Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epotiloneilla ovat uuden luokan mikrotubulia stabilointiaineita lupaavia prekliinisen ja kliinisen aktiivisuuden. Heidän solukohteeseen on β-tubuliinia ja vaikuttavia tekijöitä luontainen herkkyys epotilonien ei ymmärretä hyvin. Tässä tutkimuksessa, toiminnallinen merkitys tietyn β-tubuliinia isotyyppien in luontainen herkkyys epotiloni B tutkittiin käyttämällä siRNA-geenin pudotus vastaan ​​βII-, βIII- tai βIVb-tubuliinit kaksi erillistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat, NCI-H460 ja Calu-6. Drug saaneilla klonogeeniset määritykset osoittivat, että herkkyys epotiloni B ei muuttunut seuraavalla knockdovvn βII-tubuliinin molemmissa NSCLC solulinjoissa. Sen sijaan knockdovvn βIII-tubuliinin merkittävästi lisääntynyt herkkyys epotiloni B. Mielenkiintoista, βIVb-tubuliinin knockdowns oli huomattavasti vähemmän herkkä epotiloni B, verrattuna vale- ja hallita siRNA soluja. Solusyklin analyysi βIII-tubuliinin knockdown solut osoittivat suurempi prosenttiosuus solukuoleman kanssa epotiloni B pitoisuudet niinkin alhainen kuin 0,5 nM. Sen sijaan βIVb-tubuliinin knockdown soluilla väheneminen epotiloni B aiheuttama G

2-M solusyklin kertyminen verrattuna ohjata siRNA soluihin. Tärkeää on, βIII-tubuliinin knockdowns näkyy merkittävä annosriippuvainen nousu prosenttiosuuden apoptoottisten solujen käsittelemällä epotiloni B: tä, kuten havaittiin käyttäen kaspaasi 3/7 aktiivisuus ja anneksiini-V-värjäyksellä. Suurempia pitoisuuksia epotiloni B: tä tarvitaan indusoimaan apoptoosia βIVb-tubuliinin knockdowns verrattuna kontrolliin siRNA, esiin mahdollisen mekanismin taustalla vähentynyt herkkyys tälle aineelle. Tämä tutkimus osoittaa, että erityiset β-tubuliinin isotyyppien voi vaikuttaa herkkyyttä epotilonin B ja voivat vaikuttaa ero herkkyyttä tämän lupaavan uuden aineen.

Citation: Gan PP, McCarroll JA, Byrne FL, Garner J, Kavallaris M (2011 ) Erityiset β-Tubulin Iso- tyyppien Can Toiminnallisesti korostaa tai vaimentaa epotiloni B Herkkyys ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (6): e21717. doi: 10,1371 /journal.pone.0021717

Editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 lokakuu 2010; Hyväksytty: 9 kesäkuu 2011; Julkaistu: 29 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Lasten Cancer instituutti Australia for Medical Research, joka on sidoksissa University of New South Walesin ja Sydney lastensairaalassa sekä avustuksia New South Wales Cancer neuvosto (MK). Endeavour Kansainvälinen Jatko Research Scholarship (PPG), University of New South Wales lääketieteellisen tiedekunnan Fellowship (JAM), University of New South Wales Lääketieteellinen tiedekunta Varhainen ura Research Award (JAM), Balnaves Award (JAM), Anthony Rothe jatko Award (JLB ), ja jonka NHMRC Senior Fellowship (MK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: MK, PPG ja JAM, patenttihakemus 20100159030 havaitsemiseksi käytettävistä JA MODULATING herkkyyttä tuumorisoluja antimitoottisena AINEIDEN SEKÄ MODULATING TUMORGENICITY 24.6.2010. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS ONE politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

taksaanit (kuten paklitakseli ja doketakseli) perustetaan huumeita käytetään laajasti hoidossa useiden tyyppisiä kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien munasarja-, rinta-, keuhko- ja pään ja kaulan alueen syöpä, joko yksinään tai yhdessä muiden kemoterapia-aineiden kanssa. Kliininen menestys taksaanien on antanut sysäyksen etsiä muita uusia aineita, joilla on samanlaisia ​​ominaisuuksia, mutta parantunut tehokkuus. Epotilonit ovat uusi luokka kuin taksaanin mikroputkia stabiloivat aineet, jotka ovat osoittaneet lupaavaa syövän vastaista aktiivisuutta. Niistä epotiloni B analogi, Ixabepilone (BMS-247550, atsa- EpoB) hyväksyttiin vuonna 2007 Food and Drug Administration metastaattisen tai paikallisesti edennyt rintasyöpä resistenttejä antrasykliineille, taksaanit ja kapesitabiinin, joko yksittäin tai yhdessä näiden aineiden kanssa [1]. Luonnossa esiintyvät epotiloni B (patupilone, EPO906), on myös osoittanut lupaavia aktiivisuutta erilaisissa kokeellisissa malleissa, jotka ovat resistenttejä taksaania kemoterapiaan ja on parhaillaan faasin II /III kliinisissä tutkimuksissa [2], [3], [4], [5]. Huolimatta pieni rakenteellinen samankaltaisuus epotilonien ja taksaanit, sekä aineet samaa tai päällekkäistä sitoutumiskohta on β-tubuliinin [6], [7]. Samanlaisia ​​taksaaneja, epotilonien aiheuttaa mikrotubulusten niputtaminen [6], tukahduttaa mikrotubulusdynamiikan; mikä soluproliferaation inhibointi ja mitoosi block [8]. Vaikka epotilonien ja taksaanien vakauttaa mikrotubuluksia vastaan ​​depolymerisaatiota, niillä selviä eroja aktiivisuutta ja tehoa (tarkistetaan [9], [10]).

Sekä epotilonien ja taksaanien voi vakauttaa mikrotubuluksia vastaan ​​depolymerisaatiota, mutta niillä selviä eroja aktiivisuuden ja tehokkuuden (tarkistetaan [9], [10]). Syyt erot aktiivisuuden tunnetaan huonosti. Tähän mennessä tutkimukset ovat keskittyneet kehittynyt resistenssi epotilonien avulla lääke valitaan populaatioita, joilla on useita resistenssimekanismeja lukien muutokset tubuliinia isotyypin ilmaisun ja mutaatiot β-tubuliinia [11], [12], [13], [14]. Olemme aiemmin kuvattu epotiloni B: analoginen resistenttejä leukemiasoluja, joilla on useita mikrotubulusten muutoksia mukaan lukien lisääntynyt ilmentyminen βIII-tubuliinin, lisääntyneen ekspression MAP4 ja mutaatiot βI-tubuliinin [13]. Vaikka kehittynyt resistenssi epotilonien on kuvattu, tutkimus sisäisiä piirteitä, jotka välittävät herkkyys epotilonien ja liittyvät solukohteeseen lääkkeen, tubuliinin, ovat olleet niukkoja. Koska nämä aineet edetä klinikalla on tärkeää ymmärtää, miten tämän luokan yhdiste on vuorovaikutuksessa eri tubuliinia isotyyppeihin ja miten sisäinen määriä näitä proteiineja vaikuttavat tehokkuuteen.

käyttäminen RNAi tekniikkaa, olemme aikaisemmin osoittaneet, että βIII-tubuliinin välittää herkkyyttä paklitakselille ja

Vinka

alkaloideja NSCLC soluissa [15]. Vaimentaminen ilmaus βII- ja βIVb-tubuliinin isotyyppien, toisaalta, parantaa herkkyyttä näiden solujen

Vinca

alkaloideja, mutta ei paklitakseli [16]. Vastaavaa todisteita siitä, että ylösajon βIII-tubuliinin ei välittävät resistenssiä epotiloni B: n on myös raportoitu [12]. Kuitenkin, yli-ilmentyminen βIII-tubuliinin HeLa-soluissa tekee solut vähemmän herkkä epotiloni B: n [17]. Ei tiedetä, onko ero ilmentyminen β-tubuliinia isotyypit vaikutusta vasteena epotilonien. Ymmärtäminen vuorovaikutus on erittäin haluttu kehittämiseen ennakoivan merkkiaineiden tarjota räätälöityjä hoito pienisoluista keuhkosyöpää ja muita potilaita hoidetaan epotilonien.

tutkimiseksi toiminnallista merkitystä näiden β-tubuliinin isotyyppien vastauksena epotiloni B NSCLC, käytimme RNAi tekniikka nimenomaan pudotus ilmentymistä näiden isotyyppien kahdessa itsenäisessä NSCLC solulinjojen ja luonnehtivat vaikutuksia solumorfologiaan, herkkyyttä epotiloni B ja lääkkeen aiheuttama apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, siRNA transfektio ja sytotoksisen lääkkeen

H460 ja Calu-6-solut saatiin ATCC: ltä (Manasses, VA, USA) ja pidettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Solulinjat seulotaan rutiininomaisesti ja mykoplasmaa. Kaikki transfektio toimenpiteet suoritettiin niin raportoitu aiemmin [15]. Teho ja spesifisyys siRNA: iden kohdistaminen kunkin β-tubuliinin isotyyppi on validoitu aikaisemmin [15], [16]. Epotiloni B (Calbiochem, Merck Biosciences) valmistettiin varastossa pitoisuutena 100 uM DMSO: ssa.

immunofluoresenssi

Lyhyesti, siRNA-transfektoiduissa Calu-6-solut kasvavat lasikammiota objektilasit käsiteltiin jossa epotiloni B: ilmoitettuina pitoisuuksina 1 tunti. Immunofluoresenssivärjäyksen siRNA-transfektoiduissa soluissa Sitten suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15], [16].

Drug-käsitelty klonogeenisten määrityksissä

Drug-käsitelty klonogeenisten määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15 ], [16]. Tulokset ilmaistiin eloonjääntifraktio ja estävä annos (ID

50) ekstrapoloitiin annos-vaste-käyrä käyttäen GraphPad Prism-ohjelma [15], [16].

Solusyklianalyysiä

analyysiä varten DNA-pitoisuus propidiumjodidivärjäys, H460 ja Calu-6-solut ympättiin 6-kuoppaisille maljoille, jotka sisälsivät 6 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin siRNA. 72 tunnin kuluttua transfektiosta solut altistettiin epotiloni B: ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Päivänä analyysin sekä pysyvä ja kelluvat solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 80% etanolilla vähintään 24 tuntia 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut värjätään sitten liuoksella, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidia ja 2 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. DNA-pitoisuus mitattiin FACSCalibur virtaussytometrillä (BD). CellQuest ohjelma käytettiin kvantitoimiseksi solujen jakauma kussakin solusyklin vaihe: sub-G

1 (kuollut tai hajanaiset), G

1, S ja G

2-M [15], [ ,,,0],16].

apoptosis määrityksissä

Cellular apoptoosi määritettiin mittaamalla kaspaasi 3/7 aktiivisuus käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu pienin muutoksin [18], [19 ]. Lyhyesti, solut transfektoitiin siRNA: lla 24 h ja maljattiin uudelleen 96-kuoppaisille levyille (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä vielä 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla epotiloni 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin kaspaasi-Glo 3/7 reagenssi 2 tuntia huoneenlämpötilassa, ja luminesenssi mitattiin luminometrillä (PerkinElmer Victor 3). Lisäksi apoptoosi määritettiin myös anneksiini V-FITC-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Becton Dickinson), kuten aikaisemmin on kuvattu [15], [19].

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM ja analysoidaan ANOVA tai opiskelijan

t

testiä, jonka jälkeen nonparametric Dunnettin tai Mann-Whitney testeissä, joissa käytettiin GraphPad Prism-ohjelma. AP arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Differential herkkyys epotiloni B seuraavat βII-, βIII- tai βIVb-tubuliinin Knockdown

spesifisyys jokaisen n β-tubuliinia siRNA vahvistettiin proteiinin taso (kuva S1). Yhdenmukaisesti aiempien tutkimusten βII-, βIII-, ja βIVb-tubuliinin siRNA voimakkaasti inhiboi proteiinin ilmentymisen kunkin näiden tavoitteiden osalta vaikuttamatta ilmentymisen muiden suurten β-tubuliinia isotyyppien, että NSCLC solulinjoissa (kuvio S1) [15] , [16]. Vaikutusten tutkimiseksi näiden β-tubuliinin isotyyppien vastauksena epotiloni B NSCLC-solujen ja kvantifioimiseksi muutoksia huumeiden herkkyys, lääkettä saaneissa klonogeeniset määritykset suoritettiin. Knockdovvn βII-tubuliinin ilmaisua sekä H460 ja Calu-6-solut eivät vaikuta herkkyyttä epotiloni B (Fig. 1A). Sen sijaan knockdovvn βIII-tubuliinin merkittävästi herkistyneet sekä NSCLC solulinjat epotiloni B (Fig. 1 B). Viime aikoina olemme kuvattu kehittäminen ja karakterisointi H460 valittujen solujen stabiilia ekspressiota shRNA vastaan ​​βIII-tubuliinin, ja lisääntynyt herkkyys näiden solujen paklitakseli, sisplatiinin ja sen analogisen karboplatiinin [19]. Tärkeää on, että lisääntynyt herkkyys epotiloni B, käyttäen ohimenevä knockdovvn βIII-tubuliinia vahvistettiin myös käyttäen vakaa H460 βIII-tubuliinin shRNA taintumisen soluja (kuvio S2), edelleen vahvistamaan havaintoja tämän isotyypin. Mielenkiintoista on, että pudotus on βIVb-tubuliinin merkittävästi vähentää herkkyyttä epotiloni B: n molemmissa solulinjoissa, verrattuna vale- ja hallita siRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 1C), mikä viittaa siihen, että tuumorit ilmentävät suuria määriä tämän isotyypin voivat olla herkempiä epotiloni B: kuin kasvaimet, joilla on alhainen tämän isotyypin.

klonogeeninen määritykset suoritettiin mock (umpinaiset neliöt, yhtenäinen viiva), ohjaus siRNA (avoimet neliöt, yhtenäinen viiva) ja erityiset β-tubuliinia isotyyppi siRNA-transfektoiduissa soluissa (suljettu timantit, katkoviiva) kahdessa NSCLC solulinjoissa, H460 (vasen paneeli) ja Calu-6 (oikea paneeli). Käyrät osoittavat klonogeeniset selviytymistä (A) βII-tubuliinin; (B) βIII-tubuliinia ja (C) βIVb-tubuliinin pudotus solut altistetaan epotiloni ilmaistuna elossa osa. Bars, keskiarvo ± SEM vähintään neljä erillistä määrityksiä. Tilastot laskettiin vertaamalla elossa osa Knockdown solujen valetransfektoiduista solujen kunkin lääkkeen pitoisuus. *

P

0,05, **

P

0,01.

tutki myös tasauspyörästön vaikutuksia epotiloni B mikrotubuleiksi ja solujen morfologian βII -, βIII- ja βIVb-tubuliinin knockdown soluissa. Kuten kuviossa S3, kaikki käsittelemättömät siRNA-transfektoiduissa soluissa ei osoittanut selvää muutoksia mikrotubulusten rakenteita, yhdenmukaiset kanssa aiempien tutkimusten [15], [16]. Kuitenkin epotiloni B (5 nM) oli selvä vaikutus solujen βIII-tubuliinin köyhdytettyä mikrotubulushaarojen. Mikrotubulusproteiinit niput olivat yhä näkyvämpi βIII-tubuliinia knockdown soluissa. Sen sijaan, mikroputkiverkostoa pysyi suurelta osin järjestetty ja ehjänä ohjaus siRNA, βII- ja βIVb-tubuliinin pudotus soluja käsitellään samana pitoisuutena. 20 nM epotiloni B, sekä ohjaus ja βII-tubuliinin Knockdown solut alkavat näytteille mikrotubulusten nippujen verrattuna βIVb-tubuliinia knockdowns. Nämä havainnot täydentävät klonogeeniset tiedot ja viittaavat siihen, että solut reagoivat eri tavoin epotiloni B jälkeen erityisiä knockdown kunkin yksittäisen β-tubuliinia isotyyppiä.

knockdovvn βIII-tubuliinin vähentää epotiloni B aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja parantaa solukuolemaa

Solusyklianalyysiä suoritettiin seuraava onko pudotus kunkin β-tubuliinia isotyyppiä vaikuttaa solusyklin profiilit, kun läsnä on epotiloni B: 24 tuntia. Kun käsitelty alhaisina pitoisuuksina kuin 0,5 nM epotiloni B βIII-tubuliinin knockdown solut osoittivat merkittävää kasvua sub-G

1 sisältö, alustava solukuoleman (Fig. 2). Suurempi ero havaittiin 20 nM epotiloni B ohjaus- siRNA- ja βII-tubuliinia siRNA-käsitellyistä soluista osoittaa merkitty G

2-M lohko taas βIII-tubuliinin Knockdown soluilla kasvua osa-G

1 väestöstä (Fig. 2). βIII-tubuliinin pudotus soluja oli vähemmän soluja kertyvää G2-M kontrolleihin verrattuna, mikä viittaa siihen, että solukuolema voidaan esiintyviä riippumattomia mitoottisten pidätys. On selvää, että pudotus on βIII-tubuliinin voimakkaasti lisää herkkyyttä epotiloni B: n kautta lisääntynyt solukuolema, koska ala-G

1 väestö kasvoi kaikilla testatuilla pitoisuuksilla. In βIVb-tubuliinin pudotus solujen Toisaalta, alempi G

2-M pitoisuus havaittiin verrattuna kontrolliin siRNA-käsitellyissä soluissa 20 nM epotiloni B: (Fig. 2). Osa-G

1 sisältö ei ollut eroa βIVb-tubuliinia Knockdown ja ohjaus siRNA käsiteltyjä soluja 20 nM. Sen sijaan knockdovvn βIVb-tubuliinin, se oli pienempi määrä soluja estetty G

2-M, mikä vahvistaa lasku herkkyyden näiden solujen epotiloni B.

Drug pitoisuudet ilmoitettu päälle kuvion. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen lääkehoitoa ja sitten määritettiin niiden DNA-sisällöstä virtaussytometrialla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Edustavia luvut neljästä itsenäisestä kokeesta on esitetty. *

P

0,05, **

P

0,01.

Voit selvittää epotiloni B aiheuttama G

2-M solukierron viive esiintyvät aikaisemmin pistettä, solusyklin analyysi käyttäen H460 ja Calu-6-solut tehtiin 4, 8 ja 12 tuntia, kun läsnä tai poissa epotiloni B: (20 nM). Läsnä ollessa lääkkeen, G

2-M solusyklin pysähtymisen havaittiin jo 4 h H460-soluja (taulukko S1) ja 8 h Calu-6-solut (taulukko S2) sekä βIII-tubuliinia pudotus ja kontrolli-siRNA transfektoiduissa soluissa. 8 ja 12 tuntia prosenttiosuus H460-solujen estetty G

2-M oli pienempi kuin (taulukko S1), joskin samanlaista suuntausta ei havaittu Calu-6-solut (taulukko S2).

herkkyys epotiloni B: korreloi apoptoosin taso induktion

käsitellä sitä, lisääntynyt tai vähentynyt herkkyys epotiloni B: n kunkin β-tubuliinia isotyyppi liittyvät apoptoosin, mittasimme kaspaasi 3/7 aktiivisuus näissä soluissa 24 tunnin jälkeen lääkehoitoa. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus βIII-tubuliinia pudotus solujen lisääntynyt vähintään 2-kertaisesti, että ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa yhdelläkään testatulla pitoisuudella (Fig. 3). Lisääntynyt kaspaasiaktiivisuus vuonna βIII-tubuliinin Knockdown soluissa korreloi lisääntyneen solukuoleman havaittu näissä soluissa kun lääkehoitoa. Sitä vastoin kaspaasi 3/7 aktiivisuus pysyi tausta tasoilla βII- ja βIVb-tubuliinin pudotus soluja, samanlainen ohjaus siRNA solut ≤1 nM epotiloni B. Tärkeää on, oli merkittävä väheneminen kaspaasi aktiivisuuden βIVb knockdown-soluja at ≥2 nM, mikä viittaa βIVb-tubuliinin knockdowns olivat vähemmän herkkiä epotiloni: n indusoiman apoptoosin.

siRNA-transfektoiduissa H460-solut kerättiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 24 tuntia, kun läsnä tai poissa epotilonin B ja sen jälkeen määritettiin apoptoosin induktion kaspaasiaktiivisuus määrityksessä. Avoimet pylväät: ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa; vaaleanharmaa massatangoissa: βII-tubuliinin knockdown soluissa; solid mustat palkit: βIII-tubuliinin knockdown soluissa; tummanharmaa massatangoissa: βIVb-tubuliinia pudotus soluissa. Data edustaa keskiarvoja ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05; **

P

0,01.

määritellä tarkemmin rooli β-tubuliinin isotyyppien epotilonin B: n indusoiman apoptoosin, anneksiini V-FITC-värjäys suoritettiin myös seuraavat 48 h hoidon epotiloni B. Kuten kuviossa. 4A, hoito βIII-tubuliinin pudotus H460-soluissa indusoiman apoptoosin peräisin konsentraatio oli niin alhainen kuin 320 pM epotiloni B prosenttiosuus apoptoottisten solujen oli merkitsevästi suurempi βIII-tubuliinia siRNA-käsitellyissä soluissa kuin verrokeilla, βII- tai βIVb- tubuliinia siRNA-käsitellyt solut kaikilla testatuilla pitoisuuksilla (Fig. 4A). Sitä vastoin korkeamman pitoisuuden epotiloni B tarvitaan indusoimaan apoptoosia βIVb-tubuliinin pudotus soluja verrattuna joko ohjaus- tai βII-tubuliinin siRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4B). Yhdessä tämä data osoittaa, että lisääntynyt apoptoosin voisi olla yksi mekanismeista yliherkkyyttä epotiloni B seuraavat βIII-tubuliinia knockdown. Knockdovvn βIVb-tubuliinin, toisaalta, vähentynyt herkkyys epotiloni B: n indusoiman apoptoosin induktio NSCLC.

Avoimet pylväät: ohjata siRNA-transfektoiduissa soluissa; vaaleanharmaa massatangoissa: βII-tubuliinin knockdown soluissa; solid mustat palkit: βIII-tubuliinin knockdown soluissa; tummanharmaa massatangoissa: βIVb-tubuliinia pudotus soluissa. Huomautus epotiloni B: tä, kykeni indusoimaan apoptoosin βIII-tubuliinin knockodown solujen niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 12:32 (A), kun taas suuremmat pitoisuudet epotiloni B: tä indusoivat merkitsevästi pienempi apoptoosin βIVb-tubuliinin pudotus-solut (B). Data edustaa keskiarvoja ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05; **

P

0,01.

Keskustelu

Epotiloneita edustavat uutta luokkaa mikrotubulia stabilointiaineiden, jotka voivat tarjota toisen lähestymistavan voittamiseksi paklitakseli vastarintaa. Epotilonit ovat osoittaneet lupaavia kliinisestä tehosta faasin II tutkimuksessa pienisoluista keuhkosyöpää [20] ja on äskettäin hyväksytty käytettäväksi metastaattisen rintasyövän. Ei tiedetä, miten tämä luokka on vuorovaikutuksessa eri tubuliinia isotyyppeihin ja miten nämä vaikuttavat epotiloni B herkkyys. Täällä, osoitamme, että erityinen β-tubuliinin isotyyppien differentiaalisesti vaikuttaa NSCLC solun herkkyyttä epotilonien (taulukko 1).

Vaikka muuttunut ilmentyminen β-tubuliinin isotyyppien on liittynyt laajasti taksaanin vastus, vähän tietoa on saatavilla rooli β-tubuliinin isotyyppien herkkyydessä epotilonien. Tässä tutkimuksessa, βII-tubuliinin ei vaikuttanut herkkyys epotiloni B joko kaksi itsenäistä NSCLC solulinjoissa tutkittiin, H460 ja Calu-6-solut. Mielenkiintoista on, herkkyys mikrotubulusten stabilointiaine paklitakseli ei näytä olevan vaikutusta yli-ilmentyminen tai poistaminen βII-tubuliinin ilmaisun [16], [21]. Tämä tulos on erilainen tilanne kuin edellisessä tutkimuksessa tarkastellaan

vinka

alkaloideja, jossa suppressio βII-tubuliinin lisää herkkyyttä näille aineille [16].

Prekliiniset ja kliiniset tutkimukset ovat aiemmin osoittaneet, että lääkeaineen vastustuskykyä TBAs liittyy usein βIII-tubuliinin säätelyyn ylöspäin (katsaus esitetty [10], [22]). On spekuloitu ja korrelatiivisten näyttöä siitä, että sytotoksiset vaikutukset epotilonien ovat riippumattomia βIII-tubuliinin ilmaus, koska niiden toiminta βIII-tubuliinin yliekspressoivia soluja

in vitro

ja ihmisen ksenograftimalleissa [9], [12] . Kuitenkin lopullista näyttöä ei ole osoitettu, että epotiloni toiminta on todella riippumaton βIII-tubuliinin ilme. Käyttämällä RNAi tekniikka, osoitamme, että knockdovvn βIII-tubuliinin johtaa merkittävään kasvuun herkkyydessä epotiloni B. sopimus, vakaa yliekspressio βIII-tubuliinin HeLa-soluissa havaittiin resistenssiä erilaisia ​​TBAs lukien epotiloni B [17 ]. Yksi kuvattiin epotiloni kestävä munasarjasyövän solulinjoissa vähentynyt βIII-tubuliinin ilmaisun [12]. Lääkeresistenssin on monitekijäinen ja eri solulinjaan malleja voisivat selittää erot. Tärkeää on, muita muutoksia β-tubuliinia isotyypit ja βI-tubuliinin pistemutaatioiden havaittiin myös epotiloni B-resistenttejä solulinjoja [12], mikä viittaa siihen, että nämä tekijät ovat saattaneet myös osaltaan vastustuskykyisiä fenotyypin. Olemme aiemmin kuvattu epotiloni B: analoginen resistenttejä leukemiasoluja näyttää useita mikrotubulusten muutoksia mukaan lukien lisääntynyt ilmentyminen βIII-tubuliinin ilmaisun ja βI-tubuliinin mutaatioita [13]. Tähän mennessä osuudet hankitun epotiloni B resistenssin mekanismeja ei ole hyvin korreloi luontainen herkkyys epotilonien. On korostettava, että kaksi riippumatonta NSCLC soluja käytetään nykyisessä tutkimuksessa on ei tehty ennen lääkkeen valintaan eikä ilmaista P-glykoproteiinia (tuloksia ei ole esitetty), ja siksi se tarjoaa mahdollisuuden arvioimiseksi herkkyyttä epotiloni B siirrettävä kunkin β tubuliinin isotyyppejä tutkittiin.

Mielenkiintoista, kun taas kaatamalla βIII-tubuliinin hypersensitizes solujen epotiloni B, knockdovvn βIVb-tubuliinin vähentynyt herkkyys NSCLC solujen epotiloni B. Äskettäin Cabral ja työtoverit ovat raportoitu, että solut, jotka yli-ilmentävät βIVb-tubuliinin esillä pieni mutta merkittävä lisäys herkkyydessä epotiloni A: [23]. Yhdessä kanssa Tutkimuksessamme βIVb-tubuliinin ilmentyminen voi olla suotuisa terapeuttinen indikaattori epotiloni B -hoidon. Olemme aiemmin osoittaneet, että pudotus on βII- ja βIVb-tubuliinit in NSCLC-solut, joita käytetään tässä tutkimuksessa ei merkittävästi vaikuta paklitakselin herkkyys, mutta ei merkittävästi lisää herkkyyttä vinka-alkaloidit, [16]. Näin ollen huolimatta paklitakseli ja epotiloni B jakamiseen päällekkäin sitoutumiskohdat β-tubuliinia, βIVb-tubuliinin ekspressiotasot esiin erillisiä vaikutuksia herkkyyttä paklitakselia ja epotiloni B. On yhä enemmän todisteita siitä, että sitoutuminen epotilonien ja paklitakselin tubuliiniin välttämättä ole identtisiä [13], [24]. Ilmeisesti jossain vaiheessa mutaatiot β-tubuliinia alayksikköä CONFER paklitakselin mutta ei epotiloni vastus soluviljelymalleissa [7], [25], mikä viittaa siihen, että epotilonien ja taksaaneja saattaa olla selvä vuorovaikutus β-tubuliinia isotyyppien. Rationalisointiohjelma erojen herkkyyden aiheuttama β-tubuliinia isotyyppiä ilmentyminen voi liittyä aminohappoon eroja isotyyppien. Beeta-tubuliinin isotyyppien βI, βII, βIVa ja βIVb, osuus on vähintään 95% identtisyys ja on rajallinen määrä ei-konservatiivisia aminohapposubstituutioita (kuvio S4) [26]. Sen sijaan βIII-tubuliinin eroaa koska se jakaa vain 92% identiteetti edellä β-tubuliinia isotyyppien. Sisällä paklitakseli /epotiloni sitova taskussa, βII ja βIVb isotyyppejä, Ser275 on ollut mukana välittäjänä paklitakselin diffuusion kautta nanohuokosiin [27] ja voi vetysidoksen kanssa Gln279 ja Lys216, vakauttaa M-silmukka (Fig. 5). Tämä puolestaan ​​voi parantaa vetysidoksia, jotka on havaittu Arg276, että laktonin ja Thr274 ketoniksi hapen C5 epotiloni A (ja oletettavasti epotiloni B). In βIII-tubuliinin, on Ser275Ala mutaatio, joka saattaa aiheuttaa epävakautta M-silmukka, ja tämä heikentää Arg226 ja Thr274 vetysidoksia ligandin, edistää sen pienentää herkkyyttä. Tämä ei selitä ero herkkyyttä havaittu βIII-tubuliinia ja βIVb, kun aminohapposekvenssit tunnistettu olevan tärkeä sisällä paklitakseli /epotiloni sitova tasku, tai BKT sitoutumiskohta ei ole eroa näiden kahden iso- tyyppeihin [24]. Nykyinen tutkimus ei voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että ero spesifisten β-tubuliinin isotyyppien vaikuttaa sitoutumisen epotilonien että mikrotubulusten seinään, tai stabilointi välisten yhteyksien dimeerien muodostumisessa protofilamenttien. Kuitenkin tuoreessa tutkimuksessa, jossa epotiloni A osoitti se sitoutuu yhtä hyvin sekä βI- ja βIII-tubuliinin [28]. Samanlainen tutkimus tutkimalla sitova epotilonin B ja erityiset β-tubuliinin isotyyppien olisi tärkeää määrittää, miten nämä isotyyppien vaikuttavat vuorovaikutukseen tämän lääkkeen kanssa tubuliinia.

epotiloni B on esitetty tikkuja (vaaleanharmaa hiiltä). Sitovan syvennyksen jäämiä 1TVK näkyvät tikkuja (tummanharmaa hiiltä). Polaarittomat vetyä on jätetty pois selvyyden vuoksi. Vetysidoksia näkyvät romuttuneet vihreitä viivoja. Ser275 voivat muodostaa 3 vetysidoksia Gln292 ja Lys216. Syntyneitä kuvia DS Modelling 3,0 (Accelrys®).

Antituumoriaktiviteettia epotilonien välittyy tukahduttaminen mikrotubulusdynamiikan, mitoosi pidätys on G

2-M solukierron vaiheessa seuraa apoptoosin. Puuttumaan mahdollisten mekanismeista ero vastaus epotiloni B seuraaviin knockdown tietyn β-tubuliinin isotyyppiä, selvitimme taipumusta solujen tehdään lääkkeen aiheuttamista solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Kanssa inkuboinnin jälkeen epotiloni B, βIII-tubuliinin Knockdown osoitti kasvua osa-G

1 populaatioiden (solukuolema) kun taas lasku G

2-M lohko verrattuna kontrolliin siRNA-transfektoiduissa soluissa. Knockdovvn βIII-tubuliinin voi vähentää merkittävästi laajuus mitoosi lohkon indusoi inkuboimalla joko paklitakselin tai vinkristiini [15], kun taas tason nostaminen solukuoleman. Vaikutus epotiloni B herkkyyttä ei voida yksinkertaisesti selittää muutoksen mikrotubulusdynamiikan, kuten olemme viime aikoina osoittaneet, että mikrotubulusdynamiikan eivät muutu H460 soluissa βIII-tubuliinin Knockdown [29]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että pudotus on βIII-tubuliinin voi parantaa TBA-indusoitua apoptoottista solukuolemaa erillisellä reitillä, joka on riippumaton mitoottisten pidätys. Toinen tutkimus on osoittanut, että anti-kasvain vaikutuksia paklitakselin, korreloi paklitakselin aiheuttama apoptoosin mutta ei mitoosi pidätys [30]. Epotilonien voi olla samanlainen vaikutusmekanismi. Mielenkiintoista, βIVb-tubuliinin knockdown soluilla oli väheneminen solujen estetty G

2-M (epotiloni B 20 nM) verrattuna valvoa ja βII-tubuliinin knockdovvn soluja, vaikkakin korkeammalla tasolla kuin βIII- tubuliinia pudotus soluja. Toisin kuin βIII-tubuliinin knockdovvn soluja, βIVb-tubuliinin Knockdown solut käyvät läpi lääkkeen aiheuttama solukuolema samalla tasolla kuin ohjaus- ja βII-tubuliinin knockdown soluissa. Edelleen, sekä kaspaasi 3/7 aktiivisuus ja anneksiini V-värjäys osoitti, että βIII-tubuliinin pudotus soluja oli merkittävä nousu epotiloni B: n indusoiman apoptoosin induktion kaikilla testatuilla pitoisuuksilla. Sen sijaan knockdovvn βIVb-tubuliinin suojattu soluja vastaan ​​epotiloni B ilmi alentuneena apoptoosin induktioon. Näin ollen apoptoosin voi olla yksi mekanismeista lisääntynyt tai vähentynyt herkkyys havaittu näiden erityisten β-tubuliinia isotyyppien vastauksena epotiloni B.

molekyylitason yhteydestä β-tubuliinia ja epotiloni B: n indusoiman apoptoosin vielä on selvitettävä. On osoitettu äskettäin, että epotiloni B: n indusoiman apoptoosin ihmisen neuroblastoomasoluja lisäämällä reaktiivisten hapen lajien mitokondrioita ja sen jälkeen relocalization on proapoptoottiset proteiinin Bim mitokondrioissa osastoon [31]. Tulevaisuuden tutkimukset määritetään, ROS sukupolvi ja mitokondrioissa tai ilmaisun eri pro- ja antiapoptoottisten proteiinit ovat vastuussa kyky βIII-tubuliinia tai βIVb-tubuliinin differentiaalisesti vaikuttaa epotiloni B aiheuttama apoptoottisia signaaleja, ja ovatko nämä signaalit tapahtua itsenäisen mitoosin pidätys .

merkitys ero β-tubuliinin isotyyppien herkkyydessä epotiloni B vaatii vielä validointi kliinisessä arvioida sen soveltuvuutta ennustettaessa tehoa epotiloni B: Se on myös erittäin kiinnostunut onko lauseke of βIVb-tubuliinin korreloi kliinisen vasteen syövissä käsitelty epotilonin, sillä tulosten perusteella tässä tutkimuksessa, kasvaimet korkean βIVb-tubuliinin tasoja voidaan olettaa olevan herkempiä tälle aineelle.

yhdessä nämä tulokset osoittavat, että β-tubuliinin isotyyppi koostumus solun vaikuttaa herkkyyttä epotiloni B. kliiniset tutkimukset ovat perusteltuja arvioida terapeuttista arvoa ero ilmentymisen β-tubuliinin isotyypit NSCLC ja niiden roolia hoitovastetta epotilonien.

tukeminen Information

Kuva S1.

siRNA kohdistaminen βII, βIII tai βIVb-tubuliinin nimenomaan vaimentaa niiden ilmentyminen H460 ja Calu-6 NSCLC soluissa. Tyypillinen Western blot, joka esittää siRNA kohdistaminen βII (A), βIII (B), tai βIVb-tubuliinin (C) inhiboi sen proteiinin ilmentymistä H460 ja Calu-6 NSCLC-soluja verrattuna soluihin, joita on käsitelty ohjaus siRNA tai Mock (lipofektamiini 2000 vain) . Ei merkittäviä muutoksia ilmaisua muiden β-tubuliinin isotyyppejä havaittu. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

) ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. Edustavia geelejä.