Krooninen sairaus

tiivistelmä

Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on sytoplasminen tyrosiinikinaasi, joka on kohonnut monissa eri ihmisen syövissä. Vaikka FAK on osallisena monissa solun prosesseja, jotka levoton syövässä, mukaan lukien proliferaatiota, aktiini ja tarttuvuus dynamiikka, polarisaatio ja invaasio, on vain jonkin verran tietoa roolista FAK säteilyn selviytymistä. Olemme arvioineet, onko FAK on yleinen radio-herkistävä kohde, kuten on ehdotettu aiemmissa raporteissa. Käytimme puhdas geneettinen järjestelmä, jossa FAK poistettiin hiiren okasolusyöpä (SCC) soluja (FAK – /-), ja käyttövalmiiksi eksogeenisen FAK villityypin (wt). Yllättäen puuttuminen FAK liittyi lisääntynyt radio-resistenssin kehittynyt SCC soluissa. FAK uudelleen ilmentyminen esti p53-välitteisen transkription säätely ylöspäin p21, ja sub-sarja muut p53 kohdegeenien osallistuvat DNA: n korjaukseen, käsittelyn jälkeen ionisoivaa säteilyä. Lisäksi p21 ehtyminen edistää radio-herkistymistä, mikä tarkoittaa, että FAK estoa p21 induktio vastaa suhteellisen radio-herkkyyden FAK-taitavia SCC soluissa. Työmme lisää yhä enemmän todisteita, että on läheinen toiminnallinen suhde integriini /FAK signalointi ja p53 /p21-reitin, mutta osoittaa, että FAK rooli selviytymisen jälkeen stressi on kontekstisidonnaisia ​​ainakin syöpäsoluja. Ehdotamme, että pitäisi olla varovaisuutta harkitessaan estävä FAK yhdistettynä säteily, koska tämä ei ehkä aina ole kliinisesti edullista.

Citation: Graham K, Moran-Jones K, Sansom OJ, Brunton VG, Frame MC ( 2011) FAK poistaminen Edistää p53-välitteistä induktio p21, DNA-vauriot vasteet ja Radio-Resistance in Advanced Squamous syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10,1371 /journal.pone.0027806

Editor: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2011; Hyväksytty: 25 lokakuu 2011; Julkaistu: 14 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Graham et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Cancer Research UK Program Grant (C157 /A9148). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sädehoito on tukipilari syöpähoidon useita tauti yhteyksissä, mutta hoito ei ole aina parantava. Paljon työtä on suunnattu paitsi tuottamisen parantamisessa sädehoidon mukaan yhä kehittyneempiä paikkatietojen ja dosimetriset menetelmiä, ja myös tunnistaa yhdistelmästrategioista parantamiseksi säteilylle vastauksia. Koskien viimeksi mainittua, ionisoiva säteily voi edistää aktivaation reseptori ja ei-reseptori-tyrosiinikinaaseilla (TK), ja modulaatio cytoprotective vaikutteita, kuten lisääntynyt DNA: n korjaukseen, proliferaatiota ja vähentää apoptoosia [1], [2], [3] , [4], [5], [6], [7]. Koska nämä vastaukset edistävät solukkoradiojärjestelmässä-vastus, joka voi tietenkin myös rajoittaa sädehoidon syövän hoidossa, ymmärtäminen osuus TKs voi tarjota uusia molekyylitason tavoitteet radio-herkistymistä, ja mahdollisesti parantaa tuumorivasteita. Yksi esimerkki on epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), joka on nykyinen laajimmin tutkituista TK tässä yhteydessä. Vahva prekliinisissä todisteita merkitsee kapasiteetti EGFR esto parantaa kasvaimen vastaisen ionisoivan säteilyn vaikutuksilta, ja tämä on käännetty hoitopaikassa tulosten perusteella vaiheen III tutkimuksessa pään ja kaulan alueen syöpä [8], [9]. Tämä osoittaa, miten tärkeää on vankka interventiostrategioita selvittämään erityisesti TKs edistää solukkoradiojärjestelmässä-herkkyys, tai radio-vastus.

Toisin syntymässä todisteita EGFR, myös muiden TK, erityisesti ei- reseptori-TK, ei ole yhtä selkeä. Focal Adhesion Kinase (FAK) sijaitsee sivustoja integriinin tarttuvuus, josta se transdusoi signaaleja soluihin, jotka hallita useita syöpään liittyvän ominaisuuksia, kuten tarttuvuus ja aktiini dynamiikka, muuttoliike, invaasio, angiogeneesi, suojaa soluja lykkäyksen solukuolema ( joskus kutsutaan anoikis) ja lisääntymistä 3-mitat [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK on usein yli-ilmentynyt ihmisen syövässä [18], [19], [20], [21], ja on merkitystä kasvainten synnyssä, kuten on osoitettu useissa kudostyypeissä

in vivo

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Olemme aiemmin osoittaneet, että FAK poisto estää hiiren ihosyöpä kehitystä ja pahanlaatuiset etenemistä, ja että FAK poisto edistää apoptoottista kuolemaa normaalin ihon keratinosyyttien viljelyssä [25]. Viime aikoina olemme myös hyödyntäneet K14-Cre-ER

T2 /f

lox

-FAK hiirijärjestelmää johtamiseksi levyepiteelin syöpäsolujen (SCC) kemiallisesti aiheuttama kasvainten [29], [ ,,,0],30]. FAK poisto aiheuttaa useita vikoja, kuten heikentynyt polarisaatio ja vastauksia sävyjä, kuten kemotaktinen invaasio, sekä heikentynyt kasvu 3-mitat (vaikka kasvu on 2-D muovi ei vaikuta) ja viivästynyt kasvua ksenografteissa

in vivo

[29], [30].

FAK välittämää pro-PELASTAUTUMINEN ajatellaan olevan tärkeä rooli syöpäsolujen selviytymisen, ja että tämä todennäköisesti liittyy p53-reitin [31]. Lisäksi FAK promoottori sisältää p53 reagoiva elementit ja voi olla alas-säätelee DNA-vaurioita p53-riippuvainen tavalla, kun taas FAK ilmaisu korreloi mutantti p53 rintasyövän [32], [33], [34]. Myös

in vitro

ja

in vivo

todisteet, jotka osoittavat, että FAK knock-down voi herkistää soluja solunsalpaajille [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. Sen sijaan on suhteellisen vähän tutkimuksia roolista FAK säteilyn herkkyys. FAK fosforylaatio indusoidaan altistus ionisoivalle säteilylle

in vitro

[42], vaikka tämä saattaa vain olla ohimenevää stressiä vastauksen FAK roolia ei ollut tutkia. On kuitenkin olemassa yksi raportti, että siRNA-välitteinen FAK knock-down edistävää radio-herkistymistä haiman syöpäsoluissa [43], vaikka taustalla oleva mekanismi on epäselvä. Lisäksi yli-ilmentyminen FAK in HL-60-solujen antaa merkittävä kestävyys erilaisia ​​apoptoottisten ärsykkeille, mukaan lukien ionisoiva säteily [44], kaikki viittaa siihen, että inhibitio signalointi FAK on omiaan edistämään radio-herkkyys. Tässä on käytetty puhtaan geneettinen poisto /saattamisen järjestelmä testata FAK: n roolia solujen säteilyn vastauksena

in vitro

ja

in vivo

, erityisesti FAK-puutosta SCC soluja (ja niiden FAK ilmentäviä kollegansa), ja alkaa leikellä pois oleva mekanismi.

tulokset

johdettujen SCC soluja kemikaalien aiheuttamien levyepiteelisyöpä syöpiä hiirillä, jotka ilmaisivat

Floxed

muodossa ATP-sitoutumisen koodaavan eksonin

fak

valvonnassa ihospesifisiä (K14)

Cre

rekombinaasin fuusioitu estrogeeni-reseptorin [25]. Poistoleikkauksen

floxed

–

fak

kun yksi käsittely 4-hydroksi-tamoksifeeni (4-OHT) johti täydelliseen FAK proteiinin puutos [29], [30] (kts. 1C ja 2B), jota voisimme kääntää uudelleen ilmaisemalla paino- FAK, jotta voimme tutkia miten syöpäsolut selviytyä vakava häiriön integriinin /FAK signalointireitin. Sen arvioimiseksi, radio-herkkyyden rajoittavan laimennuksen klonogeenisten määritys suoritettiin vertaamalla FAK – /-, jossa FAK paino- solujen lisäämiseen säteilyannoksia korkeintaan 10 Gy. Tämä osoitti, että täydellinen puuttuminen FAK näissä soluissa liittyi lisääntynyt radio-vastus

in vitro

(Fig. 1A). Tilastollisesti merkittävä ero eloonjääntifraktio nähtiin annoksilla 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ja 10 Gy (p arvoja 0,0136, 0,0097, 0,0045, ja 0,0036 vastaavasti, analysoitiin opiskelijan pariton t-testi, n = 9).

(A) aliyhtyvät populaatiot FAK – /- ja FAK paino- solut trypsinoitiin ja laimennettiin kasvualustaan ​​lopulliseen konsentraatioon, joka sallisi yhden pesäkkeen kasvua. 100 ui tätä suspensiota lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaiselle levylle. Inkuboinnin jälkeen 6 tunnin ajan, jotta solujen kiinnittymistä levyt säteilytettiin 0, 2, 4, 6, 8 tai 10 Gy. Solut analysoitiin kolmena rinnakkaisena kullekin säteilyannoksen. 7 päivän jälkeen pesäkkeiden määrä maljaa kohti laskettiin ja eloonjääntifraktio lasketaan. Graafinen esitys on esitetty edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Elossa jakeet kullakin säteilyannoksen verrattiin YK-säteilytettyjen solujen opiskelijan pariton t-testi, n = 9 (B) 2 x 10

5 FAK – /- ja FAK paino- solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen naisten nude-hiirissä. Ksenograftit annettiin saavuttaa noin 150 mm

3. Sitten eläimet säteilytettiin 5 Gy koko kehon sädehoidon tai mock säteilytettyä. 7 päivän jälkeen ksenograftit mitattiin ja hiiret tapettiin. Keskimääräinen -ksenografti volyymit ± SEM ennen säteilyä (ylempi paneeli) ja jälkeen säteilyä (alempi paneelit) näkyvät. Tilastollinen analyysi mock säteilytetty vs. säteilytetty volyymit 7 päivää arvioitiin opiskelijan pariton t-testi, * merkitsee p 0,05, n = 10 (C) Protein uutteet valmistettiin ksenografteista, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle , ja blotattiin anti-FAK (ylempi) ja anti-β-aktiini (alempi) vasta-aineita. Näyte viidestä erillisestä otteita kustakin ryhmästä näkyy. Positiivinen kontrolli (FAK paino- solu-uute) lisättiin lopulliseen kaistalle FAK – /- vierassiirrettä näytteitä.

(A) FAK – /- ja FAK paino- soluja säteilytettiin 5 Gy on 70% konfluenssiin ja lysaatit valmisteltiin ilmoitettuina ajankohtina. Immunoblottaus suoritettiin sitten anti-p21 (ylempi paneeli), ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). (B) Proteiini-uutteet valmistettiin subkonfluenteista FAK – /- ja FAK paino- solupopulaatioiden, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle ja niitä blotattiin anti-FAK (ylempi paneeli), anti-p21 (keskimmäinen paneeli) ja anti- β-aktiini (alempi paneeli) vasta-aineita. (C) RNA uutettiin subkonfluenteista FAK – /- ja FAK paino- soluja, PCR suoritettiin ja tuote analysoitiin. p-aktiini lastaus on myös esitetty (alempi kuva). (D) proteiini uutteet valmistettiin FAK – /- ja FAK paino- solupopulaatioiden tasolla konfluenssiin ilmoitettu. Immunoblottaus suoritettiin sitten anti-p21 (ylempi paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli) vasta-aineet.

Testasimme myös, onko FAK vaikuttanut radio-herkkyys

in vivo

vertaamalla FAK – /- ja FAK paino- SCC ksenograftit. 2 x 10

5 solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen naisten nude-hiirten ja eläimet olivat joko säteilytetään 5 Gy (muodossa koko kehon säteilytys) tai vedos säteilytettyä kun ksenografteista oli noin 150 mm

3. Tämä koko valittiin FAK – /- kasvaimissa oli voittanut ensimmäisen viive niiden kasvu

in vivo

, ja niiden leviäminen nopeus tässä vaiheessa ei merkittävästi poikkea FAK paino kollegansa. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CD1 kannan nude-hiirten voisi sietää 5 Gy koko kehon annos 10-14 päivää. Kun 7 päivää, ksenograftit mitattiin ja eläimet uhrattiin. Kasvainten tilavuudet laskettiin ennen ja jälkeen 5 Gy Säteilytyksen tai mock säteilytys, ja analysoitiin opiskelijan pariton t-testi. Tilastollisesti merkittävä väheneminen kasvaimen havaittiin säteilytetyn FAK paino- ksenografteissa verrattuna mock-säteilytettyä (p = 0,0030, n = 10), mutta tämä ei ole toistettu FAK – /- ksenografteja (p = 0,3300, n = 10) (Fig. 1 B). Proteiini uutteet valmistettiin 5 hiirtä kussakin ryhmässä ja alistettiin Western blotting vahvistaa tasolle FAK ilmentymistä FAK – /- ja FAK paino- kasvaimet (Fig. 1 C). Alhainen FAK läsnä FAK – /- kasvainperäinen materiaali on todennäköisesti pienestä määrästä strooman tai immuunijärjestelmän infiltraatiota (kuvio. 1 C).

SCC solut käytimme täällä ilmaistu villityypin p53 (vahvistettu sekvensointi (ei esitetty)), ja olemme tunnistaneet FAK-riippuvainen ero induktion p53 kohdegeenin, p21, säteilytyksen jälkeen (Fig. 2; katso myös jäljempänä). Erityisesti induktio p21 ilmeni 2 tunnin kuluttua hoitoon FAK – /- solut 5 Gy säteilytys; sitä vastoin p21 ei ollut aiheuttama kun FAK oli läsnä (Fig. 2A). Mielenkiintoista, pohjapinta tasoja p21-proteiinin ja mRNA konfluentti populaatiot sekä FAK – /- ja FAK paino- solut olivat samanlaisia ​​(kuva. 2B ja 2C, vastaavasti), kun taas p21 tasot olivat koholla molemmissa solulinjoissa yhä konfluenssiin (kuvio . 2D). Tämä oli sopusoinnussa yleisesti hyväksytty merkitys p21 kosketuksissa aiheuttaman solusyklin pysähtymisen (Fig. 2D), ja osoitti, että eri ärsyke pystyi lisäämään p21 tasolle riippumatta FAK asemasta. Varmistaakseen eroja induktio p21 altistus ionisoivalle säteilylle ei liittynyt eroista solutiheyden, huolellisuutta kaikissa kokeissa, jotta solut säteilytettiin vertailukelpoisilla konfluenssiin, tyypillisesti 70%.

FAK -dependence p21 asetuksen toistettiin

in vivo

. Erityisesti nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 2,5 x 10

5 FAK – /- tai FAK p- solujen -ksenografteja saa laatia, ja eläimet sitten säteilytettiin 5 Gy säteilytys kun kasvaimet saavuttivat noin 500 mm

3 volyymin. Hiiret lopetettiin 0, 2 tuntia, 6 tuntia ja 24 tuntia säteilytyksen jälkeen (n = 3 per ryhmä) ja p21 tasot arvioitiin sekä western blottauksella kasvaimen lysaatit ja immunohistokemia (IHC) värjäys parafiiniin kudosta. FAK – /- ksenografteissa näytteillä lisääntyminen p21-proteiinin tasot jo 2 tunnin kuluttua säteilytys (Fig. 3A, vasen paneeli); p21 tasoja esiintyi maksimaalinen noin tällä kertaa. Kasvu p21 oli myös nähtävissä IHC (Fig. 3A, oikea paneeli). Mean p21 positiivisuus (perustuen pisteytystä 20 kentät) analysoitiin kaikissa aikapisteissä ja tämä osoitti merkittävää eroa p21 tasot kasvainten säteilytettyjen

versus

YK-säteilytetty eläimiä (Kruskal-Wallis, p = 0,038, n = 3). Lisäksi yksittäiset vertailu erillisen ajankohtina kuvitettu tilastollisesti merkittävän kasvun p21 pisteytys verrattuna lähtötasolle (Mann Whitney, p = 0,0404, n = 3). Sen sijaan FAK paino- ksenografteista ei osoittanut johdonmukaista lisäystä p21 tasolle tahansa ajankohtina tutkittiin. Western blottaus FAK wt ilmentävä kasvain lysaatit varmisti FAK, mutta ei ollut merkittävää kasvua p21-proteiinin tasot (Fig. 3B). Lisäanalyysi IHC (Fig. 3B, oikea paneeli) vahvisti ei ollut merkittävää kasvua p21 ilmentymistä 2 tuntia (p = 0,6625), 6 tuntia (p = 0,6625), tai 24 tuntia (p = 0,3827) (Mann Whitney, n = 3), verrattuna kontrolleihin.

(A) FAK – /- SCC soluja tai (B) FAK paino- SCC soluja, injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen naisten nude-hiirissä. Kun ksenografteissa oli noin 500 mm

3, hiiriä säteilytettiin 5 Gy ja uhrattiin 0, 2 tuntia, 6 tuntia, ja 24 tuntia (n = 3 per ryhmä). Puolet ksenograftin kiinnitettiin formaliiniin sitten upotettiin parafiiniin ja toinen puoli on jäädytettiin nestemäisessä typessä. Proteiini uutteet valmistettiin jääleikkeet, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle ja niitä blotattiin anti-FAK (ylempi blot paneeli), anti-p21 (keskellä blot paneeli), ja anti-β-aktiini (alempi blot paneeli ). Parafiini upotettujen leikkeiden värjättiin p21 ja p21-positiivisten solujen visualisoitu IHC (oikeanpuoleiset ruudut). Edustavia Kirkas kuvia p21 värjättyä kudoksen 0, 2 tuntia, 6 tuntia ja 24 tuntia post säteily on esitetty (asteikko bar, 0,1 mm).

uutetaan RNA konfluentti väestölle FAK – /- ja FAK paino- solut eri aikapisteissä seuraavat 5 Gy säteilytyksen ja qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita endogeenisen p21. Näkyvissä oli kaksivaiheinen nousu p21 mRNA-tasojen, korkeimmillaan 2 tuntia ja 6 tuntia säteilytys FAK – /- solut; sitä vastoin p21 mRNA ei indusoitunut FAK paino solulinjan jälkeen säteilytys (Fig. 4A). RNA uutetaan myös molempien solulinjojen 2 tuntia sen jälkeen, kun eri säteilyannosten (0, 2, 5, 10, 20, ja 30 Gy) ja analysoitiin qRT-PCR: llä. Huomasimme, että p21 mRNA-tasot lisääntyivät FAK – /- SCC solujen annoksesta riippuvalla tavalla (alue 2 Gy 10 Gy); annoksen suurentamista jatketaan ei johtanut edelleen lisääntynyt p21 mRNA. Annoksesta riippuvaa lisääntymistä p21 transkriptio oli heikennetty upon uudelleen ilmentäminen FAK paino on FAK puutosta SCC-soluissa (kuvio. 4B). Samanaikaisesti kokeissa olemme huomanneet, että lisääntynyt vakaan tilan tasoja p21-proteiinin näkyivät säteilytyksen jälkeen eri annoksilla FAK – /- SCC soluja, ja että tämä oli heikennetty kun FAK ilmentyminen oli palautettu (Fig. 4C, vertaa vasen ja oikea paneeli) . Täydentämään geneettinen deleetio FAK, käytettiin myös FAK-inhibiittori (PF-562271; [45]), annoksena 0,5 uM (joka on optimaalinen inhibitio FAK kinaasiaktiivisuuden näissä soluissa (ei esitetty)) ja 2 tuntia ennen säteilytystä, ja kerättiin proteiini lysaateille immunoblottaus 0, 2, 4, ja 6 tunnin kuluttua 5 Gy. p21-tasot näkyvästi kasvoi 2 tuntia sen jälkeen, kun säteily on 0,5 uM PF-562271 käsitellään FAK paino- soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio. 4D).

(A) RNA uutettiin subkonfluenteista FAK – /- ja FAK wt solupopulaatioiden eri ajankohtina kuluttua 5 Gy säteilytys. qRT-PCR-analyysi Sitten tehtiin kolmena kappaleena. Kertainen lisäys p21 mRNA laskettiin DDC (t) menetelmä, jossa β-aktiini latauskontrollina. Graafinen esitys yhdistetyn keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta on osoitettu. (B) RNA uutettiin sub-konfluentteja FAK – /- ja FAK paino- solupopulaatioiden 2 tunnin kuluttua 0, 2, 5, 10, 20, ja 30 Gy säteilytys. cDNA tuotettiin sitten ja qRT-PCR: llä p21 suoritettiin, kuten edellä on esitetty. (C) proteiini uutteet valmistettiin FAK – /- ja FAK paino- solupopulaatioiden 2,5 tuntia altistuksen jälkeen eri annoksia säteilyä. Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle ja niitä blotattiin anti-p21 (ylempi paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). (D) FAK paino- soluja inkuboitiin 2 tuntia joko FAK-estäjä PF-562271 0,5 uM, tai 0,1% DMSO: ta vain, säteilytettiin sitten 5 Gy. Proteiini-uutteet valmistettiin 0, 2, 4, ja 6 tuntia ja immunoblot tutkittiin anti-p21 (ylempi paneeli), ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). Edustaja immunobloteissa 0,1% DMSO: ta (vasemmalla) ja 0,5 uM lääkkeellä käsiteltyjen (oikealla) solupopulaatioiden on esitetty.

Kuten odotettua, p21 vakaan tilan tasot SCC solut olivat ainakin osittain riippuvainen p53, ja säteilyn aiheuttamista p21 SCC soluissa estyi knock-down p53 käyttämällä siRNA (Kuva. 5A-C). Olemme kuitenkin myös, että p53 induktio säteilytyksen jälkeen ei ollut erityisen voimakasta ja oli samanlainen molemmissa FAK – /- ja FAK paino- SCC soluja (Kuva. 5D), mikä osoittaa, että läsnäolo FAK johti joihinkin irrotus p53 ja p21 induktio , ja herkkyys säteilytys näissä syöpäsoluissa. Densitometria suorittaa määrällisesti kertaiseksi muutoksia p21 ja p53-proteiinin tasot jälkeen säteilytys FAK-taitavia ja FAK-puutteellinen SCC soluissa (kuvio S1). Nämä havainnot merkitsevät sitä, että merkittävästi lisääntynyt transkriptio ja ilmentäminen p21-proteiinin esiintyy FAK – /- solut jälkeen kliinisesti merkityksellisiä ionisoivan säteilyn annoksia, ja että tämä vastaus on tasoitettiin läsnäolo FAK. Niinpä FAK toimii näiden kehittyneiden syöpäsolut tukahduttaa p53-riippuvaisen transkription p21 säteilytyksen jälkeen. Tämä ei ole näkyvästi liittyy erilaiseen solusyklin pidätys (kuvio S3 (määritetty kuten on kuvattu menetelmät S1)) tai apoptoosin, jota on vaikea havaita, kun SCC solun säteilytyksen arvioituna puute sub-G1-DNA-sisältö (ei esitetty) . Näin on siitä huolimatta ero säätely ilmentymisen p53 kohdegeenin PUMA (kuvio S4), joka voi liittyä apoptoosin.

(A) FAK – /- solut transfektoitiin 100 nM siRNA (joko salattu allas tai p53 siRNA) 50% konfluenssiin. 24 tunnin kuluttua proteiiniuutokset valmiita ja immunoblot tutkittiin anti-p53 (ylempi paneeli), anti-p21 (keskimmäinen paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). (B) Densitometria verrataan p21 tasot FAK – /- proteiiniuutoksia hoidettiin joko salattu altaan siRNA tai p53 siRNA suoritettiin. P21-proteiini tasot normalisoitiin p-aktiini ja tulokset ovat edustavat yhtä kolmesta erillisestä kokeesta. (C) FAK – /- solujen 50%: n konfluenssiin transfektoitiin joko 100 nM salattu siRNA tai 100 nM p53 siRNA, inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten säteilytettiin 5 Gy. Lysaatit kerättiin tuolloin osoittamassa ja immunoblot tutkittiin anti-p53 (ylempi paneeli), anti-p21 (keskimmäinen paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). (D) proteiini uutteet valmistettiin FAK – /- ja FAK paino- solut 2 tunnin altistuksen jälkeen eri annoksilla säteilyn (0-30 Gy). Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblot tutkittiin anti-p53 (ylempi paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). Oikea kaista kumpaankin geeliä sisältää proteiinia otteita FAK – /- tai FAK p- solujen altistettiin yön yli tapahtuneen käsittelyn 0,1 uM aktinomysiini D.

Aikaisempi tutkimus on vahvistanut selkeä yhteyksiä FAK ja p53, joka edistää selviytymisen jälkeen stressin aiheuttama signalointi (soluissa, joilta puuttuu p21),

kautta of the FAK FERM verkkotunnuksen sitoutuminen p53 tumassa, helpottaa p53 hajoaminen ja selviytymisen [46]. Siksi me immunosaostettiin FAK lysaateista FAK paino- SCC solut ennen ja jälkeen 5 Gy Säteilytyksen ja immunoblotattiin p53 ja Src (positiivisena kontrollina). Kuten odotettua, Src oli pakko FAK, ja tämä oli muuttumaton säteilyttämällä (kuvio S2A (määritetty kuten on kuvattu menetelmät S1)). Olemme kuitenkin havainneet, että FAK eivät vaikuttaneet p53 (Fig. S2A). Lysaatit koestettiin FAK, Src ja p53 tasapuolisen lastaus (Fig. S2B). Olemme myös havainneet, että p53 tehokkaasti kulkeutua tumaan sekä FAK – /- ja FAK paino- solut säteilytyksen jälkeen (ei esitetty).

Koska p21 on liitetty sekä vastustuskyky ja herkkyys DNA: ta vaurioittavat aineet, mukaan lukien ionisoiva säteily, me seuraavaksi köyhdytettyä p21 avulla siRNA. Saavutimme noin 90% knock-down p21 SCC soluissa (Kuva. 6A ja 6B). Kyky muodostaa klooneja arvioitiin sitten 0, 4, ja 8 Gy ja välistä vertailua solupopulaatioiden transfektoitu p21 siRNA, salattu siRNA tai ohjaus solupopulaatioiden joka oli valetransfektoiduilla. Olemme löytäneet merkittävä ero eloonjääntifraktio 8 Gy (p = 0,0129) välillä salattu siRNA- ja p21 siRNA-käsitellyissä soluissa, niin, että p21 edistää radio-resistenssin SCC-soluissa (kuvio. 5C). Näin ollen on olemassa vahva yhteys säteilyn aiheuttamista p21 FAK-vajaiden solujen (mutta ei niiden FAK ilmentäviä kollegansa) ja havainto, että FAK menetys indusoi radio-resistenssi, jossa p21 on kausaalinen rooli SCC soluissa.

(A) FAK – /- SCC-soluja transfektoitiin 100 nM siRNA (joko salattu allas tai p21 siRNA) 50% konfluenssiin. Inkuboinnin jälkeen 24 tunnin ajan, proteiini uutteet immunoblotattiin ja tutkittiin anti-p21 (ylempi paneeli) ja anti-β-aktiini (alempi paneeli). (B) Densitometria verrataan p21 tasot FAK – /- proteiiniuutoksia hoidettiin joko salattu altaan siRNA tai p21 siRNA suoritettiin. P21-proteiini tasot normalisoitiin p-aktiini tason ja tulokset ovat edustavat yhtä kolmesta erillisestä kokeesta. (C) FAK – /- solut valetransfektoidut tai transfektoidaan 100 nM joko salattu siRNA-altaan tai p21 siRNA 50% konfluenssiin. 24 tunnin jälkeen solujen populaatiot trypsinoitiin ja laimennettiin kasvualustaan ​​lopulliseen konsentraatioon, joka sallisi yhden pesäkkeen kasvua. 100 ui tätä suspensiota lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaiselle levylle. Inkuboinnin jälkeen 6 tunnin ajan, jotta solujen kiinnittymistä levyt säteilytettiin 0, 4, tai 8 Gy. Levyjä perustettiin kolmena kappaleena kullekin säteilyannoksen. 7 päivän jälkeen pesäkkeiden määrä maljaa kohti laskettiin ja eloonjääntifraktio lasketaan. Kuvaaja osoittaa, keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Elossa jakeet p21 siRNA käsiteltyjen solujen verrattiin salattu siRNA käsitellyissä soluissa kullakin säteilyannoksen ja tilastollinen merkitsevyys arvioidaan opiskelijan pariton t-testi, * merkitsee p 0,05, n = 9.

Lopuksi olemme arvioineet FAK puutos vaikuttaa yleisempiä piirteitä liittyy DNA-vaurioita. Olemme havainneet, että mRNA-tasot useiden p53 kohdegeenien, jotka ovat mukana korjaus seuraavasti ionisoivaa säteilyä, eli

gadd45

,

p53R2

ja

ddb2

, ja ne ovat tunnettuja olla alas-säädellä c-Myc [47], stimuloitiin in FAK – /- SCC soluja, mutta johdonmukaisesti vähemmän niiden FAK-ilmentävien kollegansa (Fig. 7). Tämä oli erityisen totta

ddb2

klo 2 tunnin kohdalla, sillä

gadd45

myöhempinä ajankohtina, ja

p53R2

kaikkialla 0-24 tuntia säteilytyksen jälkeen ( Fig. 7A, B ja C). Koska olemme osoittaneet, että FAK vaaditaan c-Myc up-regulation alavirtaan

APC

deleetio hiiren suolen [22], se voi olla, että FAK heikentää säteilyn indusoima genomin eheyden ylläpito geenejä SCC-soluissa

kautta

c-Myc-välitteisen tukahduttaminen. Kuitenkin olemme huomanneet, että BRCA1 on esimerkki DNA-vaurioita reagoiva geenin, joka on vain vähän vaikutusta FAK menetys; todellakin, BRCA1 ilmentyminen vaimennetaan FAK puutos myöhempinä aikoina säteilytyksen jälkeen (Kuva. 7D). Näin ollen teemme sen johtopäätöksen, että säteily-indusoitua transkriptiota alaryhmä p53: een reagoiva geenien moduloidaan läsnäolo tai puuttuminen FAK, ja niin ei ole yksinkertaisesti johtuu yleisestä p53 toimintahäiriö.

RNA uutettiin subkonfluenteista FAK – /- ja FAK paino- solupopulaatioiden eri ajankohtina kuluttua 5 Gy säteilytys. qRT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen alukkeita vastaan ​​suunnattuja Ddb2 (A), gadd45 (B), p53R2 (C) ja BRCA1 (D), ja ne ovat kaikki normalisoidaan P-aktiini.

on mainittu, ei ole helposti havaittavaa apoptoosia tai ero solusyklin pysähtymisen, joka voidaan katsoa FAK tilan. Siksi tutkimme seuraavaksi fosforylaatio seriinillä 139 histoni γH2AX jota esiintyy vastauksena ionisoivan säteilyn [48] ja pidetään luotettavana korvike kaksijuosteisen tauon korjaus. Kvantifiointi prosenttiosuus ytimien sisältävien 5 tai ≥5 γH2AX pesäkkeitä osoitti, että sekä FAK – /- ja FAK paino- populaatiot oli ≥5 γH2AX pesäkkeitä lähes kaikissa soluissa 1 tunti säteilytyksen 5 Gy (Fig. 8A). Kuitenkin FAK – /- solut alkoivat poistaa nämä pesäkkeitä 6 tunnin kuluessa ja nämä palasi perustasolle 24 tunnin kuluessa; toisin FAK uudelleen ilmentymisen FAK p- solujen aiheutti hitaammin pesäkkeitä puhdistuma (vertaa 6 ja 24 tunnin ajankohtina, (Fig. 8A). Tämä vastaa tehokkaampaa DNA: n korjaukseen toimintaa FAK – /- solut, ja hitaampi korjaus kun FAK on läsnä. Edustavia kuvia γH2AX immunofluoresenssilla FAK – /- solut (ennen ja 1 tunti sen jälkeen 5 Gy säteilytys) esitetään (Fig. 8B). Olemme myös havainneet, että FAK – /- SCC solut näyttivät on yleensä korkeampi γH2AX pesäkkeitä kontrolloiduissa olosuhteissa (0 tuntia) kuin niiden FAK-ilmentävät vastineet (kuvat ei esitetty), ja suurin osa FAK – /- soluilla useita pesäkkeitä ja noin 10-15%, näytetään ≥5 pesäkkeitä (kuvio. 8A, 0 tuntia). Tämä viittaa siihen, että FAK-vajaiden SCC soluilla voi olla suurempi geneettinen epävakaus kuin FAK paino- kollegansa, ainakin siltä, ​​että FAK – /- SCC-solujen on yleisesti parannettu DNA: n korjaukseen toimintoja, ja tämä korreloi radio-resistenssi . Mielenkiintoista, emme löytäneet mitään eroa FAK riippuva sääntely säteilyn aiheuttamista fosforylaation joko p53 tai Chk2 (Fig. S5).

(A) FAK – /- ja FAK paino- solut alhaisella tiheydellä lasipeitinlevyille, inkuboitiin 24 tuntia ja säteilytetään 5 Gy. Eri ajankohtina, solut kiinnitettiin, permeabilised, värjättiin anti-fosfo-γH2AX (seriini 139) ja visualisoitiin käyttämällä konfokaalimikroskopialla. Määrä pesäkkeiden per ydin ( 5 pesäkkeitä tai ≥5 pesäkkeitä) dokumentoitiin vähintään 100 solua. Esitetyt tulokset edustavat yhtä kahdesta erillisestä kokeesta. (B) Kuvat ovat osoittavat un säteilytetty ja säteilytetty FAK – /- solut 1 tunnin kuluttua 5 Gy esitetään, vihreä – fosfori-γH2AX ja sininen – DAPI (asteikko bar, 20 pm), nuoli oikeassa yläkulmassa ruudussa näkyvät osoitteessa tuma, jossa 5 pesäkkeet ja rikkoutuneiden nuolta alhaalla oikealla laatikko osoittaen ydin kanssa ≥5 pesäkkeitä.

keskustelu

Me täällä osoittavat, jyrkässä ristiriidassa on edellisen raportin, jossa FAK knock-down herkistyneet haimasyöpäsoluissa ionisoivaa säteilyä [43], FAK poisto (ja FAK estäjä) voi estää signalointia säteilyn aiheuttamista, p53-välitteisen induktion p21, ja tämä liittyy radioaktiivisten resistenssin kehittynyt SCC soluissa. Mielestämme on tärkeää kirjata, että FAK rooli soluvasteiden ionisoivaa säteilyä, ja ehkä pro-eloonjäämisen signalointi yleensä, voi olla yhteydessä riippuvaisia, ja että on oltava varovainen, kun otetaan huomioon terapeuttiset yhdistelmät FAK estäjien ja sädehoidon, koska tämä ehkä aina ole kliinisesti hyödyllistä.

tässä kuvattuihin, osoitamme, että poistamalla FAK (tai estämällä sen kinaasiaktiivisuutta) voidaan vapauttaa rajoituksia FAK paikoista signalointia p53 induktioon useiden kohdegeenien eli p21 ja ainakin osa-set p53-geenien mukana DNA: n korjautumista SCC soluissa. Lisäksi FAK – /- SCC-solut näyttävät olevan tehokkaampia korjaus jälkeen säteilyn aiheuttamien DNA-vaurioita. Kuitenkin näissä soluissa emme löytäneet mitään merkittävää vaikutusta FAK deleetion p53-proteiinin vakautta (joko vastauksena säteilytys tai DNA vahingoittamatta huumeet), p53 fosforylaatio tai kykyä p53 tumaan, ja emme löytäneet todisteita a FAK /p53 monimutkaisia, että on raportoitu toimia muissa yhteyksissä. Näin työmme lisää kasvava määrä todisteita siitä, että toiminnallinen cross-talk välillä FAK ja p53 signalointireittejä, mutta osoittaa, että on olemassa muita tapoja, joilla tämä voi tapahtua. Vaikka emme täysin ymmärrä mekanismia, huomasimme, että SCC soluja, joista voisimme poistaa FAK geneettisellä rekombinaatiolla, FAK toiminnot tukahduttaa säteilyn aiheuttamien DNA korjaukseen toimintoja p53 estämällä induktion p21, ja että tämä liittyy