Krooninen sairaus

tiivistelmä

Käänteinen transkriptio – kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on standardi tekniikka useimmissa laboratorioissa. Valinta viite geenien on välttämätöntä datan normalisoinnin ja sopivien viite geenien edelleen kriittinen. Tavoitteena oli 1) läpi kirjallisuutta, koska täytäntöönpanon MIQE suuntaviivojen tunnistamiseksi aste hyväksyntää; 2) vertailla eri algoritmien niiden ilmaisun vakautta; 3) määritetään joukko sopivan ja luotettavimpia viite geenejä erilaisten ihmisen syöpäsolujen linjat. PubMed tietokanta tarkastelu tehtiin ja julkaisut vuodesta 2009 valittiin. Kaksitoista otaksuttu viite geenit profiloitu normaalissa ja eri syöpäsolulinjoissa (n = 25) käyttäen 2-vaihe RT-qPCR. Tutkitut viite geenejä paremmuusjärjestykseen ilmaisun vakautta viidellä algoritmeja (geNorm, Normfinder, BestKeeper, vertaileva ACt, ja RefFinder). Meidän tarkastelu paljasti 37 julkaisuja, joissa kaksi kolmasosaa potilaan näytettä ja yksi kolmasosa solulinjoissa. qPCR tehokkuutta annettiin 68,4% kaikista julkaisuista, mutta vain 28,9% kaikista tutkimuksista edellyttäen RNA /cDNA määrä ja standardi käyrät. GeNorm ja Normfinder algoritmeja käytettiin 60,5% yhdistelmänä. Meidän valinta 25 syöpäsolulinjoja, olemme määritelleet

HSPCB

,

RRN18S

, ja

RPS13

vakain ilmaistaan ​​viittaamalla geenejä. Alaryhmässä munasarjasyövän solulinjoissa, viittaus geenit olivat

PPIA

,

RPS13

ja

SDHA

, mikä osoittaa selvästi, että on välttämätöntä valita geenien riippuen tutkimuksen painopiste. Lisäksi kohortin vähintään kolme sopivaa viittaus geenejä luotava etukäteen kokeiden suuntaviivojen mukaisesti. Perustamiseksi joukko viite geenien geenien normalisoinnin suosittelemme käyttöä mieluiten kolme viite geenit valitaan vähintään kolme vakautta algoritmeja. Valitettava puute vaatimustenmukaisuustodisteita MIQE ohjeiden heijastaa että niitä on edelleen perustettu tutkimusyhteisöä.

Citation: Jacob F, Gürtlerin R, Naim S, Nixdorf S, Fedier A, Hacker NF, et al . (2013) huolellinen valinta Reference Genes tarvitaan luotettava suorituskyky RT-qPCR Human Normal ja Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10,1371 /journal.pone.0059180

Editor: Sui Huang, Järjestelmä- Biology, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 marraskuu 2012; Hyväksytty: 12 helmikuu 2013; Julkaistu: 15 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Jacob et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Swiss National Foundation (PBZHP3-133289 ja -138752 sen FJ, 320030-120543 VHS.); Cancer Institute of New South Wales (09 /CRF /2-02 VHS); Royal Australian ja Uuden-Seelannin College of Synnytyslääkärit ja Gynekologit (VHS); William Maxwell Trust (VHS) ja Royal Hospital for Women Foundation (VHS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Reverse Transcription (RT) – kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) on tullut monipuolinen tekniikka tutkia ilmentyminen muuttuu yhden tai useamman mielenkiinnon kohteena olevia geenejä eri patologisten tilojen. Koska sen spesifisyys, herkkyys, yksinkertaisuus, kustannusten ja suuren läpimenon, RT-qPCR tarjoaa laajan valikoiman etuja tavanomaisilla menetelmillä, kuten Northern blot ja semikvantitatiivinen PCR. Siksi on tullut kaikkein syntymässä työkalu absoluuttisen ja suhteellisen kvantifioinnin mRNA transkription tasolla [1]. RT-qPCR on vankka määritys, joka käyttää vakiintunutta kemiaa ja data-analyysi, ja näin ollen parempi tekniikoita, kuten Southern blotting tai DNA-sekvensointi [2]. Huolimatta laajaa hyväksyntää, on epäjohdonmukaisuuksia käytön kokonais-RNA uuttamismenetelmiä RNA määrä reaktiota kohti [3], RNA eheys arvioinnit [4], qPCR Master sekoitukset ja eri valmistajien käänteistranskriptioreagenssien sarjat. Lisäksi käytetään erilaisia ​​qPCR havaitsemismenetelmät kuten väriaine- tai koetin-pohjaisten järjestelmien laajentaa kirjo mahdollisia sovelluksia. Jotta päästäisiin eroon mahdollisia vaikeuksia ja päästävä yksimielisyyteen suorituskyvyn ja analysointi määrällisiä PCR kokeissa MIQE (Minimi Tietoa julkaiseminen Quantitative Real-Time PCR Kokeet) ohjeet otettiin käyttöön vuonna 2009, parantaa kokeellinen suunnittelu [5]. Lisäksi näitä ohjeita sovellettaessa toimittaa parempia ja toistettavia tuloksia raportoimalla parametreja kuten RNA eheys, reaktiotilavuudessa, cDNA /RNA-pitoisuus, tai kalibrointikäyriä [6].

Kohdegeenin normalisointi saavutetaan yleensä käyttämällä viittaus geenien korvaamiseksi sekä yksilöiden välinen kineettisen RT-qPCR [7]. Useat matemaattisia lähestymistapoja on julkaistu, jotka tarjoavat sopivia viittaus geenien alin vaihtelua ja korkean vakautta koko biologisia näytteitä. Neljä yleisimmin käytetty, ovat seuraavat: (1) NormFinder algoritmi [8], joka on tilastollisen mallin, joka arvioi yleinen vaihtelu geenin ilmentymisen kunkin ehdokkaan viite-geenin ja tuottaa vakautta arvo. Tämä arvo liittyy systemaattinen virhe kunkin ehdokkaan geenin. (2) GeNorm [9] laskee geenin vakauden mitta kunkin ehdokkaan geeniä. Viittaus geeni, jolla on pienin vakauden (M) poistetaan tarkempaa analysointia, ja M-arvot toistuvasti laskea vasta vakain viittaus geeni on jäljellä. (3) BestKeeper, Microsoft

® Excel-pohjainen työkalu, käyttää pareittaiset korrelaatiot [10]; ja (4) vertailevan delta Ct (perustuen nimikkeistön ja MIQE ohjeet: kvantifiointiin sykli (Cq) parempana kuin kynnys (Ct), molemmat kuvaavat murto PCR-sykliä kvantifiointiin käytetään) menetelmä riveissä vakaus kandidaattigeenien mukaan toistettavuus geeniekspression eroja [11]. Mikään käyttöön algoritmien näyttää olevan optimaalinen ja tutkijan on aina valita, mitä viittaus geeni käyttää ja miten tunnistaa. Tämä voi vaikuttaa myös tulkintaan RT-qPCR tuloksia.

Lukuisat otaksuttu viittaus geenit on raportoitu erilaisia ​​ihmisen kudoksia, ihmisen solulinjoja, ja soluviljelmissä erilaisissa koeolosuhteissa kuten lääkehoitojen tai ympäristötekijöihin. Ei kuitenkaan viittaus geenit soveltuvat analysointiin ihmisen syövän solulinjoista peräisin gynekologisten syöpien ja paksusuolen syövät ole vielä kuvattu.

ensisijaisena tavoitteena oli selvittää vakain viittaus geenit tutkimukseen soveltuvia normaalien ja syöpäsolujen linjat munasarjojen tai paksusuolen alkuperää profiloidaan sarja 12 otaksuttu viite geenejä ja ensimmäistä kertaa sovellettaessa viisi vakautta algoritmeja arvioida vaikutuksen bioinformatical tietojen analysointi. Olimme myös kiinnostuneita näkemään, miten eri valmistajien käänteiskopioijaentsyymin sarjat vaikuttavat vaihtelua viite-geenin ilmentymisen. Lisäksi on tarkasteltava nykyisen kirjallisuuden suoritettiin, jotta voidaan arvioida noudattaminen MIQE suuntaviivojen suorituskykyä RT-qPCR ilmoitetaan niiden käyttöönotosta alkaen.

Materiaalit ja menetelmät

Literature Review

PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) tietokannan tarkastelu käytöstä otaksuttu viitataan geenien RT-qPCR tehtiin. Julkaisujen tammi 2009 huhtikuu 2012 otettiin huomioon ja tunnistettiin käyttämällä avainsanoja: ”viittaus geenit” tai ”taloudenpito geenejä” ja ”RT-qPCR” TAI ”kvantitatiivinen PCR”. Viiteluetteloihin valituista julkaisuista myös harkita lisättäväksi mahdollisesti asiaan artikkeleita. Julkaisut ole kirjoitettu Englanti ja ne raportointi RT-qPCR suoritettiin alle viiden viite geenejä ulkopuolelle. Vain julkaisuja ihmisen näytteitä otettiin mukaan. Julkaisut arvioitiin mukaan julkaisuvuoden, tyyppi ja määrä näytteitä, lukumäärällä geenejä, menetelmiä käytetään määrittämään RNA eheys, määrä kokonais-RNA alunperin käytetään RT ja /tai qPCR määrä toistolla qPCR, yksityiskohtia sarjalaimennoksia kalibrointikäyrän ja tehokkuuden hyödyntää qPCR kemiaa (SYBRgreen tai TaqMan), ja matemaattinen lähestymistavat (computing algoritmit) viitteellisiä geeniekspressiota vakautta mittaus.

Cell Culture

tässä tutkimuksessa 2 normaalia ja 23 syöpäsolulinjat eri alkuperää käytettiin. Solulinjat olivat peräisin ATCC (www.atcc.org) tai olivat lahja Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia. Kirjallinen eettinen lupa on myönnetty (HREC 08/09/17 /3,02, VHS.). Yksityiskohtainen luettelo solulinjojen ja kulttuurin olosuhteet ovat täydentäviä tietoja (taulukko S1). Kaikki soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Viljelmät mykoplasmaa, määritettynä laadulliset PCR käyttämällä VenorGeM

® Mycoplasma Detection Kit (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Australia).

RNA ja Integrity

ekspression tutkimiseksi 12 oletetun viittaus geenejä kussakin näistä solulinjoista, 1 x 10

5-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Tanska) konfluenssiin 70-90%. Sitten solut pestiin kahdesti steriilillä suolaliuoksella ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen NucleoSpin RNAII kit (MACHEREY Nagel, Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia). Tämän solut hajotettiin lisäämällä lyysipuskuria suoraan soluihin. RNA lukien DNaasikäsittely suoritettiin mukaan valmistajan protokollaa. RNA eluoitui 60 ul RNaasi vapaata vettä ja RNA-pitoisuus mitattiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Tanska). Eheyden RNA-näytteet varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla 1,0% agaroosigeelillä, joka sisälsi GelRed ™ (Biotium, Inc., Hayward, CA, USA). RNA-näytteet ilman merkkejä hajoamisesta olivat edelleen arvioitiin RNA 6000 Nano sirun avulla Agilent 2100 elektroforeesi Bioanalyzer (Sen Ramaciotti Centre for Gene Functional Analysis, University of New South Wales, Sydney, NSW, Australia).

Käänteinen mRNA: n transkription

Kokonais-RNA (1 ug) käänteiskopioitu käyttäen iScript Käänteinen transkriptio Supermix RT-qPCR (# 170-8840, MMLV-pohjainen RTase, RNaseH

+, Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia) kokonaistilavuudessa 20 ui mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Supermixiä sisälsi sekä oligo dT ja satunnaisia ​​alukkeita saada maksimimäärä cDNA selostukset. Reaktioseos inkuboitiin 25 ° C: ssa 5 min esikäsittely, sitten 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan käänteistranskriptioon, ja lopuksi 85 ° C: ssa 5 min käänteistranskriptaasin inaktivoimiseksi. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) säilytettiin -20 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

Lisäksi BioRad, olemme mukana kaksi muuta valmistaa (Takara ja Bioline) tutkia sen vaikutusta suorituskykyyn käänteistranskriptioreagenssien. Me käänteiskopioitua kokonais-RNA (1 ug) kuudella käänteinen transcriptions (Takara ja Bioline) seuraavasti: Reaktioseos valmistettiin käyttämällä BluePrint ™ 1

st juosteen cDNA-synteesi Kit (# 6115A, MMLV-pohjainen RTase, RNaseH

+, Takara Bio Inc., Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia) kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi satunnaisia ​​6 jia, oligo-dT tai molemmat yhtä molaarisuus. Lopullinen tilavuus 10 ui, joka sisälsi aluketta, dNTP seoksen ja kokonais-RNA: ta inkuboitiin 65 ° C: ssa 5 minuuttia ja jäähdytetään välittömästi. Sitten 5 × BluePrint

TM 1

st juosteen puskuria, yhdistelmä-RNaasi-inhibiittoria ja BluePrint

TM RTase lisättiin lopputilavuuteen 20 ui. Lopullinen käänteistranskriptio inkuboitiin 30 ° C: ssa 10 min, sitten 42 ° C: ssa 60 min, jota seurasi inaktivointi 95 ° C: ssa 5 min. Käänteinen transkriptio käyttäen Bioline n Tetro cDNA-synteesi kit (# BIO-65042, MMLV-pohjainen RTase, RNaseH

+, Bioline (Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australia) suoritettiin seuraavasti: a lopullisessa tilavuudessa 10 ui, joka sisälsi aluketta ( random 6 meerejä tai oligo-dT tai molemmat yhtä molaarisuus), dNTP seos ja RNA: ta inkuboitiin 70 ° C: ssa 5 min, minkä jälkeen lisättiin 5 x RT-puskuria ja Ribosafe RNaasi-inhibiittoria 20 ui. Lopullinen Reaktioseosta inkuboitiin 45 ° C: ssa 30 minuuttia ja lopetettiin 85 ° C: ssa 5 minuuttia.

kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) B

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin 12 otaksuttu viite geenit . Niiden ominaisuudet kuten nimi, tallennusnumero, kromosomi lokalisointi, tuotteen pituus ja vastaavat eteenpäin ja käänteisalukkeet on koottu taulukkoon 1. viittaus geenit ja alukesekvensseihin (Sigma-Aldrich Pty. Ltd, Castle Hill, Australia) valittiin perustuu aiempiin tietokantoihin ja julkaisujen raportointi vakaa geeniekspressioprofiilien [8], [9], [12] – [15]. Alukesekvensseissä olivat myös ristiintarkastettiin avulla web-pohjainen työkalu

in-silico

PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) at ihmisen genomin selaimesta UCSC [16] vastaan -geenin ja genomin tavoitteet.

ilmentyminen vakain geenien määritettiin ihmisen solulinjoissa normaalin pinnan epiteelin munasarja (n = 2) ja syöpä- alkuperää, sisältäen munasarjojen (n = 9 ), paksusuoli (n = 9), rinta (n = 1), kohdunkaulan (n = 1), kohtusyöpä (n = 1), ja leukemia (n = 2).

qPCR suoritettiin Stratagene Mx3005

® (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Australia) 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia). Optimaalinen reaktio- olosuhteissa saatiin 1 x SsoFast ™ EvaGreen

® Supermixiä alhainen ROX ohjearvon väriaine (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia), 400 nM erityiset sensealukkeen 400 nM erityisiä antisensealuketta, RNaasi /DNaasi-vapaata vettä, ja cDNA-templaattia (aikaisemmin eristetty ja käänteistranskriptoidaan RNA 1 ng /kuoppa) asti lopulliseen tilavuuteen 10 ui. Monistukset suoritettiin alkaen 30 sekuntia entsyymin aktivointi 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 5 sekuntia, ja sen jälkeen hehkutus /pidennys 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Lopussa kunkin ajaa sulamiskäyrä-analyysi suoritettiin 65-95 ° C: ssa. Kaikki näytteet ja negatiiviset kontrollit monistettiin kolmena kappaleena, ja saatu keskiarvo käytettiin sitten lisäanalyysiä varten. Cycle määritysrajan (Cq) arvot 35 jätettiin edelleen matemaattisia laskelmia. ”Ei mallia näyte” (RNA käänteistranskriptio ilman käänteistranskriptaasia) ja näyte ilman RNA: ta tai cDNA olivat negatiivisia kontrolleja.

PCR Tehokkuus (E) B

vertailukelpoisuus varmistettiin tutkimalla qPCR tehokkuus kaikissa viittaus geenit satunnaisesti valitun solulinjan RNA-uutetta. Vertaamaan RNA-transkripti tasot 12 otaksuttu viittaus geenejä, Cq arvot aiheutuvat suoraan tietylle kynnys. Cq määritellään jaksojen määrä tarvitaan fluoresenssisignaali saavuttaa tietyn kynnyksen havaitsemiseksi ja näin ollen korreloi käänteisesti tuloon määrä kokonais-RNA: [17]. Vertailla eri qPCR ajoja suoritettiin eri päivinä, levyt ja kulkee säädettiin kynnyksen Cq 0,1. Käänteiskopioitua cDNA laimennettiin 100 ng 1 pg tulon RNA ennen RT 10-kertaisia ​​kullekin viite geeni kolmena kappaleena. Saatiin fluoresenssi signaalit selvä RNA-pitoisuus piirrettiin ja lineaarinen regressio suoritettiin löydetään parhaat lineaarista suhdetta edustava standardikäyrä. Kaltevuus lineaarista yhtälöä käytettiin laskettaessa tehokkuutta yhtälön E = (10

[- 1 /kulmakerroin] -1) x 100.

Data Analysis

Raw data kuten sulaa ja monistuskäyriä saatu MxPro- Mx3000P v4.10 (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Australia) purettiin Microsoft

® Excel-tiedostoja (.xls), tallennetaan Microsoft

® editori tiedostoja (.txt), ja sitten ladataan edelleen tietojen analysointi osaksi avoimen lähdekoodin tilastollinen ohjelmointikieli R (https://CRAN.R-project.org/, versio 2.13.2). Tarkempia mallintaminen ja analysointi RT-qPCR data, R paketti ”qPCR” käytettiin (https://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). Pearsonin korrelaatio (r) laskettiin määrittää yhdistyksen välillä sovelletaan algoritmeja.

Jos haluat vertailla eri algoritmeja valinnassa vakain viittaus geenejä, haimme RefFinder (https://www.leonxie.com/referencegene.php), web-pohjainen monipuolinen työkalu. Se käyttää tällä hetkellä saatavilla algoritmit geNorm [9], Normfinder [8], BestKeeper [10] ja vertailevasta ACt menetelmiä [11], ja antaa asianmukaista painoa yksilön geenin ja laskee geometrinen keskiarvo yleistä järjestystä kaikki viittaukset geenejä.

tulokset

täyttääkö MIQE suuntaviivat perustaminen Reference Genes

Koska niiden käyttöönotto vuonna 2009 [5], tiedeyhteisö on jatkuvasti hyväksyä MIQE suuntaviivat julkaisuja ja huomioon tieteellinen käsikirjoituksia käyttäen RT-qPCR. Tutkia hyväksymisen MIQE tarkemmin, teimme kirjallisuuskatsaus julkaisuja siinä esitetään oletettuja viite geenien (n≥5) ihmisen näytteet RT-qPCR. Havaitsimme 37 julkaisuja tammikuusta 2009 huhtikuuhun 2012 joiden lukumäärä lisääntyi jatkuvasti vuosittain (kuvio 1A). Useimmat näistä tutkimuksista tutkittu potilaan näytettä (63,2%), jonka jälkeen ensiö- ja kuolemattomia solulinjoja (31,6%). Vähäinen osa (5,3%) tutki kudosnäytteitä ja solulinjoissa yhdessä. RNA eheys oli useimmissa tapauksissa (68,4%) tutkittiin kaksi erillistä menetelmiä kuten spektrofotometrialla (90,9%) ja RIN eheys numero (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). Määrä totaali-RNA: käänteistranskriptioon tai cDNA qPCR reaktioita ilmoitettiin 78,9% kaikista julkaisuista. SYBR

® Green (57,9%), fluoresoivaa dsDNA sitova väriaine, oli useammin käytetty kuin TaqMan (26,3%), fluoresoivasti leimattua kohde-spesifinen koetin. QPCR tehokkuus kaikki tutkitut viite geenit toimitettiin 68,4% kaikista julkaisuista, mutta vain 28,9% edellyttäen yksityiskohtia kuten cDNA määrä ja laimennosalueen Standardikäyrien. Lopuksi tutkimme mitkä tunnettujen algoritmien (geNorm, Normfinder, BestKeeper, vertaileva ACt) levitettiin tunnistamaan kaikkein pysyvästi ilmensivät viite geenejä. GeNorm ja Normfinder algoritmeja yhdessä käytettiin useimmissa tutkimuksissa seurasi geNorm yksin ja geNorm, Normfinder, ja BestKeeper yhdessä (kuvio 1 B). Ottaen huomioon, että vain julkaisut suorittamalla RT-qPCR tunnistamiseksi pysyvästi ilmensivät viittaus geenit olivat mukana, nämä tiedot osoittavat, että olennaiset tiedot, kuten RNA eheys, määrä kokonais-RNA reaktiossa, qPCR tehokkuus, ja cDNA määrä puuttuu merkittävän osan näistä julkaisuista.

(A). Linja kaavio julkaisuista (n = 37) tutkia kaikkein pysyvästi ilmensivät viite geenejä. (B) Prosenttia algoritmien avulla tunnistetaan luotettavasti viittaus geenien joukossa kaikki julkaisut.

Laatu ja eheys RNA Näytteitä

Yhteensä RNA: sta meidän joukko solulinjojen arvioitiin laadun ja eheys. Yksityiskohtainen luettelo solulinjojen ja vastaavat tiedot RNA määrää, laatua ja eheyttä (absorbanssi suhteet 260/230 nm ja 260/280 nm, RNA eheys numero RIN, ja 28 s /18 s suhde) esitetään täydentäviä tietoja ( Taulukko S2). Huomasimme, että absorbanssi suhteet, keskimäärin (keskiarvo ± keskihajonta) kaikkien 25 solulinjat olivat 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) ja 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Olemme lisäksi havainneet, että RIN vaihteli 8,4-10, mikä osoittaa riittävää kokonais-RNA laatua. RIN algoritmi siirtäessä RIN numeron pisteet 1 ja 10, jolloin arvoa 10 edustaa täysin ehjä RNA ja arvo 1 merkitsee hajonnutta RNA: ta. Lisäksi laatu kokonais-RNA vahvistettiin myös suhde 28 s /18 s ribosomi-RNA, joka vaihteli 1,7-2,7.

mahdollinen läsnäolo kontaminoivan DNA (kuva S1) kussakin qPCR kokeessa oli tutki monistamalla koealojen, sulamiskäyrien, ja 1% agaroosigeelielektroforeesilla. Käänteiskopiointireaktioita negatiivinen kontrolli reaktiot on vahvistettu, ettei kontaminoivan DNA. Tästä huolimatta oli PCR-monistukset kieltävästi valvonnasta

PPIA

,

GUSB

,

RPII

ja

TBP

yhdessä tai kahdessa rinnakkaisena Cq arvojen 35. Nämä arvot olivat merkittävästi korkeammat kuin näytteiden sisältävää templaattia 1 ng cDNA: ta, mikä osoittaa, vähäinen vahvistus kontaminoivien DNA: ta. Ei PCR monistuksia negatiivisia kontrolleja havaittiin muiden viite geenejä. Nämä tulokset osoittavat, että meidän koko RNA-näytteet olivat riittävän laadukkaita ja pääosin vapaa kontaminoivista DNA.

qPCR Tehokkuus, Intra- ja Inter-määritys vaihtelevuus

RT-qPCR tehokkuutta kunkin alukesarjan määritettiin sarjalaimennoksia cDNA-templaattia ihmisen munasarjojen pinnan epiteeli solulinja HOSE17-1 (taulukko 2). Käytimme RNA satunnaisesti valitusta solulinjan sijasta plasmidit koska RNA voi aiheuttaa mahdollisia ei-merkityksetön vaihtelu käänteistranskriptio [18], [19]. Saadun, keskimääräinen Cq-arvot kaikille laimennoksia logaritminen laimennos sarja cDNA, standardikäyrän syntyi. Kulmakerroin, leikkauspiste, qPCR monistustehokkuudessa ja korrelaatiokertoimet (R

2) kutakin aluketta parin laskettiin standardikäyrältä (kuva S2). Alkuperäinen laimennusvälillä 100 ng 1 pg tulon RNA ennen RT sopeutettiin johtuen ei-havaittavissa amplikonien at alarajan tai kyllästymisen qPCR reaktioita korkeammilla cDNA määrinä, molemmat vaikuttavat tehokkuuteen

RRN18S

,

RPII

ja

B4GALT6

(taulukko 2).

GUSB

osoittivat optimaalisen lineaarisen laimennusvälillä 10 s 10 ng. PCR tehokkuutta tutkittiin viittaus geenien vaihteli 87,1%: sta 106,6%, rinne -3,680–3,157, siepata 11,10-27,30 ja R

2 ,994-,999.

Jotta varmistetaan vakaa RNA-transkripti tasolla, vaikutus teknisten vaihtelua, sisäinen ja määritysten välinen vaihtelu tutkittiin käyttämällä satunnaisesti valittu

HSPCB

RNA SKOV3- soluista. Inter-variaatio määritettiin suorittamalla RT-qPCR kanssa identtistä viidestä eri päivinä, paljastaen variaatiokerroin (CV) 1,74%. Sisäinen variaatio oli vähemmän kuin CV 0,3% käyttämällä noin 0,5 ng ja 2,0% käyttäen 5 ug RNA: ta. Nämä tiedot osoittavat, että tekninen vaihtelu on hyväksyttävällä alueella, ja siksi pidetään vähäisenä.

käyttö Asianmukaiset käänteistranskriptaasia Setup

Tutkia onko alkuperä (valmistaja) on käänteistranskriptaasien vaikuttaa reaktion laatua, neljä viite geenit (

SDHA

,

HSPCB

,

GUSB

ja

TBP

) valittiin satunnaisesti ja qPCR suoritettiin sen jälkeen, kun käänteisen transkription. Määritellä yleistä suorituskykyä kaikkien neljän valittujen viittaus geenit, vaihtelut laskettiin Cq ja CV-arvot (n = 7). Vaihtelu on Cq vaihtelivat vähintään 1,14 (

TBP

) enintään 2,83 (

GUSB

) (kuvio 2A). Sisäiset variaatio kuluessa kolmena rinnakkaisena oli korkein

SDHA

(CV = 2,51%) ja pienin

GUSB

(CV = 0,04%) (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat, että alkuperä käänteistranskriptaasin ja eri pohjamaali asetelmia on vain marginaalinen vaikutus suorituskykyä näiden neljän viite geeneistä.

(A) Random 6 mer käytettiin 2 ja 5, oligo dT alukkeena 3 ja 6, ja molemmat yhdessä 1, 4 ja 7 (x-akseli); Cq on ordinaatta osoittaa eroja testattujen käänteiskopioijaentsyymin olosuhteissa. (B) vaihtelukerroin (CV). RT toimittajat merkitty roomalaisin numeroin: I) BioRad, II) Takara, ja III) Bioline. X-akselilla eri RT alukkeilla: oligo dT (oligo), random 6 mers (random), ja molemmat (molemmat).

Expression vakaus Candidate Reference Genes ihmissolulinjoissa

jotta voitaisiin tunnistaa vakain viittaus geenien poikki testattu normaali ja syöpäsolujen linjojen ilmaisu stabiilisuudesta viitteen geenien tutkittiin suorittamalla viisi algoritmeja (RefFinder, geNorm, BestKeeper, Normfinder, ja vertaileva ACt) ja sijoitusta geenit kukin algoritmin erikseen. Nämä riveissä olivat tiivisti, jolla on pienin sijoitus, joka edustaa kaikkein pysyvästi ilmensivät viite geeni ja korkein sijoitus, joka edustaa ainakin pysyvästi ilmensivät viite geenistä. Across kaikissa tutkituissa solulinjoissa (kuvio 3A) tunnistimme

HSPCB

,

RRN18S

ja

RPS13

kuin 3 eniten pysyvästi ilmensivät viite geenejä.

B4GALT6

oli vähiten stabiili viittaus geeni. Alaryhmässä koolonsyöpäsolulinjoissa

HSPCB

, YWHAZ, ja

RPS13

olivat 3 eniten ekspressoivat stabiilisti viite-geenien (kuvio 3B). Lisäksi osajoukon normaalin ja munasarjasyövän solulinjoissa, vastaavat geenit olivat

PPIA

,

RPS13

ja

SDHA

(kuvio 3C).

(A) Kaikki tutkittu solulinjat (n = 25), (B) koolonsyöpäsolulinjoissa (n = 9), ja (C) normaalia ja munasarjasyövän solulinjoissa (n = 11). Numerot korosta kolmen ensimmäisen vakain viittaus geenejä kussakin Koejärjestely.

Nämä tulokset osoittavat, että suurin osa pysyvästi ilmensivät viittaus geenien vaihtelevat eri solulinjan sarjaa, jossa on vain

RPS13

on läsnä kaikissa kolmessa solulinjassa sarjaa ensimmäisten 3 alkuun viite geenejä. Mielenkiintoista on, että useimmin käytetyt viite geeni

GAPDH

oli vähiten stabiilisti ilmaistu viittaus geeni meidän perustaa.

Tutkimme lisäksi korrelaatiota viiden soveltavaa algoritmeja, jotka tuottavat vakain geenit . Korrelaatio kaikki viisi Säilyvyyskokeiden oli kohtalainen tai suuri keskuudessa sovellettu algoritmeja. Korkein korrelaatiota ei havaittu Normfinder ja vertailevaa delta Ct menetelmä (r = 0,99) (kuvio 4), mikä osoittaa, että kaikki 12 viitaten geenit lähes identtisesti paremmuusjärjestykseen. Pienin korrelaatio (r = 0,71) oli välillä Delta Ct menetelmän ja RefFinder, mikä osoittaa korkea ristiriita sijoitusta.

Itseisarvo Pearsonin korrelaatio ja

p

-arvo on merkitty tähdellä (0 ***, 0,01 **). Pohjassa sirontakuvaajiin visualisoi bivariate korrelaatiota tutkitaan Säilyvyyskokeiden myös asennettu linjan.

Keskustelu

1) suoritetaan kirjallisuuskatsaus, täyttävätkö MIQE ohjeiden suorittaessaan RT-qPCR kokeissa tunnistamaan sarjaa viite geenejä, 2) arvioitu suorituskyvyn algoritmeja sijoitusta viittaus geenien niiden ilmaisun vakautta; ja 3) määritetty joukko sopivan ja luotettavimpia viite geenejä valikoimaan ihmisen syöpäsolujen linjat eri alkuperää.

kirjallisuuskatsaus osoitti, että noudatetaan MIQE suuntaviivojen oli vain osittainen. Olennaisten tietojen [5], kuten RNA eheys, määrä kokonais-RNA reaktiossa, cDNA määrä, laimennus vaihteluväli standardin käyriä, ja tehokkuus qPCR usein puuttuu julkaisuissa, joka ei ole noudatettu MIQE suuntaviivojen . Lähin mahdollinen ohjeita noudattaen suorittamista varten RT-qPCR sekä ilmoittamassa tiedot julkaisuissa jolla parannetaan kokeellisen tutkimuksen suunnittelu ja vakuuttaa toistettavuus ja luotettavuus tutkimuksen tuloksia. Muussa tapauksessa minimaalinen eroja havaittu kohdegeenin ilmentyminen voi olla mahdollinen vaihteluiden tuloksena viitaten geeniekspression.

Olemme osoittaneet, että käänteistranskriptaaseilla tarjoamat eri valmistaa johtavat vaihteluihin kvantifiointiin jaksoissa (Cq enintään 3). Siksi voi olla hyödyllistä tarkastella eri RT ja testata erilaisia ​​alukesarjoista, oligo dT tai satunnainen 6 meeriä tai molemmat yhdessä ennen yrityksen kokeiluja. Meidän havainnot ovat myös yhdenmukaiset aiempien tutkimusten kanssa, joissa transkriptio saannot vaihtelivat jopa 100-kertaisesti eri käänteistranskriptaasien on geeneihin riippuvaisesti [20], [21]. Löysimme kirjallisuudesta ja vahvisti tutkimuksessamme, että eri RT pohjustus strategiat ovat ratkaisevia määrällinen mittaaminen geenien ilmentymisen [21]. Lisäksi havaitsimme omissa kokeissa, ettei RT on ylivoimainen muihin RTs joten mitään johtopäätöstä voitaisiin tehdä valinta RT esikäsittely; eli ei voidaan tehdä päätös, johon aluke on parempi kuin muut.

tilastollisten algoritmien vakauden mittausten tarkasteltava kriittisesti, koska kaikki nämä algoritmit perustuvat siihen oletukseen, että mikään tutkituista viite geenit osoittavat systemaattista vaihtelua ilmaisun profiilin poikki näytteitä [22]. Lisäksi meidän kirjallisuuskatsaus osoitti, että useimmissa tutkimuksissa vain yksi tai kaksi algoritmeja on sovellettu. Tutkimuksemme paljastivat merkittävää vaihtelua korrelaatiota sovellettu algoritmeja. Lisäksi huolimatta suhteellisen korkea korrelaatio (r = 0,9) välillä geNorm ja Normfinder algoritmien soveltaminen näiden kahden algoritmin toimitetaan samanlaista sijoitusta vain 5 ulos tutkittujen 12 viite geenejä. Tämä aiheuttaa puute, joka voi johtaa vääriin valintaa viite geenejä, joilla voi olla kielteinen vaikutus laatuun ja tietojen luotettavuus. Siksi suosittelemme, että enemmän kuin kaksi algoritmeja olisi sovellettava valittaessa viitteen geenien.

Olemme hyödyntäneet aiemmin osoittaneet ja julkaistu alukepareja havaitsemiseksi transkriptipitoisuuksissa oletettujen viite geenien altaan normaali ja syöpä solulinjat. Yleensä lähes kaikki viittaukset geenit suoritetaan sopivalla tavalla ja voitaisiin käyttää tulevissa tutkimuksissa käyttää solulinjoja. Lisäksi perustuen tuloksia sisäisten ja määritysten välinen vaihtelu kaikki tutkitut viittaus geenejä voidaan käyttää lisätutkimuksiin. Kuitenkin, kaikkien testattuihin solulinjoihin olemme huomanneet, että

HSPCB

,

RRN18S

, ja

RPS13

ovat stabiilisti ilmentyvien geenien viittaa niiden soveltuvuuteen viitteenä geenien tulevien tutkimusten tämän kokeellisen perustettu. Tutkimukset paksusuolen ja normaali sekä munasarjasyövän solulinjoissa paljasti odotettavissa ristiriitaisuuksia keskuudessa valittu viite geenien ja olisi sen vuoksi huomioon tulevissa tutkimuksissa. Se osoittaa, että viittaus geenit on valittava huolellisesti kullekin kokeellista perustaa.