Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain eloonjääminen on merkitsevästi korreloi immuunivastetta potilaista. IFNy on tärkeä rooli kasvaimen isännän vasteen ja laski IFNy ilmentymistä havaitaan usein keuhkosyöpään. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CpG-saarekkeen hypermetylaation on keskeisessä asemassa transkription hiljentäminen IFNg geenin ilmentymisen. On kuitenkin rajallinen ymmärrys molekyylitason mekanismeja muuttunut metylaation, ja onko kasvain microenvironment on mitään vaikutusta DNA: n metylaation ja IFNy tuotantoa. Nykyisessä tutkimuksessa, osoitamme, että plasman ja solunsisäinen IFNy tasot ovat huomattavasti alhaisemmat keuhkosyöpäpotilaita. Hypermetylaatiota IFNy promoottorin CD4

+ T-solujen ja plasma IFNy oli negatiivinen korrelaatio. CD4

+ T-solut terveiden yksilöiden viljellä yhdessä sellaisten SPC-A1-soluja syntyy alhaisempi IFNg aktivaation jälkeen, kohonnut ilmentyminen DNA: n metyylitransferaaseja (DNMTs), ja sillä oli hypermetylaatiota IFNy-promoottorin. Lopuksi vähentynyt IFNg ilmentyminen CD4

+ T-soluja viljeltiin yhdessä keuhkosyöpäsolua liittyy IFNy-promoottorin hypermetylaatio. Tutkimuksemme osoittaa, että vuorovaikutus keuhkosyövän solujen ja CD4

+ T-solujen indusoi DNMT ilmaisun ja IFNy promoottori hypermetylaation CD4

+ T-solu, joka voi toimia tärkeänä kasvainten aiheuttaman immunosuppressio.

Citation: Wang F, Xu J, Zhu Q, Qin X, Cao Y, Lou J, et al. (2013) alassäätely IFNg CD4

+ T-solujen in Lung Cancer kautta hypermetylaation: Mahdollinen mekanismi kasvainten aiheuttaman Immunosuppressio. PLoS ONE 8 (11): e79064. doi: 10,1371 /journal.pone.0079064

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 2. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 24 syyskuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81371894, 81272324, 81201359, 81101322), Key laboratorio Laboratory Medicine Jiangsun maakunnassa Kiinassa (nro XK201114), rahoittama projekti Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolle Jiangsu Higher Education laitokset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on lyhyt 5 vuoden pysyvyys, koska on vaikea diagnosoida ja hoitaa varhaisessa vaiheessa [1]. Vaikka mekanismeja, keuhkosyövän aloittamisesta ei täysin tunneta, uskotaan, että kasvain poistuu immuunivalvonnan [2].

Sytokiinit ovat osa monimutkaista immuunivasteen, joka voi auttaa syövän kehittymiseen, sekä poistaa sen. On läheinen suhde kasvainprogression ja häiriöstä sytokiiniekspressiota katsottuna varten IFNy, TGF-β, ja IL-17 [3], [4]. Näistä sytokiinien, IFNy, joka löydettiin vuonna 1965 on maine auttaa suojautumaan kasvainsairaus. IFNy estää leviämisen, herkistää kasvainsolut apoptoosiin, jopa säätelee MHC-luokan I ja luokan II ilmentymisen, ja stimuloi kasvaimenvastaista immuuniaktiivisuutta [5], [6]. Vähentynyt IFNy seerumitasot on yhdistetty lyhyempiin eloonjäämisen keuhkosyövän [7]. Näin ollen, selvittämiseen molekyylitason mekanismeja IFNg kasvainten synnyssä on kriittinen on selvempi käsitys kasvaimen synnyssä.

Epigeneettiset muutoksia, kuten histonimodifikaation, DNA: n metylaatio, ja muutokset kromatiinin rakenteessa on osoitettu olevan tärkeä selektiivinen sytokiini geenien T solualaryhmiä. Näistä DNA: n metylaatio on tutkittu laajalti suhteessa sytokiinin geenin ilmentymisen [8] – [10]. Tässä tutkimuksessa tarkastelimme käänteinen korrelaatio IFNg ilmaisun ja DNA: n metylaation keuhkojen potilailla. Vielä tärkeämpää on, arvioimaan, keuhkosyöpään solut voivat vaikuttaa metylaatiostatuksen immuunisolujen mukaan alaspäin säätelemällä IFNy ilmaisun perustimme in vitro siirtokuoppaan viljelemällä järjestelmä ja sitten tutkittiin CpG metylaation IFNy promoottorin CD4

+ T-soluja.

tulokset

IFNy tasot terveiden kontrollien ja keuhkosyöpä Potilaat,

ELISA havaitsemiseen käytettiin plasman IFNy tasoja (Fig. 1A). IFNy tasot keuhkosyöpäpotilaita olivat merkittävästi alhaisemmat (69,30 ± 38,56 pg /ml) kuin terveillä verrokeilla (92,62 ± 34,75 pg /ml,

P

= 0,017).

(A) vertailu plasman IFNg tasojen tutkimusryhmissä. ELISA käytettiin mittaamaan plasman IFNy tasot 30 keuhkosyöpäpotilaita ja 30 tervettä verrokkia. Plasma IFNy tasot potilailla ja terveillä verrokeilla oli 69,30 ± 38,56 pg /ml ja 92,62 ± 34,75 pg /ml (*

P

= 0,017). (B) edustavat tulokset IFNg ilmaisun CD4

+ T-solujen keuhkosyöpään potilailla (n = 2) ja terveiden verrokkien (n = 2). (C) virtaussytometrianalyysin IFNg tasoa tutkimusryhmissä. Tiedot ovat yksittäisiä taajuuden keuhkosyöpään potilailla (n = 9) ja terveiden verrokkien (n = 9). Rekit osoittavat ryhmä tarkoittaa. Riippumattomat t testejä käytettiin laskettaessa

P

arvot (***,

P

0,001).

IFNy tuotetaan pääasiassa CD4

+ T-soluja, vaan myös NK-solujen ja CD8

+ T-soluja. Heijastaa IFNy ilmaisun CD4

+ T-solut, arvioimme CD4

+ T-solujen virtaussytometria-analyysiä. PBMC 9 keuhkosyöpäpotilaita ja 9 tervettä verrokkia kerättiin ja IFNy havaittiin. Alhaisempi taajuus IFNg tuottavien CD4

+ T-soluja havaittiin keuhkosyöpäpotilaita verrattuna terveisiin kontrolleihin (Kuva. 1 B-C, P 0,001).

IFNy geenipromoottorin Metylointi korreloi negatiivisesti IFNy tasot

CD4

+ -T-solut eristettiin PBMC: istä 11 potilasta ja 10 ohjaa. IFNy-geenin promoottori alueille 526 emäsparin pituinen tutkittiin bisulfiitti sekvensoimalla PCR. 15 käänteisjuoste sekvenssit kunkin näytteen pisteytettiin niiden metylaation profiili CpG sivustoja -295, -186, -54, +122, +128 ja +171 suhteessa transkription aloituskohdasta (Fig. 2A).

(A) 526 bp: n alueen IFNy-promoottori monistettiin PCR: n päässä ui bisulfiittikäsiteltyä käänteinen lohkon. Metyloidut sytosiinit resistenttejä vetysulfiittikäsittelyä pisteytettiin 15 kloonatuista PCR sekvenssit kunkin ja merkitään geenissä kartalla kuten CpG (neliöt). (B) Gene kartta metyloitu IFNy promoottori CD4

+ T-solujen kymmenen terveiden verrokkien. Aste metylaatio kussakin CpG sivusto on kuvattu vahvuus varjostus. (C) Gene kartta metyloitu IFNy promoottori CD4

+ T-solujen 11 eri keuhkosyöpäpotilaita. Aste metylaatio kussakin CpG-sivusto on kuvattu kuvattu B (D) IFNy metylaatio CpG sivustoja IFNy promoottori CD4

+ T-solut oli merkitsevää eroa keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla. Esitetyt tiedot ovat prosentin metylaation kunkin IFNy promoottori CpG sivuston. Chi-neliö testi kontingenssitaulukkomenetelmillä käytettiin osoittamaan

P

arvot keuhkosyöpäpotilaita vs terveillä verrokeilla. Vertailut jälkeen pisteytys nimellinen muuttujat keuhkosyöpäpotilaita /terveiden kontrollien ja metyloituja /metyloimattomien jatkuvassa tiedot kunkin CpG-sivuston (virhepalkkien, SD, *,

P

0,05; **,

P

0,01, ***,

P

0,001). (E) Korrelaatio analyysi koko prosentin metylaatio kanssa IFNy plasmakonsentraatiot keuhkosyöpäpotilaita. Korrelaatio analysoitiin Spearmanin kertoimella.

bisulfiittimodifiointi sekvenssi IFNy promoottori keuhkosyöpään potilailla (n = 165 kloonia) osoitti merkittävästi suurempaa metylaation CpG sivustoja suhteessa terveisiin kontrolleihin ( n = 150 kloonia). Yhteensä metylaation CpG sivustoja keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla oli 85,4% ja 71,4%, tässä järjestyksessä (

P

0,001) (taulukko 1). Vertasimme prosenttiosuus erityisten CpG metylaatiokohtia jokaisesta näytteestä. IFNy promoottori CD4

+ T-solut näkyvät hypermetylaation 6 CpG sivustoja potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin (Kuva. 2B, 2C). Erityisesti CpG metylaatio klo IFNy promoottori potilaan CD4

+ T-solut oli merkittävästi suurempi asemissa -186, -54, +122, +128 ja +171 (p 0,01) Pearson Chi-square test (kuvio . 2D). Näistä kantoja, transkriptiotekijän sitoutumiskohtia tapahtuvat -186, -54, jossa sivustoja +122, +128 proksimaalisesti transkription aloituskohdasta.

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi metylaation on IFNg ilmaisun laskimme korrelaatio plasman IFNy pitoisuuden ja metylaation kurssi potilailla. Plasman IFNy pitoisuudet korreloi negatiivisesti prosenttia IFNy-promoottorin metylaation potilaan CD4

+ T-soluja (r = -0,797,

P

= 0,004, Fig. 2E).

Tukahdetut IFNy Expression CD4

+ T solu SPC-A1 TranswellTM Culture System

siirtokuoppaan viljely järjestelmää käytettiin tutkimaan vaikutusta keuhkosyövän solulinjaa SPC-A1 IFNy ilmaus CD4

+ T-solut (Fig. 3A). CD4

+ T-solut eristettiin transwell viljellään järjestelmän SPC-A1 oli huono IFNy tuotannon jälkeen anti-CD3 stimulaatio 6 h tai 24 h. Sitä vastoin CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1 osoitti voimakkaasti IFNy vastetta anti-CD3-stimulaatio 6 h tai 24 h. (

P

0,05;

P

0,05, Fig. 3B). Kvantitatiivisen RT-PCR-analyysi osoitti myös, että CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1 osoitti voimakkaasti IFNy mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun anti-CD3 stimulaatio 6 h tai 24 h, verrattuna CD4

+ T-soluja viljeltiin yhdessä SPC-A1 (

Taita = 2,37, P

0,05;

Taita = 2,37, P

0,05, Fig. 3C).

( A) CD4

+ T-solut viljeltiin yhdessä SPC-A1. CD4

+ T-solujen (6 x 10

5 solua /kuoppa) ja SPC-A1 (2 x 10

5 solua /kuoppa) kasvatettiin erotettu 0,4 um huokoskoko insertin 24-kuoppaisille viljelylevyille . SPC-A1 soluja kasvatettiin ulomman kuoppiin ja CD4

+ T-soluja kasvatettiin suspensiossa sisempi kuoppiin. (B) Tuotanto IFNg CD4

+ T-soluja viljeltiin kanssa tai ilman SPC-A1. Supernatantit kerättiin sen jälkeen kun anti-CD3, tai CD28 stimulaatio 6 tai 24 tuntia, ja IFNy havaita ELISA. Tulokset ovat kokeista suoritettiin CD4

+ T-solujen 6 terveillä vapaaehtoisilla (virhepalkkien, SD). (C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi IFNg selostukset CD4

+ T-soluja viljeltiin kanssa tai ilman SPC-A1. RNA eristettiin sen jälkeen, kun anti-CD3 tai CD28 stimulaatio 6 tai 24 tunnin ajan. Tulokset ovat kokeista suoritettiin CD4

+ T-solut 6 terveillä vapaaehtoisilla. IFNy nousivat 2,37 kertainen stimuloitiin 6 h CD4

+ T-soluja kasvatettiin ilman SPC-A1 verrattuna CD4

+ T-solut on kasvatettu SPC-A1.

hypermetylaation tila IFNy Järjestäjä CD4

+ T-solut viljeltiin yhdessä SPC-A1

metylaatiotilan IFNy promoottorin CD4

+ T-soluja on viljelty ilman SPC-A1 soluissa arvioitiin. Promoottori näytetään hypermetylaatio, kun viljeltiin yhdessä SPC-A1-soluja (n = 90 kloonia), osoitti jyrkästi CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1-soluja (n = 90 kloonia). Prosenttiosuus CpG sivustoja CD4

+ T-soluja viljeltiin kanssa tai ilman SPC-A1 oli 85,4% ja 70,9%, vastaavasti. Lukumäärä Metyloitujen ja metyloimattomien sivustoja pisteytettiin ja Chi-square analyysiä käytettiin arvioimaan p-arvot (***,

P

0,001) (taulukko 2). Sitten verrattiin prosenttia erityisten CpG metylaatiokohtia kunkin ryhmän (Fig. 4A, B). Metylointi prosenttiosuus IFNy promoottori oli 80,0% -95,5% ja 64,4% -78,9%, ja ilman SPC-A1 yhdessä viljelemisen, vastaavasti. CpG sivustoja asemissa -295, -186, -54, +128 ja +171, erityisesti, näkyy merkittäviä eroja (Fig. 4C).

(A) Gene kartta metyloitu IFNy promoottori CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1 6 terveillä vapaaehtoisilla. Aste metylaatio kussakin CpG sivusto on kuvattu vahvuus varjostus. (B) Gene kartta hypermetyloitunut IFNy promoottori CD4

+ T-soluja viljelty SPC-A1 6 terveillä vapaaehtoisilla. Aste metylaatio kussakin CpG sivusto on kuvattu vahvuus varjostus. (C) metylointi CpG sivustoja IFNy promoottori oli merkitsevää eroa CD4

+ T-soluja viljeltiin kanssa tai ilman SPC-A1 soluissa. Kuviossa on yhteenveto prosenttia metyloitu CpG sivuston havaittiin kussakin asemassa analysoitu. IFNy promoottori osoittaa hypermetylaation joukossa CD4

+ T-soluja viljelty SPC-A1 soluissa verrattuna CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1 soluissa. Chi-neliö testi kontingenssitaulukkomenetelmillä käytettiin osoittamaan

P

arvoja. Vertailu CD4

+ T-soluja viljelty SPC-A1 solujen vs CD4

+ T-soluja viljeltiin ilman SPC-A1 soluja (virhepalkkien, SD,

*

P

0,05;

**

P

0,01). (D) Yhteensä RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin määrällisesti DNMT1 ja DNMT3b mRNA-tasoja. MRNA-tasot normalisoitiin P-aktiini. Ne osoittivat olevan suhde CD4

+ T-soluja viljeltiin kanssa tai ilman SPC-A1 soluja, kolmesta itsenäisestä kokeesta, ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

DNMT1 ja DNMT3b mRNA-tasot CD4

+ T-soluja viljelty SPC-A1 solut kasvoivat säänneltyä verrattuna CD4

+ T-soluja viljeltiin yksinään (DNMT1 taittaa = 2,7,

P

0,05; DNMT3b kertainen = 2.2,

P

0,05).

keskustelu

selvemmän kuvan dynaamisen suhteen isännän immuunijärjestelmää ja kasvaimen kasvu on nousemassa solujen ja molekyylien osallistua luonnon anti-kasvain immuunivasteen on tunnistettu [11], [12]. Isäntä immuunijärjestelmän aktivoituminen IFNy on ratkaiseva kasvaimen vastaisen vasteen. Tuore tutkimus osoitti, että IFNy on tärkeää kasvaimen valvontaa immuunijärjestelmää ja että oli suuri korrelaatio IFNy tuotannon ja kasvaimen regressio immunoterapian aikana [5]. Hiiret puuttuu tai puutteellisia IFNy reseptorien tai STAT1 kehittynyt kasvaimia nopeammin, ja oli korkeampi kasvain taajuudella kuin villityypin hiirissä haasteen metyylikolantreinikäsittelys- [13], [14].

On hyvin tunnettua, että sytokiiniekspressiota ohjataan verkon transkriptiotekijöiden ja epigeneettiset muutokset [15] – [18]. Ihmisellä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että IFNy tuotanto aikuisten ääreisverenkierron ja napanuoraverestä säätelee CpG metylaation sivustojen tai vieressä IFNy promoottori CD4

+ /CD45RO

– T-solujen [19], [20]. Lisäksi rooli IFNy promoottori metylaation atooppisen oireyhtymää on ehdotettu [21], joka osoitti Metylointia mekanismi valvoa ilmaisua. Keuhkoastma potilaalla näyttää hypermetylaatiota IFNy geenin CD4

+ T-solujen seuraavat allergeenialtistuksen joka korreloi vähentynyt IFNy ilme [22], [23]. Samanlaisia ​​tuloksia on myös raportoitu PBMC akuutista vs. krooninen hepatiitti B maksan vajaatoiminta ja paksusuolen syöpäpotilaiden [24], [25]. Kaikki nämä havainnot viittaavat DNA: n metylaatio on tärkeä epigeneettiset mekanismi, johon on IFNy ilmaisun asetuksessa.

Tutkimuksessamme havaitsimme vähentynyt plasman IFNg ja solunsisäisen IFNy CD4

+ T-solujen keuhkosyöpään potilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että IFNy ilmaistu alempana keuhkosyöpä. Varaamiseen todistusaineisto on sekaantunut CpG metylaation IFNy promoottori tärkeänä negatiivinen transkription säätelijä IFNg tuotantoa ihmisen T-soluissa [26], [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme käytetään bisulfiitti sekvensointi määrittää CpG metylaatiostatuksen IFNy-promoottorin. Merkittävä negatiivinen korrelaatio IFNy plasmassa ja yhteensä IFNy promoottori metylaatio CD4

+ T-solujen keuhkosyöpäpotilaiden havaittiin. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus viittaa siihen, että IFNy promoottori metylaatio saattaa vaikuttaa IFNy ilmentymistä keuhkosyövässä. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​havaintojen että epigeneettiset metylaatiostatuksen IFNg voi olla ratkaiseva rooli moduloivan limakalvon sytokiinien eritystä [28] ja astmaa potilailla [22].

Vertasimme myös metylaatiostatuksen useiden CpG sivustoja. Vuonna keuhkosyöpäpotilaita, viisi kuudesta CpG sivustoja (-295, -186, -54, +122, +128, +171) analysoitiin merkittävästi hypermetyloitunut (ainoana poikkeuksena oli päällä -295). Erityisesti aste metylaation nousi näkyvästi +122 ja +128, mikä viittaa läheinen suhde IFNy ilme. Löysimme merkittävä kasvu aste metylaation asemissa -295, -186, -54, +128 ja +171 (muuttamatta työmaalla +122) CD4

+ T-solut viljeltiin yhdessä keuhkojen adenokarsinoomasolulinjaan line SPC-A1. Erityisesti aste metylaation nousi näkyvästi asemissa -54, +128 ja +171. Tämä tulos osoitti hieman eroa tuloksesta havaittiin keuhkosyöpäpotilaita, koska olemassaolo ympäristön vaihtelut in vitro ja in vivo kunnossa.

On suurta kiinnostusta paremmin ymmärtämään molekyylitason mekanismit johtavat muuttuneeseen metyloinnin IFNy-geenin promoottori aikana tuumorigeneesin [29], [30]. Viime aikoihin asti on ollut vain vähän tietoa siitä, keuhkosyövän solut toimivat suoraan immuunijärjestelmän solujen indusoimiseksi hypermetylaatiota IFNy-promoottorin. Meidän tutkimus, hypermetylaation tila CD4

+ T-solujen keuhkosyöpäpotilaita viittaa siihen, että läsnäolo syöpäsolujen voi myötävaikuttaa muuttuneeseen mentymisprofiili.

mikroympäristöihin on ratkaiseva merkitys syövän etenemiseen, jossa immuunijärjestelmä kestävä kasvain vaihtoehdot valitaan [31]. Kasvainperäinen liukoisen tekijät pakottaa eri mekanismeja paeta immuunihyökkäyksen kasvaimen mikroympäristössä [32], [33]. Vuonna siirtokuoppaan viljelemällä järjestelmää sovelletaan täällä, löysimme selviä eroja epigeneettiset sääntelyn IFNy promottorista CD4

+ T-soluja terveistä yksilöistä viljelty ilman SPC-A1. Tuloksena IFNg promoottorin metylaation CpG-sivustojen osoitettu hypermetylaation oli samanlainen kuin havaittiin CD4

+ T-solujen keuhkosyöpäpotilaiden (85,4% vs. 85,4%), joka syntyy alhaisempi IFNg aktivoinnin. Mielenkiintoista, Janson et ai oli raportoitu, että kasvaimen infiltroituneen CD4

+ T-solut sopimattomasti hypermetyloitunut paksusuolen syöpäpotilaiden [34].

SPC-A1 solut voisivat toimia CD4

+ T-solut terveillä vapaaehtoisilla aiheuttavan hypermetylaation ilman suoraa kosketusta, jotka viittaavat liukoisen, kontaktiton riippuvainen mikro-tekijä (t). Tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n metylaatio on katalysoivat DNMTs, mukaan lukien ylläpito metyylitransferaasi DNMT1, joka vaikuttaa hemi-metyloitu substraattien säilyttämään metylaation DNA-replikaation jälkeen [35], [36]. Lisäksi, on olemassa de novo metyylitransferaasit DNMT3a ja DNMT3b, jotka katalysoivat metylaatio metyloitumattoman DNA: n [37], [38]. Muutoksia DNMT ilmentyminen korreloi muutoksiin genomisen DNA: n metylaatio, ja on kuvattu hyvin monissa syövissä [39] – [44]. Kun tarkastelu DNMT ilmentymismalleja mallissamme, havaitsimme selvästi lisääntynyt DNMT1 ja DNMT3b mRNA ilmaisun CD4

+ T-soluja viljelty SPC-A1 soluissa. Siksi me arveltu, että liukoinen, kontaktiton riippuvat tekijät voivat aiheuttaa hypermetylaatiota IFNy promoottori stimuloimalla DNA metyylitransferaasiaktiivisuus, joka sitten downregulate IFNy eritystä. Nämä tekijät voivat olla sytokiinien, nukleiinihappoja, tai MikroRNA erittyy tai johdettu keuhkosyövän soluihin [45] – [47]. Kuitenkin lisätutkimusta tarvitaan vahvistavat tämän hypoteesin. Nämä in vitro -tulokset viittaavat siihen, että promoottori metylaatio saattaa vaikuttaa IFNy ilmentyminen keuhkosyöpäpotilaita. Metylointi välittämä IFNy pienenee voivat hyötyä kasvain selviytymisen ja tasapainon siirtämiseksi kasvainimmuniteetin kohti syövän etenemiseen.

Olemme aiemmin osoittaneet, että vähentynyt ilmentyminen tuumorisuppressorigeeneille liittyy poikkeavaan CpG-saarekkeen metylaation geenin promoottori alueilla keuhkojen syöpäpotilailla, ja tätä ilmaisua voidaan palauttaa demetyloimalla [48]. Tämä viittasi siihen, että demetylaation kuten välittämä 5-atsa-dC voisi olla hyödyllinen lähestymistapa hoitoon keuhkosyöpään [48] – [50]. Näin ollen, keuhko- syöpä demetylaation, mikä lisää ilmentyminen ei ainoastaan ​​tuumorisuppressorigeeneille, mutta myös sytokiinien geenejä, kuten IFNy, suojaavat kasvaimia.

Lopuksi, IFNy-promoottori metylaatio liittyy pienentynyt IFNy ilmentyminen keuhkosyöpäpotilaita. Vuorovaikutus keuhkosyövän solujen ja CD4

+ T-solujen indusoi hypermetylaatiota IFNy-promoottorin CD4

+ T-solut, jotka toimivat mekanismi kasvainten aiheuttaman immunosuppressio.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi valiokunnan etiikka ihmisten hoitoon ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University (Luvan numero: 20A6-2869) ja kirjallinen suostumus saatiin myös jokaiselle osallistujalle.

valinta keuhkosyöpäpotilaiden ja terveillä verrokeilla

Keuhkosyöpä potilailla (N = 30) ja terveillä aikuisilla (N = 30) olivat ensimmäisestä sidoksissa sairaalaan Nanjing Medical University (Nanjing, Kiina). Keuhkosyöpäpotilaita diagnosoitiin syöpä patologisen diagnoosin. Potilailla, jotka saivat ennen leikkausta kemoterapiaa, sädehoitoa tai käyttöön ennen keräämistä verinäyte oli jätetty. Yksityiskohtaiset kliiniset tiedot (kuten ikä, sukupuoli, tupakointi historia) saatiin kunkin objektin potilastiedot ja taulukossa 3. Niistä keuhkosyöpäpotilaita oli 24 tapausta adenokarsinooma, 2 tapausta squamous karsinooma, 2 tapausta alveolaarinen karsinooma , ja 2 tapausta huonosti eriytetty syöpä.

veren Näytteenotto ja käsittely

Laskimoverta (10 ml), jossa EDTA-K

2 kerättiin terveiden verrokkien ja keuhkojen syöpäpotilailla ennen käyttöä. Plasma erotettiin ja varastoitiin -70 ° C: ssa ennen mittausta IFNy. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) erotettiin Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoinnilla (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). CD4

+ -T-solut eristettiin PBMC: istä käyttäen CD4-positiivisia eristyspakkausta (Dynal, Oslo, Norja). Puhtaus eristetty CD4

+ T-solujen määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä PE-konjugoitu anti-CD4 (Beckman, Marseille, Ranska). CD4

+ T-solut kerättiin sitten DNA: n eristämiseksi, bisulfiittimodifikaatio, ja sekvensointi.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen NSCLC solulinja SPC-A1 hankittiin Kiinan Academy of Sciences Shanghaissa, ja viljeltiin 5% CO

2 RPMI 1640 2 mmol /l L-glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), penisilliini G (50 U /ml ), ja streptomysiinillä (50 ug /ml).

CD4

+ T Cells Co-viljeltiin Transwell viljely System

Transwell kokeet suoritettiin 24-kuoppaisilla levyillä, joissa huokoskoko 0,4 pm (Corning Costar, Corning, NY, USA). SPC-A1-soluja (2 x 10

5) viljeltiin ulomman kuoppiin 24-kuoppalevyillä 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% ihmisen AB-seerumia. CD4

+ T-solujen (6 x 10

5) erillään tervettä aikuista lisättiin sisempään kuoppiin samassa väliaineessa. Kuten on esitetty kuviossa. 3, kontrollihiiriä perustettu CD4

+ T-solut kasvavat sisä- kuoppiin ilman SPC-A1 soluissa. 5 päivän kuluttua viljelyn, CD4

+ T-solut pestiin, ja 1 x 10

6 solut kerättiin DNA: n eristämiseksi, kun taas loput siirrettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille. 5 x 10

4 solua /kuoppa stimuloitiin 1 ug /ml liukoista anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA, USA) ja 1 ug /ml liukoista anti-CD28 (eBioscience) (yhteensä 200 ui ui) 6 tai 24 tunnin ajan. Jälkeen stimuloiva, supernatantit kerättiin IFNy havaitsemista ELISA: lla, CD4

+ T-solut kerättiin IFNy mRNA: n analyysi.

ELISA

IFNy tasot viljelmäsupernatanteissa ja plasma määritettiin ELISA: lla (R IFN-γ-käänteisfaasi, 5′-TGT CTT CCT TGA TGG TCT CCA CAC-3 ’; DNMT1 eteenpäin, 5’-GAT CGA ATT CAT GCC GGC GCG TAC CGC CCC AG-3 ’; DNMT1-käänteinen, 5’-ATG GTG GTT TGC CTG GTG C-3 ’; DNMT3b eteenpäin, 5’-CCT GCT GAA TTA CTC ACG CCC C-3 ’; DNMT3b-käänteinen, 5’-GTC TGT GTA GTG CAC AGG AAA GCC-3 ’; β-aktiini-eteenpäin, 5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 ’; β-aktiini-käänteinen, 5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3 ’. Ct-arvot normalisoitiin ilmaisun CD4

+ T-soluja käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmä ja β-aktiini kuin taloudenhoito geeni. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset kolmen erillisen kokeen keskiarvo laskettiin.

DNA eristäminen ja metylointianalyysi

metylointianalyysi suoritettiin käyttäen bisulfiitti sekvensointia. Genomi-DNA CD4

+ T-soluja eristettiin käyttäen QIAamp Mini Kit (Qiagen), kuten valmistajan suosittelemia. DNA oli bisulfiitti muunnetaan CpGenome ™ DNA muutos Kit (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet, joita käytettiin monistamaan IFNy-promoottori olivat: IFNy-eteenpäin, 5′-TGT GAA TGA AGA GTT AAT ATT TTA TTA-3 ’; IFNy-käänteinen, 5’-TTG GTA GTA ATA GTT AAG AGA ATT TA-3 ’[19]. PCR-tuotteet muodostettiin käyttäen ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta templaattina.

näkyvin PCR-vyöhyke erotettiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla ja puhdistettiin geelistä uuttamalla (Qiagen), käsiteltiin TA-kloonausvektoriin käyttämällä DNA-Tailing (TaKaRa), ja sekvensoitiin ABI 3730 (Applied Biosystems). Kaikki toiminnot suoritettiin GeneScript Corporation (kiinalais-Amerikassa yhteisyritys, Nanjing, Kiina). Sekvenssit analysoitiin Bioinformatiikkaohjelmistojen täyteläisyyden versio 1,45 (Technelysium, South Brisbane, Australia).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 16.0 ohjelmistoa (IBM, Chicago, IL, USA). Riippumattomat t testejä käytettiin verrattaessa plasman IFNy tasoja ja solunsisäistä erot potilaiden ja terveiden verrokkien. Tiedot on koottu keskiarvona ± SD. Metylointi eroja IFNy promoottori eri ryhmien arvioitiin käyttämällä Pearsonin Chi-square testi.

P

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Olemme kiitollisia teknistä tukea National Key Clinical osasto laboratoriolääketieteen Jiangsun maakunnassa sairaala.