Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien sekä miehille että naisille. Varhainen diagnoosi keuhkosyöpään on 5 vuoden pysyvyys 48,8%, mutta lähes 35% I vaiheen potilaiden pahenemisvai- jälkeen kirurgisen resektion, siten ennakoiden huono ennuste. Siksi havaitaan keuhkosyöpä varhaisessa vaiheessa ja edelleen tunnistaa korkean riskin potilailla antaisi mahdollisuuden tarjota adjuvanttihoito ja mahdollisesti lisätä selviytymisen. On paljon todisteita siitä, että immuunijärjestelmä tuottaa autovasta-vaste neoplastisten solujen. Havaitseminen kuten autovasta-aineiden on osoitettu olevan diagnostista ja prognostista arvoa. Täällä käytti suurikapasiteettisten Luminex tekniikka multiplex yhteensä 14 kasvaimeen liittyvien autoantigeenien tunnistaa autovasta-aine potilailta seerumeista. 14 antigeenejä ilmennettiin in vitro transkriptio /translaatio-järjestelmä, jossa HaloTag on N-päässä. Fuusioproteiinit sitten kovalenttisesti immobilisoitu Luminex mikropallot konjugoida halo-linkin ligandi, mikä poistaa proteiinin puhdistusmenetelmä. Seeruminäytteitä syöpäpotilaista ja tervettä verrokkia vuorovaikutuksessa mikropalloilla antigeeni kompleksi mitata autovasta. Olemme kehittäneet nopean multiplex tunnistusjärjestelmä mittaamiseksi autovasta allekirjoittamista potilaiden seerumit pienellä rajat reaktio. Paneeli seitsemän autovasta biomarkkereiden on aiheutunut AUC 80% vuonna erottamaan keuhkosyövässä peräisin terveiden verrokkien. Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti yhdistämällä Luminex alustan ja HaloTag teknologiaa havaitsemaan humoraalisen immuunivasteen syöpäpotilailla. Joustavuuden ansiosta Luminexin tekniikkaa, tämä lähestymistapa voidaan soveltaa muita ehtoja, kuten tarttuva, neurologiset ja metaboliset sairaudet. Voidaan kuvitella, että tämä multipleksin Luminex järjestelmä sekä paneeli seitsemän biomarkkereiden voitaisiin käyttää seulomaan suuren riskin väestöstä myöhemmin CT testi perustuu verikoe tulos.

Citation: Jia J, Wang W , Meng W, Ding M, Ma S, Wang X (2014) kehittäminen Multiplex Autovasta testi paljastaa keuhkosyöpään. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10,1371 /journal.pone.0095444

Editor: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 lokakuu 2013; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2014; Julkaistu: 22 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation (81172072), Science Foundation for Distinguished Young Scholars (R2101405), infrastruktuurin ja Facility Development Program of Science and Technology Department of Zhejiang Province (2011F10015), Major Science and Technology Innovation projekti Hangzhou ( 20112313A01), Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien sekä miehille että naisille kaikkialla maailmassa. Vuonna 2012 arvioitiin, että 226160 ihmiset diagnosoitu keuhkosyöpä ja 160340 potilaat kuolevat heidän sairautensa. Nykyinen 5 vuoden yleinen eloonjäämisaste potilaiden on 16% vuoteen 2007 alhaisimpia kaikista syövistä, mikä on parantanut vain hieman viime vuosikymmenen aikana [1]. Useimmat keuhkosyöpäpotilaita diagnosoidaan myöhään /kaukainen vaiheissa näin alhainen eloonjäämisaste johtuen puutteesta havaittavissa oireiden alkuvaiheessa tumorigeneesin [2].

Tiedot viittaavat siihen, että diagnosoimiseksi keuhkosyöpätapauksista kun se on pieni ja paikallisesti määriteltyjen saattaa lisätä parannuskeinoa mahdollisuus [3], [4]. Varhainen diagnoosi keuhkosyöpään voisi merkittävästi parantaa 5-vuoden pysyvyys jopa 48,8% verrattuna 3,3% myöhään /kaukaisten vaiheessa [5]. Siksi havaitseminen alkuvaiheen keuhkosyöpään ja tunnistaminen korkean riskin potilailla tarjoaisi potentiaalia adjuvanttihoito ja mahdollisesti lisätä selviytymisen.

Nykyinen menetelmiä diagnoosi keuhkosyövän vaativat koepala ja patologinen tarkastelu kudos yleensä havaittuaan vaurion rinnassa röntgen- tai tietokonetomografia. Tällä hetkellä ei ole verikoe käytettävissä keuhkosyöpä. Useita lähestymistapoja on kehitetty tunnistamaan biomarkkereita diagnoosi keuhkosyövän [6], [7]. Näistä immuunijärjestelmä on osoitettu tuottavan autovasta-aineita vastaan ​​kasvainsolujen sekä väärin säädellystä kasvaimeen liittyvät antigeenit [8], [9], siis havaita esimerkiksi autovasta-aineiden on diagnostista ja prognostista arvoa [10], [11]. Tärkeintä on, humoraalisten immuunivasteiden olemassa useita kuukausia tai vuosia ennen kliinisiä oireita, jolloin autovasta-aineita voidaan käyttää varhaisen diagnoosin syöpäpotilaiden [7], [9], [12]. Lisäksi on raportoitu, että B-solujen ja B-solujen liittyvä vasta edistää de novo syövän synnyn [13], mikä viittaa siihen, että humoraalisen immuunivasteen voi olla suora rooli syövän etenemiseen.

(1) HaloTag amiiniligandeista konjugoitiin Luminex magneettisia helmiä kautta aktivoitua karboksyylihappoa COOH radikaaliryhmä. Erilaiset väri edustaa eri Luminexin helmiä. (2) Yhdistelmä-DNA-Halo-merkittyjen proteiinien kovalenttisesti immobilisoitu Luminex helmien konjugoitu HaloTag ligandin kautta reaktiivisen kloorialkaanin linkkereistä ligandeja. Kukin helmi immobilisoitiin eri proteiiniin erikseen. (3) – (4) Koska kovalenttinen sitoutuminen, kukin helmi-proteiinikompleksi yksilöllisesti meni läpi voimakkaasti pesun ja sitten yhdistetty tehdä mikropalloformu- allas. (5) proteiini-kytketyn mikropallon allas sitten yhtä alikvootteihin 96-kuoppalevylle. Kukin kuoppa sisältää useita autoantigeenin biomarkkereita ja voidaan käyttää yhden seeruminäyte. (6) autovasta-aineita seerumista sitoutuneen antigeenin konjugoituna mikropalloja, ja havaittiin R-fykoerytriinikonjugoitua anti-humaani vasta-aine. Signaali luettiin Luminex 200 bioanalysaattorin.

Tässä tutkimuksessa olemme kuvattu ei-invasiivisia diagnostinen järjestelmä Luminex xMAP alustan seerumin autovasta diagnosointiin keuhkosyöpään. Ehdokas autoantigeenit valittiin kirjallisuudesta ja ekspressoida in vitro transkriptio /translaatio-järjestelmä käyttäen HaloTag on N-päässä. Ilman puhdistusta, yhdistelmä-DNA-proteiinit kovalenttisesti immobilisoituna Luminex helmi. Seeruminäytteet inkuboitiin helmi-autoantigeeni kompleksin määrän mittaamiseksi autovasta-aineiden. Paneeli seitsemän antigeenejä eli p53, NY-ESO-1, Livin, Ubiquilin1, BIRC, P62 ja PRDX, käytettiin Monimuuttuja tilastollinen malli erottaa syövän potilaiden terveiden verrokkien. Tämä on ensimmäinen tutkimus havaita multiplex autovasta on Luminex teknologia.

Materiaalit ja menetelmät

rekombinanttiproteiinien ilmentäminen

cDNA 14 autoantigeeneinä kloonattiin Flexi vektoriin ( Promega, USA), jossa on HaloTag on N-päässä. Halo-koodattu rekombinantti proteiinit ilmennettiin in vitro transkriptio /translaatio-järjestelmä (Promega). HaloTag proteiinia tuotettiin myös negatiiviseksi proteiinia. Proteiinit havaittiin Western blot käyttäen kaniinin anti-HaloTag-vasta-aine (Promega).

Western blot -määritys

Halo koodattu rekombinantti ekspressoitiin

in vitro

transkriptio /translaatio järjestelmä, ja sitten sille varten Western Blot. Lyhyesti, yhteensä 3 ui proteiini lysaatti ladattiin 12% SDS-PAGE, sitten siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-membraanille (GE). Proteiini lysaatti kanssa HaloTag proteiini ainoa (31 kDa) lataamisen kontrollina. Blokkauksen jälkeen membraanit blotattiin kanin anti-HaloTag vasta-ainetta (Promega), jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Proteintech). Proteiini signaaleja havaittiin ECL reagenssi (GE), ja valokuvattiin käyttäen Alpha Innotech Fluor Chem FC2 kemiluminesenssin kuva-analyysi-järjestelmän (Alpha Innotech).

Patient seeruminäytteet

Tutkimus hyväksyttiin Institutional Review Board of Zhejiang Academy of Medicine Sciences. Kaikki osallistujat, jotka tarjotaan seerumit antanut kirjallisen tietoon perustuva suostumus.

Potilaat, joilla oli paikallinen keuhkosyöpä kerättiin klo Syöpätautien, Hangzhou ensimmäinen ihmisten sairaala elokuusta 2010 maaliskuuhun 2012. Kaikkiaan 117 potilasta näytteet täyttivät seuraavat kriteerit tähän tutkimukseen: 1) mistä biopsialla kliinisesti paikallinen keuhkosyöpä, 2) ei ole aiempaa keuhkosyövän hoidossa, 3) päivämäärä seerumin piirretty oli välittömästi ennen päivämäärää kirurgian, 4) ole muita samanaikaisia ​​pahanlaatuiset sairaudet ja autoimmuunisairauksien sairaudet. Näistä 117 näytteestä 44 näytettä valittiin satunnaisesti voidaan hyödyntää kehitettäessä ja validointi Luminex-alustalla, kun taas 25 näytettä käytettiin biomarkkerina valintaan, ja loput 48 näytettä käytettiin multiplex biomarkkereiden analyysiin. Samoin palvelemaan verrokeilla, sairaala edellyttäen 110 seeruminäytteet on ikäryhmä 29-76, joilla ei ollut syöpää kerättiin vuosina 2011 ja 2012. Nämä 110 näytteet myös satunnaisesti kolmeen ryhmään tässä tutkimuksessa, erityisesti 35 näytettä for Luminex kehittämiseen, 25 näytteitä biomarkkereiden valintaa ja 50 näytteitä multiplex analyysiä.

konjugaatio HaloTag Amine ligandin Luminex Microsphere

vähimmäismäärä HaloTag Amine (O4) ligandia (Promega, USA) suurimmalle konjugaatio hyötysuhde on Luminex mikropalloihin (Luminex Corp.) määritettiin seuraavan. Yhteensä 5 x 10

6 Luminex magneettisia mikropalloja konjugoitiin useita laimentamisen HaloTag Amine Ligandi: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Lyhyesti, mikropallot suspendoitiin liuokseen, joka sisälsi 100 mmol /l MES (pH 6,0), joka sisälsi 5 mg /ml 1-etyyli-3- (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-(Thermo Scientific) ja HaloTag Amine ligandin. Sen jälkeen, kun 2 tunnin inkubaation pimeässä, mikropallot pestiin ja suspendoitiin uudelleen 100 mmol /l MES (pH 4,5), ja säilytettiin 4 ° C: ssa.

Luminex mikropallot yhdessä HaloTag ligandin inkuboitiin puhdistettua HaloTag proteiini sarjassa laimennus 0 ug 5 ug. MFI (fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo) edustaa sitova signaalin ja havaittiin anti-HaloTag vasta-aine.

kehittäminen ja validointi Protein-microsphere Complex

ligandi-mikropallo kompleksin eri helmi alueilla erikseen inkuboitiin yhdistelmä-DNA-HaloTag fuusioproteiinien ympäristön lämpötilassa pimeässä 60 minuutin ajan. Inkuboinnin jälkeen mikropallot pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% BSA: ta ja 0,5% Tween 20, ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,1% BSA: ta validointi.

proteiinin määrä konjugoitu mikropallojen mitattiin käyttäen kaupallista vasta-ainetta ( kanin anti-p62-vasta, kanin anti-p53-vasta, Santa Cruz) vastakkain kohdeproteiiniin. Lyhyesti, sarjalaimennoksia kullekin vasta-aineelle (vaihteluväli 0-5 ug /ml PBS: ssä, 1% BSA), inkuboitiin 3000 mikropalloja konjugoitu eri proteiinia 96-kuoppaiselle levylle 1 tunnin ajan. Pesun jälkeen PBS /1% BSA: ta, mikropallot inkuboitiin R-fykoerytriinillä konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 minuutin ajan. Saatu kompleksi pestiin jälleen ja resuspendoitiin PBS /1% BSA ennen käsittelyssä Luminex 200 bioanalysaattorin (Luminex Corp). MFI arvo edustaa sitoutumissignaali.

testaamiseksi havaitsemisen kyky Luminex järjestelmän, 44 syöpä ja 35 terveystarkastus seeruminäytteet valittiin sattumanvaraisesti, ja NY-ESO-1 autovasta mitattiin Luminexe järjestelmässä. Lyhyesti, eri mikropallot on konjugoitu yhdistelmä-DNA-NY-ESO-1 ja HaloTag erikseen, yhdistettiin ja jaettiin 96-kuoppaiselle levylle. Seeruminäytteet laimennettiin 1:200 PBS /1% BSA: ta ja inkuboitiin helmien kanssa yön yli 4 ° C: ssa ravistellen. Autovasta-signaalit sitten havaita R-fykoerytriinikonjugoitua anti-ihmisen polyklonaalista vasta-ainetta (Rockland) 0,5 tunnin ajan koko ajan sekoittaen. Kolmen pesun jälkeen, reaktio kompleksi suspendoitiin uudelleen PBS /1% BSA lukemiseen Luminex 200 bioanalysaattorin. MFI-arvot edustivat MFI (NY-ESO-1) miinus rahalaitos (HaloTag).

fluoresenssivoimakkuuksien verrattiin myös kaupallisella ELISA Kit (tarkeastelua, USA). Koe suoritettiin valmistajan ohjeen.

havaitseminen Autovasta seerumissa

Eri mikropalloja konjugoitu yhdistelmä-DNA-proteiinien ja HaloTag erikseen, yhdistettiin ja jaettiin 96-kuoppaisen levyn havaita autovasta seerumissa. Seeruminäytteet laimennettiin 1:200 PBS /1% BSA: ta ja inkuboitiin helmien kanssa yön yli 4 ° C: ssa ravistellen. Autovasta-signaalit havaittiin sitten Luminex kuten aiemmin on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Sekä yhden ja usean analyysejä käytettiin. Erot kahden ryhmän välillä arvioitiin Studentin t-testillä. Korrelaatio single-Plex ja multi-Plex järjestelmien välillä tai ELISA ja Luminex-single-Plex järjestelmä arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa (R). Luokan ennustus tutkittiin käyttäen BRB-Array Tools paketti (versio 3.6) osoitteessa https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Kaikki laskelmat suoritettiin käyttäen R tilastollista ohjelmointikielellä (https://cran.r-project.org/) ja Bioconductor paketteja. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0, ja Excel. p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Yleinen Tutkimuksen lähestymistapa on kuviossa. 1

Jotta kovalenttisesti ajokieltoon rekombinanttiproteiineja on Lumimex microsphere The HaloTag amiiniligandia ensin konjugoida Luminex mikropallojen kautta aktivoitua karboksyylihappoa COOH radikaaliryhmä eri pitoisuus (Fig. 2A). Kytkimen tehokkuus kasvoi pitoisuutena riippuvaisella tavalla kuin havaitaan HaloTag standardin proteiinin (Fig. 2A). Lisäksi rahalaitos ulottui ylänkö 0,2 mg ja 1 mg amiiniligandia, osoittaa kyllästymistä amiiniligandia helmen pinnalla. Tässä tutkimuksessa 0,2 mg ligandia käytettiin konjugoida mikropallon.

(A) titraus HaloTag Amine ligandin konjugoidun on Luminex mikropalloja. Puhdistettu HaloTag standardi proteiinia käytettiin havaitsemaan konjugoinnin tehokkuus sarjassa pitoisuuksia. MFI (fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo) edustaa sitoutumissignaali havaita anti-HaloTag vasta-aine. (B) validointi Luminexin mikropallon kompleksi yhdistettynä HaloTag amiiniligandia. Luminex helmet yhdistettynä 0,2 mg HaloTag ligandin ja signaalit havaittiin, kuten (A).

Luminex mikropallonen konjugoitu 0,2 mg amiinia ligandin vahvistettiin edelleen käyttäen HaloTag standardin proteiinin eri pitoisuus. Tiedot osoittivat, että suurin rahalaitos jopa 1,25 ug standardin proteiinin osoittaa optimaalinen konjugaatio tilassa (kuvio. 2B).

nopeasti seuloa ehdokas autoantigeenejä, paneeli 14 proteiinien ilmaistiin

in vitro

transkriptio /translaatio-järjestelmä. Sen jälkeen kun vahvistettiin Western blot (kuvio. 3A), yhdistelmä-fuusioproteiinien kanssa HaloTag olivat suoraan inkuboitiin mikropalloilla ligandikompleksi ilman proteiinien puhdistamiseen. Kovalenttiset sidos HaloTag ja ligandin muodostuu nopeasti alle yleisten fysiologisissa olosuhteissa ja on hyvin erityinen ja peruuttamattomasti, jolloin saadaan kompleksi, joka on stabiili jopa ankarissa olosuhteissa. Proteiinin määrä immobilisoida yksittäisten Luminex mikropallon jälkeen tutkittiin käyttäen kaupallista vasta-aineita vastaavan antigeenin proteiineja. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, rahalaitos signaaleja mitattiin pitoisuutena riippuvaisella tavalla havaita anti-P62 ja anti-HaloTag aineita.

(A) edustaja Western Blot rekombinantin autoantigeenien kanssa HaloTag at N-päähän ilmaiseman in vitro transkriptio /translaatio-järjestelmä. (B) validointi Luminexin mikropallojen yhdessä rekombinantin HaloTag proteiineja. Immobilisoitu proteiinien havaittiin anti-p62 ja anti-HaloTag vasta-aineet erikseen ja signaalit olivat pitoisuutena riippuvaisella tavalla. (C) vertailu NY-ESO-1 autovasta seerumeista havaitsee Luminex ja ELISA. Kaikkiaan 44 keuhkosyövässä ja 35 tervettä verrokkia valittiin sattumanvaraisesti vertaamaan NY-ESO-1 autovasta mitattuna Luminex järjestelmän ja ELISA-määritystä. R

2 = 0,92 osoittaa korkea korrelaatio Luminex ja ELISA alustojen havaitsemisessa NY-ESO-1 autovasta.

tutkia, Luminex järjestelmä voi tunnistaa autovasta ihmisen yksilö, 44 keuhkoissa syöpä ja 35 tervettä seeruminäytteet valittiin sattumanvaraisesti ja NY-ESO-1-autovasta verrattiin käyttäen Luminex-järjestelmän ja kaupallista ELISA-kittiä (tarkeastelua, USA). Molemmat määritys alustat havaittu merkittävää suuremman määrän NY-ESO-1 autovasta syöpäpotilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin (Kuva. 3C). Unary lineaarista regressioanalyysiä paljasti, että korrelaatiokertoimen (Pearson r) oli 0,92 ja NY-ESO-1-vasta-aineita mitattuna molemmat Luminex ja ELISA-tekniikoilla, mikä viittaa siihen, että kahden menetelmän oli korkea sopimuksen havaitsemisessa NY-ESO-1 autovasta (

p

0,01).

vieressä kehittäneet multipleksoidun Luminex järjestelmään. Neljä proteiini-mikropallon kompleksit (NY-ESO-1, p53, p62, ja PRDX) sekä HaloTag konjugoitu helmi viitteenä kontrollina yhtä yhdistettiin ja jaettiin 96-kuoppaiselle levylle. Anti-p53-vasta-ainetta käytetään havaitsemaan p53 mikropallon tässä multiplex-järjestelmä. Tiedot osoittivat, että rahalaitos signaalit korreloivat voimakkaasti kanssa yksittäisten pallejärjestelmä (single-Plex) (Fig. 4A) osoittaa multiplex järjestelmä on voimassa autovasta havaitsemiseen. Lisäksi, lukuun ottamatta p53 mikropallo, kaikki muut mikropallot, mukaan lukien NY-ESO-1, p62, PRDX tuotettu tausta indikoivat signaalit ei ollut ristireaktiivisuutta välillä helmiä tässä multiplex-järjestelmä (Fig. 4B).

(A) vertailu p53 kytketyt helmet on singleplex (yksittäinen helmi) ja multiplex (useita helmiä) järjestelmään. MFI-arvo havaittiin joukko laimentaminen p53-vasta-aineen. (B) Ristireagoivuutta eri biologisten merkkiaineiden multiplex järjestelmään. Multipleksisiirtomenetelmä, joka sisältää viisi mikropalloja yhdistettynä NY-ESO-1, p53, p62, PRDX ja HaloTag erikseen inkuboitiin p53-vasta-ainetta, ja ainoastaan ​​p53 mikropallot saatettiin reagoimaan anti-p53-vasta-ainetta, kun taas muut mikropallot havaittu tausta MFI-arvot. (C) Signaali korrelaatiota p53 mikropallojen singleplex ja multiplex-järjestelmän. (D) Sama kuin (C), mutta käyttäen p62 kytketty mikropalloja.

vieressä pyrittiin testaamaan korrelaatio yksin- ja multi-Plex Luminex järjestelmät vertaamalla autovasta signaaleja satunnaisesti valittujen seeruminäytteitä havaitaan molemmissa järjestelmissä erikseen. Kuten osoitti kuvassa. 4C ja kuvio. 4D, korrelaatiokerroin (Pearson r) oli 0,84 p53 microsphere (

p

0,01), kun taas 0,81 varten p62 microsphere (

p

0,01), The Pearson r oli myös yli 0,80 muiden proteiini-mikropallon komplekseja (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa korkea korrelaatio yksi- ja multi-plex järjestelmissä.

Perustuen multiplex Luminex-järjestelmä, seuloimme paneeli 14 ehdokkaan autoantigeenien ja havaita verenkierrossa vasta riippumattomien 25 keuhkosyöpään ja 25 terveillä verrokeilla satunnaisesti valittu näyte kohortin tässä tutkimuksessa. Seitsemän autoantigeenit, mukaan lukien p62, BIRC, Livin-1, p53, PRDX, NY-ESO-1 ja Ubiquilin, tuotti huomattavan korkeampi rahalaitos signaaleja keuhkosyöpäpotilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna (Mann-Whitney p-arvo 0,05) (kuvio . 5).

vieressä määritetään, onko paneeli 7 biomarkkerit voidaan käyttää noninvasiivista havaitsemista keuhkosyöpäpotilaiden. Seuloimme itsenäinen 48 keuhkosyövässä ja 50 kontrolliseerumeita näytteitä eri keuhkosyöpä tyypit ja vaiheittain Luminex multiplex järjestelmään. Perusparametreista 48 syöpäpotilaiden ja 50 ohjaa on koottu taulukkoon 1, kuten ikä, sukupuoli, tupakointi ja juominen tila. Erottamisen jälkeen syövästä ja valvontaa luokkia, tarkkuutta binary lopputulokseen ennustus arvioitiin käyttämällä erilaisia ​​koneoppimisen algoritmeja saatavilla BRB Array Tools. Jokaisen näytteen arvo kullekin näistä 7 biomarkkereiden kerrottiin vastaavalla johdetusta kerroin yhden muuttujan logistista regressiota koulutusta asetettu syövän /ohjainta binary vastemuuttuja, ja niin arvot laskettiin yhteen. Luotu indeksipistelukua sitten arvioitiin ROC käyrä, joka tarjosi puhdas indeksi testin tarkkuus piirtämällä herkkyys vastaan ​​1- spesifisiä kunkin tuloksen arvo testin. Kolme ennustaminen algoritmeja käytettiin tuottamaan ROC, mukaan lukien yhdiste kovariaattina ennustajan (CCP), diagonaalinen lineaarinen erotteluanalyysi (DLDA), ja Bayesian yhdiste kovariaattina ennustajan (BCCP). Huomattavaa on, että analyysi tuotti hyvin vertailukelpoinen ROC kaikkien kolmen algoritmit AUC 0,82 (CCP), 0,81 (DLDA), 0,81 (BCCP) vastaavasti (Fig. 6), mikä osoittaa vahvaa syrjivä voima 7 biomarkkereita. Ei korrelaatiota iän, sukupuolen, tupakoinnin tai juominen tila havainnoitiin tämän biomarker paneelissa.

Keskustelu

Detection kiertävän vasta-aineita kasvaimeen liittyviä antigeenejä on lupaava lähestymistapa varhaisen diagnoosin syövän ja teknologiat ovat laajasti kehitetty [14], [15]. Tähän mennessä, ELISA on tavanomainen menetelmä havaitsemiseksi autovasta seerumin, mutta sen sovellus multiplexing autovasta-allekirjoitus on rajoitettu. Äskettäin proteiini microarray ja Luminex xMAP tekniikoita hyväksyttiin mittaamiseksi serologisten autovasta paneelin [16], [17].

Luminex xMAP on korkealla koko alustan ylivoimainen herkkyys ja spesifisyys kuin ELISA [18], [19 ], [20]. Tässä tutkimuksessa olemme kuvannut yksinkertaisen Luminex perustuva menetelmä HaloTag tekniikka tunnistaa autovasta-aineiden potilaiden seerumit. HaloTag proteiinit, jotka sitoutuvat kovalenttisesti kloorialkaanin linkkerit konjugoitu mikropallojen [21], [22]. Koska erityisiä kovalenttisen sitoutumisen, raaka Halo merkittyä fuusioproteiinia lysaatit selektiivisesti immobilisoidaan Luminexin helmiä ja sen jälkeen käydä läpi voimakasta pesuvaihetta, jolloin ohita ikävä proteiinin puhdistusmenetelmä.

On hyvin tunnettua, että kanavointi single biomarkkerit (esim autovasta profilointi) voidaan merkittävästi parantaa herkkyyttä ja spesifisyyttä syövän biologisten merkkiaineiden erottelee syöpäpotilaiden terveiden valvontaa [23]. Tavoitteena oli tutkia hyödyntää Luminex tekniikan multiplex paneelin 14 kasvaimeen liittyviä autoantigeenejä havaitsemiseen keuhkosyöpään potilailla. Nämä autoantigeeneinä valittiin perustuu niiden suorituskykyä erottamaan syöpiä peräisin terveiden verrokkien kuvattu kirjallisuudessa. Esimerkiksi p53 autovasta havaittiin noin 15% syöpäpotilaista [24], [25]. Ubiquilin 1 havaittiin olevan lupaava biomarkkeri keuhkosyöpä AUC on yli 0,7 [26]. Livin-1 autovasta ilmoitettiin 19 37 keuhkosyöpäpotilaita (51,3%) [27]. Lisäksi, 25 (47%) 53 NSCLC potilaista testattiin positiivinen autovasta-aineet vastaan ​​PRDX seerumeissa [28]. Autovasta NY-ESO-1, BIRC, ja p62 havaittiin myös keuhkosyöpää sairastavilla potilailla 20%, 19,5% ja 18,8% herkkyys vastaavasti [29], [30], [31].

kanavoimaan kasvaimeen liittyviä antigeenejä on laajalti tutkittu ELISA [32], [33], [34], [35], [36], tai microarray [37]. Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti yhdistämällä Luminex alustan ja HaloTag teknologiaa havaitsemaan humoraalisen immuunivasteen keuhkosyöpäpotilaiden. Paneeli 7 biomarkkereiden saavutettu yli 80% tarkkuudella havaitsemisessa keuhkosyöpään terveiden verrokkien. Nämä autovasta kuitenkaan ole yhdessä kasvaimen histologialtaan, vaiheet ja tyypit, koska raja otoskoko. Siksi seurantatutkimus tarvitaan suuri potilaalla kohortti seoksella kasvaintyypeissä ja vaiheet vahvistamaan suorituskykyä autovasta poikki kasvain histologialtaan ja tyyppejä, varsinkin, korrelaatio taudin pahanlaatuisen ja autovasta tiitteri. Voidaan kuvitella, että tämä multipleksin Luminex järjestelmä sekä paneeli seitsemän biomarkkereiden voitaisiin käyttää seulomaan suuren riskin väestöstä myöhemmin CT testi perustuu verikoe tulos.

hyödyntäminen immuunivastetta kasvaimia tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden kehittää uusia työkaluja serologisen havaitsemalla syöpä sekä johtoa hoitoa. Testi perustuu osoittamista autovasta tuumoriantigeeneille seerumeissa potilaat voivat olla suuri merkitys syövän varhainen havaitseminen koska pitkittynyt ajan kuluessa syövän synnyn ja koska havaittavissa oleva määrä vasta-aineita karsinogeeni kannustin voisi olla paljon ennen kasvaimen fenotyypin syntyy. Kuten muutkin syövät, keuhkosyöpä kehittyy tulokset suistuminen heterogeeninen ja useita sääntelyn prosesseja. Näin ollen, se ei ole yksi biomerkkiaine, joka on selvitetty. Multipleksoidut biomarkkeri kuviot on huomattavasti korkeampi positiivinen ennustearvo kuin yhden merkkiaineiden erotteleva sairaissa, joilla ei esiinny syöpää valvontaa.

autovasta testi erittäin lupaava, mutta paljon tutkimusta laajat näytteet varmistamiseksi tarvitaan testin luotettavuutta ja mukauttaa tekniikka massaseulontaohjelmien. Lisäksi lääkäreiden täytyy myös oppia, jos varhaisen diagnoosin parantaa tuloksia potilaissa keuhkosyöpää, mikä auttaa tuottamaan vasta-aineita taudin hoitoon. Siksi kaventamalla kuilua perustutkimuksen ja kliinisen käytännön edustaa päätavoitteena lähitulevaisuudessa, jotta lääkärit voivat räätälöidä riskisopeutetun seulonta ja hoito strategioita nykyisen keuhkosyöpäpotilaita.