Krooninen sairaus

tiivistelmä

munasarjasyöpä, yksi tulehdukseen liittyvä syöpiä, on viides suurin syy syövän kuolemat naisten keskuudessa. Tulehdus kasvaimen mikroympäristössä liittyy vatsakalvon kasvain levittämiseen ja massiivinen askites, jotka edistävät korkea kuolleisuus munasarjasyöpään. Kasvain p53 usein poistettu tai mutatoitunut aggressiivinen ja korkea-asteen munasarjasyöpä, luultavasti pahentaa syövän etenemistä ja lisäämällä kuolleisuutta. Siksi tutkittiin vaikutusta p53 proinflammatoristen kemokiinien munasarjasyöpäsoluja. PCR-array kemokiinin verkon paljasti, että munasarjojen syöpäsolujen, joilla on alhainen tai mutatoidun p53: n ilmentyminen ilmaistaan ​​korkea proinflammatoristen kemokiinien, kuten CXCL1, 2, 3 ja 8. Ohimenevä transfektio p53 huomioon p53-null munasarjasyöpäsoluja vaimentua proinflammatoristen kemokiinien indusoiman tuumorinekroositekijä-α (TNF), joka on tulehdusta edistävä sytokiini, ilmentyy runsaana munasarjasyöpä. Lisäksi p53 palauttaminen tai vakiinnuttaminen esti TNF-induced NF-KB-promoottorin aktiivisuutta ja vähentää TNF-aktivoitu IKB. Palauttaminen p53 lisääntynyt ubikitinaa- of IKB, jotka johtuvat samanaikaisesti vähennetään proteasomiaktiivisuus seurasi vakautta lKB. Ubikinaa- PCR array palauttaminen p53 ei paljastanut mitään merkittäviä muutoksia ilme paitsi MDM2, mikä osoittaa, että tasapaino p53 ja MDM2 on tärkeämpää säätelyssä NF-KB signalointi sijaan suora vaikutus p53 ubikitiinipromoottori liittyviä geenejä tai IKB-kinaasit. Lisäksi nutlin-3, erityinen indusoija p53 vakauttaminen, esti proinflammatoristen kemokiinien vähentämällä TNF-aktivoitu IKB kautta p53 vakauttaminen. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että p53 estää proinflammatoristen kemokiinien munasarjasyöpäsoluja vähentämällä proteasomaalisten hajoamista lKB. Niinpä usein menetys tai mutaatio p53 voi edistää syövän etenemistä parantamalla tulehduksen kasvaimen mikroympäristössä.

Citation: Son DS, Kabir SM, Dong YL, Lee E, Adunyah SE (2012) estävä vaikutus kasvain vaimennin p53 Esitulehduksellisten Kemokiini ilmentäminen munasarjasyöpäsoluja vähentämällä proteasomaalisten hajoaminen lKB. PLoS ONE 7 (12): e51116. doi: 10,1371 /journal.pone.0051116

Editor: Ashok Kumar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 31 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Son et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health NIAID SC1AI089073 (DS), NIGMS SC1 089630 (EL), NCI U54CA163069-02 ja NIMHD U54MD007593-04 (SA) National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on viides johtava syy syöpäkuolemista naisten keskuudessa, koska se on yleensä oireeton ja usein diagnosoitu myöhään kunnes kasvaimet ovat levinneet kaukana munasarjat [1]. Vaikka tarkka etiologia on tuntematon, yhä näyttöä siitä, että munasarjasyöpä liittyy krooniseen tulehdukseen [2] – [3]. Munasarjasyöpä kudos ilmentää korkeita CXCL1; Samoin seerumin CXCL1 ovat korkeampia munasarjasyöpä potilailla kuin kontrolleilla [4] – [5]. Advanced (vähemmän eriytetty) munasarjasyöpä myös yli-ilmentävät CXCL8 in kysta nesteissä [6] ja kasvaimen soluihin [7]. Munasarjasyöpä vesivatsanestesupernatan- on myös todettu sisältävän korkeita CXCL8 [8]. Lisäksi paklitakseli-resistenttejä munasarjojen solulinjoissa ilmaista lisääntynyt CXCL8 verrattuna paklitakseli-herkkien solujen [9]. Tulehdusreaktio aiheuttaa pääasiassa proinflammatoristen kemokiinien, kuten CXCL1, 2 ja 8 kautta NF-KB: n signaloinnin munasarjan epiteelin syöpäsoluissa [10]. Myös proinflammatoristen kasvain mikroympäristön tiedetään edistävän syövän etenemisessä. Siksi yhdessä nämä tekijät todennäköisesti edistävät kliiniset piirteet munasarjasyöpä, jotka aiheuttavat korkeaa kuolleisuutta, kuten vatsakalvon kasvain levittämistä ja massiivinen askites.

Vaikka mekanismia, jolla upregulation proinflammatoristen kemokiinien munasarjasyövän on tuntematon; todennäköinen syy on NF-KB: n ovat seurausta kasvaimen p53. Geneettisiä muutoksia p53 kuten mutaation ja poisto havaitaan usein korkealaatuista pahanlaatuinen munasarjasyöpä [11]. Kertyneet todisteet osoittavat, että p53 tukahduttaa NF-KB signalointi kautta downregulation IKB kinaasin (IKK) [12] – [14] tai kilpailua varten transkription koaktivaattoreiden P300 /CREB-sitovan proteiinin (CBP) [15] – [17]. Kiinnostavaa kyllä, muut ovat havainneet, että p53 edistää NF-KB: n aktivaation [18] – [19]. Huolimatta kiistanalainen vaikutukset p53: NF-KB: n signalointia, mutaatioita tai deleetioita p53 voi pahentaa munasarjasyöpä eteneminen perustuu siihen, että hiirissä, joilta puuttuu p53 ovat alttiita syövän kehittymiseen [20]. Siksi hypoteesina, että toiminnallinen menetys p53 munasarjasyöpään voi lisätä proinflammatoristen kemokiinien by de-rajoittamalla NF-KB: n signalointi.

Tässä tutkimuksessa palautettu p53 munasarjasyöpäsoluja määrittää sen vaikutukset tulehdusta edistävien kemokiinin ilmentymistä vastauksena tulehdusärsykkeisiin. Lisäksi tutkimme, mekanismi, jolla tämä voi tapahtua mittaamalla hajoamista lKB, proteasomiaktiivisuuden, ja ilmaisun MDM2, negatiivinen säätelijä p53 ja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

rekombinantti ihmisen TNF ja ihmisen p53 DuoSet® IC ELISA kit saatiin R 25 syklin 35 sykliä. Tulokset osoittavat korkeita ilmentymisen kemokiinien seuraavista munasarjasyövän solulinjoissa: CCL20 ja 28, CXCL1, 2, 3 ja 8 OVCAR-3 solujen kanssa; CCL28 ja CXCL1 in SKOV-3-solut; CXCL1, 2 ja 8 CaOV-3-solut; ja CXCL2 in TOV-21G-solut (kuvio 1A). Mielenkiintoista A2780 solut eivät ilmaista tai ilmoittaneet alhainen lähes kaikki kemokiinien verrattuna muihin munasarjasyöpäsoluja. Edelleen CCR1 ja CXCR4 olivat erittäin ilmaistaan ​​A2780 ja CaOV-3-soluissa, vastaavasti (kuvio 1 B). Vaikka p53 villityypin IGROV-1-soluissa ilmaisivat erittäin CXCL3, CXCL14, CCR10: n ja CXCR4 (kuvio S1A).

(A) allekirjoitus kemokiinin ligandien ja (B) kemokiinireseptorien ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. Eristämisen jälkeen kokonais-RNA kustakin solulinjasta, PCR array suoritettiin käyttäen räätälöityjä PCR array levy, joka sisältää komplementaariset sekvenssit ihmisen kemokiini-geenejä. Eri värit osoittavat keskimäärin sykli kynnyksen kanssa ilme vaihtelee 35 25. (C) Proteiinin p53 ja MDM2 munasarjasyövän solulinjoissa. Kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita p53: n, MDM2 ja β-aktiini kuin lastaus ohjaus. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja edustava tulos esitetään. OV, OVCAR-3-solut; SK, SKOV-3-solut; A A2780 soluissa; Ca, CaOV-3-solut; TOV, TOV-21G soluissa.

Lisäksi analysoitiin proteiinin tasot p53 ja MDM2 samassa solulinjoissa. OVCAR-3 solujen ilmentyy voimakkaasti p53-proteiini, kun taas ID8 ja A2780 soluissa ilmaisivat suhteellisesti vähemmän p53. On selvää, SKOV-3, CaOV-3, ja TOV-21G solut eivät ilmaista p53. Tutkimme myös ilmentymisen MDM2, negatiivinen säätelijä p53. MDM2 oli hyvin ilmaistu A2780 ja OVCAR-3 soluja verrattuna ei ilmentymistä ID8 ja CaOV-3-soluissa (kuvio 1 C). SKOV-3 ja TOV-21G solut ilmensivät MDM2 huolimatta menetys p53 (kuvio 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että p53 on joko poissa tai ekspressoituu hyvin alhaiselle tasolle useimmissa solulinjoissa tutkittu.

vaikutus p53 TNF-induced kemokiinien

TNF on tulehdusta edistävä sytokiini ilmentyy runsaana munasarjasyöpä [24]. Valitsimme SKOV-3-soluissa kuin p53-null malli munasarjasyöpäsolu tunnistaa reagoiva kemokiinien TNF. TNF indusoi spesifisesti proinflammatoriset kemokiinit, kuten CCL20, CXCL1, 2, 3 ja 8 (kuvio 2A). Lisäksi olemme ohimenevästi transfektoitu p53 osaksi SKOV-3-soluja mitata vaikutusta p53 TNF-indusoidun kemokiinien (kuvio 2B). Palauttaminen p53 osaksi SKOV-3-soluissa johti downregulation proinflammatoristen kemokiinien sekä perus- ja TNF-induced tasot (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että toiminnallinen menetys p53 munasarjasyövän voi lisätä proinflammatoristen kemokiinien, jolloin tulehdukseen kasvaimen mikroympäristössä.

(A) TNF-indusoitu kemokiinien SKOV-3-soluja. Eristämisen jälkeen kokonais-RNA, PCR array suoritettiin käyttäen ihmisen kemokiini PCR array levy. Katkoviiva 2-kertainen; kemokiinien kanssa on suurempi kuin 2-kertainen lisäys kirjataan TNF-aiheuttamaa kemokiinit. (B) Vahvistus p53-proteiinin ilmentymisen jälkeen ohimenevän transfektion SKOV-3-soluissa. Transfektion jälkeen tyhjän vektorin (EM) ja p53-ekspressiovektoriin (p53), kokosolulysaateille valmistettiin ja p53 ilmentyminen vahvistettiin Western blot. β-aktiini käytetään latauskontrollina. (C) vaikutus p53 TNF-aiheuttamaa kemokiinit. Yön yli transfektion vektoreita, soluja käsiteltiin TNF (10 ng /ml) 1 h ja qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita CCL2: n, CXCL1, 2, 3 ja 8. β-aktiini toimii normalisointia ohjaus. Eri kirjaimet tarkoittavat merkitseviä eroja (P≤0.05) kussakin Kemokiiniryhmä (ANOVA ja Tukeyn pairwise vertailut). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SE.

vaikutus p53: NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta, ja TNF-aktivoitu IKB

TNF-induced kemokiinit, kuten CCL20, CXCL1, 2, 3 ja 8 on proksimaalinen KB sivustoja niiden promoottorit (kuvio 3A). Siksi käytetään NF-KB-driven lusiferaasireportteri vektori vahvistaa osallistumista NF-KB: estävää vaikutusta p53 TNF: n ja p65: n (alayksikköä NF-KB) induktion kemokiinin ilmentyminen. Valitsimme kolme solulinjoja, jotka vaihtelevat kannalta p53 ilmaus: SKOV-3 (p53-tyhjä), A2780 (p53 villityypin) ja OVCAR-3 (p53 mutantti) solujen [25] – [26]. Tilasta riippumatta p53: n, p53: n palauttamisen merkittävästi vähentää TNF ja p65-indusoidun NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys p53 munasarjasyövän voi lisätä proinflammatoristen kemokiinien lisäämällä NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta vasteena tulehdusreaktioon.

(A) nukleotidisekvenssit promoottorien TNF-indusoidun kemokiinit, kuten CCL20, CXCL1 , 2, 3 ja 8. Nämä kemokiinin promoottorit sisältävät yhden NF-KB: n päällä proksimaalisessa alueella, lukuun ottamatta CCL20, jossa on kaksi NF-KB: n sivustoja distaalisen ja proksimaalisen alueen. (B) vaikutus p53: NF-KB lusiferaasiaktiivisuus. Transfektion jälkeen vektoreita tai kotransfektiolla p65, soluja käsiteltiin TNF (10 ng /ml) 4 tuntia. (C) vaikutus p53 TNF-aktivoitu IKB. Transfektion jälkeen tyhjän vektorin tai p53: SKOV-3 (p53-tyhjä), OVCAR-3 (p53-mutantti) ja A2780 (p53 villityypin), soluja käsiteltiin TNF (10 ng /ml) ilmoitetaan kertaa. β-aktiini toimii latauskontrollina. Kokeet suoritettiin kahtena ja edustava tulos esitetään; pienemmät luvut ovat suhteellisen tiheyden arvoja.

tutkia tarkemmin, onko p53 vaikuttaa TNF-induced aktivoitumisen IKB näissä ohimenevästi transfektoiduissa soluissa. Vaikka p53 palauttaminen ei ollut tuntuvaa vaikutusta TNF-aktivoitu IKB 5 läpi 30 min, se vähensi aktivointi IKB at 1-2 h. Huolimatta vaihtelevia p53, tämä vähentynyt vaikutus myöhään ajankohtina oli samankaltainen kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 3C). Vähentynyt aktivointi IKB myöhään ajankohtina viittaavat siihen, että p53 voi vaikuttaa tapahtumiin liittyvät NF-KB kompleksi (IKB-p65 /p52) pikemmin kuin ylävirran NF-KB: munasarjasyöpäsoluja.

osallistuminen p53 IKB hajoamista

Yksi mekanismi, jolla IKB säännellään tapahtuu proteasomaalisten hajoaminen jälkeen ubikitinaation. Olemme tutkineet, onko tämä mekanismi oli mukana p53: n kykyyn vähentää IKB aktivointia. Transientin transfektion jälkeen p53, olemme vahvistaneet p53 tutkimalla, onko se lisääntynyt ekspressio p21, joka on voimakas sykliinistä riippuvaisen kinaasin estäjä tiukasti kontrolloitua p53. A2780 soluissa konstitutiivisesti p21 taas OVCAR-3 ja Skov-3-solut eivät ilmaisseet p21. Yli-ilmentyminen p53 lisääntynyt p21-proteiinin tasoa kaikilla solulinjoissa (kuvio 4A). Lisäksi p53 merkittävästi parannettu kertyminen ubikitinoituja proteiinien kokosolulysaateista (kuvio 4A), luultavasti häiritsemällä hajoamisen järjestelmään. ELISA-määritys paljasti, että palauttaminen p53 lisääntynyt p53 aktiivisuutta kaikissa solulinjoissa (kuvio 4B). P53 villityypin A2780 solut ilmensivät pohjapinta p53 aktiivisuuden kun taas p53-mutantin OVCAR-3 ja p53 null SKOV-3-soluja ei havaittu p53 aktiivisuutta (kuvio 4B). Selvittää syy tämän kertyminen, mittasimme proteasomiaktiivisuus ja todennut sen väheni yli-ilmentyminen p53 kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 4C). Lisäksi kun immunosaostus IKB, me vahvisti, että p53 lisääntynyt ubikinaa- of IKB (kuvio 4D). Kertyvät ubikitinoitu IKB p53 viittaa siihen, että p53 lohkojen hajoaminen IKB vähentämällä proteasomiaktiivisuus munasarjasyöpäsoluja.

(A) Kertyneet vaikutus p53 ubiquitylated proteiineihin. Transientin transfektion jälkeen p53 A2780, OVCAR-3 ja SKOV-3-soluja, kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita ubikitiinipromoottori, p21, IKB, p53 ja β-aktiini (kuten lastaus kontrolli). Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja edustava tulos esitetään. (B) Vahvistus p53 toimintaa sen jälkeen, ohimenevän transfektion p53. ELISA suoritettiin kolminkertaisena ja tulokset esitetään keskiarvona ± SE. Tummanharmaa palkit osoittavat merkitys (p 0,05, pariksi Opiskelijan

t

-testi) kussakin solulinjassa. (C) vaikutus p53 proteasomiaktiivisuus. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset esitetään keskiarvona ± SE. Tummanharmaa palkit osoittavat merkitys (p 0,05, pariksi Opiskelijan

t

-testi) kussakin solulinjassa. (D) Vaikutukset p53 ubikinaation of lKB. Immunopresipitoidun IKB immunoblotat- käyttäen ubikitiinipromoottori vasta-ainetta. Kokeet suoritettiin kahtena ja edustava tulos esitetään.

vaikutus p53 ubikitiinistä liittyviä geenejä

vaikutus p53 ubikitiinistä liittyviä geenejä on esitetty taulukossa 1. vaikka laski proteasomiaktiivisuus selittäisi kasvun ubikitinoitu proteiineja, lisääntynyt ilmentyminen ubikitiinistä liittyvien geenien voisi myös osaltaan. Siksi käytetään PCR array, tutkimme p53 vaikuttaa suoraan ubikitiinistä liittyviä geenejä, kuten ubikitiinistä aktivoivia entsyymejä (E1), ubikitiinistä entsyymien konjugoimiseksi (E2) ja ubikitiinipromoottori-proteiini ligaasit (E3). PCR-matriisia ubikinaa- geenien paljasti, että yli-ilmentyminen p53 ei ollut välittömiä vaikutuksia E1 tai E2 paitsi noin 2-kertainen lasku UBE2E2 in SKOV-3-soluissa. Vaikka A2780 ja OVCAR-3 soluja, p53 yli-ilmentyminen aiheutti 2-3-kertaisen lisäyksen ubikitiini-ligaasi CUL9 ja RNF148 ilmaisu, vastaavasti PCR-array paljasti, että nämä geenit ilmennettiin matalalla tasolla. Mielenkiintoista p53 erityisesti lisääntyneen ilmentymisen MDM2, negatiivinen säätelijä p53 tuumorisuppressorin, ja E3-ubikitiinipromoottori ligaasilla, kaikissa testatuissa solulinjoissa. Erityisesti entistä suurempi vaikutus p53 MDM2 oli 1,53-kertainen A2780 soluissa, 5,41-kertaisesti OVCAR-3 ja 3,13-kertaisesti SKOV-3-soluissa. MDM2 kuin p53-geenin, in ubikitiinistä liittyvien geenien todennäköisesti mukana tukahduta p53 toimintaa, joka vaimentaa NF-KB signalointi itsesäätelydomeenin negatiivinen kierre.

vaikutus p53 MDM2 ilme, sitovan NF-KB: n komponentteja ja IKK-isoformien

perusteella p53-induced MDM2-mRNA: n osoitetaan PCR array (taulukko 1), seuraavan kerran vahvisti lisääntyneen ilmentymisen MDM2-proteiinin p53: A2780, OVCAR-3 ja SKOV -3-solujen Western blot (kuvio 5A). Koska IκBα tiedetään sitoutuvan p53

in vitro

[27] ja tukahduttaa p53-riippuvainen vaikutus [28], yliekspressio p53 voisi vähentää NF-KB: n signaloinnin sitoutumalla p65 ja IkB. Immunosaostus p53 paljasti, että palauttaminen p53 ei ollut merkittävää vaikutusta p53 sitoutumiseen joko p65 tai IKB (kuvio 5B). Koska menetys p53 jonka tiedetään lisäävän aktiivisuutta IKKα tai IKKβ [12] – [13], me selvitettävä, onko p53 oli mukana säädellään ilmentymisen IKK. Vaikka kukin solulinja ilmaistaan ​​selvä yhdistelmä IKK isoformeja (IKKβ ilmennettiin kaikissa testatuissa solulinjoissa, SKOV3- solut ilmensivät IKKγ sijasta IKKα, ja IKKε ei ollut esitetty mitään solulinja), yliekspressio p53 ei ollut vaikutusta IKK ilmaisun ja fosforylaatio missään solulinjassa (kuvio 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kenties hallitseva vaikutus p53 yli MDM2 on tärkeämpää vaimennus NF-KB signaloinnin pikemmin kuin suoria vaikutuksia ylävirtaan tai komponentteja NF-KB: n.

(A) vaikutus p53 MDM2 ilme. Transientin transfektion jälkeen p53 A2780, OVCAR-3 ja SKOV-3-soluja, kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita MDM2; ja β-aktiini toimi latauskontrollina. (B) vaikutus p53 ilmentymisen p53 sitoutumiseen p65 ja IKB. Transientin transfektion jälkeen p53, immunosaostettiin (IP) p53 immunoblotat- (IB) käyttäen p65 tai IkB-vasta-ainetta. (C) vaikutus p53 ilmentymistä eri IKK isoformeja. Transientin transfektion jälkeen p53, kokosolulysaateille valmistettiin ja Western blot suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita IKKα, IKKβ, IKKγ, IKKε; β-aktiini toimi latauskontrollina. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja edustava tulos esitetään.

vaikutus nutlin-3, spesifinen indusoija p53 vakauttamisen, TNF-indusoidun kemokiinit

käyttää nutlin-3 koska p53 stabilointiaineena vahvistaa estävää vaikutusta p53 TNF-indusoidun kemokiinin ilmentyminen. Nutlin-3 ei ollut vaikutusta TNF-indusoidun NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta p53 null SKOV-3-soluja, mutta vähentää sen aktiivisuutta p53-yli-ilmentyy SKOV-3-soluja (kuva 6A). Jatkuvasti tutkimme, nutlin-3 vaikuttaa TNF-aktivoitu IKB p53-yli-ilmentyy SKOV-3-soluissa. Nutlin-3 vähentää TNF-aktivoitu IKB stabiloimalla p53 kuten on osoitettu augmentation MDM2 (kuvio 6B). Vakauttaminen p53 nutlin-3 p53-yli-ilmentyy SKOV-3-soluissa johti downregulation TNF-induced proinflammatoristen kemokiinien (kuvio 6C). Nämä tulokset vahvistavat, että toiminnallinen menetys p53 aktiivisuuden munasarjasyöpä voi lisätä proinflammatoristen kemokiinien, lisäämällä tulehdus taakka kasvaimen mikroympäristössä. Lisäksi, käytimme p53 villityypin IGROV-1-soluissa vahvistaa, että inhiboiva vaikutus nutlin-3 TNF-aktivoitu IkB. Nutlin-3 laski TNF-aktivoitua IKB stabiloimalla p53 kuten on osoitettu kasvattamiselle p21 ja MDM2 huolimatta alhainen perusilmennystä p53 (kuvio S1B). Vaikka IGROV-1-soluissa ilmaisivat erittäin IKKα ja IKKβ (IKKγ oli vaatimaton ilmennettiin ja IKKε ei ollut esitetty), nutlin-3 ei ollut vaikutusta IKK fosforylaatiota (kuvio S1C). Lisäksi tutkimme ero vaikutus nutine-3 TNF-aktivoitu IKB välillä p53 villityyppisen A2789 ja p53 mutantti OVCAR-3-soluissa. Nutlin-3 vähensi TNF-aktivoitu IKB p53 villityypin A2780 soluissa vakauttaa p53 seurasi p21 ja MDM2 vahvistukseksi (kuvio S2A). Toisaalta, nutlin-3 ei ollut mitään vaikutusta p53 mutantti OVCAR-3 soluja kuten ilman muutoksia p53 ja MDM2 (kuvio S2B). Muut kirjoittajat osoittivat, että nutlin-3 stabiloitua p53 kanssa kasvattamiselle p21 ja MDM2 muissa p53 villityypin soluissa, mutta ei p53 mutanttisoluista [29] – [30]. Nutlin-3 ei vaikuttanut TNF-aktivoitu IKK molemmissa soluissa (kuvio S2). Nämä tulokset vahvistavat, että toiminnallinen voitto p53 on tärkeämpää vaimennus NF-KB signaloinnin pikemmin kuin suorat vaikutukset ylävirtaan NF-KB: n.

(A) vaikutus nutlin-3 NF-KB lusiferaasiaktiivisuus. Transfektion jälkeen vektoreita tai kotransfektiolla p53: n kanssa, soluja esikäsiteltiin nutlin-3 (10 uM) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen TNF: n (10 ng /ml) 4 tuntia. Eri kirjaimet tarkoittavat merkitseviä eroja (P≤0.05) kussakin ryhmässä (ANOVA ja Tukeyn pairwise vertailut). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SE. (B) vaikutus nutlin-3 TNF-aktivoitu IKB. Transfektion jälkeen tyhjän vektorin tai p53: SKOV-3-soluja, soluja esikäsiteltiin nutlin-3 (10 uM) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen TNF: n (10 ng /ml) osoitetun kertaa. β-aktiini toimii latauskontrollina. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja edustava tulos esitetään. (C) vaikutus nutlin-3 TNF-aiheuttamaa kemokiinit. Yön yli transfektion vektoreita, soluja esikäsiteltiin nutlin-3 (10 uM) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen TNF: n (10 ng /ml) 1 h ja qRT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita CCL2: n, CXCL1, 2, 3 ja 8. β-aktiini toimii normalisointia ohjaus. Tähti osoittaa merkittäviä eroja (P≤0.05, pariksi Opiskelijan

t

-testi) verrattuna läsnäolo nutlin-3. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki tiedot näytetään keskimääräisenä ± SE.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että p53 estää proinflammatoristen kemokiinien munasarjasyöpäsoluja. Tämä vaikutus p53 on todennäköisesti seurausta heikennettyjä NF-KB-signaloinnin vähentynyt proteasomaalisten hajoamisen IKB ja hallitseva vaikutus p53 yli MDM2.

Tutkimus oli perusteltu sillä, että aggressiivinen ja korkea-asteen munasarjasyöpä, joka on tulehdukseen liittyvä syöpä, liittyy usein mutaatioita tai deleetioita p53 [11]. Ensimmäinen korrelaatiotutkimusta koe paljasti, että p53-nolla tai mutantit munasarjasyöpäsoluja ilmentyy voimakkaasti proinflammatoristen kemokiinien kuten CCL20, CCL28, CXCL1, 2, 3 ja 8, jotka on samaa mieltä aiempien havaintojen [10]. Lisäksi, CCR1, CCR10: n ja CXCR4 olivat erittäin ilmaistu A2780 soluissa, CaOV-3-soluja (kuvio 1 B) ja IGROV-1-soluissa (kuvio S1A). Koska CCR1, CCR10: n ja CXCR4 eivät ole spesifisiä reseptoreita proinflammatoristen kemokiinien vapautuu munasarjasyöpäsoluja, nämä reseptorit ovat todennäköisesti vuorovaikutuksessa kemokiinien vapautuu muihin solutyyppeihin, kuten immuunijärjestelmän solujen ja endoteelisolujen mikroympäristö.

TNF indusoima CCL20, CXCL1, 2, 3 ja 8, mutta ei CCL28, joka ilmentyy voimakkaasti SKOV-3 ja OVCAR-3-soluihin (kuvio 1A ja 2A). Puute induktion CCL28 TNF näissä munasarjasyöpäsoluja on vastoin aiemmin raportissa [31] – [32], että TNF: n ja IL-1 lisäys ilmentymisen CCL28 ihmisen keratinosyyttisolujen ja paksusuolen epiteelissä. Itse asiassa, CCL28 säilyi muuttumattomana kaikissa ihmisen munasarjan syöpäsolujen testattu (tuloksia ei ole esitetty). Tämä ero osoittaa, että kemokiiniverkosto todennäköisesti eri säänneltävä eri solutyyppejä.

Palauttaminen p53 osaksi p53-null SKOV-3-solujen heikennetty proinflammatoristen kemokiinien sekä perus- ja TNF-induced olosuhteissa (kuvio 2C ). Tämä tulos osoittaa, että menetys tai p53: n mutaatio havaitaan usein munasarjasyövän edistää täydennetty proinflammatoristen kemokiinien kasvaimen mikroympäristössä, jonka tiedetään helpottamaan syövän etenemisessä.

Koska promoottorit CCL20, CXCL1, 2, 3 ja 8 sisältävät KB sivustoja (Fig. 3A) ja proinflammatoristen kemokiinien säätelee NF-KB: n signalointi [10], p53 vaikutukset kemokiinin ilmaisun todennäköisesti aiheuta muutoksia NF-KB signalointi. Tässä tutkimuksessa palauttaminen p53 osaksi munasarjan syöpäsolujen nutlin-3, joka on p53-stabilointiaine, poistetaan TNF-indusoidun NF-KB: n promoottorin aktiivisuutta (kuvio 3B ja 6A). Nämä tulokset vahvistavat ja kontrasti aiempien tulosten kanssa, koska ristiriitaisia ​​vaikutuksia p53 NF-KB signalointi on löydetty. Jotkut viittaavat siihen, että p53 aktivoi p65-alayksikön NF-KB: n välityksellä ribosomaalisen S6-kinaasi 1 [18] ja TNF laukaisee transkriptionaalisesti aktiivisen kompleksin p65: n ja p53: KB: n vaste-elementit, mikä osoittaa, että mutatoitu p53 sijaan menetys p53 edistää kasvaimen eteneminen [19]. Toisaalta, varaamiseen todisteet osoittavat negatiivinen vaikutus p53: NF-KB signalointi, kanssa tuloksemme. P53 voi tukahduttaa NF-KB signalointi häiritsemällä IKK ilmaisu kuin ylävirran NF-KB: n signalointi.