Krooninen sairaus

tiivistelmä

havaitsemiseen ja hoitoon syöpä on edennyt merkittävästi viimeisen useita vuosikymmeniä, tärkeitä parannuksia käsityksemme perustavaa laatua molekyyli- ja geneettisen perustan taudin. Huolimatta näistä edistysaskeleista, huumeisiin seulonta menetelmiä ovat pysyneet pääosin ennallaan käyttöönoton jälkeen

in vitro

ihmisen solulinjassa näyttö vuonna 1990. Vaikka nykyiset menetelmät antavat tietoa yleisestä Yhdisteiden vaikutukset solun elinkelpoisuutta, ne ovat rajoittaa bulk mittauksia, suuret otoskoot, ja puute kyky mitata leviämisen kinetiikkaa yksittäisen solun tasolla. Todella ymmärtää luonteen syöpäsolujen lisääntymistä ja kehittää yksilöllisiä adjuvanttia hoitoja, on olemassa tarve uusista menetelmistä, jotka tarjoavat määrällistä tarkkailutiedoista vaikutusta lääkeaineiden solujen kasvuun sekä morfologisia ja fenotyyppisiä muutoksia yksittäisen solun tasolla. Tässä osoitamme, että määrällinen vaihe kuvantamismodaliteetin tunnetaan spatiaalinen valon puuttumista mikroskopialla (SLIM) puututaan näihin tarpeisiin ja siinä on useita etuja verrattuna nykyisiin lisääntymismäärityksissä. Osoitamme nämä ominaisuudet mittaamalla vaikutuksista hormonin estradiolin ja antiestrogeeni ICI182,780 (Faslodex) kasvuun MCF-7 rintasyövän soluja. Yhdessä tiedottaminen muutosten yleistä kasvua, SLIM tarjoaa lisää biologisesti tarvittavat tiedot. Esimerkiksi huomaamme, että altistuminen estradioli tuloksia nopeasti lisääntyviä soluja pienemmillä kuivamassa kuin vertailupopulaatiossa. Tämän jälkeen estää estrogeenireseptorin kanssa ICI johtaa hitaampaan solujen kasvuun pienemmillä kuivia massoja kuin kontrolli. Tämä kyky mitata muutoksia kasvukinetiikat vastauksena ympäristöolosuhteissa tarjoaa uutta tietoa kasvuun sääntelymekanismeja. Tuloksemme vahvistaa valmiuksia SLIM kuin kehittynyt lääkeaineiden seulonta teknologiaa, joka tarjoaa tietoa muutoksista leviämisen kinetiikkaa solutasolla herkemmäksi kuin kaikki nykyiset menetelmällä.

Citation: Mir M, Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) Erittäin herkkä Quantitative Imaging Monitoring Yhden Cancer Cell Growth Kinetics and Drug Response. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10,1371 /journal.pone.0089000

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 lokakuu 2013; Hyväksytty: 13 tammikuu 2014; Julkaistu: 18 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Mir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation (NSF) Avustukset: Science and Technology Center emergentin käyttäytymisen Integrated Cellular Systems CBET 0939511 (GP), NSF URA 08-46660 (GP), CBET-1040461 MK (GP), rintojen Cancer Research Foundation (BSK), National Institutes of Health (NIH) P50 AT006268 (BSK) ja tutkijatohtori Fellowship puolustusministeriön, W81XWH-09-1-0398 (ja AB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: G. Popescu on taloudellisten etujen Phi Optics, Inc., yhtiö kehittää määrällinen vaihe mikroskoopit, joka kuitenkaan ei sponsoroi tätä tutkimusta. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Solun kasvun ja massan homeostaasiin on kuvattu olennainen biologian, mutta ne eivät ole riittävän ymmärtänyt [1]. Tämä puute voidaan jäljittää puutteesta menetelmiä, joilla määrällisesti yhden solun massa vaaditulla herkkyydellä. Tämän seurauksena viime aikoina merkittävää edistystä on tapahtunut kohti kehittävä opiskeluun solujen kasvua. Nämä menetelmät voidaan jakaa

mikromekaaninen

[2] – [4], kääntäminen resonanssitaajuus siirtyy mikrostruktuurien soluun noste massa, ja

optinen

[5] – [8], muuntamalla kvantitatiivinen vaihe kuvat kuivaan massatiheys karttoja. Optiset menetelmät soveltuvat erinomaisesti opiskeluun kasvun kiinnittyneet yksittäisten solujen sekä soluklusterien. Tämä ominaisuus avaa uusia mahdollisuuksia syövän solubiologian, jossa herkkä mittaukset solujen lisääntymisen voi johtaa parempiin tietämys sairaudesta sekä määrällinen seurata lääkkeen tehosta. Tässä osoitamme, että

kvantitatiivinen vaihe kuvantaminen (QPI) B tarjoaa erittäin herkkä menetelmä opiskeluun syöpäsolujen kasvua ja testaamiseen huumeita. Käytämme rintasyövän solulinjoissa mallina todistetaan periaatetta menetelmämme.

Rintasyöpä osuus on 30% kaikista diagnosoitu syöpätapauksista ja 14% kaikista syöpään liittyvät kuolemat naisten [9]. Merkittävä vähennys (7%) ilmaantuvuuden on havaittu vuodesta 2002, jotka voidaan katsoa johtuvan suoraan ymmärtää paremmin välisestä estrogeenin ja kasvua rintasyövän [10] – [16]. Tämä tieto on johtanut kehitystä luokan aineet, jotka suoraan moduloivat estrogeenireseptori (ER), ja ne ovat nyt kulmakivi hoitoon ja ehkäisyyn ER positiivisilla potilailla (70% kaikista tapauksista) [17]. Toteutumiseen, että on mahdollista valvoa syövän kasvua antihormooneista ja kemoterapeuttiset aineet tulivat tarvetta suuren mittakaavan testaukseen mahdollisesti hyödyllisiä yhdisteitä. Vuoteen 1974 yli 40000 yhdisteet testataan vuosittain käyttäen hiiren malleissa [18], [19]. Vuonna 1990 NCI perustettu ensisijainen näyttö 59 ​​ihmisen solulinjoista, joka on edelleen käytössä tänään [20], [21]. Tämä uusi ensiölajittimesta tarvitaan menetelmiä, joilla arvioidaan kasvun

in vitro

. Useita metabolisen määrityksiä kehitettiin mittaamaan solujen kasvua ja kannattavuuden -joka tähän mennessä ovat pysyneet pääosin ennallaan [20], [22] – [26].

laajalti käytetty lähestymistapa perustuu pelkistämällä väritön tetratsoliumsuolan, jolloin saatiin värillinen formozan verrannollinen elävien solujen lukumäärään. Vaikka tällaiset määritykset ovat käyttökelpoisia mitattaessa yleistä sytotoksista tehoa yhdisteen, suuri määrä soluja (10

3-10

5) [27], on käytettävä, jotta vältetään vääriä johtopäätöksiä vaikutuksilta, kuten muuttuja kahdentumisajoista [20]. Lisäksi koska monet lääkkeet ovat vaikutuksia solukierron pysähtymisen jotka eivät aiheuta aineenvaihdunnan muutoksia, joissakin tapauksissa väärän lukeman voidaan tehdä [28]. Ei-tetratsolium perustuvia määrityksiä on kehitetty. Nämä määrityksissä käytetään väriaineita, jotka sitoutuvat sähköstaattisesti perus aminohappoja [25] ja mitatun signaalin siten lineaarinen kanssa solujen määrä. Huolimatta käytännön vaikeuksia, yksi tällainen reagenssi tunnetaan sulforodamiini B (SRB) hyväksyttiin lopulta tavanomaisesta näytöksiin. Molemmat määritys tyypit tarjoavat välillisiä mittauksia kasvu: tetratsoliumsuo- perustuvissa määrityksissä mittaamaan aineenvaihdunta taas SRB määritys olennaisesti mittaa kokonaisproteiinipitoisuus. Molemmat menetelmät luottaa käytetään suuria määriä soluja, antaa vain bulk mittauksia koko kokoelma soluja, ja jotka eivät voi mitata aikaa riippuvainen vastausten huumeiden solutasolla. Tyypillisesti kasvun määritys tietoja täydennetään fluoresenssidetektoriin soluerotte- (FACS) kokeissa tarjota lisää tilastotietoja, ja tutkia geenien ilmentyminen ja solusyklin etenemisen. Vaikka erittäin informatiivinen, FACS-analyysit vaativat solujen poistamista niiden tavanomaisen viljelyolosuhteissa, soluklustereita erottaa, jotka aiheuttavat muutoksia fenotyypin ja morfologia.

Siksi on yhä selvemmäksi, että todella ymmärtää luonteen syöpäsolujen lisääntymistä ja kehittää yksilöllisiä adjuvanttia hoitoja, on olemassa tarve uusista menetelmistä, jotka tarjoavat määrällistä tietoa seurata lääkkeen vaikutukset solujen kasvua seuranneen morfologiset ja fenotyyppisiä muutoksia yksittäisen solun tasolla. Ihanteellinen lääkeaine näytön tulisi olla riittävän herkkiä arvioida nopeasti vaste pieni määrä solujen erilaisia ​​mahdollisia hoitoja, jotta suoraan arvioida vaste potilaan tai tehoa tietyn lääkkeen. Tässä osoitamme, että QPI [29] käsitellään tätä teknistä kuilua. Spatial valon puuttumista mikroskopialla (SLIM) [30] on QPI lähestymistapa, joka on femtogram taso herkkä muutoksille kuivamassa ja voi samanaikaisesti tarjota näitä tietoja sekä yhden solun ja väestötasolla [31]. SLIM voidaan yhdistää fluoresenssimikroskopialla mitata solusyklin riippuvaista kasvua [31]. Tässä työssä, käytämme estrogeenireseptorin (ER) -positiivinen MCF-7 rintasyövän solulinjassa [32], [33] mallina järjestelmä, osoittaa, että SLIM voidaan käyttää erittäin herkän lääkeaineen lisääntymisen määritys.

MCF-7 solulinja on laajasti käytetty malli opiskeluun hormonaalista vaikutusta rintasyövän kasvua, etenkin, vastauksena estrogeenit, jolla on keskeinen rooli edistettäessä kasvua ja etenemistä syöpäsoluja. Mittasimme MCF-7 soluklusterien standardissa soluviljelyalustoissa (Veh) ja vaikutuksen alaisena estradioli (E2), vallitseva muoto estrogeenin aikana lisääntymis- vuotta, ja ICI, 182, 780 – joka tunnetaan myös Faslodex- [ ,,,0],34], täydellinen antagonisti ER käytetään hoitamaan metastaattisen rintasyövän postmenopausaalisilla naisilla. Tulokset kuvassa vahvistaa, että sen lisäksi, että arvokas proliferaatiomääritys, kvantitatiivinen vaihe kuvantaminen myös biologisesti merkitykselliset tiedot yksittäisen solun ja soluklusterin väestötasolla, joka ei ole saatavilla muilla menetelmillä. Tällaiset mittaukset, yhdessä olemassa olevien molekyylien määrityksissä on mahdollista parantaa huumeiden suunnitteluun ja luonnehdinta sekä kuroa yhteys meidän molekyylitason ymmärtäminen syövän ja lääkehoidon vaikutukset solujen kasvuun ja fenotyyppiset ominaisuudet kuten solukoko /massa.

tulokset

MCF-7-solut ympättiin kahden hyvin dia kammio ja mittaukset suoritettiin kolmessa soluviljelmässä (katso

Materiaalit ja menetelmät

lisätietoja soluviljelmissä ja hoito) . Ensinnäkin tyypillinen solun kasvua median ohjaus ajoneuvon (Veh), toisen solun kasvun elatusaineessa, joka sisälsi 10 nM estradiolia (E2), ja lopuksi solujen kasvualustojen antiestrogeeni 1 uM ICI182,780 +10 nM E2 (E2 + ICI). E2 + ICI hoito, soluja kasvatettiin E2 olosuhteissa 10 tuntia ennen ICI lisättiin. 10-tunnin kohdalla valittiin lääkkeen antamiseksi, koska tämä on varhaisin piste, jossa merkittävä ero kasvuvauhdin Veh ja E2-käsitelty populaatioiden havaittiin (Fig. S1). 1,55 × 1,16 mm

2 ala Kunkin kuopan skannattu 30 minuutin välein käyttäen kaupallista faasikontrastimikroskooppia varustettu SLIM lisämoduuli. Kutakin koetta varten, yksi kuoppa sisälsi käsittelemätön kontrolli väestöstä (Veh) ja toinen hyvin sisälsi E2 tai E2 + ICI käsiteltiin väestöstä. Kaksi mittaukset suoritettiin siten, kunkin kunnossa. Kaikki tiedot vapaasti saatavilla pyydettäessä.

Kaavamainen instrumentin ja edustava SLIM kuvaa yhdestä hyvin esitetään kuviossa. 1 A ja B vastaavasti. SLIM ylläpitää subsellulaarisista resoluutio (Fig. 1 B) laajalle alueelle skannaamalla kukin kammio on mosaiikki kuvio (lisätietoja mittaus viittaavat

Materiaalit ja menetelmät

). Suurista mosaiikki kuvia, reunat yksittäisten klustereita (joka koostuu 2-3 solujen t = 0 tuntia) jäljitettiin kunakin ajankohtana ja pinta-ala ja koko kuiva massa mitattiin (katso Movie S1 Viivästys on näkökenttä kaikille ryhmille). Tällä tavalla voimme analysoida sekä yleistä kasvutrendeihin kustakin ryhmästä ja heterogeenisyys ryhmätasolla kussakin väestöstä. On huomattava, että tämän tyyppinen mittaus on tällä hetkellä mahdoton suorittaa olemassa oleviin proliferaatioanalyysi.

(A) Kaaviokuva koejärjestely. Täysin automatisoitu kaupallinen vaihekontrastimikroskoopilla varustettu vaiheessa top inkubaation ohjaus ja x, y, z-skannata käytettiin skannata 1,5 mm x 1,2 mm alue kussakin kuopassa 2 hyvin liukuvat 30 minuutin välein. Komponentit katkoviivan käsittävät SLIM lisämoduuli: Fourier linssi 1 (FL1) projisoi oppilas tasossa vaihekontrastimikroskoopilla päälle nestekidefaasissa modulaattori (LCPM), joka tarjoaa valvoa vaihe viive hajallaan ja un-hajallaan valossa; Fourier Lens 2 projekteissa vaihemoduloitu kuvan päälle CCD. Kaikki osat instrumentin olivat synkronoitu avulla CPU. (B) edustavat kuvat skannattu näkökentän yksi kammioista 0 tuntia ja 94 tuntia, alue katkoviiva keltainen viiva on laajentunut ja esitetty kunakin ajankohtana (keltainen asteikko bar on 50 mikronia). (C) keskimääräiseksi pinta-ala klustereiden kussakin ryhmässä leimatun ajanjaksoina. (D) keskimääräiseksi massa klustereiden kussakin ryhmässä leimatun ajanjaksoina. (C-D) Square markkereita osoittavat keskiarvon, keskiviiva on mediaani, top of box on 25

persentiilin linja, pohja on 75

persentiilin linja, whiskers osoittavat 5

th ja 95

th persentiilit , merkittävyys testattiin YK-pariksi t-testi, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (E) WST-1 runsaudenmäärityksessä mittaus 72 tuntia.

ajalliset muutokset Massa ja Area

Ensinnäkin vahvistaa valmiuksia SLIM kuin lulisäkasvumäärityksessä mittaamalla vaikutukset Estradioli suhteellisesta muutoksia kasvu, joka on laadullisesti samanlainen toimittamien tietojen tavanomaisissa määrityksissä. Määrät kiinnostavia tässä ovat suhteelliset määrät koon kasvun ja massan, ei absoluuttisia arvoja. Voit suorittaa tämän analyysin massa ja pinta-ala kunkin klusterin normalisoidaan suhteessa sen alkuperäiseen kokoon, M (t) /M (t = 0) ja Area (t) /alue (t = 0), tässä järjestyksessä. Normalisoitu alue ja massa kaikille analysoitiin klustereita (vähintään 5 ryhmää kohti) erotettiin 15 tunnin astiat, kuten kuvioissa. 1C ja 1D. Ei ole mitään merkittävää eroa normalisoitu alueella jokaisessa aikapisteessä. Sitä vastoin erot normalisoitu massa on havaittavissa koko mittauksen ajan (Fig. 1 C-D). Tämä korostaa massojen mittauksessa eikä pelkästään alueen klusterin. Lisäksi ICI hoito vaikutus alkaa nopeasti kuin E2 ryhmä esiintyy suurempi suhteellinen kasvu massa 30 tunnin kuluessa. Ero E2 + ICI ja kontrolliryhmän voidaan havaita 60 tunnin ajan. On huomattava, että vaikka nykyisen lisääntymismäärityksissä luottaa käyttäen suurta määrää soluja, Slim-mittaukset suoritettiin yksittäisten klusterin tasolla.

Vertailu Kolorimetrinen

Vertailun mittauksia WST-1 määrityksessä otetaan 72 tunnin jälkeen hoidon on esitetty kuvassa. 1E. Voidaan nähdä, että on olemassa hyvä laadullinen välisen WST-1 data, joka epäsuorasti osoittaa proliferaationopeus, ja normalisoitu alue mittausten jälkeen 75 tuntia. Kuitenkin normalisoitu massa on suurempi kontrolli kuin E2 + ICI ryhmän jälkeen 60 tuntia. Nämä erot ovat todennäköisesti koska WST-1-määritys mittaa yksinkertaisesti vähentää tetratsoliumvärin solun ulkopuolelle. Vaikka taso tämän vähennyksen on sukua metabolista aktiivisuutta solujen ja heijastaa elinkykyisten solujen populaation, se ei ole suora mittaus solujen massan tai kokoa. Lisäksi tällaisia ​​määrityksiä on rajoitettu tarjoaa yhden numeron irtotavarana väestö eivätkä ne tuota käytännöllinen tapa tutkia heterogeenisuus väestöstä. Jotta voidaan paremmin havainnollistaa mitattua vaihtelua datan normalisoitu massa ja pinta-ala yksittäisten klusterit on esitetty kuviossa. 2.

(A) Normalized massa vs. aika kaikille klustereita, jotka analysoitiin. (B) Normalized ala vs. aikaa kaikille klustereita. (A-B) Katkoviivat osoittavat yksittäisiä klusterin tiedot ja kiinteät viivat osoittavat keskimäärin data. Katkoviivat osoittavat missä ryhmien välinen ero tulee merkittäväksi.

ajalliset muutokset Mass Growth Rate

Sen lisäksi, että määrällinen ymmärrystä siitä, miten erilaisia ​​hoitoja vaikuttavat suhteelliset muutokset koon ja massan , SLIM voi myös mitata muutoksia kasvuvauhti pienisoluisen klusterien ajan funktiona tai kokoa. Mittaamalla kasvu korkea herkkyys on enemmän informatiivinen kuin vain mitata suhteelliset muutokset massa, koska se antaa ymmärtää, kun hoidot alkavat vaikuttaa ja kuinka kauan vaikutus kestää. Kuiva massatiheys karttoja tyypillisiä klusterien kustakin ryhmästä ajan on esitetty kuvassa. 3A (katso Elokuva S2). Kuva. 3B esittää kasvuvauhti klustereita kussakin ryhmässä vs. aika. Merkittävä ero kasvu kaikkien kolmen ryhmän voidaan havaita jo 15 tuntia (5 tuntia ICI hoito annettiin), joka on 15 tuntia aikaisemmin kuin havaittava muutos sekä alueen ja massa. Lisäksi, vaikka normalisoitu massa on suurempi E2 + ICI ryhmässä kuin kontrolliryhmässä jopa 60 tuntia, kasvuvauhti valvonnan ylittää E2 + ICI ryhmä 45 tuntia. Se voidaan myös nähdä, että vaikka klustereita E2 ryhmässä paljon suurempaa suhteellisten massojen ja alueilla kuin kontrolli, ei ole merkittävää eroa kasvun kahden ryhmän välillä sen jälkeen, kun 90 tuntia.

(A) kemiallinen massatiheys karttoja edustajan klusterien kustakin ryhmästä MCF-7-rintasyöpäsolujen jokaisessa 22 tuntia. Värit osoittavat kuiva massa tiheys jokaisen pikselin osoittamalla väripalkkia. Keltainen Mittakaavapalkki on 50 mikronia. Huomaa, että E2 + ICI ryhmä, ICI lisättiin kuhunkin näytteeseen 10 tuntia. (B) Cluster kasvuvauhti kussakin ryhmässä esitetyssä ajassa. (C) Cluster kasvuvauhti kussakin ryhmässä funktiona normalisoitu massasta. Yhtenäiset viivat näkyvät ohjeena silmän määrittää, miten kasvuvauhti on muuttumassa funktiona massan kasvua. (B-C) Square markkereita osoittavat keskiarvon, keskiviiva on mediaani, top of box on 25

persentiilin linja, pohja on 75

persentiilin linja, whiskers osoittavat 5

th ja 95

th persentiilit , merkittävyys testattiin YK-pariksi t-testi, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001.

piirtämällä kasvuvauhti funktiona normalisoitua massa (Fig. 3C) kasvutrendi (eksponentiaalinen tai lineaarinen) ryhmien voidaan määrittää. Voidaan nähdä, että keskimääräinen kasvuvauhti klustereita E2 ja Veh ryhmien kasvaa edelleen, kunnes 4-kertainen nousu massa on saavutettu, minkä jälkeen kasvunopeus on joko stabiili tai vähenee. Tämä suuntaus merkitsee sitä, että noin kaksi massa oli kaksinkertaistunut molemmissa ryhmissä esiintyy eksponentiaalista kasvua, minkä jälkeen kasvu on lineaarinen. Sen sijaan, E2 + ICI ryhmä osoittaa eksponentiaalista kasvua (lineaarisen trendin kuviossa. 3C), kunnes 2-kertainen massa on saavutettu, jonka jälkeen kasvu on lineaarinen (vakio käyrä kuviossa. 3C). On tärkeää huomata tässä, että tuplaantuu massa ei välttämättä vastaa täydellistä solusyklin koska sekä estrogeenia ja ICI tiedetään aiheuttaa muutoksia miten solussa etenee solusyklin läpi, eli kaksinkertaistui ja koossa ja jako molemmat voivat vaikuttaa.

Effects of Estradioli Cell size ja kaksinkertaistaminen Time

määrittää, miten muutokset yksisoluvaiheessa taso edistävät mitattavissa muutoksia suhteellisen koon, massa, ja kasvu mittasimme kaksinkertaistaa ajan ja prosentuaalinen muutos keskimääräinen solukoko yksittäisistä soluista, jotka muodostavat klustereita (Fig. 4). Tuplaus aika lasketaan yksinkertaisesti, jossa

t

f

on viimeinen ajankohta,

t

0

on alkuajankohdassa, ja

N

solu (t) B on solumäärä hetkellä

t

. Kahdentumisajoista E2 ryhmän havaittiin olevan huomattavasti alhaisempi kuin Veh ja E2 + ICI ryhmissä (Fig. 4A). Nämä tiedot osoittavat, että estradioli indusoi soluja jakautumaan lähes kaksinkertainen määrä kontrolliryhmässä ja että hoito ICI lähes täysin kumoaa tämän vaikutuksen. Mukaisesti aiemmin raportoitu tutkimuksia, huomaamme, että estrogeenit nopeuttaa solujen solusyklin läpi, mikä nostaa soluproliferaatioon. Huomattavaa on, että vaikutus ICI lisäämisessä soluihin kaksinkertaistui aika ei tarkoita sitä, että solusyklin palautetaan normaaliolosuhteissa mutta todennäköisemmin on seurausta solujen viettää suuremman määrän aikaa tietyssä vaiheessa solusyklin.

(A) kaksinkertaistaminen aika kussakin ryhmässä, keskimääräinen kaksinkertaistumisaika vähenee 12 tuntia E2 ryhmässä verrattuna Veh ja E2 + ICI ryhmiä, mikä osoittaa, että lisäämällä ICI palauttaa kaksinkertaistaminen aikaa valvoa tasolle. (B) Prosentuaalinen muutos keskimääräisessä solumassan mittauksessa aikana kullekin ryhmälle. Merkittävä väheneminen solumassa havaitaan sekä E2 ja E2 + ICI ryhmissä verrattuna kontrolliin. (C) Mitattu kaksinkertaistaa aika vs. muutos keskimääräisessä solumassan kullekin klusteri, joka mitattiin, näitä kahta muuttujaa voidaan käyttää erottamaan kolmeen ryhmään täysin ja voi toimia kasvun allekirjoitus.

muutos keskimääräinen solumassan ajan laskettiin jakamalla kokonaismassa kunkin klusterin solujen määrä klusterissa. Kuviossa 4B on esitetty prosentuaalinen muutos keskimääräinen solumassan välillä alku- ja viimeisen kerran pisteitä jokaisesta klusterin. Tulokset osoittavat merkittävää laskua keskimääräinen solumassan ajan myötä E2 ja E2 + ICI soluja verrattuna kontrolliin. Tämä vähentää solujen massan ja kaksinkertaistaa ajan osoittavat, että kontrolliin verrattuna, estrogeeni tuottaa pienempiä, nopeampia jakamalla soluja, ja että lisäämällä ICI johtaa pidempään kaksinkertaistaa ajankohtien sekä pienempiä soluja. Mitä pienempi solujen E2 + ICI ryhmät viittaavat siihen, että vaikka kahdentumisaika on palannut kontrollien tasoihin, ICI vaikuttaa solujen metabolista aktiivisuutta ja kykyä kasvaa normaalisti. Kuten kuviossa 4C kaksinkertaistaa ajan ja muutoksen keskiarvon solumassan tarjota luotettava ”kasvua allekirjoitus” kunkin ryhmän ja viittaavat siihen, että ekspressiotasot estrogeenireseptorin tai läsnä ollessa ER-modulaattorin voidaan arvioida yksinkertaisesti tutkimalla näiden kahden parametreja. Koska nykyiset määritykset eivät anna suoraa mittausta solujen kasvua, nämä ovat ensimmäiset mittaukset, suoritetaan jatkuvasti populaatiossa, joka valaista miten estrogeeni vaikuttaa MCF-7 kasvukinetiikat yksittäisen solun tasolla.

Keskustelu

tulokset kuvassa vahvistaa, että SLIM mittaukset kuivan massan tiheyttä voidaan käyttää erittäin herkkä lisääntymismäärityksissä. Tärkeimmät edut verrattuna nykyisiin menetelmiin on, että SLIM voi havaita muutoksia kasvukinetiikat harvempiin määrä soluja, lyhyemmässä ajassa, ja voidaan tutkia erojen populaatiossa eikä vain tarjoamalla numero suurimman kasvun kulttuuria. Vertailun vuoksi, WST-1 määritys toimii solujen numerot 10

3-10

5 välillä [27], kun taas SLIM on herkkä muutoksille leviämisen jopa yhden solun. Lisäksi SLIM tarjoaa mahdollisuuden analysoida kasvuvauhti yksittäisten solujen ja klusterit funktiona massasta perehdyttäisi mekanismista kasvun asetuksen (esim. Onko solun koon tai iän tarkistuspiste on hyödynnetty) [35]. Nämä tiedot eivät pääse mitään nykyisten runsaudenmäärityksessä. Tämä järjestelmä voidaan helposti käyttää mittaamaan kasvukinetiikkaa ja fenotyyppivaikutukset tahansa solutyyppiä ja hoitoa.

Tuloksemme osoittavat myös, että mitataan kasvu solutasolla ja klusterin taso ei vain etuja parantuneen herkkyyden ja vähentää otoskoot, vaan myös tuottaa lisätietoja, ei pääse nykyisiä menetelmiä. Erityisesti osoitamme kinetiikkaa ja liikennemuotojen toiminnan E2 MCF-7. Itse MCF-7 vaikutuksen alaisena E2, jakaa nopeammin ja saavuttaa pienemmillä massoilla, jolloin lisääntynyt määrä soluja, jotka ovat keskimäärin pienempiä. Vähentymisen johdosta kaksinkertaistamista aika, tämä vielä johtaa lisääntymiseen kokonaismassa E2 verrattuna kontrolliryhmään. Kasvatettujen solujen E2 ja joita käsitellään myöhemmin ICI kahdentumisajoista palautetaan ne löytyvät ohjaus, mutta vähennys solukoko oli vielä suurempi kuin verrokkiryhmässä.

vaikutukset E2 ja anti-estrogeenit on solusyklin etenemisen on aikaisemmin tutkittu yksityiskohtaisesti [11], [15], [36], [37]. Sekä nopea ja ohimeneviä vaikutuksia on havaittu johtuen toiminnallinen aktiivisuus sekä tumassa (genomista vaikutukset) ja extranuclear lokero (non-genomista vaikutukset) [38]. Nopea vaikutukset kasvuun ovat selvästi havaittavissa meidän tietojen erot kasvuvauhdin välinen E2 ja Veh altistuneet solut ovat havaittavissa 10 tunnin jälkeen (Kuva. S1) ja voidaan katsoa johtuvan varhaisen aktivoinnin aineenvaihduntaan liittyvien geenien [39 ]. Lisättäessä ICI, puhtaan ER antagonisti, erot kasvuvauhti välillä E2 ja E2 + ICI ryhmät alkavat näkyä ajan (Fig. 3B). Ohimenevä vaikutukset E2 + ICI myös ilmenee, miten kasvu muuttuu funktiona kasvusta solun kokoa (Fig. 3C), selkeä katkos kasvuvauhdin voidaan havaita, kun ICI klustereiden noin kaksinkertaiseksi.

Estrogeenit tiedetään aktivoivan transduktio kaskadeja, jotka säätelevät monien geenien -sekä positiivisesti ja negatiivisesti että avainrooleja solujen lisääntymisen ja aineenvaihduntaa [10] – [15], [39]. On myös osoitettu, että estrogeenit aiheuttavat ei-pyöräily soluja (G

0 vaihe) syöttää solusyklin ja nopeasti edetä G

1 S vaiheeseen [11], [15], [37 ]. Tämä nopea eteneminen solusyklin läpi osuus sekä laski kaksinkertaistaa ajan ja väheneminen solujen keskimääräinen massa havaittiin E2 ryhmässä (Fig. 4). Toisaalta, ICI on osoitettu estävän MCF-7-solut G0-G

1 vaiheessa [15], [28], [37]. Tämä estävä vaikutus etenemiseen kautta G1 ilmenee lisääntynyt kaksinkertaistaa aikaan E2 + ICI ryhmä verrattuna E2 ryhmään. ICI vaikuttaa myös transkription useiden geenien vastuussa kasvun säätelyssä kaikissa vaiheissa solusyklin. Alas sääntelyn geenien tiedetään olevan vastuussa leviämisen yhdistettynä lisääntyneeseen aika G1 todennäköisesti vastuussa alentamista solukoko havaittiin E2 + ICI ryhmä [15].

Kuten kyseessä estrogeenireseptori, soluproliferaatiota myös ohjataan aktivoinnin ja modulaatio sääntelyn signalointikaskadien kasvutekijät; mitataan kasvu solutasolla on potentiaalia välisen kuilun molekyylitason ymmärtäminen syövän kasvua ja todellisen kasvaimen kasvua. Näin ollen on hyvin kiinnostavaa yhdistää nämä kasvun mittaukset fluoresenssi merkkiaineiden solusyklin vaihe (kuten tehtiin aikaisemmin U2OS solujen [31]) ja muiden proteiinien tiedetään avainasemassa säätelyssä lisääntymistä. Muutosten mittaamiseksi kasvun kinetiikka funktiona solusyklin tai tarkemmin geenin aktivointia, mahdollistaa ymmärtää paremmin erityisesti yhdisteen toimintaa /lääkkeen solusyklin etenemisen.

Yhteenvetona, olemme osoittivat uusi erittäin herkkä runsaudenmäärityksessä lääkeseulontaan sovelluksiin. Vaikka olemme keskittyneet mallista solusysteemi täällä, koejärjestely sovelletaan ilman muutoksia muihin solutyyppeihin ja hoitoja. Mittaamisen lisäksi kasvukinetiikat, menetelmämme myös samanaikaisesti antaa tietoa solun morfologiaan ja liikkuvuuteen [40], ja voidaan myös helposti yhdistää muihin mikroskoopilla säännöt. Aihetta tulevaisuuden tutkimuksen tulee ymmärtää ja luonnehtivat morfologiset erot, jotka syntyvät seurauksena moduloimaan ER (ks Elokuva S1 ja S2). Biologinen oivalluksia tarjoamia SLIM mittaukset yhdessä muiden molekyylien määrityksissä epäilemättä parantaa ymmärtämystä syöpäsolujen kasvua yleensä, ja on mahdollista saavuttaa parannuksia lääkeaineen suunnittelu, kuvaamisen, ja terapeuttista tehoa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Kaupallisesti saatavilla MCF-7-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja viljeltiin MEM (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 5% vasikan seerumia (HyClone, Logan, UT), 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja 25 ug /ml gentamysiini (Invitrogen). Sitten soluja siirrostettiin fenolipunattomalla MEM, joka sisälsi 5% hiilellä dekstraani käsiteltiin vasikan seerumia inkuboitua 4 päivää. Kaksi kammio dioja (Lab-Tek) lasin pohja peitelaseja käytettiin jotta side-by-side kuvantaminen ohjaus- ja käsiteltyjen näytteiden. Väliaine vaihdettiin päivänä 2 ja 4 ennen hoidon valvontaa ajoneuvon tai ligandia hoidot (estradioli (E2, 10 nM) ja ICI 182,780 (ICI Fulvestrantti, 1 uM)). Kolorimetrisellä Mittausten WST1-määritys (Roche, Basel, Sveitsi) käytettiin, ja absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen BioRad 680 Microplate Reader.

kuvantamisen aikana soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO2 ilmakehässä kanssa yrityshautomo ja kuumennetaan vaiheessa insertti. Jokainen kuoppa skannattiin 30 minuutin välein 4 × 4-laatta malli Zeiss EY Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 tavoite eli yhteensä näkökentän 1,55 x 1,16 mm

2. Z-pinon 12 viipaletta (48 pm) kirjattiin kussakin asemassa. Valotusaika oli 15 ms jokaisen kuvan täydellä lampun teho (3200 K, tai 10,7 V). Kutakin koetta varten, yksi hyvin jätettiin käsittelemättä toimimaan kontrollina väestön ja muiden hyvin käsiteltiin joko E2 tai E2 + ICI kunnossa. Jokainen ehto mitattiin yhdessä sen ohjaus kaksi kertaa.

Imaging

Kuvaus suoritettiin käyttäen spatiaalista valon puuttumista mikroskopialla (SLIM) [30], [41]. SLIM on valkoista valoa optinen interferometriaan modality suunniteltu lisäosa moduuli kaupalliseen faasikontrastimikroskooppia. Lyhyesti, SLIM toimii projisoimalla polttovälin of faasikontrastimikroskoop- tavoite päälle nestekidefaasissa modulaattori (LCPM). LCPM kalibroidaan tarkasti siirtää vaiheen hajottama valo näyte suhteessa YK-hajallaan valoa. Intensiteetti kartat kirjataan vaihesiirrokset nolla, π /2, π, ja 3π /2.

SLIM setup Tässä tutkimuksessa käytetty perustuu Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss luettelo # 431007901000) moottoroitu ylösalaisin tutkimus kuvantaminen mikroskoopilla. Mikroskooppi pohja on varustettu moottoroidulla painopiste asema (vähintään vaihe leveys 10 nm). Tavoitteet käytetty tässä tutkimuksessa on Zeiss EY Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH 1 M27. Välissä kuva seuraava tavoite ja putki linssi on suunnattu vasemmalle satamasta mikroskoopin jossa SLIM moduuli kiinnitetään.