Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transforming kasvutekijä-β1 (TGF-β1) ja -β2 korreloivat huonompi ennuste mahasyövän (GC), jotka toimivat sekä kasvaimen ja immuunisolujen. Kuitenkin niiden ilmaisut precancer ja kasvaimen-solu-vuorovaikutuksiin, jossa perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) ovat edelleen epäselviä. Proteiini tasot TGF-β1 ja -β2 analysoitiin immunohistokemiallisesti ja vastaavan mRNA: n tasot määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio 93 kirurgisten ja biopsianäytteistä. Seerumin TGF-β pitoisuuden havaittiin entsyymi-immunologiset määritykset. AGS ja MKN45 solulinjoja suoraan tai epäsuorasti viljellään kanssa PBMC

in vitro

. TGF-β ja Smad molekyylejä havaittiin jälkeen keraviljelmistä ja kasvaimet GC solut ja PBMC arvioitiin soluproleferaatiomäärityksessä. Tulokset osoittivat positiivista värjäytymistä TGF-β1 havaittiin 20% Kontrollinäytteiden 52,3% of precancer, 59,1% varhaisen GC ja 66,7% kehittyneiden GC näytteiden korreloi vaurion etenemisen (χ

2 = 9,487,

P

= 0,002). Kaikki kudokset olivat positiivisia TGF-β2. TGF-β1 mRNA-tasot lisääntyivät edenneisiin syöpiin, kun taas TGF-β2 kasvoi aiemmin. TGF-β1 mRNA-tasot olivat korkeampia kasvain kuin peritumor, joka korreloi positiivisesti Smad2 ja Smad7. Seerumin TGF-β-tasot olivat merkitsevästi suurempi potilailla, joilla alussa ja pitkälle edenneitä syöpiä verrattuna kontrolleihin (TGF-β1:50.08 ± 4,38 ja 45,76 ± 5,00 vs. 27,78 ± 6,11 ng /ml; TGF-β2:133.61 ± 21.90 ja 111,34 ± 15,76 vs. 59.41 ± 15.42 ng /ml, sekä

P

0,05). Tasot TGF-β1 mRNA ja sytokiinien erityksen olivat korkeammat GC soluissa jälkeen suoraan yhteisviljelmä verrattuna välillisiä kulttuuriin. TGF-β1 vähennettiin ja TGF-β2 lisääntyi PBMC jälkeen keraviljelmät. Lisäksi TGF-β1 esti elinkelpoisuutta PBMC-, mutta ei syöpäsoluja. Yhdessä neoplastisen transformaation voi olla varhainen tapahtuma, johon lisääntyminen TGF-β1 yleiseen ja paikalliseen ympäristöön. TGF-β1 tuotanto edistävät suoraa vuorovaikutusta GC solujen ja PBMC, jotka saattavat helpottaa syövän kehitystä.

Citation: Ma GF, Miao Q, Zeng XQ, Luo TC, Ma LL, Liu YM, et al . (2013) transformoivan kasvutekijän-β1 ja -β2 mahalaukun Precancer ja Syöpä ja roolit Kasvain-soluinteraktiot veren mononukleaarisoluissa

In vitro

. PLoS ONE 8 (1): e54249. doi: 10,1371 /journal.pone.0054249

Editor: Noriko Gotoh, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan

vastaanotettu: 16 elokuu 2012; Hyväksytty: 10 joulukuu 2012; Julkaistu: 14 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Xinjiangin Uygur autonomisen alueen Science and Technology Support Project (No.200991127) (https://www.kjzj.gov.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi tuhoisa ihmisen syöpien, joiden esiintyvyys on korkein esiintyy Itä-Aasia [1]. Transformoivan kasvutekijän β (TGF-β) näyttelee tärkeä rooli pahanlaatuinen kasvain etenemisen [2] – [4]. TGF-β-perheeseen kuuluu TGF-β1: n, TGF-β2 ja TGF-β3, joilla on erilaisia ​​ja ei-päällekkäisiä toimia in vitro [5]. TGF-β1 ja TGF-β2 enimmäkseen edistävät syövän etenemisen toimimalla sekä kasvainsoluissa ja stroomasolujen [6], [7], ja menetys herkkyys kasvun inhibitiolle TGF- β ajatellaan esiintyvän useimmissa syöpäsoluissa. Samaan aikaan, syöpäsolut saada etua selektiivisellä vähentää kasvaimen esti aktiivisuuden TGF-β ja vahvistukseksi sen onkogeenistä toimintaa [8], [9]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TGF-β1 muodostaa itsenäisen ennustetekijä korreloivat kasvaimen vaiheen ja huonompi ennuste [5], 10,11. Kuitenkin tilat TGF-β-proteiini ja mRNA rooleineen muodonmuutoksen mahalaukun precancer (PC) syöpä ovat edelleen epäselviä.

TGF-β on voimakas immunosuppressiivinen tuottamaa sytokiinia immuuni ja ei-immuunisolujen , mukaan lukien kasvainsolut [12], [13]. TGF-β voivat edistää kasvaimen kasvua aiheuttamalla epiteelisolujen läpi epiteeli- mesenkymaalitransitioon [14]. Inhibition of TGF-β signalointi on raportoitu etenemisen ehkäisemiseksi ja etäpesäkkeiden tiettyjen kehittyneiden kasvaimia [15], [16], kun taas TGF-β1 on osoitettu vähentävän immuunivastetta [17], [18] ja stimuloivat angiogeneesiä [19 ] kasvaimen mikroympäristössä. Smad proteiineja, kuten solunsisäinen efektoreita TGF β signalointi, aktivoidaan reseptoreita ja translokoituvat tumaan transkription säätelemiseksi [20]. Kuitenkin Smad riippuvuus TGF-β signalointi mahalaukun PC ja varhaisen syöpä ei ole vielä täysin ymmärretty.

TGF-β on merkittäviä rooleja kasvaimen mikroympäristössä, joissa ei ainoastaan ​​vuorovaikutuksia immuuni ja ei-immuunisolujen , mutta myös vuorottelu joidenkin sytokiinien tuotantoa. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) ovat keskeisiä sytokiini-erittävien immuunisolujen, ja niiden vuorovaikutukset syövän soluja voidaan indusoida tai tukahduttaa syövän immuunivasteet, mukaan lukien apoptoosin ja sytokiinien tuotantoa, joka edistää yleensä kasvaimen etenemiseen [12], [21 ], [22]. Vuorovaikutukset syöpäsolut ja PBMC esiintyvät pääasiassa kahdella tavalla: suoraan solu-solu yhteyttä, ja epäsuorilla sytokiini-riippuvainen keskiarvon. Vaikka jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että useat kasvainsolut voivat aiheuttaa CD4 + CD25 + säätelijä-T-solujen reuna-CD4 + naiiveja T-solujen kautta eritystä TGF-β [23], [24], [25], muut on osoittanut, että tasot sytokiinien TNF-α, interleukiini (IL) -1β, IFN-γ lisättiin välisen vuorovaikutuksen aikana paksusuolen syövän ja lymfosyyteissä [26]. Kuitenkin kaksi menetelmiä yhteystietoja ei verrattu näissä tutkimuksissa, ja tärkeimmät tapahtuvaa vuorovaikutusta siten edelleen tuntematon.

Tässä tutkimuksessa arvioimme proteiini- ja mRNA-tasoja TGF-β1, TGF-β2, ja muut korreloivat molekyylien kirurgisten ja endoskooppinen näytteitä potilailta, joilla precancer ja syöpä, analysoimaan niiden roolit karsinogeneesissä. Olemme myös Yhteisviljeltyjä GC soluja PBMC onko ne vuorovaikutuksessa suoraan solu-solu-kontakti-riippuvaista tai välillinen sytokiiniriippuvaisen avulla simuloidussa kasvain mikroympäristön.

Materiaalit ja menetelmät

Patient näytteitä

yhteensä 93 tapausta mukana tässä tutkimuksessa, joka käsittää 30 kirurgisesti resektoitiin ensisijainen GC yksilöitä, 43 neoplastisia ja syöpä- yksilöitä saatu endoskooppinen limakalvon alaista leikkely (ESD), ja 20 ohjaus biopsianäytteissä normaalista-näkymisen mahalaukun limakalvon potilailla vapaa neoplastisten tai tulehdussairaudet. Potilaiden ominaisuuksiin analysoitiin seuraavasti: 20 normaalien kudosten (12 urosta, 8 narttua, keski-ikä = 45,20 ± 14,01 vuotta, soi 28-63 vuotta), 21 PC lukien pääosin matala-asteinen tai korkea-asteen intraepiteliaalinen neoplasia (15 urosta , 6 narttua, keski-ikä = 65,86 ± 7,81 vuotta, vaihteluväli 57-79 vuotta), 22 varhainen GC (EGC) määritellään pinnallinen kasvain hyökkääviä enintään submukoosassa (14 urosta, 7 narttua, keski-ikä = 63.50 ± 13,82 vuotta, vaihteluväli 41-81 vuotta), ja 30 kehittyneet GC (AGC) (21 urosta, 9 naista, keski-ikä = 59,48 ± 10,75 vuotta, 30-70 vuotta). Kaikki potilaat vahvistettiin patologinen tutkimus. Histologinen tyyppi arvioitiin mukaan Maailman terveysjärjestön luokitus [27]. Ryhmät tutkittu olivat demograafisesti verrattavissa kontrolliryhmään (

P

0,05).

Ethics lausunto

Potilailla, jotka saivat radiochemotherapy kärsi muiden syöpien, tai joilla oli suvussa GC jätettiin pois tutkimuksesta. Kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista. Projektin hyväksyi Research Ethics komitean Zhongshan sairaalan [28].

immunohistokemia (IHC) B

TGF-β1 ja TGF-β2 proteiinin tasot tutkittiin IHC 4-Pm o paksu parafiinileikkeillä leikattu yhdestä valitun lohkon sisältävän neoplastisia ja ei-neoplastisia mahalaukun kudoksiin. Näytteitä rutiininomaisesti vaha ja sammutettua. Sen jälkeen estämällä endogeenisen peroksidaasin, antigeenejä haettiin lämmittämällä etyleenidiamiinitetraetikkahappo (pH = 9,0). Antigeenit todettiin sitten käyttämällä tavanomaista värjäysmenettelyä (EnVision ™ Detection Kit, Dako, CA, USA). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita käytettiin havaitsemaan TGF-β1: n ja TGF-β2 (kaikki laimennukset 1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA). Vasta–negatiiviset kontrollit, ensisijainen vasta-aineet substituoitu normaalia kanin seerumia. Tapauksia olisi pidetty positiivinen, jos vähintään 5% of dysplastisia tai syöpäsolujen näkyvissä sytoplasmista värjäytymistä TGF-β1 tai TGF-β2 at x 100 suurennus.

kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)

Kokonais-RNA eristettiin kudosnäytteistä ja kirurgisista näytteistä, tai viljellyistä soluista, käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA). Täydentävä DNA valmistettiin käyttämällä oligo

dT-alukkeita protokollan mukaisesti mukana toimitettu Primer Script ™ RT Reagent (TaKaRa, Tokio, Japani). Ekspressiotasot TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 ja Smad7-mRNA: t vahvistettiin SYBR® Green II qRT-PCR käyttäen Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hampuri, Saksa), jossa kaksivaiheinen, 95 ° C: ssa 30 sekuntia tämän jälkeen 60 ° C 1 min, toistettiin 40 sykliä. Alikvootit PCR-tuotteet analysoitiin sulamiskäyristä testata spesifisyyden. Kaikki alukkeet, mukaan lukien TGF-β1: n, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 ja Smad7, testattiin monistuksen tehokkuus ja normalisoitiin mRNA-tasot glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (taulukko S1). Kaikki qRT-PCR-kokeet suoritettiin samalla tutkija ilman tietoa vastaavan kliinisten tietojen.

Solut ja Cell Culture

AGS ja MKN45 GC solulinjoja ostettiin Shanghai Institute of Cell Biology Kiina Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Ne viljeltiin rutiininomaisesti DMEM-alustassa (Gibco, Invitrogen, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco), 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C.

eristäminen PBMC

PBMC-solut eristettiin laskimoverestä GC potilaiden tai valvontaa, kuten aiemmin on kuvattu [22], [29]. Lyhyesti, 3 ml verta laimennettiin välittömästi 3 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja kerrostettiin 3 ml Ficoll-Paque Plus ™ (Amersham Healthcare, Aylesbury, UK). Sentrifugoinnin jälkeen PBMC: t otettiin talteen interphase kerroksesta, suspendoitiin uudelleen täydelliseen elatusaineeseen ja viljeltiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, jotta kiinnitys on kiinnittyneitä soluja, kuten dendriittisoluja.

Cell yhteisviljelmä Model

TranswellTM levyt (Corning, New York, USA) käytettiin epäsuorana yhteisviljelmä malli, joka sisältää pohja kammiot ja ylhäältä kammiot 0,4 um kalvosuodattimen huokoset, jotka eivät salli GC soluja lävitseen mutta mahdollistavat väliaineen vaihtaa vapaasti. Koinkubaation kahden tyyppisiä soluja käytettiin suoraan yhteisviljelmä malli. Yhden kulttuuri GC solujen määriteltiin mono-kulttuuri. GC-solut säädettiin 5 x 10

5 solua /ml, ympättiin pohjaan kammioissa 6-kuoppaisille levyille ja niitä inkuboitiin 8 h, jotta kiinnitys. Insertit sisälsivät 5 x 10

5 solua /ml viljellään PBMC siirrettiin sitten huipulle kammioihin ja viljellään vielä 24 h FBS-vapaa ehdollinen keski tai täydelliseen alustaan. Negatiivisina kontrolleina, insertit PBMC: t asetetaan kuoppiin samalla elatusaineeseen ilman syöpäsolujen, ja kaivot, joissa GC-solut jäivät ilman teriä. Solumäärät on yksipuolinen ryhmässä oli kaksinkertainen, että yhteisviljelmä ryhmässä, jotta varmistetaan samanlaiset solujen määrä kaikissa ryhmissä. Supernatantit ja solut kerättiin erikseen 24 tunnin jälkeen jatkokäyttöä varten.

proliferaatiomääritystä

Cell-IQ soluviljelyprosessin platform (Chip-Man Technologies, Tampere, Suomi), joka on varustettu vaihe -contrast mikroskoopilla (Nikon CFI Achromat vaihekontrasti tavoitteen kanssa × 10 suurennus, Nikon, Japani) ja kamera, käytettiin havaitsemaan tuumorisolujen kasvua, kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, GC-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä (1 x 10

4 solua /kuoppa) 24 tuntia ja sitten käsiteltiin TGF-β1 (Peprotech, USA) 25 ng /ml. Kontrolliryhmät jätetään hoitamatta. Soluja inkuboitiin sitten vielä 72 h, Cell-IQ-järjestelmä. Kuvat otettiin 30 minuutin välein 72 tuntia, ohjaa Image ohjelmisto (Chip-Man Technologies), ja analysoitiin käyttämällä vapaasti jaettu kuva ohjelmisto (McMaster Biophotonics Facility, Hamilton, ON), käyttäen manuaalista seuranta plug-in luoma Fabrice Cordelières (Institut Curie, Orsay, Ranska). The Cell-IQ automaattisesti erottelee jako- ja vakaa solun vaihetta, ja laskee koko solujen määrä aikana lisääntymistä. Kahdeksan kuvat analysoitiin kussakin ryhmässä.

liikkuvuus lymfosyyttien vaikeuttaa seurata ja laskea solujen määrä tarkasti käyttämällä Cell-IQ-järjestelmän. Siksi käytetty Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys (Dojindo, Kumamoto, Japani) arvioimaan kannattavuutta PBMC mukaan toimittajan ohjeiden. Lyhyesti, viljeltiin PBMC: t ympättiin 5 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille. Viljelmät käsiteltiin TGF-β1 tai jätetään hoitamatta verrokkeina. 72 tunnin jälkeen, CCK-8 reagenssit lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 4 tuntia. Solujen määrä määritettiin sitten viisi syvennystä per koeryhmä, joka perustuu absorbanssin 450 nm: ssä vähentää CCK-8 reagenssia käyttäen automicroplate lukijaa (Flexstation 3, Molecular Devices, USA). Solujen elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina elävien solujen suhteen laskee käsittelemättömien solujen. Kukin koe suoritettiin kahdesti. Data otettiin keskiarvo ja yksi edustava koe on esitetty.

entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

TGF-β1: n ja TGF-β2 tasot monokulttuurin ja yhteisviljelmä järjestelmät määritettiin sandwich-ELISA: lla käyttäen Quantikine ihmisen TGF-β1 immunomääritys ja TGF-β2 immunomääritykset (R

P

0,05). Sub-analyysi osoitti, että TGF-β1 mRNA-tasot olivat merkitsevästi korkeammat AGC verrattuna PC ja verrokkiryhmien (

P

0,05), kun taas TGF-β2 kohoamiseen vuonna EGC ja AGC, verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,01) (kuvio 2B). Lisäksi TGF-β1 mRNA-tasot olivat korkeampia kasvain kuin peritumor (

P

0,001) (kuvio 2C); kuitenkin, TGF-β2 tasoilla osoitti vastakkaista suuntausta (

P

0,05) (kuvio 2D). Lisäksi korrelaatio analyysi havaittiin positiivinen korrelaatioita mRNA tasojen TGF-β1 ja Smad2 (

r =

0,346,

P =

0,025) ja Smad7 (

r =

0,461,

P =

0,002) (kuvio 2E ja 2F). TGF-β2, ei kuitenkaan voitu osoittaa yhdessä Smad2 tai Smad7, eikä TGF-β1 eikä TGF-β2 korreloi Smad3 tai Smad4. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-β1 ja TGF-β2 voisi olla erilaisia ​​rooleja syövän etenemiseen.

(A) TGF-β1 mRNA-tasot järjestyksessä alkaen säätimet (

n

= 20), precancer (PC) (

n

= 21), varhainen mahasyöpä (EGC) (

n

= 22), jotta edennyt mahasyöpä (AGC) (

n

= 30). Tiedot annetaan keskiarvoina ± SD transkriptipitoisuuksissa normalisoitiin GAPDH. (B) Vastaava TGF-β2 mRNA-tasoja samassa järjestyksessä. (C) ja (D) TGF-β1-tasot voimistunut ja TGF-β2 tasot vaimentua kasvainkudoksissa, verrattuna peritumoraalista kudoksia samoista potilaista. Tasot normalisoitiin GAPDH. Tiedot qRT-PCR 20 pariksi tapauksissa esitetään. (E) ja (F) Merkittävä positiivinen korrelaatioita TGF-β1 ja Smad2 /Smad7 käyttäen kahden muuttujan korrelaatio malli. Tiedot edustavat transkriptipitoisuuksissa 36 tapausta GC normalisoinnin jälkeen GAPDH. (G) Seerumin TGF-β1 ja TGF-β2 mitattiin ELISA olivat huomattavasti korkeammat alussa ja kehittynyt GC verrattuna kontrolleihin (

F =

4,745 ja

P =

0,018;

F =

4.939 ja

P =

0,015, tässä järjestyksessä). Ei ollut merkitsevää eroa varhaisen ja kehittynyt GC.

Ctrl

: valvoo vapaaehtoisia;

EGC

: aikaisin mahalaukun syöpä;

AGC

: edennyt mahasyöpä.

TGF-β seerumissa

edelleen tutkia esiintyminen TGF-β yleisessä ympäristössä, vertasimme pitoisuudet seerumissa TGF-β potilailla, joilla EGC tai AGC niille kontrolleissa. Pitoisuudet seerumissa TGF-β1 verrokeilla ja potilailla, joilla on EGC ja AGC oli 27,78 ± 6,11, 50,08 ± 4,38, ja 45,76 ± 5,00 ng /ml, vastaavasti, kun taas vastaavat arvot TGF-β2 oli 59,41 ± 15,42, 133,61 ± 21,90 ja 111,34 ± 15,76 ng /ml, vastaavasti. Tasot sekä TGF-β1 ja TGF-β2 olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla EGC tai AGC verrattuna kontrolleissa (

F =

4,745 ja

P =

0,018;

F =

4.939 ja

P =

0,015). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä eroja potilailla, joilla on varhainen ja myöhäinen vaihe GC (kuvio 2G). Nämä tulokset viittaavat siihen, että epänormaali tila TGF-β in mahasyövän voivat olla systeemisen vasteen, joihin osallistuvat paitsi kasvain microenvironment, mutta myös yleistä vikaa.

yhteisviljelmä In vitro

yhteisviljelmä kautta luotiin sen määrittämiseksi, onko suora solusta soluun kontakti tai epäsuoraa sytokiini riippuva kontakti on tärkein mekanismi on matkimalla kasvain mikroympäristön. Ensinnäkin, ei ollut merkittäviä eroja tuloksiin TGF-β1 ja TGF-β2 mRNA tasot GC soluissa suorassa yhteisviljelmä mallilla käyttäen PBMC eristettiin GC potilaista tai valvonta (kuvio 3A), ja nämä tiedot on siis yhdistää analyysia. Lisäksi pitoisuudet TGF-β1 solussa supernatantissa Keraviljelmiä merkittävästi lisääntynyt verrattuna kuin PBMC tai GC viljelty yksin FBS-vapaa ympäristö (

P

0,05) ja sen tasoilla suorassa yhteisviljelmä ryhmä olivat merkittävästi korkeammat kuin epäsuoriin ryhmässä (

P =

0,029); kuitenkin, että vaikka TGF-β2 tasot lisääntyivät myös suoraan keraviljelmiin, erot sen jälkeen, kun keraviljelmiä eivät olleet merkittäviä (kuvio 3B).

(A) TGF-β1: n ja TGF-β2 mRNA-tasot GC-soluissa sen jälkeen, kun suora keraviljelmiin nostettiin verrattuna monokulttuuria, mutta ei ollut merkittäviä eroja TGF-β1 ja TGF-β2 mRNA tasot GC soluissa riippumatta alkuperästä PBMC (GC potilaiden tai valvonta). (B) TGF-β1concentrations solussa supernatantissa Keraviljelmiä merkittävästi lisääntynyt verrattuna kuin PBMC tai GC viljelty yksin FBS-vapaa ympäristö (

P

0,05). Sen tasot suorassa yhteisviljelmä ryhmä olivat merkittävästi korkeammat kuin epäsuoriin ryhmässä (

P =

0,029). TGF-β2 tasot lisääntyivät myös suoraan keraviljelmiin, mutta erot jälkeen keraviljelmät eivät olleet merkittäviä. (C) Sytokiinituotanto tasot olivat lisääntyneet huomattavasti välillisten yhteisviljelmä ryhmissä lisäämisen jälkeen FBS (

P

0,05), mutta mitään selvää muutosta ei havaittu suoraa yhteisviljelmä niistä. Koe suoritettiin kahdesti. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen. (D) alkuperä sytokiineja. GC soluissa, TGF-β1 mRNA kohoamiseen noin 3-kertaisesti suoran yhteisviljelmä ja nousi 2-kertaiseksi sen välillisen verrattuna monokulttuurien; TGF-β2 mRNA tasot olivat huomattavasti jälkeen suoraan yhteisviljelmä mutta ei tilastollisesti muuttunut jälkeen epäsuora. Vuonna PBMC, TGF-β1 mRNA-tasot laskivat merkittävästi ja TGF-β2 tasot olivat huomattavasti lisääntynyt jälkeen keraviljelmät. Tasot normalisoitiin GAPDH, ja tasot yksipuolinen ryhmään määriteltiin 1.0. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD. (E) mRNA tasot Smad2 ja Smad3 GC solut huomattavasti jälkeen keraviljelmistä (

P

0,05), joka oli suurempi suoran yhteisviljelmä kuin sen välillisen, mutta ei ollut tilastollinen ero tasojen Smad4. (F) Cell-IQ osoitti, että eksogeenisen TGF-β1 (25 ng /ml) GC soluihin esti kasvua ja jakautumista kasvainsolujen, mutta joilla ei ole merkittävää eroa. Kahdeksan kuvia eri näkökenttään analysoitiin kussakin ryhmässä. (G) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys osoitti, että TGF-β1 (25 ng /ml) esti elinkelpoisuuden PBMC merkittävästi 72 tuntia. Rivi osoittaa inhibition suhteen TGF-β1 stimuloiduissa soluissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.

GC:

mahasyöpä;

PMBC:

ääreisverenkierron mononukleaarisia soluja;

Dir-co:

suora yhteisviljelmä;

Ind-co:

epäsuora yhteisviljelmä;

Mono:

monokulttuuriin;

FBS:

naudan sikiön seerumia.

ns,

ole merkittävä; *,

P

0,05; **,

P

0,05.

jälkeen tutkittiin vaikutusta seerumin vuorovaikutukseen kasvainsolujen ja PBMC. Yllättäen TGF-β1 ja TGF-β2 pitoisuudet epäsuoraan ryhmässä, verrattuna että FBS-vapaa ehto, olivat käänteisesti korkeammat kuin suora ryhmä lisäämisen jälkeen FBS. Lisäksi pitoisuudet TGF-β1 ja TGF-β2 in solusuperenatanttiin lisääntyivät merkitsevästi epäsuoriin ryhmissä (

P

0,05), mutta ne olivat vain hieman lisääntynyt suora ryhmissä (

P

0,05), lisäämällä FBS (kuvio 3C). Tämä viittaa siihen, että rikastettu ympäristössä voi helpottaa sytokiinien tuotannon epäsuoraa ole suorassa yhteydessä.

Lisäksi, määrittää alkuperä sytokiinien, TGF-β1 ja TGF-β2 mRNA tasot mitattiin GC-soluissa ja PBMC vastaavasti . Verrattuna monokulttuuria, TGF-β1 mRNA kohoamiseen noin 3-kertaisesti suoran ryhmässä ja 2-kertainen epäsuoraan ryhmän GC soluissa jälkeen yhteisviljelmä kanssa PBMC; TGF-β2 mRNA lisättiin merkittävästi GC soluissa jälkeen suoraan yhteisviljelmä mutta ei tilastollisesti muuttunut välilliset yhteisviljelmä. Samaan aikaan TGF-β1 mRNA-tasot laskivat merkittävästi ja TGF-β2 mRNA kohoamiseen yli 5-kertaiseksi PBMC jälkeen keraviljelmistä (

P

0,05) (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittavat, että kohonnut TGF-β1 tasot solusuperenatanttiin saattaisi olla peräisin miltä GC soluista, kun taas TGF-β2 saattavat olla peräisin PBMC. Lisäksi olemme havainneet, että mRNA tasot Smad2 ja Smad3 GC solut lisääntyi huomattavasti jälkeen keraviljelmistä, jotka olivat suurempia suoran yhteisviljelmä kuin sen välillisen, mutta ei ollut tilastollinen eroa tasojen Smad4 (kuva 3E). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että sytokiinien tuotanto riippuu pääasiallisesti suoraa vuorovaikutusta syöpäsoluja ja PBMC: t, ja TGF-β /Smad2 /3 signalointia voitaisiin edistää tämän prosessin aikana.

Lopuksi, edelleen tutkia TGF-β1 rooleja GC-soluissa ja PBMC: t, solun kasvun kyky kahden tyyppisiä soluja havaittiin lisäämällä eksogeenista TGF-β1 ja monokulttuureja PBMC tai GC-soluja. Cell-IQ osoitti, että keskimääräinen laskee sekä kokonais- ja jakamalla solut vähentynyt; Käyttövalmis TGF-β1 inhiboi kasvua GC-soluilla 72 tuntia, mutta ero ei ollut merkittävä (kuvio 3F), kun taas eksogeeninen TGF-β1 vaikutti merkittävästi elinkelpoisuuden PBMC (kuvio 3G). Tämä havainto viittaa siihen, että kohonnut TGF-β1 pääasiassa esti funktio mononukleaarisia soluja, mutta ei syöpäsoluja.

Yhdessä nämä havainnot osiossa osoitti, että vuorovaikutus kasvainsolujen ja PBMC: t tapahtuu pääasiassa suora solu to-solukontaktissa, mutta joidenkin osuutta sytokiinien riippuvaa yhteyttä. Lisäksi rikastettua olosuhteet edistävät sytokiinien, kuten TGF-β1: n ja TGF-β2. TGF-β1 toiminut pääasiallisesti estämällä toimintaa PBMC mutta ei GC soluja.

Keskustelu

poikkeavuudet kasvutekijän ja sytokiinien eritystä, erityisesti TGF-β, avainasemassa syövän kehittymisessä [ ,,,0],3], [32]. Kuitenkin parhaan tietomme, proteiini ja mRNA tilat TGF-β1 ja TGF-β2 in precancer ei ole hyvin tutkittu, ja sytokiinien välisen vuorovaikutuksen aikana kasvainsolujen ja PBMC jää epäselväksi. Nykyinen tutkimus määritteli siten profiilit TGF-β1 ja TGF-β2 mahalaukun precancer ja syöpä, sekä tutkitaan luonne vuorovaikutuksen (suora tai epäsuora) välillä syöpäsoluja ja PBMC ja sen vaikutus sytokiinien tuotantoa.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että lisääntynyt ekspressiotasot TGF-β1 ja TGF-β2 proteiinit yhteydessä heikompaan ennusteeseen [5], [11], ja TGF-β1 mRNA ja proteiini kohoamiseen vuonna dysplastic ja GC kudoksissa verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksiin [33], [34]; Sitä vastoin TGF-β2 mRNA tasot GC kudoksissa olivat verrattavissa valvontaa [33]. Tulokset nykyisen tutkimus vahvisti ja laajensi aikaisempien havaintojen; TGF-β1 mRNA-tasot olivat merkitsevästi korkeammat AGC, kun taas TGF-β2 tasot olivat korkeampia dysplasia ja EGC. Lisäksi TGF-β1 mRNA-tasot olivat korkeampia kasvain kuin peritumor, kun taas TGF-β2 osoittivat päinvastainen suuntaus. TGF-β1 proteiinin tasot osoittivat IHC olivat yhdenmukaisia ​​näiden tulosten. Nämä havainnot viittaavat siihen, että neoplastisen transformaation saattaa olla varhainen tapahtuma, johon lisääntyminen TGF-β1 yhdessä menetys TGF-β2.

Vaikka edellinen tutkimus osoitti, että 80% suoliston-tyyppinen GC yksilöitä ilmaisi TGF -β1 verrattuna vain 43% diffuusi-type [10], löysimme eroa TGF-β1 suhteessa

Hp

infektio, Lauren luokitus, tai imusolmuke osallistumista. Aktivoitu TGF- β1 oli runsas limakalvon

Hp

infektoiduista potilaista, mutta ei ollut merkittävää eroa verrattuna

Hp

-negatiivisilla potilailla [35]. Lisäksi tuloksemme osoittivat myös, että jotkut stromasoluja värjättiin positiivisia TGF-β1. Vastaavasti, mononukleaarisia soluja lamina propria raportoitu olevan merkittävä lähde TGF-β1 [36]. Comerci

et al

[37] osoitti, että TGF-β1 erittyy tai tuottaa tukemalla peruskudoselementeistä voivat epäsuorasti edistää syövän etenemiseen. Ottaviano

et al

[38] osoitti, että ylikuuluminen välillä syöpäsoluja ja peruskudoselementeistä välittyy TGF-β1 vaikutteita solujen pinta- ja perisellulaarinen matriisi hajottavaa potentiaalia

in vitro

. Yhteenvetona toteamme, että eritystä TGF-β kasvainsolujen ja strooman solut saattavat tärkeitä rooleja esiintyviä ja ylläpitää kasvaimen mikroympäristön.

Tulokset paljastivat, että TGF-β myös lausutaan reuna järjestelmässä, koska seerumin TGF-β1 ja TGF-β2 GC potilaat olivat korkeampia kuin kontrolleissa. Kuitenkin suhde seerumissa TGF-β1 ja kliinis merkkiä on kiistanalainen. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että pitoisuudet seerumissa TGF-β1 GC potilaat olivat huomattavasti korkeammat kuin verrokeilla, ja positiivisesti korreloi kasvaimen massan, invaasio, etäpesäke, ja kliinisessä vaiheessa [39], [40].