ja RAD51 ovat markkereita homologisella end tuloaan ja homologinen rekombinaatio, vastaavasti. DAPI käytettiin vastavärjäämiseksi tumaan. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin kaksipuolinen Studentin t-testiä ja määritellään *
P
0,05.
USP10 ja USP13 on osoitettu välittävän deubiquitination on Beclin 1, mikä vakauttaa Vps34 monimutkainen [33]. Inhibitio Näiden deubiquitinases voi näin ollen edustaa strategia tukahduttaa autophagy. Olemme havainneet, että suppressio
USP10
jonka shRNA indusoi 2-kertainen nousu DSB markkeri γH2Ax ja kaspaasi-3-pilkkoutumisen ja vähensi myös klonogeenisten eloonjäämisen säteilytettyjä soluja (Fig. 3A). Esto USP10 ja USP13 myös suorite- käyttäen spautin-1, joka on voimakas pienimolekyylinen inhibiittori autophagy, joka edistää hajoaminen Vps34 PI3-kinaasi-komplekseja [33]. Spautin-1 esti autophagy kuten alennetun LC3I-II muuntaminen ja kertymistä p62 /sequestosome 1 (Fig. 3B). Lisäksi spautin-1 parantaa DSB: t, vaatimattomasti indusoi apoptoosia (Fig. 3B, C), ja vähensi klonogeenisten eloonjäämisen solut altistetaan säteilylle yksin tai yhdessä 5-FU: ta (Fig. 3d).
A,
solut sisältävät
USP10 vs
ohjaus shRNA oli säteilytetty ja analysoitiin ilmentymisen USP10, LC3I-II, γH2Ax ja halkaistut kaspaasi-3 24 tunnin immunoblottauksella (
jäljellä
) taikka klonogeeniset eloonjäämisen (
oikea
).
B,
Soluja käsiteltiin sädehoidon tai yhdistettynä spautin-1 (10 uM), ja ilmentymisen merkitty proteiinit analysoitiin 24 tunnin immunoblottauksella.
C, D,
Soluja käsiteltiin spautin-1 (10 uM) yksin tai yhdistettynä RT (4 Gy) (C) tai RT ± 5-FU: ta (2 pM) (D). Näissä soluissa, anneksiini V:
+ PI
– merkinnät 24 h (C) ja klonogeeniset eloonjääminen (D) analysoitiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta verrattuna kontrolleihin ja rinnakkaisessa kokeessa. **
P
0,01.
UVRAG
vuorovaikutuksessa
Beclin 1
säädellä DNA Damage Response
Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että vähentynyt ilmentyminen
UVRAG
nähdään joidenkin syöpien voi tehdä kasvainsolut alttiita kromosomivaurioista [34]. Olemme havainneet, että
Beclin 1
siRNA voi voimakkaasti vähentää UVRAG ilmentymisen läsnäolo tai puuttuminen säteilyn (Fig. 4A). Knockdovvn
UVRAG
siRNA lisääntynyt säteilyn aiheuttamien DSB: t (γH2Ax) (Fig. 4B), tasot Patm (Fig. 4C), ja kaspaasi-3 pilkkominen verrattuna ohjata siRNA (Fig. 4B). Sen määrittämiseksi, onko
Beclin 1
on additiivinen vaikutus
UVRAG
sääntelystä säteilyn aiheuttaman DNA-vaurioita ja apoptoosin, vertasimme soluja knockdovvn
UVRAG vs
joilla kaksinkertainen knockdovvn
Beclin 1
ja
UVRAG
. Vaikka samalla tasolla γH2Ax ja pCHK2 todettiin, säteilytetty solujen kaksinkertainen Knockdown osoittivat lisääntynyttä kaspaasi-3 pilkkominen viittaa siihen, että modulaatio apoptoosin Beclin 1 tapahtuu riippumatta
UVRAG
(Fig. 4D). Sitten tutkittiin vuorovaikutusta Beclin 1 ja UVRAG valvonta ja säteilytetään solulinjoissa. Immunosaostettiin UVRAG on osoitettu liittyvän Beclin 1: n läsnä ollessa tai ilman säteilyä (Fig. 5A).
A, B,
HT-29 ja DLD1 solut transfektoitiin
Beclin 1
(A) tai
UVRAG
(B)
vs
ohjaus siRNA. Solut säteilytetty ja ilmaisu osoitettujen proteiinien analysoitiin 24 tunnin post-säteilyä immunoblottauksella.
C,
ajan kuluessa säteilyn vaikutusta Patm ilmaisun solujen
UVRAG vs
ohjaus siRNA.
D,
vaikutus säteilyn DNA-vaurioita ja apoptoosin markkereita soluissa dual knockdovvn
Beclin 1
ja
UVRAG
vs
UVRAG
siRNA yksin ( 24 h). Densitometria suoritettiin ja normalisoidaan tubuliinia.
A
immunosaostus UVRAG seuraavalla testauksella varten Beclin 1 suoritettiin HT-29 solulysaateista (4 h) seuraavat säteily (4 Gy)
vs
käsittelemättömät solut. Normaali IgG käytettiin kontrollina vasta-spesifisyyden. Sekä lyhyet (SE) ja pidemmän (LE) vastuut näkyvät UVRAG.
B,
HT-29-solujen yli-ilmentävät
UVRAG
villityypin (wt) tai deleetiomutantti sen kela-kela domain (ΔCCD), molemmat merkitty kolmen tandem-tag [ ,,,0],3tag: s-tag, 2XFLAG ja streptavidiinia sitova proteiini (SBP)], tehtiin immunosaostus varten FLAG. Saostuneet proteiinit koetettiin käyttäen vasta-aineita Beclin 1, UVRAG tai FLAG. Normaali IgG käytettiin kontrollina.
C,
Cell lysaatit säteilytettyä (4 Gy) soluja tutkittiin varten LC3I-II ja γH2Ax 24 tunnin säteilytyksen jälkeisiin immunoblottauksella. Vakaa
UVRAG
paino- tai
ΔCCD
mutanttisoluista hyödynnettiin täällä ja kuvassa. 5B.
D
, soluja, joiden paino
UVRAG
tai
UVRAG ΔCCD
mutantti vs. tyhjän vektorin ohjaus sai vehikkeliä tai säteilyä, ja pitkäaikainen klonogeeniset eloonjääminen määritettiin. Aineisto normalisoitiin suhteessa käsittelemättömiin soluihin ja jokaisen solun fenotyyppiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin kaksipuolinen Studentin t-testiä ja määritellään * P 0,05.
HT-29-soluihin, joissa UVRAG immunosaostettiin, sen induktio säteilyn havaittiin käsittelemättömiin soluihin verrattuna, ja UVRAG osoitettiin myös sitoutuvan Beclin 1 (Fig. 5A). Tutkia vaikutus Beclin 1 ja UVRAG vuorovaikutuksen säätelyssä radioherkkyyttä, me syntyy HT-29-solut, jotka ilmentävät stabiilisti villityypin (wt)
UVRAG
tai
ΔCCD
mutantteja, joka välittää sen vuorovaikutusta Beclin 1 [25].
UVRAG ΔCCD
mutantti-solut osoittivat lähes täydellinen menetys sitoutumisen Beclin 1 toisin UVRAG paino- soluissa (kuvio. 5B). Kohdunulkoinen paino-
UVRAG
osoitettiin parantaa LCI-II konversio säteilytettyjä soluja (Kuva. 5C). Sitten pyrittiin määrittämään, onko
UVRAG ΔCCD
voi kadota /vaimennus autophagy induktion säteilyn.
UVRAG ΔCCD
soluista osoitti lievää laskua säteilyn aiheuttama LC3I-II konversio verrattuna p- soluissa (kuvio. 5C), jotka voivat liittyä rinnakkaiseloon endogeenisen UVRAG. Solut kanssa UVRAG
ΔCCD
olivat alttiimpia säteilyn aiheuttamista DSB, osoitetaan lisääntynyt γH2Ax (Fig. 5C) verrattuna p-
UVRAG
ja tyhjän vektorin ohjaus soluja. Lisäksi solut, joilla on
UVRAG ΔCCD
olivat herkempiä säteilylle solukuolema on esitetty pitkän aikavälin klonogeenisten eloonjäämisen määritys verrattuna UVRAG paino- solut (Fig. 5D).
Beclin 1
ja
UVRAG
Asetus sentrosomimäärän Stability
Vaikka solujen viallisten autophagy ovat alttiita perimän epävakaisuuden, todiste rooli autophagy perimän suojaa on rajoitettu ja asema Beclin 1 tai UVRAG, jos sellainen on, on huonosti ymmärretty. Tutkimme kyky autophagy sääntelyviranomaisten toimia välittäjänä genomin suojaa analyysi sentrosomimäärän vahvistusta. Sentrosomimäärän vahvistus on löydetty ihmisen syöpäsoluja DNA aiheuttaman vaurion ionisoivan säteilyn tai sytostaattien [35], ja voi johtaa mitoottisiin epäonnistumisen ja johtaa solukuolemaan [36]. Autophagy esto tukahduttaminen
ATG5
tai
LC3
siRNA oli osoitettu lisäävän säteilyn aiheuttamien γH2Ax ja kaspaasi-3 pilkkominen (Fig. 6A), osoittaa kykyä autophagy säädellä näiden prosessien . Sitten määritetään, onko Beclin 1 ja /tai UVRAG voi säädellä sentrosomimäärän vakautta. Hoitamattomilla HT-29 tai Hela-solut, löysimme tilastollisesti merkittävän kasvun sentrosomimäärän seuraavissa knockdovvn
Beclin 1
tai
UVRAG
ja vähäisemmässä määrin ATG5 verrattuna hallita siRNA osoittaneet by γ-tubuliinin immunofluoresenssilla (Fig. 6B). Säteilytettyyn soluissa, tilastollisesti merkittävä kasvu sentrosomimäärän rajoittui solujen knockdovvn
Beclin 1
tai
UVRAG,
mutta ei
ATG5
(Fig. 6B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että Beclin 1 ja UVRAG voi säädellä sentrosomimäärän vakautta riippumatta autophagy.
A
vaikutus knockdovvn
LC3
(
jäljellä
) tai
ATG5
(
oikea
) on merkkiaineiden DSB: t (γH2Ax), apoptoosin (kaspaasi-3), ja autophagy (LC3I-II muuntaminen) HT-29 ja /tai DLD1 solut altistuvat säteilylle
vs
ohjaus 24 tuntia säteilytyksen jälkeisiin.
B
, sentrosomimäärän määritettiin immunofluoresenssilla
Beclin 1
,
UVRAG,
tai
ATG5
pudotus soluja (HT-29 tai HeLa) käsiteltiin säteilyä (4, 8 Gy)
vs
ohjaus. Sitten solut värjättiin γ-tubuliinin (punainen väri) ja edustavat kuvat näkyvät (
jäljellä
). Solujen prosenttiosuus, joissa on enemmän kuin kaksi sentrosomien (multi-sentrosomien) laskettiin ja piirrettiin (
oikea
). Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin kaksipuolinen Studentin t-testiä ja määritellään *
P
0,05 verrattuna kontrolliin soluihin.
Keskustelu
Vaikka roolia Beclin 1 ja UVRAG DNA vaurio on tutkittu asettaminen tumorigeneesin [4], [13], [19], tiedetään vähän molekyylitason yksityiskohdat niiden rooli tuumorisolun vastauksena syöpähoidon. Ymmärtäminen solu resistenssimekanismeihin DNA vaurioita ja korjaus vastaukset ovat kriittisiä parantaa hoitotulosten syöpäpotilailla. Asianmukaiset suorittamisesta DNA: n DSB korjaus on kriittinen kasvaimen solujen selviytymistä seuraavat DNA-vaurioita ja ylläpitoon perimän vakautta. Huomasimme, että Beclin 1 ja sen kofaktori UVRAG voi säädellä DNA-vaurio /korjausvastausviestin ja sentrosomimäärän vakautta ihmisen CRC soluissa. Erityisesti tukahduttaminen
Beclin 1
tai
UVRAG
liittyi kertymistä DSB ja lisääntynyt apoptoottista solukuolemaa vastauksena säteilyn ± 5-FU, mikä osoittaa niiden kyky säädellä näitä prosesseja. Mekanismi, jolla
UVRAG
ja
Beclin 1
säätelevät DNA-vaurioita vastaus on ehdottanut todetessaan, että tukahduttaminen joko geenin lisännyt huomattavasti säteilytettyjen solujen ydin- pesäkkeitä ilmentävien 53BP1 joka osaltaan NHEJ vuorovaikutuksessa kromatiinin klo DSB auttaakseen säännellä 5’resektio [31]. Tämä havainto on sopusoinnussa tietoa
53BP1
vajausta hiirillä, jotka näyttävät yliherkkyys säteilytys ja näytteille kromosomipoikkeavuuksien ilmaisee DNA korjaus vikoja [37]. Toisin kuin 53BP1, huomasimme, että määrä RAD51 ydin- pesäkkeitä ei vaikuttanut
Beclin 1
tai
UVRAG
tukahduttaminen, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään suosivista osallistumista NHEJ
vs
HR tässä asetelmassa. Koska Beclin 1 vakauden ohjataan ubikitinaatiosta estämällä deubiquitinases että downregulate Beclin 1 on osoitettu poistaa soluja suojaava vaikutus Beclin 1. Samanlaisia
Beclin 1
pudotus, olemme havainneet, että suppressio ubikitiinispesifinen peptidaasi, USP10, tai pieni molekyyli estäjä deubiquitinases USP10 ja USP13, eli spautin-1 [33], voidaan lisätä säteilyn aiheuttamien DSB ja kasvainsolujen kuolemaa edistävällä tavalla. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, läheinen suhde Beclin 1 ja p53 kautta deubiquitinases USP10 ja USP13 [33]. Koska USP10 välittää deubiquitination p53, sääntely deubiquitinase aktiivisuuden USP10 ja USP13 by Beclin 1 voi antaa mekanismi, jolla se voi valvoa p53-proteiinin tasoa. Kuitenkin Näiden havaintojen merkitystä soluihin kanssa mutantti
p53
, jota käytetään tässä tutkimuksessa, ei tunneta. Vaikka käytimme Knockdown lähestymistapoja ja autophagy estäjä (spautin), me tunnustamme, että tietyt autophagy sääntelyviranomaiset voivat suoraan tai epäsuorasti säädellä solun prosesseja, jotka ovat riippumattomia autophagy [13], [38].
Huomasimme, että tukahduttaminen
Beclin 1
liittyi downregulation UVRAG, sopusoinnussa todisteita siitä, että vakaus komponenttien PI (3) KC3 kompleksi, joka säätelee autophagy ovat toisistaan riippuvaisia klo transkription jälkeisellä tasolla [3], [4 ]. Määrittää toiminnallisen päällekkäisyys näiden geenien, me tuotettu solut dual pudotus on
UVRAG
ja
Beclin 1
, joka oli osoitettu lisäävän apoptoosia, mutta ei DSB, verrattuna
UVRAG
pudotus yksin. Tämä havainto viittaa siihen, että Beclin 1 voi säädellä apoptoosia riippumatta UVRAG.