Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

palmitaatti, tyydyttynyt rasvahappo (FA), tiedetään aiheuttavan myrkyllisyyttä ja solukuolemaa erilaisissa soluja. Resveratrolin (RSV) kykenee estämään synnyssä ja /tai hidastaa etenemistä erilaisia ​​sairauksia. Useat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat myös osoittaneet suojaava vaikutus RSV rasvan kertymistä aiheuttama FA. Lisäksi Endoplasmakalvosto (ER) stressi on äskettäin yhdistetty solujen adipogeenisiksi vastauksia. Puuttua hypoteesin, että RSV vaikutus liiallisen rasvan kertymistä edistää kohonnut tyydyttyneitä FA voi osittain välittyvät väheneminen ER stressin, tutkimme RSV toimia kokeellisesti aiheutettua ER stressiä käyttämällä palmitaatti useissa syöpäsolulinjoissa.

Keskeiset havainnot

osoittavat, yllättäen, RSV edistetään monistamiseen palmitaatti myrkyllisyydestä ja solukuoleman ja että tämä mekanismi on todennäköisesti johtuu häiriön palmitaatti kertymistä triglyseridien muodossa ja vähemmän tärkeitä solukalvon liikkuvuus vaihtelua. Lisäksi RSV pienenee radikaali happiradikaalien (ROS) sukupolven palmitaatti-käsitellyissä soluissa vaan johtaa parannettu X-box sitova proteiini-1 (XBP1) liitos ja C /EBP homologista proteiinia (CHOP) lauseke. Nämä molekyylien vaikutukset indusoituvat samanaikaisesti kaspaasi-3 pilkkominen, mikä viittaa siihen, että RSV edistää palmitaatti lipoapoptosis ensisijaisesti ER stressin riippuva mekanismi. Lisäksi lipotoxicity palautuminen aiheuttama eikosapentaeenihappo (EPA) tai maksan X-reseptori (LXR) agonisti vahvistaa olettamusta, että RSV-estoa palmitaatti kanavoida osaksi triglyseridi altaat voisi olla keskeinen tekijä paheneminen palmitaatti aiheuttaman sytotoksisuuden.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että RSV kykenee sen sytotoksisia rooli syöpäsolujen altistuvat kyllästettyyn FA yhteydessä ensisijaisesti triglyseridien kertymistä esto, todennäköisesti johtaa solunsisäisen palmitaatti kertymistä, joka laukaisee lipidivälitteiset solukuolemaa. Lisäksi tämä solukuoleman edistetään ER stressin kautta CHOP välittämä apoptoottinen prosessi ja voi edustaa potentiaalinen syövän vastaista strategiaa.

Citation: Rojas C, Pan-Castillo B, Valls C, Pujadas G, Garcia-Vallvé S, Arola L, et ai. (2014) Resveratrol Parantaa Palmitate aiheuttama ER Stressi ja apoptoosi syöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (12): e113929. doi: 10,1371 /journal.pone.0113929

Editor: Guillermo Velasco, Complutense University, Espanja

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 03 marraskuu 2014; Julkaistu: 01 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Rojas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä Reserach tukivat avustuksia Ministerio de Educación y Ciencia Espanjan Goverment (AGL2008-00387 /ALI ja AGL2011-25831 /ALI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Adiposyytit on ainutlaatuinen kyky varastoida ylimääräisen rasvahappoja (FA) muodossa triglyseridien lipidipisaroita, kun taas ei-rasvakudoksesta, kuten maksa, on rajallinen kapasiteetti rasvan varastointiin. Ylikuormitus FA aiheuttaa lipotoxicity ja solukuoleman kuin rasvasolujen, kuten sydänlihassolujen, β-soluissa ja hepatosyyteissä [1] – [4]. Suuret annokset tyydyttyneiden FA, kuten palmitaatti, voivat aiheuttaa soluvaurioita ja jopa solukuoleman, kun taas kohonneet pitoisuudet oleaatti ja linoleaatin, jotka ovat tyydyttymättömiä FA, ovat paremmin siedettyjä [1], [2]. Vaikka yksityiskohtainen mekanismeista FA aiheuttama lipotoxicity pysyvät epäselvä, on yleisesti hyväksyttyä, että reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja solulimakalvostoon (ER) stressi ovat suuria solunsisäisiä mekanismeista [4] – [8].

ER on merkittävä sivusto solussa proteiinin taitto ja kaupan, ja monet solutoiminnoille riippuvaisia ​​tähän lokeroon. Epäonnistuminen ER n sopeutumiskyky on määritelty ER stressiä, ja solut näyttää lukuisia sopeutumista osoittavat vasteet lievittää tätä tilannetta. Avatulla proteiinivaste (UPR) on ensisijainen adaptative vastaus ER stressiä ja leikkaa monia erilaisia ​​tulehdus- ja stressi signalointireitteihin [9], [10]. Seuranta ER ontelon ja signalointi kautta kanoninen oksat UPR välittyvät seuraavat kolme ER kalvoon liittyvien proteiinien: (a) PERK (PKR kaltainen eukaryoottinen initiaatiofaktoria 2a kinaasi); (B) IRE1 (inositoli vaaditaan entsyymin 1); ja (c) ATF6 (aktivoiva transkriptiotekijä-6). Kun ER stressi ei ole ratkaistu, solu on toiminnallisesti vaarantunut ja saattaa tapahtua apoptoosin. Tällä hetkellä useat reittejä ovat suoraan osallisina ER stressin aiheuttama apoptoosin. Esimerkiksi transkriptiotekijän C /EBP homologista proteiinia (CHOP) indusoidaan ER stressin transkriptionaalisella tasolla, joka herkistää solut apoptoosia down-regulation B-solulymfooman 2 (Bcl-2) ja aktivointi GADD34 ja ERO1α [11], [12]. ER stressi aktivoi myös IRE1 ja PERK, jotka on liitetty aktivoinnin pro-apoptoottisten c-Jun-NH

2-terminaalinen kinaasi (JNK) [13], [14].

Useat raportit ovat tutkineet yhteys resveratrolin (RSV) vaikutukset (suojaavassa tai sytotoksisen tulokset) ja ER stressin tekijät uusina molekyyli tavoitteet toiminnan polyfenolien [15] – [18]. Lisäksi monet

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat myös osoittaneet suojaava vaikutus RSV ja muut polyfenolit maksaan rasvan kertymistä aiheuttama tyydyttyneitä FA tai rasvaisen ruokavalion [19] – [22]. Riippumatta näistä suojaavia vaikutuksia, RSV kykenee estämään kasvaimen aloittamista, edistäminen ja etenemistä erilaisissa soluviljelmissä ja eläinmalleissa mekanismeilla, jotka sisälsivät solusyklin pysähtymiseen, kinaasi polkuja eston ja apoptoosin aktivointi [23] – [26].

Mielenkiintoista, aineenvaihdunnan muutoksia, ominaista lisääntynyt Glykolyysivaiheen ja lipogeneesiin, ovat tunnusmerkki syöpäsoluja [27], [28]. Siksi aktiivisesti lisääntyvien syöpäsolut läsnä paitsi määrällisiä muutoksia

de novo

lipidien biosynteesin mutta myös muutoksia lipidikalvon koostumus, joka vaikuttaa solukalvon liikkuvuus, signaalitransduktion ja geenien ilmentymisen [29], [30]. Monenlaisia ​​syöpien läsnä muutokset lipidi- kalvon koostumusta, jolle on pääasiassa tunnusomaista se, kylläisellä FA ja tyydyttymättömiä FA kertymistä. Tämä kertyminen näyttää olevan vähemmän lisääntyneen sisäänoton tyydyttyneiden FA ja kertatyydyttymättömiä FA kuin ylikorostuneisiin synteesi endogeenisen FA [31], [32].

Lisäksi tyydyttyneistä FA eroavat merkittävästi niiden vaikutus lipotoxicity. Aiemmat tutkimukset ensisijainen soluviljelmiin ja syöpäsolun linjat ovat ehdottaneet, että lipotoxicity kertyminen pitkäketjuisten FA on spesifinen tyydyttynyt FA. Tämä selektiivisyys on katsottu johtuvan spesifisten proapoptoottiset lipidilajien tai signalointimolekyylit vastauksena tyydyttyneitä mutta eivät tyydyttymättömiä FA [33]. Luonne näistä signaaleista voi vaihdella solutyyppejä mutta sisältää ROS sukupolvi,

de novo

keramidiin synteesi, typpioksidi sukupolvi, pienenee fosfatidyyli-3-kinaasi, ja ensisijaisia ​​vaikutuksia mitokondrioiden rakenteeseen ja toimintaan. Pitkä ketju FA voi myös tukahduttaa anti apoptoottiset tekijät, kuten Bcl-2 [33].

Sen hypoteesin testaamiseksi, että RSV vajaatoiminta liiallisen rasvan kertymistä aiheuttama kohonnut tyydyttyneitä FA voi osittain välittyvät väheneminen ER stressiä vastaus, me kokeellisesti aiheutettua ER stressiä käyttämällä palmitaatti useissa syöpäsolulinjoissa tai ilman RSV. Yllättäen, sub-myrkyllisiä RSV tasot (25 uM) ei solujen pelastamiseksi palmitaatti aiheuttama ER-stressi ja lipoapoptosis. Sen sijaan, me saadaan seuraavasti: (a) RSV välitteistä apoptoosia vain läsnä tyydyttyneen FA, ja (b) voimakas edistäminen lipotoxicity samanaikainen kasvu FA määrä. Olemme tunnettu tämä RSV vaikutusta molekyylitasolla ja totesi, että stearoyl-CoA-desaturaasi 1 (Scd1) rooli (tyydyttymättömyyttä rikastus) on todennäköisesti liittyy tähän solujen ”fenotyyppi”, mutta pääasiassa palmitaatti varastoinnin triglyseridien altaat näyttää kriittisesti mukana suurempi herkkyys syöpäsolujen palmitaatti-indusoidun lipotoxicity. Nämä tulokset paljastavat melko tuntematon RSV sytotoksinen mekanismi, jota voitaisiin hyödyntää kohdistaa apoptoosin edistämiseen transformoiduissa soluissa.

Tulokset

RSV aiheuttaa ER stressiä HepG2-soluissa

Kuvassa 1 että HepG2-soluissa altistettiin kasvaville RSV pitoisuudet (vaihteluväli 5-100 uM) eri kestot (4, 8 ja 24 h) on muutoksia ER homeostaasin, näin ollen esittää aktiivinen ER stressiä mekanismeja. Yksityiskohtaiset vaikutus X-box sitova proteiini-1 (XBP1) liitos ja CHOP ilmentyminen arvioitiin (kuvio 1A ja 1B). Maksimaalinen kasvu XBP1 silmukoinnin (lähes kaikki XBP1 on saumattu muodossa) ja CHOP ilmaisun (51,29 ± 4,81-kertainen muutos; p 0,001) oli 100 uM RSV keskittyminen ja 24 tunnin inkuboinnin. Vaikka ER stressiä 24 h on ilmeinen, on puute korrelaatio solujen elinkelpoisuuden, mikä viittaa siihen, että vaikka solu on lähellä ei ole johtuen ER toimintahäiriön, se on edelleen kannattava; lasku elinkelpoisuuden näyttää 24 tunnin jälkeen RSV hoidon (kuvio 1 C), jonka arvo on -40% 28 h (p 0,001). Huomaa, että valittu RSV pitoisuus (25 uM) käytettiin edelleen kokeita ei kyennyt aiheuttamaan merkittäviä ER stressin milloin tahansa vaiheessa.

HepG2 solut altistettiin ajoneuvoon (0 uM) tai lisäämällä RSV pitoisuuksilla (5, 10 , 25, 50 ja 100 uM) ja kerättiin tiettyyn aikaan pistettä (8, 4 ja 24 h). A) RSV kohdistaa ajasta ja pitoisuudesta riippuvainen aktivaatio XBP1 liitos (XBP1 silmukoimattoman-197 bp amplikoni, XBP1 saumattu-171 bp amplikoni). Edustavia kuva kolmen itsenäisen kokeen B) RSV kohdistavat ajasta ja pitoisuudesta riippuvaista aktivoitumista CHOP ilmaisua. C) RSV pienenee HepG2 elinkelpoisuuden suuremmilla annoksilla ja inkubointiaikojen. Elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo) analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001 ja * p 0,05.

RSV pahentaa palmitaatti aiheuttamaa solukuoleman HepG2-soluissa

palmitaatti-solukuolema (ilmaistuna lasku solujen elinkelpoisuus) arvioitiin MTT-määritys on HepG2-soluissa. RSV vaikutus palmitaatti käsiteltyjä soluja arvioitiin myös. Kuten kuviossa 2A, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (aina 0,2 mM: sta 1 mM) aiheutti aikaa (4, 8 ja 24 h) ja annoksesta riippuvaa vähenemistä solun elinkelpoisuutta. Kun palmitaatti-käsiteltyjä soluja oli inkuboitu yhdessä yhä RSV pitoisuuksilla (aina 25 100 um), joka on edelleen lasku HepG2 elinkelpoisuuden havaittiin. Vaikutus oli ilmeistä 50 uM (-60% enimmäislaskun solujen elinkelpoisuuden; p 0,001) ja 100 uM (-80% enimmäislaskun solujen elinkelpoisuuden; p 0,001) RSV altistuksia 24 tunnin koinkubaation (kuva 2B-D). Puuttumisen vuoksi lisäaineen vaikutuksesta 25pM RSV keskittyminen palmitaatti-solukuolema (-20% enimmäislaskun solujen elinkelpoisuuden ns), tämä pitoisuus valittiin lisätutkimuksia RSV vaikutusta ER stressiä ja sen suhteesta rasvan kertymistä aiheuttama kohonnut FA.

palmitaatti-solukuolema (ilmaistuna prosenttiosuutena solujen elinkelpoisuus) arvioitiin MTT-määritys HepG2-soluissa. RSV vaikutus palmitaatti käsiteltyjä soluja arvioitiin myös. A) lisääminen palmitaatti pitoisuudet (välillä 0,2 mM ja 1 mM) aiheutti aikaa (4, 8 ja 24 h) ja annoksesta riippuvaa vähenemistä solu- elinkelpoisuuden. Palmitaatti-käsitellyt solut olivat myös yhdessä inkuboitiin kasvavilla pitoisuuksilla RSV seuraavasti: B) 25 uM RSV; C) 50 uM RSV ja D) 100 μMRSV. Tämän vähentymisen HepG2 elinkelpoisuus verrattuna hoitoihin palmitaatti yksinään havaittiin 50 uM RSV ja 100pM RSV määrityksiä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo) analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001 ja * p 0,05.

RSV lisää palmitaatti aiheuttamaa ER stressiä syöpäsoluissa

panos ER stressin palmitaatti-solukuolema oli aluksi tutkittiin käyttäen XBP1 liitos kuin ER stressin merkki. Kuvio 3A osoittaa, että ala-myrkyllisiä RSV pitoisuus (25 uM) indusoi samanaikainen kasvu palmitaatti vaikutus XBP1 liittämiseen. Edelleen varmistamiseksi tuloksemme, olemme tutkineet muut ER stressin markkereita, kuten ATF4, ATF6 ja CHOP. Mielenkiintoista on, että RSV vaikutus havaittiin myös (kuvio 3B) on CHOP (17,03 ± 0,01 vs. 8,91 ± 0,65; p 0,001; maksimaalinen kertainen muutos oli RSV-käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen näytteiden) ja ATF4 lauseke (3,13 ± 0,35 vs. 1,7 ± 0,09; p 0,01, maksimaalinen kertainen muutos oli RSV-käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen näytteiden). Vaikutus oli palmitaatti-riippuvainen, mikä osoittaa, että vaikka saman pitoisuuden polyfenolien oli läsnä, ärsyke, joka edisti suurennus molekyylitason vaikutuksia lähes kaikkien tutkittujen ER stressin markkereita oli FA korkeus.

HepG2-soluissa pestiin kahdesti seerumittomalla DMEM ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,25, 0,5, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy. B) ATF4, CHOP ja ATF6 mRNA ekspressiotasot. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. HeLa-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DMEM: ssä ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,25, 0,5, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. C) herkkyys HeLa-solujen palmitaatti-indusoidun ER stressiä. XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy. D) RSV pahentaa palmitaatti aiheuttama silmukoinnin HeLa-soluissa. XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy E) RSV vahvistaa CHOP välitteistä signalointia. CHOP mRNA ekspressiotasot. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo) analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001 ja ** p 0,01.

ATF6 oli ainoa tutkittu ER stressin merkkiaine, joka näytti vaikuta hoitoon. Kuitenkin ATF6 translokaatio Golgin laitteeseen tarvitaan sen aktivoitumisen; Näin ollen on todennäköistä, että sen ilmentyminen ei vaikuta.

Yleisesti, nämä tulokset viittaavat siihen, että RSV edistää muutoksia useita molekulaarisia mekanismeja, jotka pahentaa kun määrä palmitaatti kasvoi.

merkittävää, samalla kokeellinen tulos saatiin, kun toinen tasyöpäsolulinja, HeLa-solut, käytettiin (luvut 3C, 3D ja 3E). Tämä viittaa siihen, että tämä vaikutus ei rajoitu tiettyyn syöpään solulinja.

RSV herkistää HepG2-solujen palmitaatti-indusoitua apoptoosia

arvioimiseksi RSV vaikutus palmitaatti lipoapoptosis, olemme kehittäneet Western blotting määrityksissä ja pilkottiin kaspaasi-3. Proapoptoottiset proteiini kaspaasi 3 syntetisoituu inaktiivisena proentsyyminä (32 kDa), joka käsitellään apoptoosin alaisten solujen itsenäisten proteolyysin ja /tai pilkkominen toinen ylävirtaan proteaasilla. Jalostetut muoto kaspaasi-3 koostuu suurista (17 kDa) ja pieni (12 kDa) alayksikköä, jotka associate muodostaen aktiivisen entsyymin. Aktiivinen kaspaasi-3 proteolyyttisesti pilkkoo ja aktivoi muita caspases ja asianmukaisten tavoitteiden soluissa, kuten PARP ja DFF [34].

Kuvio 4A esittää, että palmitaatti hoidot vain indusoi hieman enemmän kaspaasin 3 pilkkominen suuremmilla annoksilla (0,75 ja 1 mM). Kun RSV lisättiin sijasta vähentää apoptoottisten tasolla, se edisti lipoapoptotic vaikutusta palmitaatti. Näin ollen RSV co-indusoi seuraavasti: (a) lisääminen kaspaasi-3 pilkkominen verrattuna havaittiin palmitaatti yksin; ja (b) pelkistetään tyydyttynyt FA pitoisuus kynnys tarvitaan aiheuttaa apoptoottinen vaikutus (eli 0,5 mM palmitaatti vs. 0,5 mM palmitaattia +25 uM RSV).

HepG2-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DMEM ja siirretään seerumia tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,25, 0,5, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) lohkaistaan ​​kaspaasi-3 analyysi Western-blottauksella. Täplää esitetty on edustava kuva kolmen erillisen kokeen. B) HepG2-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia. Ennen 8 h palmitaatti-RSV co-hoitoa, soluja inkuboitiin DCFH-DA (20 uM lopullinen konsentraatio) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. ROS on esitetty keskiarvo RFU (suhteellinen Fluorescence Units) ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo tai palmitaatti) analysoitiin pariksi Studentin t-testejä. *** P 0,001, ** p 0,01 ja * p 0,05.

ROS tuotanto vähenee RSV palmitaatti-käsiteltyjen HepG2-soluissa

panos oksidatiivisen stressin in palmitaatti-solukuolema tutkittiin tunnistamalla ROS tuotantoa. Tässä määrityksessä mittasimme fluoresoiva signaali sen jälkeen, kun solunsisäiset hapetus ROS (kuten vetyperoksidin ja hydroksyyliradikaalin) kalvon läpäisevän väriaine 2 ’, 7’-dikloori-dihydro-fluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA). Kuvio 4B osoittaa, että viljellään HepG2-soluissa kasvavien pitoisuuksien kanssa palmitaatti (aina 0,2 mM: sta 1 mM) 8 tuntia aiheutti kasvu fluoresoivan signaalin (1026 ± 104 vs. 3294 ± 61; p 0,001; maksimaalinen ero oli välillä ei-käsiteltyjen näytteiden ja palmitaatti käsiteltyjen näytteiden). Edellinen inkubaatioista 25pM RSV 20 tuntia vähensi solunsisäisen ROS kaikissa analysoituna palmitaatin annokset (2478 ± 36 vs. 1222 ± 108; p 0,001; maksimaalinen ero oli välillä palmitaatti käsiteltyjen näytteiden ja RSV + palmitaatti käsiteltyjen näytteiden). Tämä tulos tukee vakiintunut antioksidantti kapasiteetti polyfenolien [35] ja ehdottaa, että edellä mainittu RSV liittyvien vaikutusten pahenemista palmitaatti vaikutuksen HepG2 solut eivät ole ensisijaisesti kasvun takia solunsisäisessä ROS tuotanto.

Scd1 dynamiikkaa muutetaan vasteena RSV

aiemmin on osoitettu, että yksi ravitsemukselliset ärsykkeitä, jotka moduloivat Scd1 geenin ilmentymistä, tyydyttyneitä rasvoja olivat voimakkaita aktivaattoreita. Viljellyissä lihasputkiksi, palmitaatti lisääntynyt Scd1 ilmentyminen liittyy kasvuun FA lihaksen varastointi [36]. Kuvio 5A osoittaa, että 8 h hoito lisäämällä palmitaatti pitoisuudet indusoi merkittävän yliekspressio Scd1 suuremmilla palmitaatti annoksilla (1 ± 0,14 vs. 2,21 ± 0,52; p 0,001; maksimaalinen kertainen muutos oli välillä palmitaatti käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen näytteiden ). Sen sijaan, kun HepG2-soluja esikäsiteltiin 20 tuntia RSV, Scd1 yliekspressio laski merkittävästi, mikä viittaa siihen, että RSV heikentää palmitaatti-indusoitu kasvu Scd1 lausekkeen (2,21 ± 0,52 vs. 0,7 ± 0,12; p 0,001; maksimaalinen ero oli välillä palmitaatti käsiteltyjen näytteiden ja RSV + palmitaatti käsiteltyjen näytteiden). Kääntäen, lievää laskua valkuaispitoisuus saatiin, kun Scd1 tutkittiin proteiinin taso (kuvio 5B). Tämä puute korrelaatio Scd1 mRNA ja proteiini tasoilla viittaa siihen, että tekijät (translaation jälkeiset tekijät, entsyymiaktiivisuus asetus) muut kuin geeniekspressio voisi myös olla tärkeä Scd1 dynamiikkaa vastauksena RSV. Tästä johtuen ristiriita, kehitimme siRNA pudotus kokeita asemaa selkeytetään Scd1 että RSV aiheuttama ER stressiä. Scd1 ilme merkittävästi pienentyneet siRNA transfektiota (kuvio S1A). Suuret inhibitioastei- saatiin vain 10 nM siRNA pitoisuus käyttäen siRNA- (3) tai käyttäen yhdistelmää kolmesta siRNA oligonukleotidit siRNA- (1, 2, ja 3). Niinpä Scd1 valkuaispitoisuus (kuvio S1B) vähenivät myös merkittävästi johtuen tämän kokeellisen lähestymistavan. Kun Scd1 knockdown validoitiin, tutkimme vaikutus tämän geenien päällä ER stressiä mekanismien avulla XBP1 liitos kuin ER stressin merkki. Mielenkiintoista on, kuten on aiemmin kuvattu muiden tekijöiden [37], Scd1 esto aktivoituna XBP1 liittämiseen (kuva S1C), mikä viittaa siihen, että lasku membraanin tyydyttymättömyys voi laukaista ER-stressi ja solukuoleman. Valitsimme siRNA (3) ja kolmen yhdistelmää siRNA oligonukleotidit siRNA- (1, 2, ja 3) edelleen tutkia vaikutusta Scd1 inhibition kyllästettyyn FA yhteydessä (palmitaatti hoito). Yllättäen molemmat siRNA hiljentäminen lähestymistavat (luvut 5C) osoitti, että myöhempi altistuminen palmitaatti kokeellisesti Scd1 vaje solut eivät pahentaa XBP1 liittämiseen; päinvastoin, kun läsnä on palmitaatti, tämä liitos on hieman vähentynyt. Validoida että tämä solujen fenotyyppi ei johtunut hypoteettista ”pakottavat” äänenvaimennusjärjestelmän strategian, tutkimme Scd1 lauseke kerran siRNA- (3) transfektoitiin. Palmitaatti hoito ei pystynyt kääntämään Scd1 geneettinen vaimennus (kuvio 5D). Siksi, kuten jäljempänä, muut korvausmekanismien ajama Scd1 esto voisi olla vastuussa suhteellinen lasku XBP1 liittämiseen. Lisäksi kuvio 5E mukaan CHOP tasot hieman kasvanut johtuen SCD-1 esto, mikä viittaa siihen, että huolimatta suhteellinen lasku XBP1 liittämiseen, muut anturit ER stressin, kuten ATF6 tai PERK, voitaisiin vaikuttaminen CHOP ilme. Erityisesti tämä CHOP korkeus ei ole verrattavissa siihen, joka saatiin aikaisemmin RSV + palmitaatti hoitoja (kuvio 3B).

HepG2 solut pestiin kahdesti seerumittomalla DMEM ja siirrettiin seerumia tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,25, 0,5, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) Scd1 geenin ilmentymisen tasoa. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. B) Scd1 proteiinin tasot. Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella. Tulokset kolmena Immunoblottien kvantitoitiin densitometrillä. Tulokset on esitetty kaaviossa edustavat suhde Scd1 /tubuliinia. Edustava immunoblottaus näkyy kaavion alapuolella. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo tai palmitaatti) analysoitiin pariksi Studentin t-testit Scd1 mRNA: n ilmentymisen ja yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi Western blot kvantifiointiin. *** P 0,001, ** p 0,01 ja * p 0,05. Scd1 pudotus (C) indusoi XBP1 liittämiseen, mutta tämä liitos heikkenee, kun tyhjentynyt Scd1 soluja altistetaan kasvaville palmitaatti pitoisuuksia. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy. D) lasku XBP1 silmukoinnin siRNA + palmitaatti soluja ei johdu Scd1 ennalleen. Prosenttiosuus suhteessa Scd1 geenin ilmentyminen on esitetty. Tulokset esitetään keskiarvona kertaiseksi muutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. E) Scd1 hiljentäminen edistää lievää kasvua CHOP ilmaisua. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

RSV inhibitio palmitaatti akkumulaatiota triglyseridi-allasta korreloi kasvun CHOP ja XBP-1 liittämiseen

Valaistaan ​​muita mahdollisia RSV molekyylitason mekanismi, joka edistää paheneminen ER stressin johdettujen apoptoosin keskityimme huomiomme triglyseridien kertymistä.

Triglyceride varastointi arvioitiin oil red O värjäystä. Kuvio 6A esittää, että 8 h palmitaatti indusoi annoksesta riippuvan kasvu HepG2 triglyseridipitoisuus (0,643 ± 0,006 vs. 0,994 ± 0,015; p 0,001; maksimaalinen ero oli välillä ei-käsiteltyjen näytteiden ja palmitaatti käsiteltyjen näytteiden). Käänteisesti, kun soluja esi-inkuboitiin 20 h RSV, solunsisäisen lipidin pitoisuus aleni kaikissa reitin analysoituna palmitaatin pitoisuuksia (0,951 ± 0,068 vs. 0,774 ± 0,011; p 0,001; maksimaalinen ero oli välillä palmitaatti käsiteltyjen näytteiden ja RSV + palmitaatti käsiteltyjen näytteiden). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa kertynyt

in vitro

ja

in vivo

todiste anti-adipogeeniset vaikutus RSV [38], [39].

HepG2-soluissa pestiin kahdesti seerumittomalla DMEM ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen tai ilman 25 uM RSV 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,25, 0,5, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) Öljy Punainen O värjäystä kvantifiointiin. Triglyseridi kertyminen ilmaistaan ​​keskiarvo OD (optinen tiheys) ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. Kiinteän RSV pitoisuudet, HepG2-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DMEM: ssä ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen, jossa on ajoneuvon (0,1% etanolia), 5, 10, 25, 50 tai 100 uM RSV ja kiinteä pitoisuus palmitaatti ( 0,25 mM) 24 tuntia. B) Öljy punainen O värjäystä kvantifiointiin. Triglyseridi kertyminen ilmaistaan ​​keskiarvo OD (optinen tiheys) ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo) ja 0,25 mM palmitaatti analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001. C) CHOP mRNA ekspressiotasot. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden (ajoneuvo) analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001 ja ** p 0,01. D) XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen esitetään.

Lisäksi olemme kehittäneet useita kokeita, joissa korjasimme palmitaatti pitoisuus (0,25 mmol) ja altistuvat HepG2 solut yhä RSV pitoisuuksia. Erityisesti, RSV pystyi alentamaan triglyseridien kertymistä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 6B). Tästä huolimatta lasku triglyseridien kertymistä, oli samanaikaisesti aktivoinnin ensisijaisen ER stressiä komponentti, kuten XBP1 silmukoinnin ja ER-johdettu alavirran apoptoottiset tekijä CHOP (kuvio 6C ja 6D). Tämä tulos viittasivat vahvasti siihen, että vaikka ensimmäinen edullinen vaikutus RSV vähentää triglyseridin kerääntyminen, oli raja-RSV-indusoidun inhibition lipidien kertymistä (25 uM RSV), että kun saavutetaan, laukeaa ER stressin johdettu indusoiman apoptoosin palmitaatti. Sen vuoksi oli ilmeistä, että vaikka puskurointikyky palmitaatti solun estyy RSV (pääasiassa tunnettu RSV inhiboivaa vaikutusta SREBP1c), kun tämä inhibitio on liian vahva /jatkuva määrä jäljellä palmitaatti sisällä solu lisääntyy ja edistää haitallisia vaikutuksia kyllästetyn FA (palmitaatti aiheuttama ER stressiä ja apoptoosia).

Paluu RSV johtuvat vaikutukset yhteistyöhön hoitoja eikosapentaeenihappo (EPA) tai maksan X-reseptori ( LXR) agonisti (TO-901317) B

edelleen tutkia ER stressin induktio RSV + palmitaatti käsiteltyjä soluja on muutosten vuoksi palmitaatti jalostuskapasiteettia solun kehitimme seuraavat kaksi kokeellista lähestymistapaa: ( a) monityydyttymätön rasvahappo (PUFA) lisäravinteen (käsittely EPA kahdessa kasvavia pitoisuuksia) ja (b) LXR-agonisti hoitoon (lisäys TO-901317 stimuloida Scd1 ilmaus). Silmiinpistävän, kuva 7C ​​esittää, että täydentäminen sekä EPA pitoisuuksien pelastettiin HepG2 solut apoptoottisen prosessin (kevyemmästä pilkkoa kaspaasi 3 verrattuna RSV + palmitaatti). Tämä alentuneen apoptoottisen tekijän korreloi lasku XBP1 silmukoinnin (kuvio 7A) ja CHOP ilmaisu (kuvio 7B) (16,54 ± 2,16 vs. 6,27 ± 0,67; p 0,001; maksimaalinen ero oli RSV + palmitaatti käsiteltyjen näytteiden ja RSV + palmitaatti + EPA Käsitellyt näytteet), mikä viittaa siihen, palauttaminen ER-toiminto.

HepG2-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DMEM: ssä ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen, jossa on ajoneuvon (0,1% etanolia), 25 uM RSV, 50pM EPA tai 100gM EPA 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0, 0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni). Edustava kuva kolmen itsenäisen kokeen näkyy. B) CHOP mRNA ekspressiotasot. Tulokset on esitetty keskiarvo kertamuutos ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. C) Katkennut kaspaasi-3 taso määritettiin Western blotting. Täplää esitetty on edustava kuva kolmen erillisen kokeen. Merkittäviä eroja analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin jälkikäteen testi: *** p 0,001 ja ** p 0,01.

Vaihtoehtoisesti HepG2 solut käsiteltiin kahdella pitoisuudella (1 uM ja 10 uM) LXR-agonisti TO-901317 osoittivat lisääntynyttä Scd1 proteiini ja mRNA-tasot (kuvio S2A ja S2B). Lisäksi kuvio 8 esittää, että agonistihoidon myös korjattu vaikutuksia edistetään palmitaatti ja laukaisee RSV. Esimerkiksi agonistihoidon korjattu kasvu kaspaasi-3 pilkkominen (kuvio 8A) ja peruuttaa vaikutukset ER stressin (kuvio 8B ja 8C) in XBP1 ja CHOP ilmaisun (4,43 ± 0,26 vs. 1,67 ± 0,26; p 0,001; maksimaalinen ero oli RSV + palmitaatti käsiteltyjen näytteiden ja RSV + palmitaatti + TO-901317 käsiteltyjen näytteiden).

HepG2-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa DMEM: ssä ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen, jossa ajoneuvoja (0,05% etanolia ja 0,1% DMSO) ja 25 uM RSV tai 10 mm-901317 28 tuntia; 8 h ennen kokeen lopussa, kasvavien pitoisuuksien palmitaatti (0,75 ja 1 mM), lisättiin vastaavan hyvin. A) XBP1 liittämiseen. (XBP1 silmukoimattoman-197 emäsparin amplikoni, XBP1 saumattu-171 emäsparin amplikoni).