Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Potilaat diagnosoitu metastaattinen syöpä on lähes tasaisesti huono ennusteet. Hoitokeinot potilaille, joilla on laajalle levinneenä tautina eivät yleensä ole parantava ja on sivuvaikutuksia, jotka rajoittavat hoito, joka voidaan antaa. Hoito, joka on selektiivisesti toksinen kasvaimia maksimoisi myönteisiä vaikutuksia hoidon ja minimoidaan sivuvaikutukset, mahdollisuuksien avulla tehokasta hoitoa annetaan.

menetelmät ja havainnot

olettaisi, että kasvain-hakuinen ominaisuus kantasolujen tai progenitorisolujen voidaan hyödyntää valikoivasti toimittaa terapeuttisen geenin metastaattisen kiinteitä kasvaimia, ja että ilmentyminen sopivassa siirtogeenin kasvain loci voisi välittää parannuskeinoja etäpesäkkeitä. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme ruiskutetaan HB1.F3.C1 transdusoitujen solujen ilmaista entsyymiä, joka tehokkaasti aktivoi syövän esiaste CPT-11 suonensisäisesti hiiriin, joissa levitetään neuroblastoomakasvainten. HB1.F3.C1 vaeltaneet solut selektiivisesti tuumorikohdissa koosta tai anatomisen sijainnin kasvaimia. Hiiriä käsiteltiin sitten systeemisesti CPT-11, ja hoidon tehon seurattiin. Hiirillä, joita hoidettiin yhdistelmällä HB1.F3.C1 ekspressoivien solujen CPT-11-aktivoivaan entsyymiin, ja tämä aihiolääkkeen tuottanut kasvaimen elinaika on 100% hiiristä varten 6 kuukautta (

P

0,001 verrattuna kontrolliryhmiin).

Johtopäätökset

uusi ja merkittävä löydös on, että se voi olla mahdollista hyödyntää kasvaimeen tropic omaisuutta kantasolut tai esi välittäjäksi tehokkaita, kasvain selektiivinen hoito etäpesäkkeitä, joille ei suvaita parantavia hoitoja ovat tällä hetkellä saatavilla.

Citation: Aboody KS, Bush RA, Garcia E, Metz MZ, Najbauer J, Justus KA, et al. (2006) kehittäminen kasvaimeen Selective lähestymistavan Kohtele metastaattinen. PLoS ONE 1 (1): E23. doi: 10,1371 /journal.pone.0000023

Academic Editor: Hans Clevers, Utrecht University, Alankomaat

vastaanotettu: 08 elokuu 2006; Hyväksytty: 10 elokuu 2006; Julkaistu: 20 joulukuu 2006

Copyright: © 2006 Aboody et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health /National Cancer Institute (CA113446, CA79763, CA76202, ja CA21765); Lopeta Cancer Foundation, Phi Beta Psi Osakuntatytöt, The Rosalinde ja Arthur Gilbert Foundation, Neidorf Family Foundation, Marcus Foundation ja American Libanonin Syyrian Associated Hyväntekeväisyys (ALSAC).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Neuroblastooma on yleisin ekstra- kiinteän kasvaimen lapsilla. Tyypillisesti potilaat diagnosoitu korkean riskin tauti osoittavat hyvää alustava hoitovaste, mutta jopa 80% näistä potilaista relapsi etäpesäkkeitä, joka on tulenkestävä terapiaan. Kuten muutkin kiinteät kasvaimet, kun neuroblastoomat etäispesäkkeitä, ne ovat hyvin vaikea hoitaa, ja suurin osa lapsista, joilla on metastaattinen neuroblastooma kuolee heidän sairautensa [1] – [3]. Tällä hetkellä käytettävissä olevat hoidot ovat antituumoriteholla, mutta ne tuottavat myös ei-toivottuja sivuvaikutuksia normaaliin kudokseen, mikä rajoittaa hoitoa, joka voidaan antaa. Uusia ja tehokkaita lähestymistapoja hoitoon neuroblastooma tarvitaan.

lähestymistapa on kuvattu tässä tutkimuksessa perustuu hyödyntämiseen kasvainta tropic ominaisuus HB1.F3.C1 solujen [4] – [16] antamatta tehokas terapeuttinen aine valikoivasti kasvaimia. Erityinen tavoite Tutkimuksen tarkoituksena oli osoittaa, että laskimoon annetun HB1.F3.C1 soluja, jotka ilmentävät CPT-11 (irinotekaani) -activating entsyymi kanin karboksyyliesteraasin (RCE) lisäisi merkittävästi antituumorivaikutuksen vaikutusta siedettyjen CPT-11 hiirillä laakeri levitetään neuroblastoomakasvainten. Kuvattua lähestymistapaa voidaan myös sovittaa kehittää hoito potilailla, joilla muun tyyppisiä metastaattisen kiinteä kasvain.

Neural kantasolut (NSCs) tai kantasolujen (NPC) ja mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t), on äskettäin tutkittu pakettiautoa hoitoon ihonalaisen ksenografteja sekä kasvainten hoitoon keskushermostossa ja keuhkoja kokeellisissa malleissa. Tämä on ensimmäinen tutkimus, yrittää hyödyntää merkittävä kasvaimen tropismi näiden solujen kehittää hoitoja metastaattinen, levittää kiinteitä kasvaimia. Koska mitään tehokkaita hoitoja ovat saatavilla useimpiin etäpesäkkeitä, jotka osoittavat, että kantasolut tai esi sikiön tai aikuisen alkuperä voidaan käyttää parantamaan ennustetta potilaiden kuolemaan etäpesäkkeitä olisi erittäin merkittävä.

Käytetyn solulinjan tässä tutkimuksessa (HB1.F3.C1) oli peräisin sikiön isoaivot soluista. Ensisijainen solut kuolemattomiksi retroviruksen insertoimalla v-

myc

geeni, joka tarvitaan tukemaan niiden toistettavuusmahdollisuudet [17]. Seuraavat kuolemattomaksi, HB1.F3.C1 solut jäljitellä

in vitro

muodostaa identtisiä tytärsoluja tai voidaan indusoida erilaistumaan muiden solujen neuronaalisen linjan, mikä jolla piirteitä sekä kantasolujen ja progenitorisolujen. Koska HB1.F3.C1 solut systeemisesti vaeltavat ja paikallistaa

in vivo

paikoissa patologian kuten kasvaimia, ehdotimme hyödyntää tätä ominaisuutta valikoivasti toimittaa RCE aktivoi syövän vastaista aihiolääkettä CPT-11 [18] – [20]. Oletimme, että lisääntynyt konversio tämän aihiolääkkeen aktiiviseksi metaboliitiksi (SN-38) on kasvaimia sivustoja lisäisi selektiivinen antituumorivaikutus. Me annetaan suonensisäisesti adenovirus-transdusoitujen HB1.F3.C1 soluja, jotka ilmentävät eritetyn muodon RCE hiirille, joilla levitetään neuroblastooma. Hiiriä käsiteltiin sitten systeemisesti CPT-11 ja säilyminen pitkällä aikavälillä eläimiä seurattiin. Saadut tulokset viittaavat siihen, että uusi entsyymi /aihiolääke lähestymistapoja terapia kanta- tai progenitorisolujen antovehikkeleinä voi olla käyttöä metastasoituneen syövän.

Methods

tuumorisolulinioissa

kolme humaanineuroblastoomasoluja solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa olivat NB-1691, NB-1643, ja SK-N-AS [21], [22]. Nämä solulinjat saatiin Pediatric Oncology Group ja American Type Culture Collection ja heijastavat erilaisia ​​neuroblastoomasoluviljelmissä fenotyyppejä ja genotyyppien: N-

myc

monistettu, N-

myc

vahvistamattoman /yliekspressoituina N-

myc

vahvistamattoman /alhaisen ilmentymisen,

MDM2

monistettu, ja eri suhteita ydinaseiden /sytoplasmisen p53. Jokaisella kokeessa alla tehtiin kaikkien kolmen solulinjoissa; tulokset Tyypillisissä kokeissa esitetään. Kolme neuroblastoomasolu- linjoja käytettiin osoittamaan, että havaitut tulokset eivät rajoitu yhteen solulinja; samanlaiset tulokset havaittiin kaikkien kolmen solulinjat. Tuumorisolulinjat kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS: ää 37 ° C: ssa kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10% CO

2.

HB1.F3.C1 Cell Line

HB1. F3.C1 solulinja on multipotenteista, kloonattu solulinja, joka oli peräisin kuolemattomiksi saadut solut isoaivot ihmisen sikiön 15 raskausviikolla, käyttäen retrovirusta koodaavat V-

myc

geenin [17] , [23]. Ensisijainen solut saatiin mukaisesti suuntaviivat Anatomical patologian osaston Vancouver General Hospital, jossa lupa käyttää sikiön kudosten myöntämä Clinical Research Screening komitea ihmiseen kohdistuvan of University of British Columbia. HB1.F3.C1 on vakiintunut, hyvin tunnettu, vakaa solulinjasta [23] – [27]. HB1.F3.C1 solut itse uudistaa

in vitro

, ovat ei-tuumorigeenisiä, ja ovat multipotenteista että ne voidaan indusoida erilaistumaan neuroneihin, oligodendrocytes, ja astrosyytit [17]. Käyttö Tämän solulinjan kiertänyt merkittävä ongelma rajallisesta saatavuudesta suuria määriä primäärisiä soluja ja maksimoitu toistettavuus keskuudessa kokeita. Solulinja kasvatettiin DMEM, jossa 10% FCS: ää 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, 10% CO

2.

transduktio HB1.F3.C1 Solut Express RCE

replikaatiovialliset adenovirusta, joka ekspressoi eritetyn muodon RCE valvonnassa sytomegaloviruksen (CMV) promoottori (AdCMVrCE) rakennettiin käyttäen standardimenetelmiä, kuten aiemmin on kuvattu [18], [20], [28]. HB1.F3.C1 soluja viljeltiin yhdessä AdCMVrCE 24 tuntia ennen suonensisäisen injektion. Entsyymiaktiivisuus määrityksessä käytetään tason kvantitoimiseksi ilmentymisen RCE HB1.F3.C1 transdusoitujen solujen adenoviruksella on myös raportoitu aiemmin [20].

HB1.F3.C1 Cell Migration, Injection ja Localization

sen tutkimiseksi, onko HB1.F3.C1 solut, injektoitiin laskimonsisäisesti, siirtyvät levitetään kasvainpesäkkeitä hiirillä, neuroblastooma kasvaimen solut injektoitiin suonensisäisesti häntälaskimoihin hiirten ja annetaan siemeniin ja kehittää kasvaimia, kaksi kuukautta. HB1.F3.C1 soluja (2 x 10

6) injektoitiin sitten

kautta

samaa reittiä ja elimet kerättiin 3-4 päivää myöhemmin arvioida siirtymisen makroskooppiset ja mikroskooppiset kasvaimet.

terapeuttista kokeita HB1.F3.C1 solut otettiin 2 viikon kuluttua injektion neuroblastoomasoluilla. Tänä ajankohtana, kasvaimet ovat mikroskooppisia ja havaita silmämääräisesti tai

in vivo

kuvantamiseen. Yhdenmukainen hoidon aloittamista tällä hetkellä vaiheessa, ehdotamme, että todennäköisin mahdollinen kliininen hyöty kuvatun lähestymistavan tulee hävittää vähintään jäljellä taudin seuraava tavanomainen hoito. Tämä tutkimussuunnitelma suorimmin kuvastaa että mahdollinen sovellus.

Sekä maahanmuutto ja terapeuttisia tutkimuksia, 2 x 10

6 HB1.F3.C1 transdusoitujen solujen adenoviruksella infektiokertoimella (MOI) 20 oli pre-leimattu CM-Dil: (kloorimetyylibentsamido-1,1′-dioktadekyyli-3,3,3 ’, 3’-tetrametyyli-perkloraatti, Molecular Probes, Eugene, OR) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten solut huuhdeltiin 3 kertaa PBS: llä ja injektoidaan häntälaskimoon kasvaimen kantavien hiirten. CM-Dil valittiin, koska se on ei-diffusible nojalla sen kovalenttisen sitoutumisen solun tioleja, ja sen on osoitettu olevan sopivia merkintöjä ja

in vivo

seuranta solujen vähintään 10 viikkoa [29] , [30]. Kokeissa tässä asiakirjassa, hiiret injektoitiin CM-Dil-leimattuja soluja kerättiin 3-4 päivää seuraavaa merkintää ja injektio.

ES1

e esteraasin puutosta Severe Combined immuunivajavuustila (SCID) Hiiret

plasmassa SCID-hiirten sisältää runsaasti jyrsijän karboksyyliesteraasin joka aktivoi CPT-11 [31], [32]. Siksi käytimme esteraasin puutteellisia SCID hiirillä kaikille

in vivo

terapeuttista tutkimuksissa [33]. Nämä eläimet ovat plasman esteraasin verrattavissa ihmisen plasmassa. Hiiriä pidettiin käytettäessä AALAAC-hyväksyttyjen laitos, ja niille annettiin ruokaa ja vettä ad libitum.

RT-PCR /PCR

Luuytimen kerättiin sääriluun normaalin ja kasvaimen kantavien hiirten, ja RNA uutettiin RT-PCR havaitseminen tyrosiinihydroksylaasin (TH), neuroblastoomasolu- markkeri. DNA uutettiin erillistä alikvoottia luuytimen PCR ja V-

myc

geenin tunnistamiseksi HB1.F3.C1 soluihin. Alukesekvensseissä ja RT-PCR-olosuhteet TH on julkaistu aiemmin [21]. Standardimenetelmiä käytettiin V-

myc

monistamisen käyttäen forward-aluketta 5′-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 ’ja reverse-aluketta 5′-AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3’, jossa hehkutusvaihetta 62,5 ° C: ssa 1 minuutti 30 kierrosta. Positiivinen kontrolli TH oli RNA: ta NB-1691 solut, ja V-

myc

geeni oli DNA HB1.F3.C1 soluista. Negatiiviset kontrollit sisälsivät ei RT tai ei DNA, TH ja v-

myc

reaktiot, vastaavasti.

Histochemistry, immunohistokemia ja Immunofluorescence Imaging

Urut otettiin talteen, kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä /PBS, pH 7,4, ja kylmäsuojattiin 30% sakkaroosia. Kiinteä Sitten kudokset upotettiin OCT, sarjaan cryosectioned (10 um), sulaa asennettu lasilevyille ja varastoidaan kuivassa -20 ° C: ssa. Rutiini histologinen seulontaa, kudosleikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla standardimenetelmillä.

läsnäolo HB1.F3.C1 solujen neuroblastooma kasvaimen loci tai normaalista kudoksesta tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa. Kohdissa valmistettu kuten edellä on esitetty, tumat kaikki solut värjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli; Sigma Biochemical, St. Louis, MO, sininen fluoresenssi), ja havaittiin käyttäen epifluoresenssilla eksitaatio /emissio-suodattimet 340 -380/420 nm (LP) (UV-2A, Nikon). HB1.F3.C1 soluja, leimataan CM-Dil: (punainen fluoresenssi), todettiin käyttäen eksitaatio /emissio suodattimet 540-580 nm ja 600-660 nm (Y-2E /C), käyttämällä Nikon Eclipse TE2000-U mikroskooppi (Nikon Instruments, Melville, NY) varustettuna SPOT RT Slider digitaalikamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Havaitsemaan ihmisen neuroblastooma kasvaimia hiiren kudoksissa, teimme immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttämällä hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, joka tunnistaa ihmisen mitokondrioiden proteiinia (Chemicon, Temecula, CA). Leikkeitä kiinnitettiin jälkikäteen 4% paraformaldehydissä 10 minuutin ajan, huuhdeltiin, läpäiseviksi 0,3% Triton X-100 /PBS: ää, 30 min ja inkuboitiin blokkausliuoksessa (5% BSA: ta + 3% normaalia hevosen seerumia + 0,1% Triton X-100 , 1 h). Leikkeitä inkuboitiin sitten peräkkäin primaarista vasta-ainetta (1:100 laimennos) 16 tuntia 4 ° C: ssa, biotinyloitu anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 2 tunnin ajan, ja avidiini-FITC: tä (Vector Laboratories) ja 1 tunti. Kudosleikkeet vastavärjättiin DAPI ja asentaa loisteputki kiinnitysväliaine (DAKO). FITC fluoresenssin havaittiin epifluoresenssilla suodattimen (465-495 nm: n virityksellä, 515-555 nm emissio; B-2E /C).

rutiini histologinen arviointi kasvaimet eri elinten, kudosten leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Vierekkäisten osioiden käsiteltiin immunope–3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB) värjäystä samalla tavoin kuin kudokset käsitellään fluoresenssivärjäyksellä, paitsi että sen jälkeen läpäiseväksi, endogeenisen peroksi- pysäytettiin 0,3% vetyperoksidia /PBS 30 min ajan. Vasta-aine reaktiivisuus ihmisen mitokondrioissa myöhemmin havaita käyttämällä Vectastain ABC

Elite

Kit (Vector Laboratories) ja peroksidaasisubstraatti Kit (Vector Laboratories) mukaan valmistajan ohjeiden.

Matala- ja korkea- suurennus kuvat saatiin käyttämällä Nikon Eclipse TE2000-U mikroskooppi (Nikon Instruments, Melville, NY) varustettu brightfield ja fluoresenssivalaistusta. Kuvat tallennettiin ja tallentaa käyttämällä SPOT Advanced ja Adobe Photoshop-ohjelmisto.

Modified Boyden jaosto Cell migraatiokokeessa

Modified Boyden kammion määrityksiä käytettiin arvioimaan

in vitro

tropismi HB1.F3.C1 solujen kasvainsolujen-elatusaine tai ohjata media, käyttäen standardimenetelmiä. Lyhyesti, HB1.F3.C1 solut transdusoitu MOI 0, 5, 10 tai 20 AdCMVrCE trypsinoitiin, pestiin, ja suspendoitiin uudelleen DMEM, joka sisälsi 5% BSA: ta. Solut (3 x 10

4 solua /100 ui) pantiin yläkammioissa ja neuroblastoomasolu–väliaine in alahuoneiden. Neuroblastoomasolu–väliaine sekä ylemmän ja alemman kammiot käsitti chemokinesis ohjaus ilman kemoattraktantti kaltevuus. Solujen annettiin kulkeutua 4 tuntia soluviljelmässä inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Määrä siirtynyt HB1.F3.C1 solujen alempaan kammioon kussakin kuopassa kvantifioitiin CyQuant GR fluoresoiva väriaine (Chemicon) ja fluoresenssi mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Eläinkokeet

Disseminoitunut neuroblastooma valmistettiin injektoimalla 5 x 10

5 NB-1691, NB-1643, tai SK-N-AS soluista häntälaskimoiden hiirillä. Tyypillisesti nämä hiiret vaativat eutanasiaa ~75 päivän kuluttua injektion neuroblastoomasoluilla. Gross kasvaimia useisiin elimiin näkyvät ruumiinavauksessa. Tämä metastaattinen neuroblastooma malli on hyvin tunnettu ja on hyvin toistettavissa osalta taudin kulun ja-elimet [34]. Lisäksi malli esitetään yhteenveto kliinisen rakenteessa metastaattisen neuroblastooma, että kasvaimen kehittää useita loci, mukaan lukien lisämunuaisen, luuytimen ja maksan.

Jokainen hoitoryhmä oli 10 hiiret, tarkkaillaan päivittäin taudin esiintyminen tai sairastumista. Kerran viikossa annon HB1.F3.C1 solujen ja CPT-11 (7,5 mg /kg) on ​​esitetty kuvassa 8. Tätä hoitoa annettiin 2 peräkkäistä viikkoa, jonka jälkeen 2 viikon tauko ja sitten toinen 2- viikko hoitokuurin. Kaikki eläin pöytäkirjat hyväksynyt City of Hope tai St. Jude Lasten Research Hospital IACUC. Kun hiiret näyttivät olevan epämukavuutta tai kärsimystä arvioituna riippumattomien eläinten hoito henkilöstö, jolla ei ole tietoa protokollan suunnittelu, eläimet tapettiin. Kaikki lopetettiin hiiriä todennettu kasvain by ruumiinavaus. Päätepisteen terapeuttisessa tutkimuksessa oli pitkäaikaista säilyvyyttä.

SK-N-AS-soluja (5 x 10

5) transdusoitu ilmaista lusiferaasi ruiskutettiin häntälaskimoiden.

One kuukauden kasvainsolujen injektion, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti lusiferiini ja kuvattiin käyttäen Xenogen IVIS kuvantamisjärjestelmä, mukaan suuntiin valmistajan.

Useita kasvaimia esiintyi 100% hiiristä.

kaksi edustavan hiiren esitetään.

Ihmisen neuroblastooma kasvainsoluja injektoidaan suonensisäisesti tuottaa levitetään kasvaimia.

sopivan ajan kuluttua injektion neuroblastoomasoluja, hermo kantasoluja tai hermoesiastesolut transdusoitujen solujen adenoviruksella ilmaista aihiolääkkeen aktivoivaan entsyymiin (tässä tutkimuksessa, joka on eritetyn muodon kanin karboksyyliesteraasin [RCE]) injektoidaan laskimoon.

jälkeen migraation kantasolujen tai progenitorisolujen kasvainpesäkkeitä ja viive on 3-4 päivää, jotta suhteellisen korkea ilmentyminen aihiolääkkeen aktivoivaan entsyymiin, osaksi solunulkoiseen ympäristöön kasvaimen sivustoja, hiiriä käsitellään aihiolääke (tässä tutkimuksessa, CPT-11).

aihiolääke aktivoidaan valikoivasti kasvainkeskusten, lisätä terapeuttista indeksiä aihiolääke.

(A) Leikellyt maksa edustavasta eläimen maksametastaaseja; eläin lopetettiin kahden päivän kuluttua injektion HB1.F3.C1 solujen häntälaskimoon.

(B) Matala- ja (C) korkean tehon suurennettu osa kasvaimeen liittyvät maksan, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

Kasvain solut näyttävät tumma lila (mustat nuolet); normaali kudos ei näytä olevan vaaleanpunainen.

(D) Maksa jakso värjätty anti-ihmisen mitokondrioiden proteiinin vasta ja vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Kasvain micrometastases tahrata tummanruskea (punaiset nuolet); normaali maksakudosta on violetti.

(E) Immunofluoresenssimikroskopia maksan jaksossa.

HB1.F3.C1 solut CM-Dil-merkitty ennen injektiota ja näkyvät kuten punasoluja.

maksa osassa värjättiin DAPI; kasvainkeskusten tunnistetaan alueet tiheään pakattujen DAPI-värjätty kasvainsolun ytimeksi.

punaiset nuolet osoittavat extravasated HB1.F3.C1 solujen proksimaalisesti maksan suoneen (v).

Inset on korkea suurennus on Dil-leimatun HB1.F3.C1 solun sisällä kasvain. (F-H) Maksa-osio kasvaimen kantavien eläinten, jotka saivat CM-Dil-leimattuja HB1.F3.C1 solut värjättiin FITC-konjugoidulla ihmisen erityisiä mitokondrioiden vasta-ainetta.

(F) Red CM-Dil leimattua HB1.F3.C1 soluja.

(G) sama osassa esittää, että FITC-leimattu (vihreä) ihmisen kasvainsolujen ja HB1.F3.C1 soluja.

(H) Päällekkäin F (punainen CM-Dil HB1.F3.C1 solut) ja G (vihreä FITC HB1.F3.C1 ja kasvainsoluja).

HB1.F3.C1 solua (oranssi /keltainen soluista merkitty valkoisilla nuolilla) siirtynyt maksan micrometastases (vihreät solut) ja tunkeutunut kasvain parenchyma läheisyydessä verisuonen (bv, valkoinen katkoviivat).

Mittaviivat: 1 cm (a), 2 mm (B), 500 um (C), 200 um (F, G), 100 um (D, E, H), 10 um (E upotus).

X-ray kuva takaraajan hiiren kanssa pitkälle neuroblastooma (päivä 82, vasen paneeli, asteikko bar: 1 cm).

Vahvistus kasvaimen massan ihmisen SK-N-AS neuroblastoomasoluja suoritettiin immunohistokemialla käyttäen anti-ihmisen mitokondriot-vasta-ainetta (jota ei ole esitetty ).

CM-Dil-leimattuja HB1.F3.C1 solujen (punasolujen, injektoitiin häntälaskimoon 3 päivää ennen tappamista) paikallistettu kasvain luuytimen (oikea paneeli; asteikko bar: 200 pm).

yhtäpitävät havaitseminen v-

myc

(HB1.F3.C1 solut) PCR ja TH lauseke (neuroblastoomasolujen) RT-PCR: llä luuytimen näytteet.

Luuydinnäytteet eläimistä eristettyjen ruiskutettiin HB1.F3.C1 solut analysoitiin läsnäolo v-

myc

(HB1.F3.C1 solut) tai ekspressiota TH (NB-1643-soluja).

HB1.F3.C1 soluja oli läsnä luuytimessä vain silloin, kun kasvainsolut olivat läsnä myös.

HB1.F3.C1 soluja ei havaittu luuytimessä ei-kasvain eläimiä.

positiiviset kontrollit (+) on DNA: ta HB1.F3.C1 solujen v-

myc

, ja RNA: ta NB -1691 solujen TH.

negatiiviset kontrollit (-) ei sisältänyt DNA: ta tai RNA: ta templaattina, vastaavasti.

normaali ja kasvain elimet kerättiin, leikattiin ja värjättiin DAPI. HB1.F3.C1 soluja ei havaittu normaalissa (A) aivoissa, (B) munuainen, (C) sydän, (D) suolistossa, tai (E) ihon kudosta.

Harvinainen, yksi, HB1. F3.C1 solut (valkoiset nuolet) havaittiin (F) keuhko, (G) maksa ja (H) perna.

Mittaviivat: 200 um (A-E), 100 um (F-H) .

Pylväät edustavat keskimäärin siirtynyt solujen ± SEM kolminkertaisten kuoppien muunnetut Boyden kammiossa määrityksissä.

Yksi päivä ennen niiden käyttöä in hoidot solut transdusoitiin kanssa AdCMVrCE konstruktilla (katso teksti).

hoitoaikataulu perustui ajan kuluessa ilmentymä erittyvän muodon RCE jälkeen adenoviruksen transduktio HB1.F3.C1 soluja (Danks, julkaisematon havainto) ja aikataulun annon CPT-11, joka on osoitettu olevan suhteellisen tehokas neuroblastoomapotilaista [35].

TILASTOANALYYSI

Kaikki tiedot analysoitiin GraphPad Prism-ohjelmiston (San Diego, CA). Analyysit solumigraation tuloksia (keskiarvo solujen määrä ± SEM.) On trandusoidun soluja verrattiin solujen transdusoitu adenovirus. Nämä tiedot analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista

t

-testi. Analyysi Kaplan-Meier tonttien verrattuna eloonjäämiseen 10 hiirtä ryhmässä käyttäen log-rank (Mantel-Haenszel) menetelmällä.

Tulokset

Mouse Model metastasoituneen Neuroblastooma

Suonensisäinen injektio 5 x 10

5 NB-1691, NB-1643, tai SK-N-AS humaanineuroblastoomasoluja tuottaa levitetään neuroblastooma 100% esteraasin puutteellisia SCID hiirillä. Levitetään luonne kasvainten on ilmeistä kuviossa 1 kaksi hiirtä, jotka saivat häntälaskimoon injektioita SK-N-AS transdusoitujen solujen ilmaista lusiferaasi. Kuukauden kuluessa injektion neuroblastooma solujen lusiferaasisubstraattia lusiferiini intraperitoneaalisesti visualisoida kasvaimia

in situ

. Yhdenmukainen julkaistuissa raporteissa, kasvaimia esiintyi useissa elimissä ja anatominen paikoissa kuten vatsan, luuytimen, maksan ja keuhkojen [21], [34]. Koska 100% hiiristä ruiskutettiin neuroblastoomasoluilla kehittävät levittää tautia, joka lopulta johtaa kuolemaan, tämä malli helpotti arviointia terapeuttisen kokeita, jotka tehtiin mukaan skeema kuviossa 2. Tämä kuvio havainnollistaa hypoteesia testataan. Hiiriä, joihin injektoitiin humaanineuroblastoomasoluja kehittää useita kasvaimia. Kaksi viikkoa injektion jälkeen neuroblastoomasoluja, HB1.F3.C1 transdusoitujen solujen adenoviruksella, joka koodaa aihiolääkkeen aktivoivaan entsyymiin, annetaan suonensisäisesti. Kolme päivää myöhemmin, kun HB1.F3.C1 solut ovat lokalisoitu edullisesti kasvaimen sivustoja ja aihiolääkkeen aktivoivaan entsyymiin (RCE tässä tutkimuksessa), ilmentyy korkeilla tasoilla, aihiolääke (CPT-11) anto aloitetaan, annetaan ennalta määrätty optimaalinen ajoittaa. Antituumorivaikutuksen tehoa aihiolääke yksin voi sitten verrata samanaikaisen annon HB1.F3.C1 solujen ja prodrug käyttäen eloonjääminen päätepisteenä.

lokalisaatio HB.F3.C1-solujen Neuroblastooma kasvain Liver

ensimmäinen vahvistaa, että HB1.F3.C1 solut vaeltavat ja lokalisoida klo levitetään neuroblastoomakasvainten, hiiret vakiintuneiden NB-1643 kasvaimia injektoitiin suonensisäisesti 2 x 10

6 CM-Dil leimattu HB1.F3. C1-solut. Jälkeen 3 päivää, normaali ja kasvain elimet kerättiin ja leikattiin, ja arvioidaan mikroskooppisesti. Kuten kuviossa 3, useita kasvaimia näkyivät törkeällä tarkastuksen maksassa edustavan hiiren (paneeli A), ja myös mikroskooppiset arviointi hematoksyliini /eosiinilla värjätyt leikkeet (paneelit B ja C, violetti alueet) ja immunoperoksidaasivärjäystä ihmisen mitokondrion proteiini (paneeli D, ruskea alueet). HB1.F3.C1 solut yhdessä lokalisoitu näiden kasvainkeskusten, mistä osoituksena CM-Dil-leimattuja, punasolut nähdään paneelissa E. Tämä paneeli osoittaa myös ekstravasaatiosta HB1.F3.C1 solujen ja niiden muuttoliike pois maksan suoneen (v). Paneeli F näyttää HB1.F3.C1 NSCs (CM-Dil-leimattu, punainen) ja paneelissa G esitetään samassa jaksossa värjätty ihmisen mitokondrioiden vasta–FITC (ihmisen NSCs ja kasvainsoluja, vihreä). Paneeli H, päällekkäin paneelien F ja G, osoittaa kolokalisaation HB1.F3.C1 soluja (oranssi /keltainen, merkitty valkoisilla nuolilla) ja kasvainsolujen (vihreä), paikoilla välittömässä läheisyydessä ja etäällä verisuonen (bv). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin kasvainten useiden muiden elinten, mukaan lukien munasarjan (ei esitetty) ja luuytimen (kuvio 4).

HB1.F3.C1 Solut Lokalisoi on Neuroblastooma etäpesäkkeitä in Bone Marrow

koska luuydin on usein sivusto neuroblastooma etäpesäkkeiden ja ydinaspiraatit tai koepaloja käytetään dokumentoida vaiheessa tauti korkean riskin potilailla, etsimme onko HB1.F3.C1 soluja myös soluttautunut kasvaimia tällä sivustolla. Vasemmassa paneelissa Kuvassa 4 röntgenkuva reisiluun hiiren joissa makroskooppisen kasvain, joka sai alkunsa luuytimessä. Tämä eläin ruiskutettiin suonensisäisesti CM-Dil-leimattuja HB1.F3.C1 solujen ja lopetettiin kolme päivää myöhemmin. Alue luun merkitty punainen suorakulmio käsiteltiin sitten immunofluoresenssimikroskopialla. Oikeassa paneelissa Kuvion 4 osoittaa selvästi HB1.F3.C1 soluja (punainen fluoresenssi) tunkeutuu kasvain luuytimen, joka osoittaa, että nämä solut muuttivat ja yhteistyötä paikallistaa makroskooppisia kasvaimia (kuvio 4) sekä mikroskooppisia kasvaimia (kuva 3 ). Vaikka mielenkiintoinen, me katsoi sen tärkeä ja olennainen osoittamaan migraation HB1.F3.C1 solujen mikroskooppisia kasvaimia luuytimessä (kuvio 5), koska taudin uusiutumisen uskotaan olevan peräisin jäljellä tuumorisoluja läsnä luuytimen tai perusasteen sivustoja. Lisäksi on tärkeää onnistuneen kliinisen käytön tämän lähestymistavan osoittaa, että HB1.F3.C1 solut eivät ole läsnä normaalissa kudoksessa (kuviot 5, 6).

Molecular Todisteet HB1.F3.C1 Cell ja Kasvainsolun Co-lokalisointi luuytimessä

Vastatakseen ensimmäistä näistä kaksi kysymystä, arvioimme migraatio HB1.F3.C1 solujen kasvainsolujen luuytimessä, käytettäessä herkkää molekyyli lähestymistapa havaitsemaan vähäinen kasvainten määrä soluja ja /tai HB1.F3.C1 soluja. Tätä varten olemme korjattu luuydin hiiristä, jotka oli injektoitu suonensisäisesti NB-1691-soluissa, sen jälkeen HB1.F3.C1 solut kaksi viikkoa myöhemmin. Kuten edellä todettiin, tässä ”vaiheessa” taudin, kasvaimia ei voida havaita mikroskooppisesti. Sitten käytimme PCR havaitsemaan v-

myc

geeni esiintyy HB1.F3.C1 soluissa ja RT-PCR havaitsemiseksi tyrosiinihydroksylaasin (TH), neuroblastoomasolu- merkki. Tiedot kuviossa 5 osoittavat, että joko molemmat v-

myc

ja TH tai kumpikaan näistä merkeistä havaittiin tahansa luuytimen. Jos luuytimen sisälsivät kasvainsoluja kuten osoitetaan havaittavan signaalin TH, HB1.F3.C1 solut (positiivinen signaali v-

myc

) olivat myös läsnä. Käänteisesti, kun ei neuroblastoomasoluja havaittu, HB1.F3.C1 solut olivat yhtä huomaamaton. Tämä ”co-lokalisointi” tapahtui 1 tunnin kuluttua ja kesti vähintään 7 päivää. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia kuvioissa 3 ja 4, ja osoittavat, että HB1.F3.C1 solut nopeasti siirtyvät tuumorisoluihin

in vivo

.

Harvat HB1.F3.C1 Solut ovat läsnä normaali Tissue

hoito on kasvain-selektiivinen, se on myös välttämätöntä osoittaa, että HB1.F3.C1 solut eivät siirtyä muihin normaaleissa kudoksissa. Näin ollen, 2 x 10

6 CM-Dil-leimattuja soluja injektoitiin suonensisäisesti hiiriin, joissa NB-1643 kasvaimia ja sen jälkeen 3 päivää, kaikki elimet kerättiin ja arvioitiin läsnäolo HB1.F3.C1 soluja. Kuvio 6 osoittaa, että vähän, jos lainkaan, HB1.F3.C1 soluja oli läsnä normaaleissa aivoissa, munuaisissa, sydämessä, suolistossa tai ihon kudosta (paneelit A-E, tässä järjestyksessä). Toisinaan yhden solun havaittiin keuhkoissa, maksassa tai pernassa (paneelit F-H, vastaavasti), mutta ei painopiste CM-Dil fluoresenssia nähtiin tahansa normaalia kudosta tahansa viisi hiirtä tutkittiin. Olemme päätellä, että HB1.F3.C1 solut vaelsivat valikoivasti neuroblastoomasoluilla laskimonsisäisen injektion.

terapeuttista tehoa metastaattisen Neuroblastooma

Todettuaan, että HB1.F3.C1 solut ovat kasvain- trooppinen

in vivo

, arvioimme antituumorivaikutuksen tehoa meidän hermo kantasolujen /esisolujen-suunnatun entsyymi aihiolääke (NDEPT) lähestymistapa hoito käyttäen HB1.F3.C1 soluja transdusoitu ilmaista erittyvän muodon kanin karboksyyliesteraasin (RCE) ja syövän vastaisen aihiolääke CPT-11. Ensin vahvisti, käyttämällä muunnettua Boyden kammion määrityksiä, että adenoviruksen transduktio ja ilmaus RCE ei muuttanut tropiikin ominaisuuksia HB1.F3.C1 solujen (kuvio 7). Olemme myös päättäneet, että maksimaalinen ilmentymistaso RCE tapahtui 3-4 päivää seuraavat transduktion (tuloksia ei ole esitetty). Sitten transdusoidut HB1.F3.C1 solujen replikaatiovialliset adenovirus koodausta RCE, ja antaa laskimoon transdusoidut soluja hiirillä levitetään SK-N-AS kasvaimia. Hiiret käsiteltiin protokollan mukaisesti esitetty kaaviomaisesti kuviossa 8. Kuten on esitetty kuviossa neljä päivää injektion jälkeen HB1.F3.C1 + AdCMVrCE soluja (kolme päivää injektion HB1.F3.C1 soluja), aloitimme hoidon CPT-11 (7,5 mg /kg) päivittäin × 5 aikataulu, optimaalinen aikataulu hallinnon neuroblastoomapotilailla. Tämä käsittely toistettiin seuraavalla viikolla, minkä jälkeen on 2 viikon tauko ja sitten vielä 2 viikon hoitokuurin. Kaplan-Meier graafisesti kuviossa 9 on esitetty Eloonjääntitulokset käsittelemättömän hiirillä verrattuna hiirillä, joita hoidettiin CPT-11 ainoastaan, tai yhdistelmä HB1.F3.C1 soluja, jotka ilmentävät RCE ja CPT-11.